（微生物学专业论文）木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其作用机制.pdf

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t o p oi 断裂复合物以阻止 呛断链的再连接，说明木犀草素是一种t o p oi 毒剂。 6 采用紫外可见分光光谱法和琼脂糖凝胶电泳对木犀草素与d n a 的作用方式进行 了研究，结果表明，木犀草素的吸收峰会因d n a 的加入发生红移，峰值出现减色效应， 且木犀草素能使超螺旋d n a 解旋并产生部分断裂，说明木犀草素是通过嵌入d n a 来 发挥作用的。 关键词：木犀草素；金黄色葡萄球菌；抑菌机制；拓扑异构酶 a c t i v i t ya n dd r u gr e s i s t a n c eo fl u t e o l i ne x t r a c t e df r o mn a t u r a lh e r b a lo ns t a p h y l o c o c c u s a u r e u sw a sc a r r i e do u t , a n di t sm e c h a n i s m sw e r es y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d n er e s u l t sa l e f o l l o w e d ： 1 i ti sf o u n dt h a tl u t e o l i nh a sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo i ls t a p h y l o c o c c u sa u r e u so b v i o u s l y b yu t i l i z i n go x f o r dc u pa n d2 ，3 ，5 - t r i p h e n y lt e t r a z o l i u mc h l o r i d e ( t t c ) ，a n dt h em i n i m u m i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n s ( m i c ) o fl u t e o l i ni s0 0 9m g m l 2 n ed r u gr e s i s t a n ts c r e e n i n ge x p e r i m e n t ss h o w e dt h a td r u gr e s i s t a n c ei sn o te a s yt ob e p r o d u c e db yl u t e o l i na n dt h em u t a t i o no fl u t e o l i n - r e s i s t a n ts t r a i n si sd i f f e r e n tf r o mq u i n o l o n e 3 1 1 1 em e m b r a n ei n t e g r i t yw a si n d i c a t e db yd e t e r m i n e i n gc o n d u c t i v i t ya n dc o n t e n to f m a c r o m o l e c u l e si nl i q u i dc u l t u r em e d i u m ，玎1 er e s u l ts h o w e dt h a tl u t e o l i nc o u l di m p a c to nt h e m e m b r a n ep e r m e a b i l i t yo fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，b u td o n td e s t r o yt h em e m b r a n ei n t e g r i t y d i r e c t l y 4 w i t hl u t e o l i nf o r16 h ，t h et o t a lc o n t e n to fp r o t e i n sd e c r e a s e d6 4 5 4 。t h eq u a n t i t i e so f d n aa n dr n aw e r er e d u c e d4 8 4 4 a n d3 9 3 5 r e s p e c t i v e l y i ti n d i c a t e dt h a tl u t e o l i n i n h i b i t e dt h en u c l e i ca c i da n dp r o t e i ns y n t h e s i s 5 l u t e o l i no nd n at o p o i s o m e r a s ea c t i v i t yw a si n d i c a t e db yp b r 3 2 2 d n ad e c a t e n a t i o n e x p e r i m e n t ，a n dt h e r e s u l tw a st h a tl u t e o l i ni n h i b i t e dt o p o i s o m e r a s ei ( t o p oi ) a n d t o p o i s o m e r a s el i ( t o p oi i ) s i g n i f i c a n t l yo ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u s n ed e t e r m i n a t i o na b o u t t h em e c h a n i s mo ft o p 0ii n d i c a t e dt h a tl u t e o l i nh a dt h ea b i l i t yo fs t a b i l i z i n gt h ec l e a v a b l e c o m p l e xf o r m a t i o nb e t w e e nd n aa n dt o p oi a n da c t sa sat o p oip o i s o n 6 n em o d eo fa c t i o no fl u t e o l i na n dd n aw a se v a l u a t e db yu t i l i z i n gu v s p e c t r o s c o p y a n da g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s 明1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo fl u t e o l i n s h i f t e dr e d s h i f ta n dp l a n a r i t ya f t e ri n t e r a c t i o nw i t hd n a , a n dl u t e o l i nw o u l du n w i n dd n a a sar e s u l tt h a th t e o l i nh a sd n ai n t e r c a l a t i v ec a p a b i l i t y k e yw o r d s ：l u t e o l i n ；s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ；a n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m ；t o p o i s o m e r a s e i i 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 i ： i 】1 1 源1 构及性质2 l1 3 木犀草素的生理功能：2 1 2 本研究目的和意义4 1 3 本研究的主要内容5 1 3 1 木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其耐药性5 1 3 2 木犀草素抑制金黄色葡萄球菌的作用机理5 2 木犀草素对金黄色葡萄球菌抑制活性及耐药性的研究7 2 1 实验材料7 2 1 1 供试菌种7 2 1 2 药品7 2 1 3 培养基7 2 1 - 4 主要仪器8 2 2 实验方法8 2 2 1 抑菌活性实验8 2 2 2 最低抑菌浓度( m i c ) 的测定8 2 2 3 金黄色葡萄球菌生长曲线的绘制9 2 2 4 耐药菌株的筛选：9 2 2 5 耐药菌株d n a 促旋酶突变位点的检测9 2 3 实验结果1 0 2 3 1 木犀草素等黄酮类化合物的抑菌作用1 0 2 3 2 木犀草素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度( m i c ) 的测定结果1 l 2 3 3 木犀草素对金黄色葡萄球菌生长曲线的抑制1 l 2 3 4 木犀草素的耐药性实验1 2 2 4 讨论1 3 2 ：5 小结1 5 3 木犀草素对金黄色葡萄球菌作用机制的研究1 6 木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其作用机制 3 1 实验材料1 8 3 1 1 供试菌种一1 8 3 1 2 培养基1 8 3 1 3 药品与试剂1 8 3 1 4 主要仪器1 8 3 2 实验方法1 8 3 2 1 培养液电导率的测定1 9 3 2 2 培养液中d n a 、r n a 等大分子物质的测定1 9 3 2 3 金黄色葡萄球菌可溶性蛋白含量的测定1 9 3 2 4 金黄色葡萄球菌d n a 、r n a 含量的测定2 l 3 2 5d n a 拓扑异构酶活性的测定2 1 3 2 6d n a 与t o p oi 结合测定2 2 3 2 7d n a - t o p oi 可断裂复合物形成的测定j 2 2 3 2 8 木犀草素与d n a 相互作用方式的测定2 2 3 3 实验结果2 3 3 3 1 木犀草素对金黄色葡萄球菌细胞膜的影响2 3 3 3 2 木犀草素对金黄色葡萄球菌可溶性蛋白的影响2 4 3 3 3 木犀草素对金黄色葡萄球菌核酸含量的影响2 5 3 3 4 木犀草素对金黄色葡萄球菌d n a 拓扑异构酶活性的影响2 7 3 3 5 木犀草素抑制d n at o p oi 活性的作用机制2 9 3 3 6 木犀草素与d n a 的相互作用方式3 0 3 4 讨论3 1 3 5 小结3 3 4 结论与展望3 5 4 1 结论3 5 4 2 展望3 6 参考文献1 3 7 攻读硕士学位期间发表学术论文情况4 2 致谢。4 3 辽宁师范大学硕士学位论文 1 绪论 近年来由于各种抗生素类药物的广泛使用，耐药菌群不断增加，导致许多细菌引起 的感染性疾病的治疗成为难题【l 2 】。而随着人们对生活质量要求的提高，许多有致癌可 能性的食品添加剂越来越引起人们的警惕。因此对高效、低毒且不易产生耐药性的抑菌 化合物的研究就显得尤为重要【3 一。黄酮类化合物是植物在长期自然选择过程中产生的 一些次级代谢产物，由于其种类多，分布广泛【5 川，毒副作用低，不易产生耐药性，且 具有抗氧化、抗肿瘤、调节心血管系统、调节脂质代谢、抗菌消炎等多种生理活性 8 - 1 2 】 而成为国内外学者们在医药、食品防腐等方面的研究热点。 木犀草素作为一种具有代表性的天然黄酮类化合物，近年来也广受国内外学者们的 关注。通过对木犀草素理化性质、生理活性及药理作用的广泛研究，现已证实其具有抗 氧化、清除自由基作用，抗肿瘤、抗癌作用，抗炎作用，抗菌、抗病毒作用以及抗纤维 化作用等，这些为进一步研究其生理活性及机制奠定了基础。本论文通过对木犀草素抑 菌活性及其作用机制的研究，为新型抗菌药物及天然食品添加剂的开发和应用提供理论 基础。 1 1 木犀草素的生物活性 木犀草素( l u t e o l i n ) 是一种典型的天然黄酮，属弱酸性四羟基黄酮类化合物，在 植物界分布较广【5 1 。有关药理及临床实验的结果表明木犀草素在体内具有消炎、抗过敏、 抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理活性，临床主要用于止咳、祛痰、消炎等。木犀草素的抗 菌作用可使其应用于抗菌药物的研发和食品防腐保鲜。其还被国外确认为是一种法定的 食品色素【1 3 1 。 1 1 1 木犀草素的来源 木犀草素因最初是从木犀草科( r e s e d a c e a e ) 木犀草属( r e s e d a ) 的草本植物木犀 草( 英文名r e s e d a ，植物分类拉丁文名r o d o r a t al ) 的叶、茎、枝中分离出而得名。 其在自然界中分布较广，可从多种天然药物、蔬菜果实中分离得到。目前发现主要存在 于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄芩属等天然药物和芹菜、甜椒、 辣椒、落花生等蔬菜果实中。此外，一些植物产品如橄榄油和红酒等以及野风仙花、百 里香草、唇形科植物筋骨草等也含有木犀草素。但由于天然品的提取率较低，临床应用 有一定困难，故此类化合物的合成及化学结构改造已成为近年来研究的热点。孙志忠等 u 钏曾报道了以自陈皮中提取的橙皮苷为原料，经水解、脱甲基、脱氢三步合成了木犀草 木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其作用机制 素，其总收率为4 5 9 ，同时还运用此方法以较好收率合成了具有药理活性的双氢黄酮： 橙皮素和圣草酚。该工艺原料易得、工艺简单、收率高，具有广泛的应用前景。 1 1 2 木犀草素的结构及性质 木犀草素的化学名为3 ，4 ，5 ，7 l 四羟基黄酮( 3 ，4 ，5 ，7 - - t e t r a l y d r o x y f l a n o n e ) ， 化学式为c 1 5 h 1 0 0 6 ，分子量为2 8 6 2 3 ，结构式如图1 1 。 h 0 0h0 图1 1 木犀草素结构式 f i g 1 1 s t m c 心eo fl u t c o l i n 0h 0 h 木犀草素是一种天然色素组分，这种色素组分从天然植物色素化学结构分类上属于 多酚( p o l y p h e n 0 1 ) 类的花黄素( a n t t h o x a n t h i n ) 亚类或称黄酮( f l a v o n e ) 亚类色素； 从溶解性能分类上属于水、醇溶性的染料( d y e ) 类色素。 木犀草素是从乙醇离析出的含一个结晶水的金黄色针状体，因分子中具有多元酚羟 基，是一种极性化合物，易溶于甲醇、乙醇、乙醚、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶 剂以及稀碱水溶液。木犀草素是平面性强的分子，因分子与分子之间排列紧密，引力较 大，故微溶于热水，难溶于冷水。水溶液呈悦目的淡黄色。溶于1 0 氢氧化钠水溶液时 呈深黄色。溶于浓硫酸生成锌盐，呈暗红黄色。木犀草素的熔点为3 2 8 * ( 2 - - 3 3 0 c ，同时 发生分解，与氢氧化钾共熔生成藤黄酚( p h l o r o g l u c i n 0 1 ) 和原儿茶酸( p r o t o c a t e o l n i c a c i d ) ， 在真空下升华。由于木犀草素分子上存在着酚羟基，故其水溶液显示微弱的酸性，能够 与铁、镁、钙、铜、铝、锆等金属离子生成带色的络合物。 1 1 3 木犀草素的生理功能 木犀草素由于其高效低毒的特点已成为众多国内外学者的研究重点。已有研究证 明，同其他黄酮类化合物一样，木犀草素也具有抗氧化，抗肿瘤，抗高血压，抗菌消炎 等多种生物活性。 辽宁师范大学硕士学位论文 ( 1 ) 抗氧化、清除自由基作用 炎症，肿瘤、衰老、血液病、以及心、肝、肺、皮肤等各方面疑难疾病的发生机理 与体内自由基产生过多或清除自由基能力下降有着密切的关系。木犀草素就具有抗氧 化、清除自由基的作用。阎高峰等【1 5 】采用烘箱贮存法和硫代巴比妥酸( t b a ) 快速测定 法对木犀草素的抗氧化活性及其影响因子进行了研究。结果发现木犀草素的添加量以 0 0 2 为宜，其效果与同剂量的b h t 抗氧化剂相当，比同剂量的茶多酚抗氧化效果好。 还原能力和清除羟自由基能力均比茶多酚和b h t 强。在酸性介质中，p h 3 - 4 时，抗氧 化活性最大；同时木犀草素也是一种耐热性很好的抗氧化剂，在1 8 0 下处理2 h ，基本 上不影响其抗氧化性能。研究表明木犀草素作为天然抗氧化剂具有开发潜力。 ( 2 ) 抗肿瘤、抗癌作用 近年来中外学者的研究表明，木犀草素作为黄酮类化合物的一种也具有明显的抗肿 瘤作用。b r u s s e l m a n sk 掣1 6 】指出，木犀草素可以选择性抑制前列腺癌和乳腺癌细胞的 脂肪酸合成酶活性，从而影响肿瘤细胞的增长和调亡。s i f trx 等【1 7 】指出，木犀草素可 以通过促进半胱天冬酶8 活化和半胱天冬酶3 的成熟，来易化肿瘤坏死因子相关的凋亡 诱导配体所诱导的癌细胞死亡。c h o w d h u r yar 等【1 8 】研究指出，木犀草素体外能够抑制 真核细胞d n a 拓扑异构酶i 的活性，促进其形成稳定的酶d n a 复合物，抑制d n a 再连接及合成。关于木犀草素诱导肿瘤细胞凋亡是通过其抗氧化作用，还是通过其促氧 化作用使细胞线粒体膜功能降低，而经线粒体凋亡途径发挥作用目前尚存在争议1 9 】。此 外，肖大凯等【2 0 】发现，木犀草素可体外剂量依赖地抑制卵巢癌细胞h o - - 8 9 1 0 p m 的侵 袭运动能力，这可能与木犀草素抑制基质金属蛋白酶9 0 v l m p 一9 ) 的分泌及下调细胞外 信号调节激酶2 ( e r k 2 ) 的表达有关。m a n j uv 等【2 1 】的研究表明，木犀草素可通过调节脂 质过氧化、抗氧化、抗增殖作用，显著降低二甲肼所导致的结肠癌的发生率以及肿瘤的 大小。 ( 3 ) 抗炎、调节免疫功能作用 闰庆峰等【2 z j 对小鼠巨噬细胞免疫功能的影响进行了研究，结果显示木犀草素高剂量 组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数、碳粒廓清速率和廓清指数及体 内溶菌酶活力明显降低，而低剂量和中剂量木犀草素组则无显著差别。说明木犀草素可 降低小鼠巨噬细胞的吞噬功能及体内溶菌酶活力，具有一定的免疫调节作用。张毅等【2 3 】 通过观察木犀草素对脂多糖( l p s ) 诱导的r a w 2 6 4 7 细胞( 小鼠单核巨噬细胞系) 核 因子r , b ( 套曲) 和环氧合酶2 ( c o x - 2 ) 的表达及对n f r d 3d n a 结合活性的影响， 探讨了其体外抗炎机制。结果显示木犀草素具有明显的抗炎作用，并根据实验结果推测 木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其作用机制 这种生物活性可能与其抑制核内n f 一1 的表达和d n a 结合活性，从而下调c o x 2 的 表达有关。 ( 4 ) 促凝血作用 近年来研究发现，木犀草素在凝血、止血方面起到十分重要的作用。都述虎等【2 4 】 对仙桃草的主要化学成分木犀革素体外促凝血作用进行了初步探讨，结果表明仙桃草主 要化学成分中仅有木犀草素显示出较好的体外促凝血作用。此研究也提示了木犀草素为 仙桃草止血有效成分。 ( 5 ) 抗病毒作用 研究还表明木犀草素也具有抗病毒的作用。何丽娜等口5 】研究显示木犀草素在0 3 0 - 一 9 7 5 t t g m l 浓度范围内，对b 3 病毒均有显著的抑制细胞病变作用，从而得出了木犀草素 具有体外抗柯萨奇b 3 病毒作用的结论。y il 等【2 6 】研究表明，木犀草素可以与严重急性 呼吸道综合征( s a r s ) 冠状病毒的s 2 蛋白结合，从而抑制该病毒进入宿主细胞。 t e w t r a k u ls 等t 2 n 贝u 指出，木犀草素及其衍生物能抑制艾滋病病毒整合酶的活性，具有 潜在的抗h i v 的作用。 ( 6 ) 抑菌作用 木犀草素具有广谱的抑菌作用，在1 ：3 5 0 0 0 0 浓度时可抑制葡萄球菌和枯草杆菌的生 长，对卡他菌、白色念珠菌、变形杆菌也有抑制作用。阎高峰等 1 5 】通过试管稀释法绘制 抑菌曲线的方法对木犀草素的抑菌能力进行了测定。结果表明木犀草素对食品中常见的 金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、啤酒酵母菌和大肠杆菌具有高效抗菌活性，且随浓度增加 而增强，其完全抑制浓度分别为3 0 0m g l 、2 0 0m g l 、2 5 0m g l 、3 0 0m g l ，提示木犀 草素在食品、医药等领域有着广泛的应用前景。 ( 7 ) 其他作用 木犀草素除具有上述生理功能外，还具有其它作用。赵稳兴等【2 8 1 的实验结果显示， 木犀草素可通过清除自由基，抑制胶原基因表达的途径达到在动物体内防治肝纤维化的 作用。蒋惠娣等 2 9 1 研究表明，木犀草素具有动脉舒张作用，可均浓度依赖地降低苯肾上 腺素预收缩血管的张力和拮抗高钾引起的血管收缩，且其舒血管作用表现为非内皮依赖 性。 1 2 本研究目的和意义 - 4 辽宁师范大学硕士学位论文 近年来，在治疗细菌引起的各种疾病的过程中，结构新颖、效果明显的抗生素发现 较为匮乏，过去的四十年来，仅有3 类新型抗生素药物出现，链阳性菌素 ( s t r e p t o g r a m i n s ) ，嗯唑烷酮类抗生素( o x a z o l i d i n o n e s ) 和脂肽类抗生素( 1 i p o p e p t i d e s ) 【3 0 】，与此同时，各种抗生素的广泛使用导致了抗药菌群的迅猛发展，这使得某些感染性 疾病成为临床治疗的难题 3 1 , 3 2 】。另一方面，为防止食品在制作、运输和储藏过程中受微 生物的污染而使食品变质腐化，人们常在食品中加入苯甲酸、山梨酸及其盐类、对羟基 苯甲酸酯等防腐剂。当前国内实际使用的主要食品防腐剂大多是化学合成物质，有致癌 或潜在致癌的可能性，有些也可能引发积累性中毒现象 3 3 1 。因此，为降低耐药菌株的传 播和发病率以及化学合成物质对人类的危害，寻找一种新型高效的化合物来替代传统的 抗菌药物或食品添加剂具有十分重要的作用和意义。 木犀草素等黄酮类化合物作为一种天然植物提取物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消 炎等多种生物活性，且这些有效成分具有来源广，价格低廉，毒副作用小，较少出现耐 药性等优点，使得该类化合物在医药、食品等领域有着广泛的应用前景。本文对从天然 中草药中提取的木犀草素进行了抑菌活性、耐药性及抑菌作用机制的研究，旨在为将其 开发成高效、低毒的天然抗菌药物和新型食品添加剂提供更完善的理论依据。 1 3 本研究的主要内容 本文应用微生物学、细胞生物学和分子生物学等方法，从以下几个方面研究了木犀 草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其作用机理： 1 3 1 木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其耐药性 ( 1 ) 采用牛津杯法研究木犀草素等六种黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌的抑茵活 性； ( 2 ) 采用2 ，3 ，5 一氯化三苯基四氮唑( t t c ) 染色法测定木犀草素对金黄色葡萄球菌 的最低抑菌浓度； ( 3 ) 采用分光光度法，测定木犀草素对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响； ( 4 ) 通过耐药性实验，比较分析金黄色葡萄球菌对木犀草素与喹诺酮药物的耐药 性。 1 3 2 木犀草素抑制金黄色葡萄球菌的作用机理 ( 1 ) 通过对培养液中电导率和d n a 、r n a 等大分子物质的测定，分析木犀草素对 金黄色葡萄球菌细胞膜的影响； 一5 一 木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其作用机制 ( 2 ) 通过s d s p a g e 蛋白谱带实验，研究木犀草素对金黄色葡萄球菌可溶性蛋白 的影响； ( 3 ) 利用4 ，6 二脒基2 苯基吲哚( d a p i ) 荧光染色法测定木犀草素对金黄色葡萄 球菌核酸含量的影响； ( 4 ) 采用琼脂糖凝胶电泳法，研究木犀草素对金黄色葡萄球菌d n a 拓扑异构酶活 性的抑制作用及对拓扑异构酶i ( t o p oi ) 的作用机制； ( 5 ) 采用紫外可见分光光谱法和琼脂糖凝胶电泳法研究木犀草素与d n a 的作用方 式。 究 致许多致病微生物产 重影响了传统抗生素 性疾病临床治疗难等 问题的关键之一。黄酮类化合物由于来源广泛、毒副作用低、不易产生耐药性等特点而 成为近年来天然抗菌药物研发方面的热点研究对象，同时也因其在抗肿瘤、抗氧化等多 方面表现出显著的生物活性而越来越受到国内外专家学者的青睐。本文选取天然中草药 中提取的木犀草素、汉黄芩素、槲皮素、石吊兰素、姜黄素、异鼠李素六种黄酮类化合 物，以人类化脓感染中最常见的金黄色葡萄球菌为供试菌，采用牛津杯法和2 ，3 ，5 氯化 三苯基四氮唑( 1 1 汜) 染色法对它们的抑菌活性进行了测定，并对抑菌活性最好的木犀 草素进行了耐药性的初步研究，旨在为新型天然抗菌药物的开发和研制提供理论基础。 2 1 实验材料 2 1 1 供试菌种 供试菌种为金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa t c c 2 5 9 2 3 ) ，由辽宁师范大 学微生物实验室提供。 2 1 2 药品 ( 1 ) 木犀草素标准品，汉黄芩素标准品，槲皮素标准品，石吊兰素标准品，姜黄 素标准品和异鼠李素标准品：购于大连检验检疫局。 ( 2 ) 氧氟沙星：产于东北制药集团公司沈阳第一制药厂 ( 3 ) p c r 反应液：购于上海碧云天生物技术研究所。 ( 4 ) 其它常规化学药品均为国产分析纯。 2 1 3 培养基 ( 1 ) 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g ，蛋白胨1 0g ，n a c l5g ，水1 0 0 0m l ， p h7 2 - 7 4 ( 2 ) 牛肉膏蛋白胨固体培养基( 2 琼脂) ：牛肉膏3g ，蛋白胨1 0g ， n a c l5g ， 琼脂2 0g ，水1 0 0 0m l ，p h7 2 7 4 ( 3 ) 牛肉膏蛋白胨半固体培养基( 1 琼脂) 牛肉膏3g ，蛋白胨l og ，n a c l5g ， 琼脂1 0g ，水1 0 0 0m l ，p h7 2 7 4 2 1 4 主 ( 1 ) ( 2 ) 由辽宁师 ( 3 ) ( 4 ) ( 5 ) ( 6 ) 酶标仪：s u n r i s et e c a n 公司 ( 7 ) i e c c l 3 1 rm u l t i s p e e d 型超速冷冻离心机：t h e r m o 公司 ( 8 ) 9 6 孔板：c o s t a r 公司 ( 9 ) t c 5 1 2 型p c r 仪：英国t e c h n e 公司 2 2 实验方法 2 2 1 抑菌活性实验 ( 1 ) 金黄色葡萄球菌菌悬液的制备 从纯化好的金黄色葡萄球菌斜面中挑取少量细菌接种于牛肉膏液体培养基中，置于 3 7 ，1 2 0r p m 的恒温培养箱中培养2 4h 。从培养箱中取出培养了2 4h 的金黄色葡萄球 菌菌液，用牛肉膏蛋白胨液体培养基调节菌液浓度为1 0 6 1 0 7 c f u m l 。 ( 2 ) 供试药液的配制 用无水乙醇将木犀草素、汉黄芩素、槲皮素、石吊兰素、姜黄素和异鼠李素六种标 准品分别配制成浓度为1 0m g m l 的母液，稀释1 0 倍后供抑菌实验使用。 ( 3 ) 抑菌实验 本研究采用牛津杯法检测不同黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。首先在 培养皿内倒入2 0m l 牛肉膏蛋白胨固体培养基作为底层，待凝固后，将加有0 1m l 金 黄色葡萄球菌菌悬液的牛肉膏蛋白胨半固体培养基共5m l 均匀倒于底层培养基上。彻 底凝固后，在培养基上等距离分散的放上无菌牛津杯，向其中分别加入2 0 0 止，1m g m l 的不同供试药液【3 4 1 。最后置于3 7 恒温培养箱中培养2 4h 后用直尺测定抑菌圈直径。 无水乙醇为对照组，实验重复3 次，取平均值。 2 2 2 最低抑菌浓度( m i c ) 的测定 辽宁师范大学硕士学位论文 将金黄色葡萄球菌培养至对数期，用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释至浓度为1 0 6 1 0 7 c f u m l 的菌悬液。向9 6 孔板中加入1 5 0 止菌悬液、1 5 止不同浓度的供试药液，使其 终浓度分别到达0 0 6 、0 0 7 、0 0 8 、0 0 9 、0 1 0 、0 1 5m g m l ，然后放入3 7 1 0 0r p m 摇 床中培养。待培养2 4h 后，每孔分别加入1 5 皿浓度为0 2 的2 ，3 ，5 氯化三苯基四氮 唑( t t c ) ，3 7 ，1 0 0r p m 避光培养4h 后，观察其颜色变化【3 5 1 ，以无水乙醇为对照 组，实验重复3 次，取平均值。 2 2 3 金黄色葡萄球菌生长曲线的绘制 金黄色葡萄球菌培养至对数生长期，按2 接种量加入到含0 2m g m l 木犀草素的 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入3 7 ，1 2 0r p m 摇床培养，每4h 取样一次，用可见 光分光光度计在波长为5 8 0n m 下测定其o d 值，加入等量无水乙醇为对照组，实验重 复3 次，取平均值。以时间( t ) 为横坐标，o d 值为纵坐标，绘制木犀草素作用后金黄 色葡萄球菌的生长曲线。 2 2 4 耐药菌株的筛选 将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌以2 接种于含1 2 最低抑菌浓度( m 【c ) 药 物的培养液中，3 7 培养2 4 h ，继续接种三次，然后测定药物对按此种方法培养过三代 后细菌的m i c 。如果药物作用后的细菌在含更高药物浓度的培养基中仍能生长，则在该 药物浓度中继续培养三代，再测定其m i c ，以后再向更高浓度继续培养，每三代测定一 次m i c 。在培养过程中，如果某一代细菌生长状况不佳，即以前一代的细菌重新接种， 如接种几次仍不生长，即退回低一级的抑茵浓度培养，以后再向更高浓度如前法继续培 养【3 6 1 。 2 2 5 耐药菌株d n a 促旋酶突变位点的检测 ( 1 ) 金黄色葡萄球菌d n a 模板提取 将金黄色葡萄球菌培养至对数期后，取lm l 菌悬液于4 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，弃上 清。向菌体中加入7 0 乙醇1 0 此，混匀后0 c 静置2 0m i l l ，1 2 0 0 0r p m 离心2r a i n ，弃 上清，加入t e 缓冲液( 1 0m m o l lt r i s h c ip h8 0 ，lm m o l le d t a ) 5 0 0 止，2 0m g m l 溶菌酶4 0 止，lm g m lr n a s c3 皿，0 c 放置lh ，并间隔摇晃几次，取出放置一2 0 2 0 m i l l 后，立即放入6 8 水浴1 0r a i n 。取出后加入1 0 s d s5 5 此，6 8 水浴1 5m i l l 。取 出后再加入5m o f ln a c i8 7 皿，c t a b n a c i 混合液7 5 皿，6 8 水浴1 5m i n ，之后放 入- 2 0 3 0m i l l 。取出后加入等体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 充分混匀，1 2 0 0 0r p m 离心5m i n ， 取上清，再一次加入等体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 充分混匀，1 2 0 0 0r p m 离心5m i l l ，取上 木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其作用机制 清后，用2 倍体积的冰乙酸混匀，4 。c 静置过夜。次日1 2 0 0 0r p m 离心5r a i n ，弃上清， 沉淀用7 0 7 , 醇洗涤一次，离心弃上清，将沉淀溶于3 0 皿无菌三蒸水中，4 c 保存备 用。 ( 2 ) p c r 弓j 物 为扩增出g r y a 上的5 0 0b pd n a 片段，利用引物设计软件进行p c r 引物设计，上 游引物为( 5 - 3 ) - r i a c c a g i g 儿气a t ( 配g t g a a ，下游引物为( 5 - 3 ) t c g t t g c c a t a c c t a c c g 。引物由宝生物大连有限公司合成。 ( 3 ) p c r 反应 反应体系： 1 0 x p c rb u f f e r ( 含m 矿) 2 5m m o l ld n t p 0 0 1l u n o f l 上下游引物 模板d n a 5u 7 皿t a qd n a 多聚酶 双蒸水 总体积 扩增条件： 起始变性 9 4 变性 9 4 退火 5 2 延伸 7 2 最终延伸 7 2 5 皿 4 皿 各2 皿 4 皿 0 2 5 此 3 2 7 5 止 5 0 止 5r a i n 3 0s 3 0s 4 5s 1 0 r a i n 3 0 个循环 4 c 保护 ( 4 ) 呵a 测序及序列分析 p c r 产物于l 的琼脂糖凝胶电泳中电泳4 0r a i n ，电压l l ov ，e b 染色1 5r a i n ，于 紫外检测仪中观察结果，确定正确扩增出所需d n a 片段。p c r 扩增产物送上海生工生 物工程技术服务有限公司纯化测序。使用m e g a 软件对p c r 扩增测序结果进行比对分 析，以明确是否有位点发生突变。 2 3 实验结果 2 3 1 木犀草素等黄酮类化合物的抑菌作用 辽宁师范大学硕士学位论文 本文采用牛津杯法比较研究了木犀草素、汉黄芩素、槲皮素、石吊兰素、姜黄素和 异鼠李素六种黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。由表2 1 可见，木犀草素、 槲皮素和汉黄芩素对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，其中，木犀草素表现出最强的 抑菌活性，抑菌圈直径达到1 8m n l 。因此，本文选用木犀草素作为研究对象，进一步针 对其作用金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度和作用机制展开研究。 表2 1 六种黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌的抑制效果 t a b 2 1t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f f l a v o n o i d so ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 2 3 2 木犀草素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度( mic ) 的测定结果 2 ，3 ，5 一氯化三苯基四氮唑( t t c ) 是一种氧化态为无色的常用活菌染料，该染料进 入细胞后，会和活细胞内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的还原产物甲躜。从表2 2 可 以看出，经t t c 染色后，培养基的颜色随木犀草素浓度的增加而变浅，直至无色。表 明木犀草素可抑制金黄色葡萄球菌的生长，且抑制作用随药物浓度的增加而增强。当木 犀草素的浓度大于o 0 9m e , m l 时，培养液呈现其无色，说明无活菌生长，表明木犀草 素浓度为o 0 9m e d m l 时可完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，故其对金黄色葡萄球菌的 m i c 为o 0 9m e , m l 。 表2 2 木犀草素对金黄色葡萄球菌m i c 测定结果 t a b 2 2t h em e n s u r a t i o nr e s u l to fm i co fl u t e o l i na g a i n s t s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 注：“卅”为红色；“抖”为粉红色；“+ ”为粉色； “一”为无色 2 3 3 木犀草素对金黄色葡萄球菌生长曲线的抑制 木犀草素对金黄色葡萄球菌生长曲线的抑制作用结果如图2 1 所示。无药物作用下 的金黄色葡萄球菌在经过短暂的迟缓期后，可迅速进入快速生长的对数期。2 8h 时达到 细菌生长的最高时期 而木犀草素药物组中 5 6 1 。2 4h 时达到细菌生长最高时期，但o d 值仅为0 9 4 8 。2 4h 后被木犀草素作用的 细菌进入衰亡期，比对照组提前了8 小时。 1 与 4 2 ，、 基1 叠 c ) 嚣。暑 k _ ， 容。五 v o 鲁 0 2 o o h4 1 1鞠1 幼l 铋衲狮2 8 h ，3 劾 3 6 h t i m e 国 图2 1 木犀草素作用下金黄色葡萄球菌生长曲线 f i g 2 1 e f f e c to fl u t e , o l i no nt h eg r o w t hc u i v o f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 2 3 4 木犀草素的耐药性实验 细菌耐药性的增强会使由细菌引起的各种疾病的治愈难度大大增加，因此低耐药性 药物的开发对感染性疾病的治疗起到了十分重要的作用。本文对具有抑菌活性的木犀草 素进行了耐药性研究。 ( 1 ) 耐药菌株的筛选结果 为证明作为典型黄酮类化合物的木犀草素的低耐药性，本次实验比较了金黄色葡萄 球菌对木犀草素和喹诺酮药物氧氟沙星的耐药性。按照2 2 4 的方法筛选耐药菌株，结 果显示，木犀草素作用野生型金黄色葡萄球菌9 代后发生突变，产生耐药菌，比在氧氟 沙星的作用下产生的耐药菌晚了三代。野生型金黄色葡萄球菌在含木犀草素或氧氟沙星 的培养基中培育1 2 代后，细菌对木犀草素的m i c 为o 1 2m g m l ，是野生型的1 6 倍； 辽宁师范大学硕士学位论文 对氧氟沙星的m i c 为0 0 3 5m g m l ，是野生型的7 0 倍。由此说明，与喹诺酮药物氧氟 沙星相比，木犀草素不易产生耐药性。 ( 2 ) 金黄色葡萄球菌耐药突变体的测序结果 为了对木犀草素和喹诺酮药物作用下不同耐药