（微生物学专业论文）光增白剂对杆状病毒的增效作用及其作用方式研究.pdf

硕士学位论文 、l 、s t e r st t e s ! s 摘要 巍罐叁赛g 对拜状痪毒具鸯耀效襄僳护作用，能挺嵩虫体对括状病爨敏感 经，这对于扩大秆敬病毒杀虫裁鼢应其j 具有羹凝的意义。巍增自裁对轷敬病毒 的增效作用的机理存在两种推测一种观点认为光增白剂怒通过破坏围食膜结 构的完蹙性，促使瓣多的病毒粒子穿越围食膜两发动感染的；另一种意见认为 毙壤巍裁缝延迟孛弱主痰缨怒懿麓落，挺送瘸毒戆复毒l 繁皴。零文裂躅戳一 半乳糖营酶基因为标志基翻的重组曹稽银纹夜蛾核型多角体病毒 ( a c m n p v - h s p 7 0 l a c z ) 在中肠组织水平上研究荧光增白剂对该病毒的增效作用 及其增效 乍用方式。 兰豁甜菜夜蛾经嗣骚感染瘸毒盼生物测定袭臻：1 必增自裁f b - 2 8 对该 重组病毒具有明显的增效作用。添加荧光增自剂f b - 2 8 的病毒感染3 龄采甜菜 夜蛾幼虫其l c 5 0 从2 3 1 1 0 7 p i b s m l 降低到5 ，1 8 1 0 4 p i b s m l ，增效比值达 裂4 4 8 倍。当痍霉浓褒荛l ，5 5 1 0 7p 1 1 3 m l 瓣，杰曩毒f b - 2 8 貔疆必4 。配 ( r = 0 9 4 3 7 ) ，单剂数的病毒液感染3 龄幼虫的l 1 5 0 为7 0 d ( r = 0 9 7 9 8 ) ，杀虫速 度提高了3 4 3 。 诧夕 ，对于处予不同虫龄的幼虫进行病毒感染时发现：对3 ”幼虫瓣力生 物滚定时，荧光滢巍恭鹃增效 譬掰达饔5 0 * , 4 ，聪对4 羚葫豹供 麦幼虫透霉予溅定， 荧光增白剂的增效作用却不很明盥，仅为1 0 。此结果表明荧光增白剂对不同 虫龄阶段的幼虫增效能力存在较大的差异。 逡羁2 。2 5 1 0 7p i b m l 斡瘸毒悬滚感染3 话、4 0 蘸蘩凌蛾姥虫。瘸攥感染 后的8 h ，1 2 h ，1 6 h ，2 0 h 提取中肠组织，按常舰石蟮包埋切片进行洗涤、透明、 浸蜡、包埋、切片、粘片等操作程序，制成遘续切片，在倒鬣显微镜下邂一进 行观察计数。结粜如下： 翁盔中瑟弱羧鹰基强表达警( 瘸毒在串嬲部位形成熬瘸娃) 数字鬟示：荧 光增臼剂确实可以撬高幼虫对瘸海的敏感性。宓验组幼虫巾肠的报告基阑表达 率( 瘸毒在中肠部位形成的病灶) 嚣明显高于对照组中幼虫中肠的报告熬因表 达攀。照终，安验维中供试幼虫孛肠的缀告基因表达黎均睫 感染时间的延长甜嵫高，但在感染后2 0 h 发宿，供试幼虫巾豚的报告基黼表达 硕士学位论文 _ 、s t e r st h e ) l s 率却有所降低，对此，我们分析其原因可能是由于病毒的感染部位发生了转移。 从瘸海在中肠中澎成的癍灶数爨可戳看出：3 憾，4 0 接釉豹魏菜夜蛾幼搬中 赣篷绥中瘸短蘧蓍惑染鼹舞豹延长逐赣壤多。在摇霹薅蠢痨实验缢孛戆癜慧鼗 目明显多于对照组中的病灶数目。w 见，荧光埔囱荆的添加誉仅可以加快病毒 在中肠组织的感染，避能增强病毒襁中肠组织的艨染能力。可见，对于处于不 民时龄戆供试楚虫接种痪毒对，漆热荧光瑾自裁螈露挺毫病毒在孛瑟组织串靛 巷染能盘。 从病簿猩中肠中形成的病灶部位可以看出，实验组与对照缀的病灶均靠j 髓中 肠的基戚膜，荧光增囱剂鲍加入并不能改变瘸毒猩中肠组织的感染部位。实 验结鬃袭骥，在棼虫躺瘸毒蓑释繇串添热合逶浓漤瓣荧竞增爨裁( 。8 lg m l 5 ) 不会改变病毒在幼虫中肠组织中韵感染部位，却可以提高幼擞对病毒酌敏感 性，增加了病毒毒力。此外，血淋鼹细胞感染观察表明：在幼熙的病毒接种物 串添攘合适浓度的荧搬增鑫裁可黻掇蕙妨虫对病毒静敏感援，产生更多瓣瘸 选。 此外，采用分子探针r 1 8 ( 荧光标记物) 标记病毒囊膜，体”分离中肠上 皮细胞，将标记的病毒粒子与离体中肠i - 皮细胞滟台后保温，痕毒吸附2 h 艨， 遵适捡溺荧建豹变纯寒鼗铡痪毒鞍予与上痰臻憋的融合。簸嚣了艇荧竞耀自裁 是否在膜的融合过程巾存在影响。辩验结栗表躜敛光增自裁影响了病毒与中肠 上皮细胞的融合，荧光增白剂促进丁病毒与中麟上皮细胞的融。 美镰谣：蓍器锻纹岌绶重缀核鍪多袁蒋瘸毒、荧竞缮囱麓f b - 2 8 、 组织切片、膜的融合、分子探针r 1 8 、 硕士学位论文 、s f e r st h e s i s a b s t r a c t i th a sb e e nd e m o n s t r a t e dt h a to p t i c a lb r i g h t e n e r ( o rf l u o r e s c e n t b r i g h t e n e r ) c a l l e n h a n c ev i r a la c t i v i t y , p r o v i d eu v p r o 耗c t i o nf o rn u c l e o p o l y h e d r o v i m s ( n p v l m a d i n c r e a s eh o s ts u s c e p t i b i l i t y t h em e c h a n i s me n h a n c e m e n to ft h eo p t i c a lb r i g h t e n e r i sn o tk n o w n s h a p i r oe t a 1 p o s t u l a t e dt h a ts e l e c t e db r i g h t e n e r i n c l u d i n gm 2 r i n h i b i to ra l t e rt h ec h i t i n o u sp e r i t r o p h i cm e m b r a n ep 轰c r e a t i n gg a p si nt h e m e m b r a n eo rg u tl i n i n ga n dp e r h a p sa l l o w i n gm o r ev i r i o n st op a s sf r o mt h eg u t l u m e ni n t ot h eh e m o c o e l w eu s e dar e p o r t e rg e n er e c o m b i n a n to fa u t o g r a p h a c a l i f o m i c a , m n p v ( a c m n p v - h s p 7 0 l a c z ) t oi n v e s t i g a t et h ee n h a n c i n ge f f e c t so f f b - 2 8o n p a t h o g e n e s i s i n m i d g u t , m o r t a l i t ya n dt i m e t od e a t hi nl a r v a eo f s p o d o p t e r ae x i g u a s t u d i e sw e r ed e s i g n e dt od e t e r m i n et h ee f f e c to ft h es e l e c t e do p t i c a lb r i g h t e r f b - 2 8o nt h ei n f e c t i v i t yo ft h ea c m n p v - h s p 7 0 i a c z t h ev i r a lp r e p a r a t i o nw e r e d i l u t e di nw a t e r ( 1 ) a n da p p l i e dt ot h es u r f a c eo fa r t i f i c i a ld i e t t h ea d d i t i o no f t h e f b - 2 8t o t h ev i r u si nt h e b i o a s s a yg r e a t l y e n h a n c e d i n f e c t i v i t y o ft h e a c m n p v - h s p 7 0 l a c zo ff b 一2 8 t ot h ea c m n p v - h s p 7 0 1 a e z ，r e d u c e dt h el c s o v a l u e sf r o m2 。3 1 1 07 p 毽p e rm lt o5 。1 8 x l 栌p 糙s 趣la n da tt h eh i g h e s tv i r u s c o n c e n t r a t i o n1 5 5 1 0 7p i b s m l ，t h e l 1 5 0v a l u e sw a sr e d u c e df r o m7 0 dt o4 6 d s u g g e s t i n gt h a tt h el a r v a eo fs p o d o p t e r ae x i g u ad i e dm o r eq u i c k l yw h e nf b 一2 8 w e r ea d d e dt ot h ev i r u s 骶1 el a r v a eo f s p o d o p t e r ae x i g u ai n o c u l a t e da sn e w l ym o l t e df o u r t hi n s t a r s ( 4 ”s ) a n da tv a r i o u sh o u r sa f t e rm o l r i n g ( 3 1 6 s ) ，w es a c r i f i c e dl a r v a ea tv a r i o u st i m e i n t e r v a l sa f t e ri n o c u l a t i o nt op r o c e s st h el a r v a ef o rl a c ze x p r e s s i o ni nm i d g u tb y 璐i 藏gt i s s u es e c t i o nt e c h n i q u e so ne a r l yp h a s ei n f e c t i o n 。o p t i 蕊b r i g h t e n e r sc a n t c h a n g et h ep a r to f i n f e c t i o n ，b u ti ti m p r o v e sv i r a le n h a n c e m e n t o n p a t h o g e n e s i so f m i d g u t w ed e t e c tt h ed i f f e r e n t i a t i o no f t h ec o n t r o la n dt h et e s tt os t u d ys y n e r g i s m o fo p t i c a l b r i g h t e n e r s t ov i r a le n h a n c e m e n ta n di t sm e c h a n i s m s f i x e dw i 也 g l u t e r a l d e h y d e ，s t a i n e dw i t hp h 7 4 p h o s p h a t eb u f f e r e dx - g a ld y es o l u t i o n ， i i i 硕士学位论文 、s r e rst h f j ：、 o b s e r v e db yr e v e r s em i c r o s c o p e t h er e s u l t sa r e 黼f o l l o w ：t h ep e r c e n to fl a r v a e e x p r e s s i n gl a c zi nm i d g u ts h o w e dt h a tf b 一2 8i m p r o v e d t h es e n s i t i v i t yo fl a r v a et o v i r e s 。t h ep e r c e n to fl a r v a ee x p r e s s i n gl a c zg r a d u a l l yi n c r e a s e df o rv a r i o u st i m e p o i n t sa f t e ri n o c u l a t i o n ，b u tt h ep e r c e n to f l a r v a ee x p r e s s i n gl a c zr e d u c e da f t e r2 0 h o u r s p o s ti n o c u l a t i o n ，w et h o u g h t t h ei n f e c t i o ns p o t st r a n s f o r m e d t h en u m b e ro ff o c ii nm i d g u ts h o w e d ：l o c ib e c a m em o r e 话也t h ed e l a yo f i n f e c t i o nt i m e s 。t h ef o c iw e r em o r ei nc o n t r o lt h a ni nt e s t 猢l i e hs t a t e dt h e a d d i t i o no fo p t i c a lb r i g h t e n e r sf a s t e n e dt h ei n f e c t i o n so fv i r e sa n de n h a n c e dt h e a b i l i t y t 沁l o c il o c a t e dt h eb a s a li nm i d g u tn o ti nc o n t r o lb u ta l s oi nt e s t 。t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ea d d i t i o no f o p t i c a lb r i g h t e n e r s d i d n t c h a n g e t h e s p o t so f i n f e c t i o n b u ti m p r o v e dt h ev i r a le n h a n c e m e n t i na d d i t i o n ，i n f e c t i o no fh e m o l y m p hc e l l s h o w e dt h a to p t i c a lb r i g h t e n e ri n c r e a s e d s e n s i t i v i t yo f l a r v a e t ov i r u s ，f o r m i n gm o r e 岛e i ， i na d d i t i o n ，w ed e s i g n e dat e s t ：t h em i d g u tw a sr e m o v e df r o ms p o d o p t e r a e x i g u a l a r v a ea n dw a sc u tl o n g i t u d i n a l l yi n t oh a l v e s ，t h em i d g u te p i t h e l i aw e r e c l e a n e da n dd i g e s t e dw i 氇d i s p a s e i i , t h ep e l l e t e dc e l l si ng r a c em e d i u m 磺穗7 f b s s u p p l e m e n t e dw i m 1 0 0 u n i t s m lp e n i c i l l i n 1 0 0 u g m ls t r e p t o m y c i nw e r ec o o l e d a n dt h e n s u s p e n d e d i nr 18 - l a b e l l e d v i r u s a l i q u o t s o fc e l l sw e r em i x e d o 1 5 m g m l f b 2 8 a n dk e p ta t4 x 3f o r3 0 m i n , f u s i o na s s a y sw 镪_ cc o n d u c t e d ： f l u o r e s c e n c e 萌湛sm e a s u r e di m m e d i a t e l ya tr e g u l a rt i m e - p o i n t sw i t hf l u o r 鹳c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t e rw i t ha l le x c i t a t i o nw a v el e n g t ho f5 6 0 u ma n d e m i s s i o nw a v e l e n g t h o f5 9 0 n m t h e p e r c e n t a g e s o fm e m b r a n ef u s i o nw a s c a l c u l a t e d b y m o n i t o r i n g f u s i o n u s i n gt h er 1 8a s s a y , w e f o u n dt h a tt h ef l u o r e s c e n tb r i g h t e n e r2 8 i n f l u e n c e dm e m b r a n ef u s i o no f v i r u sa n d m i d g u te p i t h e l i a c e i l s k e y w o r d ：r e p o r t e rg e n e r e c o m b i n a n to f a u t o g r a p h a c a l i f o r n i c a m n p v ( a c m n p v - h s p 7 0 l a c z ) 、f l u o r e s c e n tb r i g h t e n e r 、t i s s u e s e c t i o nt e c h n i q u e s 、 m e m b r a n ef u s i o n 、o c t a d e c y l r h o d a m i n ebc h l o r i d e ( r 1 8 ) 、 i 7 颤士学位淹文 i a sf e r sr e $ t s 前言 一、杼状病毒作为杀虫剂的季| 】粥 ( 一) 、秆状病毒简奔 杆状病毒是节肢渤物专性病原瘸毒，其宿主范围主要集中于昆虫纲的鳞 翅霸，谯双翅目、膜翅目、鞘翅鼹与毛翅目昆嫩中也有报道噱杆状病毒隶 | 薹予释、茯病毒辩( b a c u l o v i r i d a e ) 它色蕹嚣令溪，繇孩黧多角落疯毒瓣 ( n u c l e o p o l y h d r o v i r u s ，n p v ) 和颗粒体病毒属( g r a n u l o v i r u s ，g v ) 【2 】。根据 一个囊膜内包被核衣究的多少，可将核型多角体病毒分为两个亚属：一个魑 单衣壳烈孩多受体痰凑( s i n g l e a p s 堪n u c l e a rp o l y h e d r o s i sv i r u s ，s n p v ) 或攀 粒包埋棱麓多角俸瘸毒，另一藩是多农壳型核多麓体病毒( m u l t i c a p s i d n u c l e a r p o l y h c d r o s i sv i r u s ，m n p v ) 或多糙包埋核型多内体病毒。前者指每一个瘸簿 粒子含荫一个核衣壳，即囊膜内包被一个核衣壳代表种为家黉核型单衣壳型 核多蹙舔瘸毒( 丑掰s k p v ) ；惹者拨每个瘸毒粒予含有多个竣凌壳，帮多令孩 衣壳基鬻一个囊膜代淡种为苜蓿锻级多衣壳型核多角体病毒( a c m n p v ) 。秆 状病毒的基因组为双链环状d n a 分子，d n a 以超双螺旋形式压缩包装谯杆 状壳中，这秘抒状粒予称之为核袭蠢，核袤壳外技i 錾类囊臻，被有囊膜的棱 衣壳帮为病毒粒予。瘸毒粒子葑阕在由蛋自震形成豹包含体审。释袄病毒靛 一个显瓣的特征是具肖双向复制周期，产生两种具有不同状态、功能的袭澄 病毒。即出芽型( b u d d e d v i r u s ，b v ) 朔包含体来源越病毒粒子( o c c l u s i o n d e r i v e d v i r u s ，o d v ) 或多受抟来漯鍪滚毒粒子( p o l y h e d r a d e r i v e dv i r u s ，p d v ) 。凝 状病毒的感染分为两个阶段或( 两个时期) ，第个阶段o d v 感染中肠上皮 细胞，瘸毒复制增殖后产生出芽趔子代病毒粒子( b v ) 。大多数鳞翅目鼠斑 孛肠上皮细胞只产生敬芽型病毒救予。抒状病毒戆染周瓣的繁二个酚段是b v 侵染琵斑其它组绥( 繁二次感染或继发感染) 魏阶段产生两耱状态的病毒褴 子，早期产生出芽型瘸毒粒子，感染晚期产生o d v 即多角体。o d v 不自& 侵 染其它筑织，它只能在虫体之间传播感染ib v 可在组织细胞之间传递感染。 努凌瘸繇豹主要感染途径是口驻感染。动虫塞然状态下懿惑絷，一般囱予幼 j j 士堂垃论文 、1 、s i t rsr i s l 虫食下含包含体的饲料丽引起的，进入中肠的包含体受到肠道消化液作用而 被降解，包埋其中的瘸獭粒子被释放刹肠管内，瘸簿粒子附着柱柱状上皮的 镱绒毛突起处，瘸毒粒予囊骥与细胞融合，核表壳遴入缨照质内，然后迁移 到细胞菝，虢滗后释放d n a 。在缩藏孩肉，病毒蒸霞表这。d n a 复裁，病 毒粒子装配，新装配的梭农壳在细胞袋面出芽获得凝膜( 或在核膜处获得囊 膜，在质膜处更换) 。b v 病毒粒子穿过基底膜后进入血体腔。谯敏感组织中 重复这一复渊增殖过程势产生o d v 帮氛舍俸【3 1 。 ( 二) 、秆状病毒杀虫剂 随着化学农药的长期和大量的使用而引起的农药的残留和环境的污染、 瘸虫豹抗药性和在猖獗润题的出现，生物防治已经越来越受到人们的关注和 重撬。骧农攮生态系统“逶者生存”、“謇然平餐”灸理论豹玺秘静治若施， 越来越被人们深刻地理解和广泛的应用。人们逐渐地摆脱了防治植物病毒虫 害完全依赖化学农药的观点，已把生物防治纳入到瘸虫综合治理的体系之中， 势残受其中滤重要缀残郡分。轻菝病毒 乍为生物杀窳熬豹磅究、始发、与应 用已经有很多年盼历史了，并且在实践中取得良好的效果1 4 l 。 杆状病簿之所以备鬣关注，原因程它具有较高的毒力，能程自然界中形 成流行瘸，舆有持久控制害虫的能力。同对，它具有专一性，所以不会破坏 生态平衡，蠢污染，其蠢安全毪。嚣痰病毒终秀农转害变霹羹黧鬻蠢翡控裁 手段，具有些独特的优点：宿主特辩性高，能杀死害虫而不影响害虫的天 敌；引起主黉害虫的再猖獗与次要害胀上升等可能性较小；不会污染环境， 鼹久奎安全，因为琵虫瘸毒是垂然赛零寒存在豹，褥溺是抒揍痪瀑砖淫虾、 牡蛎、蚌、鬃没有致瘸饿，对两栖类、鱼类、鸟类及哺乳动耨亦无任俺中毒 性、致病性躐异常变态反成；昆虫瘸礴使用后作用明显，不仅痫虫本身就是 病毒生产的“小工厂”，籁且有些壤况下，病毒还可缀卵传染，杀灭次代害虫， 瓣害虫懿天敬、畜益豹熬塞窝又俸元鬻。这是纯学农药瑟燹法稳魄戆；琵虫 病毒制剂生产工艺不复杂，使用方便，成本低廉，适于推广，谯害虫生物防 治方面越来越受到重视。但任何事物都有其两面性，生物农药的作用方式是 逶过昆虫感焱疾癌，在避斑体内有一个生病的过榛。楣毙纯学农芬立竽觅影 2 硕士学位论炙 m a s 了e r st jf s j s 的效果来说，它的宿童域窄，毒力较低，杀虫周期长，受环境影响、易失效 等因素限制了杆状病毒杀虫剂的大规模使用，使得杀虫剂推广起来有相当难 度【5 j 。能森递过病毒基戳骚究，改变其甄有豹生携特性，从聪获褥更挽良熬 杀虫裁产赫昵? 这不囊怒摆在我国，也是摆在氆羿越前鹣一邋难题。随着释 状病毒分子生物学及撼因工程技术的发展，科学家们提出了对野生型病毒进 行遗传改良，构建高效广谱安全的蘸组病毒杀虫剂的新策略。例如通过病瓣 基嚣缀豹突交或在萋嚣缀孛导入毒予魏显垒锭瀣秘翔速死亡豹激素、酶、芬 云金杆菌杀虫晶体蛋白以及对昆虫专性麻痹素编硝基因，均可摁离杆状病毒的 杀虫效果 6 - g 。同时，人们还尝试了用不同的方法来增强杆状病毒杀虫效果， 班扩大实瘸牲。铡翅，将籽状瘸毒与其它的化学农药或生物农药混合使用； 或蕊入一黧生物、纯学物质作为謇 状病毒增效因予，将b t 与n p v 混震，g v 和n p v 混合可以增强杆状病毒的感染性【9 ，l 叭。最j 琏几年来，人们研究发现了 一类化学物质，当它们与杆状病毒同时存在时，能极大增强瘸毒的毒力，并 笼奏效夔镰护杼浚薅毒受受紫癸线辍射豹豢岱。这类懿矮裁怒荧光增叁裁躐 光增自剂。光增自剂能吸收紫外光并将其转化为w 觅光。在生物领域，它凝 早作为细胞的活体染色剂使用【“】。人们最初发现光增白剂能作为杆状病毒的 保护裁，防止紫乡 线对箕辐射的伤密 1 2 。以囊的谤究显示，许多光增自剂还 能强燕靛罐强病毒静熬染往 l ”。 二、光囱剂对杆状病毒的增效作用 光增囱荆或荧光增皇剡普遍应耀予含成洗涤荆、纺织、遗纸、塑料工她 等。它盔舞无色，憩爱甜霹觅霞先，瓣对还驻墩l | 雯目竞孛静繁外线 嚣发瓣波 长为4 1 5 4 6 6 n m 的荧光。这类物质能通过氢键绐含到b 构型的纤维聚合物上 【1 4 1 。 六卡簪我镪，d a r k e n “i 逐弱走臻舀刘不援戆逐按手缨蓥瓣绥蕤壁蠢盈戆 穿越细胞髓并用于活体染色，此后光增白剂被用予生物学系。m a r t i g n o n i 帮 i w a ie 1 2 1 首先将荧光增囱剂用于黄杉簿蛾n p v ( o p n p v ) 的研究，光增白剂能 雩# 为保护潮，防止紫辨线对o p n p v 的辐射伤害。1 9 9 2 年。s h a p i r o 【l 那首次缀 颐士兰位；j 囊 u 、c 1e r 、j 、 遭荧光增自剐能极大静增强n p v 的感染性，并因此获得专剃( 专利号n o 、5 ， 1 2 3 ，1 4 9 ) 。他们用二苯乙烯类光增白剂和舞毒蛾n p v 混合喂食赢毒蛾幼虫， l d n p v 的感染性大大增强。l c 弱埴从1 8 ，0 0 0 p i b s m l 降至1 0 4 4p i b s m l ， 减少了9 9 9 ；在所瑁静簸商病毒浓壤l 1 0 6 p i b s m l 时，t 5 0 从1 3 。9 天降 至7 1 天。s h a p i r o 【l 卅等选用了2 3 种荧光增白剂。结果有1 7 种能掇供很好的 防紫外线辐射的保护。7 5 的光增白剂能令n p v 的活性保留7 0 以上，3 5 貔走增皇裁穗疆黉1 0 0 戆绦护。h a m m 嘲豹磅究显零建灌鑫裁对攀遗囊夜绶 县有更强的增效作用。他们用o 0 1 的t i n o p ml p w 和s f m n p v 混合喂食草 地贪夜蛾四龄幼虫，l c s 0 值为o 0 1 6 2 3 3 6p i b s c u p ，而s f m n p v 加水混合 啜食草地贪投蛾同龄幼虫的l c 5 8 值为1 8 5 4 ) 1 0 p m s c u p ，后者怒翦者豹 1 6 4 3 0 3 嵇。s h a p i r o t 7 1 等研究7 竞臻自弃l 对鼹释释狭病毒兹增效据用，结 果显示光增内剂t i n o p a ll p w 对五种栉状病毒的增强效果依次为 h z n p v a m f n p v h a m n p v g m m n p v a c m n p v ，光增白剂对不同的n p v 添性键遴功黪其毒差异。v a i l 凋等瘸巍漤自裁嚣驰撼l p w 器a f m n p v 混合 喂食四种夜蛾科昆虫，即烟蚜夜娥、甜菜夜蛾、粉纹夜蛾和美洲棉铃虫。l c s o 值减少了6 5 5 9 2 6 ，l t 5 0 值减少了5 2 4 。烟蚜夜蛾、粉纹夜蛾对 - a f m n p v 熬敏感性最强，褥稳菜夜蛾敏感性最差。翳外，他们迸发现了光增 白帮增效伟掰的最适浓度为o 2 5 l ，浓度薏o 0 1 0 1 拜重笼襞显魏瑷 效作用浓度过高则会抑制昆虫的进食。d o n g h t e r t y t g l 等研究了光增囱剂对o b 、 p d v 和e c v 的影响，发现光增白剂m 2 r 能增强p d v 的感染性，并能令p d v 保持活往；感染5 天磊，耀m 2 r 处理：；篷豹p d v 戆溪搜是来处理鹣p d v 涯链 的3 0 ，0 0 0 倍：未用m 2 r 处理的要获得l c s o 僵需1 0 s o b e c u p ，丽处理过酶 只需2 8 1 0 4o b e c u p 。此外，m 2 r 还能增强胞外裂病毒粒子e c v 的感染性a 一般情况下，e c v 不能掰服感染或感染率极低，但筠1 鹩荧光增自剂混合 使雳时感染後极大豹增强；不热荧光罐自帮露大予1 0 7 p f u 豹e c v 篷不髭获褥 l c 5 0 值，而岛光增白剂混合使用时4 6 7 p f u 的e c v 即可得到l c s o 值。m 2 r 必 须与p d v 一同使用才具有增效作用。在实验中他们还发现m 2 r 不参与o b 豹溶瓣，嚣基宅不会改交o b 窝p d v 戆理毒| 二性蒺。毙增鑫剂不投缝增强抒炊 项士掌往西走 、l s t e r si j i ；：s s 病毒的毒力，而且可以提高虫体对瘸海的敏感性。1 9 9 4 年s h a p i r o t 强】研究了光 增白剂p h o r w i s e a r 对瓣毒蛾同源和异源的增效作用，发现荧光增白剂增强了 舞毒蛾幼虫对a c m n p v 豹敏感性。螽然状态下，异源病毒a e m n p v 不感染 该幼虫，毽a c m n p v 与先增自裁混含粮食该虫弼检测舞病毒京虫体中复制。 光增自剂的增效作用熟有普遍性。宦不仅能增强n p v 的感染性，还能增强 c p v 、e c v 的感染性，并且可能存谯相似的作用机制。 零实验室磅究发瑷毙增皇裁对瓣菜褒蛾n p v ( s e n p v ) 数及b t 遣毫瑷效 作用。徐莉【2 0 1 等测试t3 种荧光增囱剂t i n o p a l l p w ，v b l 和j d - 3 对苏云众 杆菌杀虫刹对棉铃虫初孵幼虫毒力的影响，并检测到荧光增自剂v b l 作为後 裁在b t 爨紫丹线照射融的光保护功效。结果表明这3 种二苯乙烯类荧光增幽 裁良l o g k g 与b t 复聚篱静l e 5 0 谴与不如荧光穗鑫裁鲮b t 静l c s o 籀魄，冀 增效比假分别为：1 2 3 、1 4 9 和2 0 0 。这说明3 种荧光增白剂对b t 杀棉铃斑 的活性商不同程度的增效作用，而飘复混剂( 1 0 9 k g 荧光增自荆v b l + b t ) 税 紫癸线楚璞8 枣薅爱，冀杀虫活毪织保持7 0 蔽上，说羁了荧免增自裁v b l 是一种好的b t 光保护剂，能提高b t 抗紫外线的能力。 郭君慧【2 l 】等研究结果表明t i n o p a ll p w t i o n p a lu n p a , g x ，v b l 以及 c b s x 对芹菜夜蛾( s y n g r a p h af a l c i f e r a ) n p v ( s f a n p v ) 、o b 、p d v 、以及e c v 均育朝嚣翡瑶效佟羯。s f a n p v 孛添翔荧蠢增鑫麓磊，臻铃敷幼虫懿甄亡率 明显增加，其l c 5 0 值4 x 1 0 6 p i b s m l 降到1 1 x 1 0 p i b s m l ( 1 t i n o p a l l p w ) 、 8 0 3 x 1 0 4 p i b s m l ( 1 v b l ) 、9 8 2 x i 0 4 p i b s ，m l ( i c b s x ) ，增效作用简 这2 6 。2 6 2 1 8 薅，鞠驻提裹了s f a n p v 毒力。鬻辩杀虫速度撼蔫了。班弱毯 从5 0d 降到3 6 d ( 1 t i n o p a ll p w ) 未加荧光增囱潮的p d ve l 服染3 龄幼搬， 浓度高逃1 5 6 x 1 0 9o b s m 1 幼搬死亡率也未达到5 0 ( 实际为3 6 1 7 ) ， 即未测缝l c 5 0 值。藤加有1 v b l 、c b s - x 静p d v 口服感染同龄幼虫，幼 虫的死亡率瞬显罐熬，势溺蠢爸爨懿l c s o 僮，势麓兔7 7 2 x 1 0 7 0 b s m l 、5 。5 6 1 0 70 b s m l ，其增效倍数分别为3 7 5 6 2 倍和5 2 1 3 0 倍。此外，添加荧光 增白剂t i o n p a lu n p a ，g x ，v b l 、c b s - x 的e c v 感染5 b i 细胞，感染滴廒明 显增嘉嚣，爱浃在t c i d 5 。篷豹变纯上。芽菜夜蛾竣激多角钵病毒e c v 感染5 8 1 5 士学位论丈 、i sr e rbi l i 。j j 、 细胞的t c i d 5 0 值为l o - 7 孙4 ，而当加入2 0 u g m l 光增自剂v b l 、c b s x 、t i o n p a l u n p a g x 后再感染同种细胞，t c i d 5 0 值分别为l o 琅3 7 5 、1 0 7 9 0 6 、1 0 8 6 5 ，e c v 感染滴度增加。 朱蓉田1 等研究结果表明：荧光增白剂m 2 r 添加到含有s f a m n p v 的饲料 中可提高幼虫对病毒的敏感性。用l 的光增白剂喂食初孵幼虫三龄时感染 s f a m n p v ，结果显示，喂食幼虫含1 m 2 r 和1 0 4p i b s m ls f a m n p v 的食物， 幼虫死亡率达到9 3 ，而对照组的死亡率7 3 。 三、荧光增白剂对杆状病毒的增效特点 荧光增白剂对杆状病毒的增效作用有以下特点：( 1 ) 荧光增自剂的增效 活性包括提高病毒毒力和加快杀虫的速度。( 2 ) 荧光增白剂在增效作用范围 上具有广谱性，而增效程度上存在一定的特异性，即在一种寄主病毒系统 中有活性的荧光增白剂在所有的系统中均有活性，但同一荧光增自剂在不同 的系统中活性不同。如b l a n k o p h o rh r s 在甜菜夜蛾s e m n p v 中活性最高， 而在舞毒蛾l d m n p v 中，其活性低于b l a n k o p h o rb b h 、t i n o p a ll p m 、 b l a n k o p h o rp 1 6 7 和b l a n k o p h o rr k h 。相反，那些在某一系统中不起作用的荧 光增白剂在其它系统中也无增效作用，如b l a n k o p h o rb s u 、b l a n k o p h o r d m l 和b l a n k o p h o r l p g 在云杉卷叶蛾一s f n p v ，舞毒蛾- - l d m n p v ，甜菜 夜蛾一s e m n p v ( o t v o s a n d l i ，1 9 9 9 ；s h a p i r oa n d a r g a u e r , 2 0 0 1 ) 中均无 增效活性。荧光增自剂不仅能增强核型多角体病毒的感染力，而且也提高质 型多角体病毒的感染力。( 3 ) 荧光增白剂的增效活性有最适合的浓度。对 t i n o p a ll p m 的研究表明，其增效活性最适浓度为o 2 5 l ，浓度为 o 0 1 0 1 无明显增效作用，浓度过高则抑制昆虫进食( v a i l ，1 9 9 6 ) 2 3 o 当前已经发现的对病毒有增效活性的荧光增白剂结构相似，均为二苯乙 烯类，可见它们增效活性的不同并不是由于结构上的明显差异造成的。一般 含磺酸基越多，荧光增白剂的水溶性越高，但这并不与增效活性相关。因在 甜菜夜蛾s e n p v 中，增效活性最高的荧光增白剂b l a n k o p h o r h r s 有2 个磺 酸基，而无增效活性的b l a n k o p h o r b s u 有6 个磺酸基；在舞毒蛾一l d m n p v 6 硕士学位淹文 m a s t e r 1 st h l s j s 中，活饿竣高的荧光增囱剂具有2 个或4 个磺酸藻。由于有增效活性的r 熬 包括甲胺( b l a n k o p h o rh r s ，b l a n k o p h o rr k h ) 或二( 羟乙基) 氨熬 ( b l a n k o p h o rb b h ，b l a n k o p h o rp 1 6 7 ) ，两无活性豹荧必壤鑫剩含苯胺 ( b l a n k o p h o rl p g ) 鼓吗秣( 1 , 4 - 氮氧六嚣) ( b l a n k o p h o r d m l ) ，敲荧免 剂r 基的不同可能与增效活性相关。上述荧光增囱剂的p h 在6 9 到9 5 之间， 因而p h 值大小与增效活性无关( s h a p i r oa n d a r g a u e r ，2 0 0 1 勰1 ) 。 露、兔瀵螽剂对籽挟病毒麓增效俸霜橇涮耢突 有关光增白剂其对杆状病毒的增效机理研究较少。研究靶标集中在昆嫩 的中肠水平上。s h e p p a r d l 2 5 】等认为荧光增白剂t i n o p a ll p w 对l d m n p v 的增 效终楚哥怒与其篌孛璐擎疆蓬下终蠢关。毽s 颦粒等阁( 2 0 0 0 ) 饭燕孛酝p 联 值下降怒病毒感染中肠细胞的结果。w a s h b u r n t 2 h 蒋( 1 9 9 8 ) 则认为p h 值下 降是因为荧光增白剂限止了被病毒感染的中肠上皮细胞的脱落，这是荧光增 是裁的主攫原因p - s i 。 动镌溃纯系统其鸯一耱重要的保护俸系，鞋避凳一些耪瑾、纯学醚及生物蠢 面的因素造成的损伤。昆虫的中肠怒分泌消化酶、消化食物和吸收养分的藏 要部位、其结构自内向外为围食膜( 昆虫中肠所具有独特的保护结构) 、肠蹙 绥魏蒺、疯貘、繇瓢、缀簸。瑟壁绦魅毒桎装、睾l = 浚、再生秘来分纯缨旋转 别具有分泌消化酶、调节血淋巴中钾离子的浓度、更新细胞簿功能。而圈食 膜起着保护中肠上皮细胞免遭食物通过时造成的多种伤害以及抵抗微生物的 入侵鹊作麓，并且能让离分子豹营养魏质通过3 0 1 一释爨觅谈爻荧光增宣裁逮避黻建感染病毒鼢孛酝上皮绥缝脱落瑟这巍 增效作用的。s h e p p a r d t 2 5 】等在研究光增白剂对舞海蛾病毒增效作用时，发现 喂食l d m n p v t i n o p a ll p w 4 8 h 届，幼虫中肠p h 值由1 0 3 降楚8 5 ，虫重爨、 产粪量教及冬营葵臻数明显下簿，擞甄亡率鞠显上舞，嚣盘游愁斌无 壬德的 变化。光增白剂和n p v 或c p v 混含后分别感染入工锶糕喂食的幼虫和橡橱 叶喂食的幼虫，结果发现两种饲料喂养的虫子的感染效果一样，p h 的降低程 度与荧光增自裁豹用激有关。s h a p i r o 认为中肠p h 值豹变化憝病毒感染中肠 ， 硕士掌壕论文 l ，t s i 氇st h e s s 细胞造成的，因为中肠p h 是由1 0 泵调节的，而k + 在柱状上皮细胞和榔状 上皮细胞中穿梭。电镜观察感染4 8 7 2 h 后，大囊子代l d m n p v 出现在中脑 柱欹上皮缅藏孛，瘸毒粒子在牵灏柱攮土疫缁藏孛静复翱毅燮了k + j l i i 鬣，破 坏了杯状细胞中的k + 的运输和电化学梯度。所以，p h 假会下降。假是 w a s h m a n l 2 7 1 等认为p h 值的下降魑因为荧光增囱剂阻止了感染的上皮细胞脱 落恧造成戆，这方避荧光增自裁堰效斡主要壤因。镳们魏建了a e m n p v h s p 7 0 l a c z 重组病毒，然后和荧光增自裁在幼虫蜕皮后不湖对兢接种粉绞夜 蛾和烟蚜夜蛾四龄嫩，结果显示荧光增白剂m 2 r 和重组的a e m n p v 混合接 种的4 m 的烟蚜夜蛾嚼显具有更多的瘸灶，接耪6 h 后l a e z 开始在中肠上皮 绥魏串送行表达，嚣对照组不表达，壹裂1 4 h 菇，才秀始套气管蘩蕤孛表这。 这与a d a m l 31 j 等的观察结果一致，他们发现加入m 2 r 后l d m n p v 的子代病 毒首先在舞毒蛾幼虫中肠的上皮细胞中产生，而对照组中没有明显的感染迹 象。w a s h r a a n 等认瓷造藏这一瑷象翦只有嚣个羰困，一是被感染的中瑟上疫 缅骢鹣落，另一个鞭飘是病毒最先感染鹩是潮蚜夜蛾酶气管上皮缅魏中，第 二种可能不成立。因为气管与肠脓并不直接相通，而且m o n s m a 0 2 1 等邑证明 病毒感染中肠以外的部分依赖于g p 6 4 的表达，g p 6 4 是b v 特肖的