（微生物学专业论文）黑曲霉a25产木聚糖酶的变温发酵研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目黑曲霉a 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究差篓f 硕士 级别i 叭上 学生 姓名鲁晓娟i 掌翌l 微生物学 曩鎏l 陈红歌副教授 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 导师魏前，芗埠 日期：2 叼7 年f 月，驴日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生龆概均导师繇菇彳鳓学院领导躲 巨因 l 印建1 日期：加j f 年吨月，o 日日期2 肜瘁么月d 日日期：沙年6 月o 日 肌p絮舳 嚣叶 致谢 本文是在导师陈红歌副教授、刘新育老师的悉心指导下完成的，无论从论文的选题， 实验的设计，还是论文的写作，他们都给予了精心的指导。三年来，导师创新的学者风范， 严谨的治学态度，以及宽阔的心胸，渊博的学识，使我十分的敬佩，她潜移默化的影响将 使我终生受益。在此向导师谆谆的教诲，无微的关心表示衷心的感谢。 在科研的具体过程中，贾新成教授、吴坤教授、邱立友教授、宋安东副教授都给予 及时的指导和建议，同时微生物教研室的全体老师，本院领导和实验室赵柏叶老师、胡瑜老 师、赵玉萍老师都给予了支持和帮助。谨此表示忠心的感谢! 三年的研究生生活中，我与吕帅、康静、张品品结下了深厚的友谊，我们在同一实 验室共同奋战，共同协作，互相帮助，使我的实验顺利进行。另外0 3 级闰欣、刘寅师兄， 0 4 级李彦鹏、王会娟等，0 5 级黄慧敏等，以及0 4 级本科生茹高林，都给予了我很大的帮 助。在此一并表示感谢。 最后感谢我的家人，朋友是他们在背后给予默默的鼓励与支持，才使我全身心投入到 实验中，以顺利完成学业。 微生物学硕士论文黑曲霉a 一2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 摘要 木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡糖，在饲料、造纸、食品以及能源工业中有着广泛的用途。木 聚糖酶及木聚糖酶基因的研究是当前酶学研究热点之一，在木聚糖酶得研究中，酶活普遍低下是一直困 扰人们的一个主要问题，酶活低就会造成在酶制剂的工业化生产中，加大成本量，阻碍其应用。而木聚 糖酶的生产主要依靠微生物的发酵，在微生物的发酵过程中，人们发现微生物的菌体生长温度，往往与 代谢产物的温度不一致，人为的控制发酵操作温度，进行不同阶段不同温度发酵，有助于其代谢产物的 合成。 本文对黑曲霉a 2 5 进行了变温发酵试验，并获得了很好的结果，通过进一步研究，探讨了变温发 酵导致酶活提高的机理，主要研究内容如下： 首先采用不同的培养温度，对黑曲霉a 2 5 分别进行了生长培养，通过测其生物量，得知黑曲霉a - 2 5 的最佳生长温度为3 3 ，而采用不同的发酵温度对黑曲霉a 2 5 进行产木聚糖酶的实验，发现其最佳的 产酶温度为2 9 。c ，接着对木聚糖酶的发酵过程进行变温操作，得出前4 8 小时3 3 c 以后降为2 9 发酵是 最佳的变温方案，最高酶活为7 2 1 u m 1 比2 9 。c 恒温发酵提高了1 1 0 个酶活单位，且缩短了发酵周期8 个小时。 通过变温和恒温条件下菌丝体的产酶能力分析，酶谱检测分析，相对定量分析，对变温发酵酶活提 高的机理进行了研究，结果表明，变温发酵促进酶活大幅度提高不仅是因为菌丝体总量的增大，还由于 单位菌丝体的产酶能力提高引起的，在分子水平上我们进一步通过酶谱检测发现变温发酵有可能刺激了 x y n l l l 提前合成或提高了合成量，应用实时定量r t p c r 法对x y n l i l 进行了相对定量检测，表明变温发酵 在m r n a 的表达水平上促进了x y n 的大量表达，从而使蛋白质的合成量得到提高。 关键词：黑曲霉a _ 2 5 ，木聚糖酶，变温发酵，r t p c r 微生物学硕士论文黑曲霉a - 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 1 文献综述 1 1 木聚糖 木聚糖( ( x y l a n ) 是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物 总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生物质资源。 木聚糖是由主链为b d - 吡喃型木糖残基通过b 一1 ，4 一糖苷键连接而成的。大部分木聚 糖为异型多糖，即主链或侧链含有不同的替代基，如乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖基等：只 有木糖基组成的木聚糖并不多见，人们仅从少数几种植物中分离出来过，如羽状草啦! 烟草茎 秆1 、瓜尔豆种子壳h 1 等。也正由于这些侧链的不同，使得木聚糖的结构变化范围很大，从 仅由b - 1 ，4 一糖苷键连接的多聚木糖线性分子到高度分枝的异质多糖。 木聚糖的侧链与植物细胞中其它几种结构性多糖( 如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等) 以共价或非共价键连接，组成植物细胞重要的结构一细胞壁。在细胞壁中它起到填充剂和粘 合剂的作用，它以非共价键连接纤维素，以共价键连接木质素，因此在保护纤维素结构的整 体性，防止纤维的降解方面具有重要的作用哺1 。 1 2 木聚糖酶 1 2 1 木聚糖酶的分类 木聚糖酶是戊聚糖酶的一种，是一类可以将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的复合酶系， 其中以内切酶为主。 常见的木聚糖酶主要包括三类：( 1 ) 内切一b 一1 ，4 一d - - 木聚糖酶( e c3 2 1 8 ) ，优先在不同 位点上作用于木聚糖和长链木寡糖，从b - 1 ，4 一木聚糖主链的内部切割木糖苷链，从而使 木聚糖降解为木寡糖，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，因此是木聚糖降 解酶中最关键的酶。( 2 ) 外切一b - 1 ，4 一d _ 木聚糖酶( e c3 2 1 9 2 ) ，作用于木聚糖和木寡糖 的非还原端，产物为木糖。( 3 ) b 一木糖苷酶( e c3 2 1 3 7 ) ，该酶通过切割木寡糖末端而释 放木糖残基，而且是唯一能水解木二糖释放出木糖糖苷的酶 1 2 2 木聚糖酶的特性 ( 1 )多样性 木聚糖酶在自然界分布很广，真菌、细菌、酵母、陆地植物组织和无脊椎动物都是其来 源，研究较多的是微生物产生的木聚糖酶，不同种类的微生物产生不同种类的木聚糖酶，而 同一微生物也常常产生不止一种的木聚糖酶，这些酶从基因编码序列、蛋白质序列、酶的空 间结构、分子量大小、等电点、催化性质都有所不同。 从对底物的特异性上划分，可将木聚糖分为特异性木聚糖酶和非特异性木聚糖酶，其 中特异性木聚糖酶以木聚糖为特定的底物发生作用，非特异性木聚糖酶能作用于多种底物如 纤维素、羧甲基纤维素、纤维寡糖等。从酶的分子量上划分，可将木聚糖酶分为低分子量木 聚糖酶和高分子量木聚糖酶，低分子木聚糖酶含1 8 2 2 3 4 个氨基酸残基：高分子量木聚糖酶 含2 6 9 8 0 9 个氨基酸残基晒1 。根据糖苷键水解酶催化区域的氨基酸序列组成和疏水簇分析， 可将其分成许多族口1 。所有的木聚糖酶都属于f i o 或g 1 1 族，高分子量木聚糖酶多属于f l o 微生物学硕士论文黑曲霉a - 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 族，低分子量木聚糖糖酶属于g 1 1 族。w o n g 等诲根据酶的理化特性将其分为两大类：分子量 小于3 0 0 0 0 的酶和分子量大于3 0 0 0 0 的酶，前者通常为碱性蛋白，而后者通常为酸性蛋白。 细菌所产木聚糖酶可分为两类：高分子量的酸性木聚搪酶和低分子量的碱性木聚糖酶。但在 真菌中却没有这种差别，不过低分子量木聚糖酶的碱性却是共同的。 ( 2 ) 催化特性 不同的木聚糖酶在结构和性质上有很大差别：有的木聚糖酶只含有单一区域，即催化区 域，也有的同时具备催化区域和多种非催化区域。催化区域承担着酶的水解功能，并作为木 聚糖酶分类的基础。木聚糖酶的催化区域在大小上都趋向一致，但活性位点的氨基酸组成在 数量上变化很大阳1 ，其中主要的氨基酸有：色氨酸：一般的说，一些特殊的色氨酸残基在木 聚糖酶分子中是稳定的，它往往位于酶的底物结合中心；胱氨酸：许多真菌和细菌木聚糖 酶分子中都含有对其活性很重要的胱氨酸残基。胱氨酸有时离活性位点很远，但它对分子形 成折叠结构是很重要的：谷氨酸：在许多木聚糖酶分子中谷氨酸都起着重要作用；另外， 酶分子中羧基基团及组氨酸对某些木聚糖酶的活性也是很重要的。 非催化区域包括：纤维素结合区域( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n c b d ) 、木聚糖结合区域 ( x y l a n - b i n d i n gd o m a i n x b d ) 、连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ) 、重复序列( r e p e a t e d s e q u e n c e ) 、热稳定区域( t h e r m o s t a b i l l i s i n gd o m a i n ) 、其它未知功能的非催化区域，这些 区域担负着不同的生理功能。t a k e n i s h i 和t s u j s a k a 在研究中发现了两种木聚糖酶之间的协 同作用，其中一种木聚糖酶负责水解木三糖，而另一种木聚糖酶负责水解阿拉伯糖残基的底 物。他们发现，阿拉伯木聚糖被木聚糖酶i 水解后会产生大量的阿拉伯木三糖和阿拉伯木二 糖，木聚糖酶i i 的存在时则会使木三糖和木二糖的含量大大减少；另一方面，木聚糖酶i i 水 解阿拉伯木聚糖可以产生木三糖和分子量较大的木寡糖，木聚糖酶i 也可以将这些物质进一 步的水解u 们。 对木聚糖酶催化特性的研究需要在分子生物学水平上深入进行，但我国对木聚糖酶的研 究从最近十几年才开始，研究内容主要集中在产木聚糖酶菌株的筛选、木聚糖酶的纯化及性 质方面，对酶的蛋白质、基因方面的研究相对较少，目前木聚糖酶在基因方面仅克隆了少数 木聚糖酶基因。但随着研究的不断深入，近年来在分子生物学方面对木聚糖酶的研究也不断 增多n 1 1 2 1 ，这些研究必将对木聚糖酶的应用起到更好的指导作用。 ( 3 ) 诱导特性 木聚糖酶是一种诱导酶，该酶的诱导合成可以通过避免诱导物快速分解和解除代谢阻遏 等方式进行1 3 1 。 诱导或阻遏作用对木聚糖酶活有较大影响。除了菌株本身的特性以外，基质中的诱导物 与酶的合成也有密切关系，向培养基中加入诱导剂可以解除阻遏作用或产生诱导效应。绝大 多数产木聚糖酶菌株的产酶可以被木聚糖所诱导，但多聚糖不能直接透过细胞膜进入细胞 内。木聚糖对木聚糖酶的诱导作用是通过木聚糖降解的片段结合细胞表面而进入细胞，启动 转录，从而加强酶的合成，这种调节机制比乳糖操纵子要复杂的多。除木聚糖外，许多研究 2 微生物学硕士论文黑曲霉a 一2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 者也研究了其它糖类对微生物产木聚糖酶的诱导作用n 4 1n 射。从这些报道来看，除木聚糖外的 其它多糖( 如纤维素) 、寡糖( 如木二搪) 、单糖对菌株产酶所表现出的作用差别较大。例如， 葡萄糖可阻遏绝大多数菌株产生木聚糖酶，但对梭菌e p p l 0 0 产生木聚糖酶无影响，甚至葡 萄糖对费希尔曲霉、枯草杆菌、树干毕赤酵母的产酶还有诱导作用：韩晓芳等n 6 1 报道了一株 产木聚糖酶嗜碱芽抱杆菌，葡萄糖对产酶无抑制作用，并且木糖对该菌株产木聚糖酶的诱导 效果优于木聚糖：刘超纲等n 刀用纤维素和木聚糖混合添加后对木聚糖酶的合成产生了复合诱 导作用，大幅度提高了木聚糖酶活。 1 2 3 木聚糖酶的生产菌种 产木聚糖酶的微生物分布很广，有几十个属、一百多个种，其中包括细菌、放线菌、真 菌以及某些酵母。多数细菌和真菌分泌胞外木聚糖酶，将木聚糖水解为单糖再进入微生物细 胞供代谢用。也有一些微生物如瘤胃细菌、嗜饱粘菌、粘液球菌及黑曲霉中的一些种类，也 产生胞内酶。目前研究得较清楚的有芽孢杆菌b a c i l l u sc i r c u l a n s w l l 2 、b c o a g u l a n s 、 b s p i i - is 、b s p w _ 1 ，链霉菌t r e p t o m y c e ss p k t 一2 3 、s 1 i v i d a n s t 7 、c r y p t o c o c c u s f a l v u s ，曲霉a s p e r g i l l u ss p 、a n i g e r ，镰刀菌f u s a r i u ma v e n a c e u m ，裂褶菌s c h i z o p h y l l u m c o m m u n e ，木霉t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m 、t k o n i n g ii ，多孔菌t r a m e t e sh i r s u t a 等n 阳 不同微生物来源的木聚糖酶性质不同。一般情况下多数真菌产生的木聚糖酶的最适p h 在3 5 5 5 之间，p i 范围比较宽，多在3 1 0 。最适反应温度在5 5 左右。细菌产生的木 聚糖酶，p h 多在5 0 7 9 之间。细菌木聚糖酶的热稳定性比真菌的好些，最适作用温度通 常与产酶微生物的最适生长温度成正向相关。尽管现在知道一系列的木聚糖酶的生产菌株， 但可以真正用于商业化生产的菌株也就仅仅只有t r i c h o d e r m as p 和a s p e r g illu ss p n 引。 1 2 4 木聚糖酶的生产 1 2 4 1 天然菌种发酵生产 目前木聚糖酶的生产主要依靠真菌、细菌等微生物发酵生产。按照发酵工艺的不同可分 为固态发酵和液体发酵两种，固态发酵及液体发酵有其各自的优缺点。固态发酵所使用的培 养基非常简单便宜，都是一些未精制的农副产品：设备简单，整个过程中无废物产生，也无 环境污染问题：产率高：但不易控制，酶系复杂，纤维素等酶含量高，难以精酶化。国内运用 于工业化生产的大都是采用固态发酵方式。相比较而言，液体发酵具有如下特点：1 ) 在液态 环境中，菌体、底物、产物( 包括热) 易于扩散，使发酵在均质或拟均质条件下进行，便于检 测、控制，容易扩大生产规模：2 ) 液体输送方便，易于机械化操作：3 ) 产品易于提取精制。但 缺点是对设备的要求较高，成本高，技术要求也较严格眦2 。究竟采用何种方式生产木聚糖 酶，应根据实际对产品的要求及己有的实验条件而定。 丝状真菌是一种非常出色的木聚糖酶生产菌，因为其分泌到培养基中的木聚糖酶的水平 远远高于酵母和细菌，并且真菌的木聚糖酶常常是糖基化酶，在室温条件下能长期保持活性， 同时丝状真菌在表达木聚糖酶时常常伴随有纤维素酶、淀粉酶的表达口别。目前自然发酵生产 木聚糖酶酶活都非常高，例如：据1 9 9 2 年h a a p a l a 报道，里氏木霉心3 1 产木聚糖酶的活力可以 3 微生物学硕士论文黑曲霉a 一2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 达到3 3 5 0 u m l ，而h a l t r i c h 在研究s c h i z o p h y l l u m 突变株比引的固态发酵时，得到木聚糖酶 活力可达到2 2 7 0 0 u m l ，但是自然发酵得到的木聚糖酶特性并不很好，都在常温条件下发酵 产酶，得到的木聚糖酶的最适温度都比较低，因而在工业应用中受到约束。 1 2 4 2 工程菌生产木聚糖酶 通过筛选及自然发酵得到的木聚糖酶是一种古老而又传统的方法，在选择菌株的时候， 必须尽量做到同时满足酶产量高、酶热稳定性好、酶p h 稳定性好的要求。而实际上，我们 在筛菌的时候往往只能同时满足两个：此外天然菌株发酵，菌株产酶酶系比较复杂，分离纯 化步骤繁琐。为了满足木聚糖酶符合工业需求，研究者们将生物技术应用到了木聚糖酶的生 产上，将一些具有良好特点的木聚糖酶基因克隆表达到已知的载体中，以满足人们的需求。 木聚糖酶基因工程的研究起始于七十年代末，八十年代初，到现在已有3 0 个属的上百 种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌及真核表达载体中表达曙刖。而且还使 用定点诱变技术探讨了木聚糖酶的结构与功能的关系，并对酶的性质进行改造以满足工业生 产的需要。 1 9 9 0 年，l u t h i 等用大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 为受体菌尝试表达来源于 c a l d o c e l l u ms a c h a r o l y t i c u m 的耐热木聚糖酶基因x y n a ，控制x y n a 的启动子采用表达载体 p 3 黼上的温度诱导的p r 和p l 启动子。x y n a 的表达量可达到细胞总蛋白的2 0 以上，并且表 达的x y n a 具有正常的生物学活性，与原始天然酶无显著差异啪1 。 1 9 9 3 年，s u n g 等根据大肠杆菌的密码子偏向人工合成的环状芽饱杆菌( b a c i l l u s c i r c u l a n s ) 木聚糖酶编码基因，并采用l a c 启动子，结果重组木聚糖酶在细胞周质中的表达 量高达3 0 0 g l 发酵液口 。 2 0 0 0 年，j e a n - g u y 心引等把a s p e r g i l l u sn i g e r 中的f l l 同源性木聚糖酶基因x y l a 采用 p h i l d 2 质粒，使用s c e r e v i s i a es u c 2 作为信号肤，表达到毕赤酵母中，在发酵罐中分泌 量为6 0m g l 。 2 0 0 3 年，m o n i c a 比引将高温菌t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u si o c - 4 2 4 5 中的木聚糖酶被表达 到p i c h i ap a s t o r i s ，采用a o x - 做为启动子，在1 l 的摇瓶中进行了培养，得到1 4 8m g l 的 木聚糖酶的产量，酶性质分析得到最适温度为7 5 。 1 2 4 3 木聚糖酶的固定化生产 据文献报道啪1 ，将分泌木聚糖酶的微生物固定在固体材料上在实际应用中具有许多优 点，包括可重复使用、易于分离、稳定性更高等在固定化研究中，可把微生物的整个细胞 固定在支持物上，酶本身也可固定在某些可溶或不溶的聚合物上。g w a n d e 和k a m a t 将 a s p e r i g i l l u ss p 的5 号菌株和4 4 号菌株固定在4 0 0 筛孔的尼龙布上，置于摇瓶中培养， 结果发现，固定化的5 号菌株比自由悬浮细胞产生的木聚糖酶产量高1 6 8 倍，将此霉菌 分泌的木聚糖酶非共价地固定在e u d r a g i ts 一1 0 0 上经糖化后，可收获和重复使用瞄纠。g o u d a 等报道将黑曲霉a s p e r i g i l l u s 固定在丝织品、人造纤维和聚酯纤维上可获得最大产量的木 聚糖酶，此固定化酶与游离酶相比，具有更多优点m 1 。聚氨基甲酸乙酯泡膜( p u ) 、聚酯、 4 微生物学硕士论文黑曲霉a - 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 丝和棉花也可作为菌丝的固定化材料。b e g 曾将s m p t o m p c e ss p q g 一1 1 3 菌丝固定在这些 支持材料上，与液体分批发酵产生的木聚糖酶产量相比，这些固定化材料可使木聚糖酶产量 分别增加2 5 倍、1 9 1 倍、1 5 4 倍和1 4 7 倍圳。 1 2 5 木聚糖酶的生产影响因素 影响木聚搪酶产率的因素除去通常的发酵条件外还有一些关键的因子，各种因子对于木 聚糖酶的表达有综合效应，它们包括底物的可接近性，低聚木糖的释放速率和数量及其化学 特性和所能够产生的木糖数量。影响木聚糖酶活性和产率的其它生物过程参数还包括p h ，温 度和通风等。 ( 1 ) 温度对木聚糖酶生产的影响 b i c h e r 5 1 等人在1 9 9 5 年对木霉代谢产酶情况进行了探讨，发现木聚糖酶的最适培养条 件为：0 6 蛋白陈，1 木聚糖和矿物盐。首先在3 7 培养1 7 h ，菌体已充分生长，进入产酶 阶段。接着降低温度到2 8 。c ，与只在同一温度下培养相比，木聚糖酶的产量可提高4 0 。 将温度摆动进行固体发酵，在不同的发酵阶段使温度在3 0 。c 一5 0 c 间有规律周期性的摆动。 结果表明在不同的发酵阶段温度起着非常重要的作用，发酵初期，较高的温度是有利的。高 温可以诱发抱子萌发，刺激菌体迅速生长。而发酵产酶阶段，降低温度可以降低酶解产糖引 起的阻遏作用，提高酶产量。因此精确控制温度十分重要。 ( 2 ) p h 对木聚糖酶生产的影响 据文献报道a s p e r g i l l u sp i d d l e ：的木聚糖酶基因x l n a 和x l n b 的表达是由培养液p h 所 调控，当培养液中的p h 呈酸性时x l n b 表达，当培养液中的p h 呈碱性时x l n a 表达，这些现 象己通过突变子证实了啪1 。 ( 3 ) 通风对木聚糖酶生产的影响 s i d e n b e r g 刀等1 9 9 7 年用麸皮等复杂碳源在搅拌式和气升式发酵罐上研究了 a s p e r g i l l u sa w a m o r i 发酵情况。研究发现发酵过程中菌丝体包裹在麸皮的周围，并可以穿 透其表皮进入麸皮内部对其进行降解，这也提示我们在进行木聚糖酶发酵时，转速是需要严 格控制的。过高的剪切力可能对菌体生长不利，也不利于菌体吸附到麸皮上。a s p e r g i l l u s a w a m o r 在3 0 0 r p m 培养时可获得很高的木聚糖酶活，当转速提高到7 5 0 r p m 时，则酶活下降很 多。 1 2 6 木聚糖酶的变温发酵 由于在微生物发酵过程中，菌体的生长温度往往与代谢产物的温度有差异，为了解决这 一矛盾，人们在进行微生物发酵时就采用不同阶段不同温度发酵的方法，即变温发酵，并在 很多领域获得了成功。如亮氨酸、柠檬酸、蛋白酶、纤维素酶、甘油等的发酵中都获得成功 应用。冉晓慧、彦景斌汹1 等在对林可霉素的发酵进行前6 0 h 维持在3 1 c 随后降到3 0 c 培养 7 0 h 再回升至3 1 。c 培养至放罐，结果显示：生产菌中、后期菌浓度降幅度减小，菌l p l 上的 空泡缩小，美兰染色加深，自溶期推迟：平均的一批放罐总亿提高了4 4 ，同时可以缓解冷 5 微生物学硕士论文黑曲霉a 一2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 却水水源不足和减轻染菌对发酵水平的影响。另外谢东明、张岩训等对甘油的生长采用变温 技术，使甘油的产率提高了2 8 7 。 在对木聚糖酶的发酵研究中，人们早在1 9 9 5 年b i c h e r 呻1 等人就对黑曲霉产木聚糖酶的 发酵中发现，首先在3 7 c 培养1 7 h ，菌体已充分生长，进入产酶阶段。接着降低温度到2 8 ，与只在同一温度下培养相比，木聚糖酶的产量可提高4 0 ，1 9 9 9 年，袁其明，马润宇h 1 1 在对黑曲霉a r r l 1 5 生产木聚糖酶的研究中，采用变温操作，得到了在不降低酶活性的情况 下，缩短了发酵时间1 6 小时，张洁、吴克旧1 等对黑曲霉a 3 采用变温固态发酵，使产酶期提 前了1 4 小时，酶活提高了2 0 0 u g 左右。 1 2 7 木聚糖酶的应用 木聚糖酶具有重要的应用价值，解决了其应用领域中的许多重大问题。木聚糖酶的应用 主要集中在造纸、食品和饲料工业，生产低聚木糖也成为目前木聚糖酶应用的新热点，此外， 木聚糖酶在生产单细胞蛋白( s c p ) 、液体或气体燃料、溶剂和糖浆等方面也具有巨大潜力。 ( 1 ) 木聚糖酶在食品工业中的应用 在食品工业中，酶制剂正作为一种新型品质改良剂应用于食品生产，相对于传统改良剂 具有效果好、安全的优点。如木聚糖酶能够调整面团性能，提高面筋网络的弹性，增强面团 稳定性，改善加工性能，改进面包瓤的结构，增大面包体积。另外木聚糖酶的水解产物( 木 糖和低聚木糖) 可作为增稠剂、脂肪替代物或抗冷冻食品添加剂。或者进一步转化为液体燃 料、单细胞蛋白、溶剂和低热量甜味剂。 ( 2 ) 木聚糖酶在制浆中的应用 2 0 世纪8 0 年代中期开始出现用木聚糖酶去除化学浆中半纤维素的生物漂白方法，之后 在该领域木聚糖酶的研究不断增多，近年来纤维素酶、木聚糖酶、漆酶已成为造纸工业中研 究较多的酶。 一 木聚糖酶被用于纸浆工业中，是因为传统的化学漂白方法主要采用多步骤的氯和二氧化 氯漂白及碱抽提来去掉木质素，废水中就会含有大量的氯及有毒的强致癌、致畸物质，造成 严重的环境污染。木聚糖酶作为生物漂白剂可进行预漂白，缩短纸浆的处理时间，降低有毒 的化学物质氯的使用，从而降低环境污染，并可提高木质素溶出率，改善纸张性能。由于在 纸浆厂，纸浆的酶法预处理是在棕色的高密度储藏罐中进行的，其中的纸浆以高温( 大约6 0 ) 和碱性p h 值的状态存在因此，在高温和碱性条件下有效和稳定的木聚糖酶是最理想的， 目 前关注的筛选标准也是具有热稳定性和最适p h 的木聚糖酶。 ( 3 ) 木聚糖酶在其它领域中的应用 木聚糖酶的应用领域不断扩大，除了在食品和纸浆工业领域外，还在饲料、能源、医药 等行业有应用。据报道h 羽，木聚糖酶可与其它酶共同参与使植物降解为戊糖、己糖，再用其 它菌株发酵生产乙醇，也有报道发现能把植物纤维直接转化为乙醇的一些菌株，如 t h e r m b a c t e r o i d e sa c e t o e t h y l i c u s 倒、c l o t r i d i u mt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u r r i 捌另据报道， 木聚糖酶在果实成熟、种子萌发、真菌的寄生等诸多生理过程中也起重要作用h 即。 6 微生物学硕士论文 黑曲霉a - 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 由于木聚糖酶具有重要的应用价值，及生物工程技术的发展，现在己经有许多科研人员 致力于木聚糖酶的开发研究，如高产菌株的选育、工程菌的构建、培养优化条件、耐高温、 耐酸碱的木聚糖酶等。这些研究的成功必将促进木聚糖酶在造纸、饲料、食品等产业中的实 际应用，使其在各行业中发挥出它所具有的巨大潜力和作用。 1 2 8 木聚糖酶的研究现状和方向 国外对木聚糖酶的研究较早，目前己逐渐趋向成熟和产业化，细菌、真菌和放线菌所产 的木聚糖酶都得到了广泛而深入的关注和研究h ，并且在1 9 9 2 年就已经实现了酶制剂的工 业化生产1 。随着分子生物学的发展和众多新的试验方法的引入，对木聚糖酶的研究已经达 到了分子生物学基因工程的水平，已有上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大 肠杆菌中表达。 国内对木聚糖酶的研究起步较晚，作为一种工业酶制剂在我国尚属空白。虽然目前已有 多家单位进行了不同的研究开发工作，但普遍存在木聚糖酶活力低这一问题。例如，王洪援 报道的f s w y 3 青霉菌固态发酵产木聚糖酶活力为4 2 3 6 u g 固体培养基啪l 北京化工大学从黑曲 酶菌株a 1 1 一i 出发，经过诱变及周期变压发酵处理后获得的木聚糖酶活力也仅有3 6 9 0 u g 固 体培养基侧：无锡轻工大学白云玲啼门对菌株i 盯( u l i - i1 进行u 、处理、n t g 诱变，液体发酵得 木聚糖酶活力分别为2 5 0 i u m l 和3 5 4 i u m l 。木聚糖酶单位酶活力低导致生产成本加大是限 制酶制剂工业化生产的主要原因之一。因此，提高木聚糖酶的单位酶活力，降低木聚糖酶的 生产成本，是本课题研究的主要目的。 由于木聚糖酶在广泛的领域有着应用，近几年来对木聚糖酶的研究一直是热点，但因现 有产品的性能仍然存在许多不足之处，使其在一些领域中的应用受到限制。今后需从以下几 个方面来研究木聚糖酶，以拓宽木聚糖酶的应用范围。 ( 1 ) 选育木聚糖酶高产菌： 酶活偏低是木聚糖酶研究开发中遇到的的普遍问题，低木聚糖酶活造成发酵成本过高， 限制了该酶制剂的工业化生产和应用。获得木聚糖酶高产菌株仍是研究的主要方面，但多数 从自然界中筛选获得的菌株往往产木聚糖酶活较低，不能满足工业化应用的需要。因此，需 要通过一定的选育手段获得高产酶菌并通过优化产酶条件等途径来提高菌株所产木聚糖酶 的活力水平。 ( 2 ) 改善木聚糖酶的性能 应用领域不同，对菌株产木聚糖酶性能的要求也有所差别。例如，造纸工业中木聚糖酶 的处理是在高温和碱性状态下进行的，因此对木聚糖酶的热稳定性和耐碱性有一定要求旧1 霉 菌所产木聚糖酶多为中性或偏酸性，在应用上受到一定限制，高温耐碱性木聚糖酶多由细菌 产生：低聚木糖生产需要木聚糖酶具有较高的内切酶活力，较低的外切酶活力：清酒酿造中则 要求产木聚糖酶菌具有一定的耐酸性啼引。为了达到应用的要求，需要选育性能合适的菌种或 者从基因水平改造蛋白质，以获得耐高温、要采取一定手段改善微生物的产酶特性。 ( 3 ) 通过分子生物学手段构建工程菌： 7 微生物学硕士论文黑曲霉卜2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 随着对木聚糖酶基因研究的逐渐深入，近年来通过对木聚糖酶基因进行克隆、表达来构 建工程菌的研究逐渐增多，但目前人工构建的工程菌还没有真正形成产业化，用于工业生产 的产木聚糖酶菌还主要是通过筛选、诱变等手段获得，但随着蛋白质工程、基因工程方面研 究的不断深入，运用基因工程技术在分子水平上对木聚糖酶基因进行分子改造，来高效地生 产高活力的木聚糖酶。使构建工程菌实现产业化将成为可能。 ( 4 ) 发展固定化技术以提高木聚糖酶的应用效率 酶制剂在生产和处理过程中固定化技术是今后研究方向之一，固定化可以使木聚糖酶更 高效的应用，特别是在酶法制备的低聚木糖时，固定化木聚糖酶比游离酶具有更大的优势， 因此以后应在这方面加大研究，探寻出最佳的固定化材料和方法。 8 微生物学硕士论文黑曲霉a - 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 2 引言 由于木聚糖酶在造纸，饲料，烘焙，能源等领域有着广泛的应用，早已成为国内外的研 究热点。国外对木聚糖酶的研究较早，目前已逐渐趋向成熟和产业化，在1 9 9 2 年就已经实 现了酶制剂的工业化生产。国内由于对木聚糖酶的研究起步较晚，到目前为止，仍然没能大 规模的生产利用，产业化生产木聚糖酶产品还未见报道。近年来随着分子生物学的进展，对 木聚糖酶基因进行克隆、表达来构建工程菌的研究逐渐增多，但能够高效表达又胞外分泌的 报道仍然很少，近年来，随着研究的深入，虽也报道了一些新的研究成果，但酶活低一直是 普遍存在的问题，而低木聚糖酶酶活将造成发酵成本高，限制了该酶制剂的工业化生产和应 用。目前我们一般采用诱变，筛选产高木聚糖酶酶活的菌株，优化产酶发酵条件，通过分子 生物学手段构建工程菌等来提高木聚糖酶活力。 木聚糖酶的生产主要依靠真菌、细菌等微生物的发酵，微生物发酵需要维持在适当的温 度，并不断地向最适发酵温度靠近，才能使菌体生长和代谢产物的合成顺利进行，温度的变 化对发酵过程可产生两方而的影响：一方而是影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质：另一 方而是影响发酵液的物理性质。不同的菌种，不同的培养条件，最适温度也有所不同。作为 代谢产物的木聚糖酶，微生物发酵其最适菌体生长温度和最适木聚糖酶合成温度往往存在差 异，文献报道瞰1 在木聚糖酶发酵过程中采用变温发酵将会有利于发酵的高效进行。 本实验旨在通过对黑曲霉a - 2 5 进行变温发酵，来提高木聚糖酶的酶活或缩短发酵周期， 为实现高活力木聚糖酶酶制剂的工业化生产提供依据，并在结果的基础上，通过研究不同发 酵温度下单位菌丝体的产酶能力差异，蛋白质合成差异，以及在m p , n a 水平上的表达量差异 来探寻其原因，为进一步的优化变温操作打下基础， 9 微生物学硕士论文 黑曲霉a _ 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 3 材料与方法 3 1 菌种 黑曲霉a - 2 5 ，河南农业大学微生物教研室保存菌种 3 2 主要仪器 u v - 2 0 0 0 型紫外分光光度计，上海尤尼克公司 雷磁p i s j - 3 f 型p h 计，上海精密科学仪器有限公司生产； s k l 8 型高速冷冻离心机，s i g m a 公司产品； d y y - i i i a 稳压稳流电泳仪，北京六一玻璃仪器厂生产 d y y - 2 8 a 型电泳槽，北京六一玻璃仪器厂生产 p t c 一2 0 0p c r 仪，si g m a t p - 8 0 0p c r 仪，t a k a r a 3 3 主要试剂 桦木木聚糖、d e p c 液、t r i s - b a s e 、e d t a 均为s i g m a 公司生产；t r i s 法提取r n a 试剂 盒、荧光燃料法r e a lt i m er t - p c r 试剂盒为上海保生物公司生产；d e p c 水、t e 缓冲液、 t b e 电泳缓冲液、柠檬酸缓冲液由配置而成；乙醇、异丙醇、氯仿均为分析纯。 3 4 培养基 斜面培养基：p d a 培养基 麸皮产酶培养基( w v ) ：麸皮2 、玉米芯2 、葡萄糖0 1 、草酸铵1 、t w 一8 00 1 5 、 c a c 0 30 6 ，p h 5 o 可溶性产酶培养基：( w v ) ：0 5 x y l a n 、0 7 脚2 p 0 4 、0 2 l ( 2 h p 0 4 、0 0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 0 1 ( n h 4 ) 2 s 0 4 、0 0 6 y e a s te x t r a c t 。 生长液体培养基：察氏培养基 3 5 单孢子悬液制备 取p d a 斜面培养基上生长5 6 天的黑曲霉孢子，置于装有蒸馏水和玻璃珠的三角瓶中， 摇床上2 0 0 r p m 震荡1 小时使孢子分散。 3 6 粗酶液的制备 培养后的发酵液用四层纱布过滤，4 c ，4 2 0 0 转离心l o 分钟，上清即为粗酶液。 3 7 木聚糖酶活力的测定 木聚糖酶的活力：取0 1 m l 适当稀释的粗酶液，加入0 1 m l2 桦木木聚糖溶液( 用0 2 m 的h a c n a a c 缓冲液配制，p h 4 6 ) ，在5 0 c 保温1 5 分钟后，加入0 6 m l d n s 溶液，煮沸1 0 分 钟灭活显色，定容到5 m l ，在5 5 0 n m 波长下测定还原糖量( 以木糖计) ，以灭活的酶液作为对 照。 酶活定义：在上述条件下，每分钟产生1 微摩尔木糖所需要的酶量为一个酶活单位( i u ) 。 3 8 生物量的测定 利用生长培养基不同温度下培养黑曲霉a 一2 5 一定时间，滤纸过滤，蒸馏水冲洗三次， 1 0 微生物学硕士论文黑曲霉a - 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 静置3 0 分钟称湿重。 3 9 菌丝体的获得 采用可溶性产酶培养基，不同温度下发酵培养，培养后的发酵液四层纱布过滤得菌丝体， 滤液4 c 下4 2 0 0 转离心1 0 分钟，得粗酶液，菌丝体用蒸馏水冲洗三次，室温静置3 0 分钟， 称湿重。 3 1 0 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺( p a g e ) 参照d a v i s 阳朝方法进行，浓缩胶为5 ，分离胶为8 。 3 1 1p a g e 木聚糖酶谱带检测 r b b - 木聚糖的制各：0 5 克桦木木聚糖溶于1 5 m l 蒸馏水中，加热并搅拌至溶解，冷却到 室温，加入0 5 克r b b ，并滴加5 m l 浓度为1 m g m l 的n a z s o t 溶液，边滴加边搅拌，搅拌5 分 钟，然后加入2 5 m 1 0 1 3 克m l 的n a o h 溶液进行碱化，室温下搅拌反应1 5 2 小时。用2 倍体积的9 5 乙醇沉淀o 5 小时，过滤收集沉淀，然后用9 5 乙醇：0 0 5 m 醋酸钠= 2 ：1 的溶液 洗涤沉淀，直至滤液无色为止，再依次用9 5 乙醇：h 。0 = 4 ：1 的溶液、9 5 乙醇、丙酮对沉淀进 行脱水，室温干燥，得到蓬松状的r b b - 木聚糖。 琼脂糖板的制备：2 0 0 m g r b b 一木聚糖溶于8 m l 蒸馏水中，6 0 c 一7 0 。c 下搅拌至溶解，然后 同1 6 m 1 3 的热琼脂糖( 用0 2 m 、p h 6 0 的柠檬酸一磷酸缓冲液配制) 相混合，灌入已预热到 6 0 左右的两块平板玻璃制作的模板中，模板厚度为1 毫米。冷凝后去掉上层玻璃板即得到 琼脂糖板。 p a g e 平板电泳木聚糖酶活力谱带的检测：p a g e 电泳完毕后，取下凝胶紧贴于r b b 一木聚 糖的琼脂糖板上，于4 0 c 保温反应至对着光观察到透明的木聚糖酶谱带清晰可见为止。此琼 脂糖板用0 0 5 m 、p h 5 4 醋酸缓冲液：9 5 乙醇= 1 ：1 的溶液脱色3 2 0 小时。 3 12 总r n a 的提取 r n a 抽提过程中所用的一切仪器均经过0 0 1 的d e p c 一出o 处理，试剂均使用0 0 1 的 d e p c h 2 0 配置以除去r n a 酶，避免r n a 的降解。 ( 1 ) 用可溶性产酶培养基变温和恒温分别培养黑曲酶a 一2 5 到4 8 小时，过滤( 四层无菌 纱布) 得到菌丝球，用o 1 的d e p c 处理过的超纯水冲洗数次。 ( 2 ) 将超低温冻结的菌丝球称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中快速研磨，期间不断 加入液氮，直至研磨成粉末状。 ( 3 ) 向研钵中加入2 m l r n a i s or e a g e n t ，室温静置，直至样品完全融化，再用研钵继续研 磨至裂解液呈透明状。 ( 4 ) 将研磨液转移至离心管中，室温静置5 分钟，1 2 0 0 0 9 离心5 分钟，加入氯仿4 0 0 r a l ， 盖紧离心管盖，用力震荡，待充分乳化溶液呈乳白状后，室温静置5 分钟。 ( 5 ) 1 2 0 0 0 9 离心1 5 分钟。 ( 6 ) 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆分为三层，即无色的上清夜，中间的白色蛋 白层及带有颜色的下层有机相，吸取上清夜转移至另一新的离心管中。 微生物学硕士论文黑曲霉a 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 ( 7 ) 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀后，室温静置1 0 分钟。 ( 8 ) 1 2 0 0 0 94 c 离心1 0 分钟。 ( 9 ) 小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁加入7 5 ( d e p c 水配制) 乙醇，轻轻上下颠倒洗涤 离心管壁，1 2 0 0 0 94 c 离心5 分钟后，小心弃去乙醇。 ( 1 0 ) 室温干燥沉淀2 - 5 分钟，加入适量的r n a s e - f r e e 水溶解，待r n a 溶解后- 8 0 保存。 3 13c d n a 的合成 以所提取的总r n a 为模板进行逆转录反应，获得总c d n a 。反应步骤为： ( 1 ) 按下列组分配制r t 反应液( 在冰上进行) 表1r t 反应组分 试剂使用量终浓度 5xp r i m e s r i p t m b u f f e r2 u l1 p r i m e s r i p t m r tn z y m em i x1 0 5 u l 2 5 p m o l o l i g od tp r i m e r ( 5 0 u m ) 0 5 u l r a n d o m6 m e r s ( 1 0 0 u m ) 0 5 u l t o t a lr n a3 u l r n a s ef r e ed h 2 0 u pt ol o u l ( 2 ) 按以下反转录条件进行 3 7 反转录1 5 m i n ，8 5 反转录酶失活5 s 。得到的c d n a4 冰箱保存。 3 1 4 电泳检测 对提取的总r n a 和反转录获得的e d n a 产物用2 的琼脂糖凝胶进行电泳检测。 3 15 实时p c r 3 1 5 1 引物设计 从g e n b a n k 中查找出黑曲霉1 8 s r r n a 基因和x y n ( d q l 4 7 7 7 5 ) 的m r n a 序列，用b e a c o n d e s i g n e r 软件设计引物。引物设计遵循以下原则：如表2 1 8 s r r n a 基因：上游引物5 一a c t c a c c a g g t c c a g a c 从a a t 从g 一3 下游引物5 一从g c a g a c 从a t c a c t c c a c c a - 3 x y l h l 基因：上游引物5 一g c a a 从c t a c a a c g g c a a c c 一3 1 2 微生物学硕士论文黑曲霉a - 2 5 产木聚糖酶的变温发酵研究 下游引物5 一a g c c c a g a c c 从c g a c a a a 一3 以上引物均由上海宝生物公司合成。 表2 引物设计原则 扩增片段大小8 0 1 5 0 b p p r i m e r 长度 1 7 2 5 b a s e g c 含量 4 0 - 6 0 t m 值两条引物的t m 值尽量接近 序列整体上碱基不能过偏 局部避免g cr i c h 或a tr i c h 避免t c 连续，a g 连续 3 末端序列3 末端避免g c 含量过