（有机化学专业论文）两类含多芳基氨的酰胺化合物的合成及生物活性研究.pdf

摘要 酰胺类除草剂是一类具有多作用靶点性质的农用化学品【1 1 ，在现代农田化学除 草剂中占重要地位【2 1 。其作用机制主要包括抑制脂肪和脂肪酸的生物合成【3 j 、抑制 植物光合作用的电子传递【4 】、干扰植物体蛋白的生物合成和抑制细胞分裂p 6 j 、影响 膜完整性【7 8 一】、以及可能抑制植株的呼吸作用等多种作用方式。在我们的前期工 作中，我们通过基于d 1 蛋白酶的同源模建和虚拟筛选，获得了一系列可能以d 1 蛋 白酶为靶标的先导结构化合物分子结构信息，其中，理论预测含多芳基氨的酰胺类 化合物具有较高的生物活性。 d l 蛋白酶是d 1 蛋白前体的加工酶，其作用是剪切d l 蛋白前体c 一端肽链形成成 熟d 1 蛋白，用于植物光合系统的组装。近年来现有的研究表明，由于d l 蛋白酶在 植物中分布量只有d 1 蛋白的1 左右，与当前广泛使用的抑制d l 蛋白的除草剂( 如西 玛津、阿特拉津、敌草隆等) 相比，d l 蛋白酶被认为是一个优异的广谱除草剂的作用 靶标。开展以d 1 蛋白酶为靶标新型除草剂的研究工作，对于创制新型除草剂品种、 满足我国粮食作物安全需求将具有重要意义。 本文是在对d l 蛋白酶的同源模建和虚拟筛选基础上，设计合成了两类含多芳基 氨的酰胺类先导结构化合物，并且进行了活体生物活性测试和基于d 1 蛋白酶的离 体生物活性研究。主要工作内容如下： 1 合成了2 一苯基3 对氨基苯基丙烯腈及其酰胺衍生物4 个、2 一苯基3 间氨基苯 基丙烯腈及其酰胺衍生物8 个，这1 2 个酰胺衍生物未见文献报道，其分子结 构经过1 h 很，m s ，r 进行了确认； 2 合成了未见文献报道的2 一苯基3 对氨基苯基丙酸及其酰胺衍生物1 个，其分 子结构经过1 h 偶，m s ，r 进行了确认； 3 对所有合成的目标化合物进行了活体除草生物活性的初步测试，发现大多数 日标化合物在1 0 0p p m 时对双子叶植物油菜和单子叶植物稗草均具有明显的 生长抑制作用，然而，当化合物浓度在1 0p p m 时，这些化合物的抑制活性 下降到2 0 0 之间。同时，对这些化合物进行了杀菌活性测试，结果显示 部分化合物对部分植物病菌具有较好的抑制效果； 4 以d 1 蛋白酶为靶标，以d 1 蛋白酶前体c 端2 4 肽为模拟底物，采用高效液 相色谱法，测定了本工作合成的2 个酰胺类化合物对d l 蛋白酶的抑制活性， 获得其抑制常数局分别为8 8 肛1 0 1 l 1 和5 2 肛m 0 1 l 1 ，初步验证了这些酰胺 类化合物的除草活性来源于对植物d 1 蛋白酶的抑制作用。 关键词：酰胺类除草剂；d l 蛋白酶；抑制剂；合成；生物活性 a b s 童r a e 耄 加n i d ek 鳓i c i d e sa 心ac l 弱so f 蛐l e - t a r g e td i 】僦t e dh e f b i c i d e s 觚dp l a y 题 趣l p o n a n tr o l e 斌n o w a d ，sc o m m e 粒i a la g r o c h o 融i c a l s 。t h e 蠹e 而i c i d a lm e c k h 矗s 礅so f a m i d eh 衲i c i d e sm a i n l yi n c l u d em ei i l 址b i t i o no fm eb i o s 妯e s e so ff a ta i l df a 欹ya c i d s i n l l i b i t i o no f 娃l ee l e c 心o n 饥m s f 打i np h o t o s ) ，l l t l l 麟i s ，洫t e r f e r e n c eo fm et h eb i o s y n t l l e s i s q f 婶强乏泌e 撖sa 鲢e e l l 感诚亟。鞋，甜甄蛀o no f 妞娩蓼旋。疑o fe e l h 砖皴m 锄心r 被e ，a 建d p r o b a b l e 娥b i 谯0 no f p l a l l tr e s p i 嘣i o i l ，e 比证o l l rp r e 、噍o i l sw o 旅，w eo b t 越n 甜as 甜e so f l l i t sc o n c e n l i n gm el e a dc o m p o u n d st a 唱e t i i l gd1p r o t e a s e a m o n g 也e m ，t w oc l a s s e s0 f m u l t i 羽y h 【i i l e sa l l d 缓e i r 毅虹d ed 撕v a t i v e sw c 童c h o s e na s 磕呛l e a dc o l ￥攀o u n d sl - o r d 嗽嫩c a ls y 致氐s i s ，越心t h e s ee o 豫p o m d sw e 糟也e o r e 蛀c a 薹l yp r e 蠡c 斌t oh a v e 糙豳 i l 吐曲i t i v ee f r e c t st od1p r o t e a s e d lp r o t e a s ei s 钍l ec a 内o x y lt e m l i n a lp r o c e s s 洒ge n z y m ef o rp r 优u r s o rd lp r o t e i n i t s r o l ei se u 技i n go 娌t h ec t e r 嫩i n a le x 毒e n s i o no fp o 玛节e p t 主如o fm ep r e c u 勰o rdlp r o t e i nt o 鲰mm 抓l r edlp r o t e i n ，w l 虹c hi sr e s p o n s i b l e 氨瀚也ea s s 蹦m l yo f 也ep h o t o s y s t e mi ii n p l a n t s hr e c e n ty e a r s ，d l p r o t e a s eh a sb e e n 两u n da so n en o v e lh e r b i c i d a lt 嘴e t ， b e c 勰s eo f i 毽l 湃e 锄l 鳓tc o m p 撕鹅谢氆d l 即疆n 遮p l a 砖，w h i 馥i s 氇e 缎g e o f c o m m e r c i a l l yp v a l e n th e r b i c i d e si i lp r e s e n t ，s u c h 勰s i m a g i l l e ，a 艄貔i n e ，e 垤u r o n ，e t c t h 髓e f o r e “i sv e 巧i m p o r t a n tt o ( k v e l o pn o v e lh 曲i c i d e st 皴g 幽gd 1p r o t e a s c h l 锄s 也e s 主s 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r o l l i b i t i o nc o n 疏m t s 焰w e r e8 8i 旺n 0 1 1 她d5 2 阚0 1 l 1 i tp r o v e d 撖a tt h e w e 斑遗g 觞 i v i 移o f 氇e s ec 鑫内o x 羹i c 鑫c 遗啦i d e s 蕊参珏蔹e d 溉氆ep 羚越b 遗强载l i v 诹 t 0 1 a i d sd lp 1 o t e a s ei nm ep l a n t k 哆w o 堪s ：蛳& 蠹嚣b 主c i 如；d l d 专e 弱e ；蛐逊i 塞。驾s 弦m 然i s ；b i o 畦访蛀e s i i i 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 试诊 日期：立。，胡年r 月知日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：肖伶 日期：帕2 年歹月_ q 日 导师签名： 日期：年月 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程 ，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回童途塞埕銮后进压! 旦圭生；旦= 生；旦三生蕉查! 作者签名：穴伶 日期：泗8 年工月知日 导师签名： 日期：年月 日 硬走学位论文 a s t e r s ? h e s 裕 第一章绪论 随着耕地蕊积的不断减少，世界入口的不断增加，人类对环境保护意识的不断 增强，使得人口、粮食、环境问题成为二十一世纪人类迫切需要解决的问题。人口 增长势必需要更多的粮食供给，人们通过提高农业生产技术，加强优质高产作物杂 交品种的育种栽培，使用杀虫、抗病、除草、杀菌等农药方式，使世界作物产量褥 到显著地提高。但是面对环境和人阴的压力，只有进一步提高作物产量，才能满足 人类人口增长的需求。提高粮食产量离不开农药，虽然农药在世界农业中已经发挥 了十分重要的作用，但是每年仍有约3 5 的农作物受损失，盘毒若离开农药，损失则 会高达7 0 左右。由此可见，农药在促进农业增产方面扮演着十分重要的角色，今 后农药将在解决人类未来的粮食问题中继续发挥其积极作用，成为人类生存和发展 不可缺少的重要物资。为解决2 l 世纪的粮食闯题，农药创新和发展将发挥极其重 要的作用。 农药在减轻病、虫、草的危害，保障农业丰收方面发挥重要作用的同时，部分 农药自身固有的缺陷也逐渐暴露出来。随着人们环境保护意识的加强，对毒性和环 境评价提出的要求也越来越高，随着科学技术的进步，尤其是微生物技术的迅速发 展，具有无公害、无污染、无残留、成本低、且不易产生抗性等特点的生物农药和 天然源农药，受到了极大的关注。根据现代农药研究开发的趋势和社会对农药的要 求来看，2 1 世纪农药发展方朝着高效、安全( 低毒、低残留、低污染、高选择性) 和经济的农药凝晶种发展，以适应农监、林业防治病虫革害和调节植物生长的需要， 以保证农业、林业持续稳定的发展。 1 农药的分类及发展方向 农药( p e s t i c i d e s ) 主要是指用来防治危害农、林、牧业生产的有害生物和调节 植物生长的化学药品，对于农药的含义和范圉，不同的时代、不同的国家和地区也 有所差异。如美国，早期将农药称之为“经济毒剂 ( e c o n o i l l i c s p o i s o n ) ，欧洲则称 之为“农药化学品”( a 舀o c l 啪i c a l s ) ，还有的书刊将农药定义为“除化肥以外的一 切农用化学品。8 0 年代以前，农药麴定义和范围偏重于强调对害物的“杀死，但 8 0 年代以后，农药的概念发生了很大变化。现在，我们最关注的不是“杀死 ，而 是调节，因此，将农药定义为“生物合理农药 ( b i o 魁t i o n a lp e s t i c i d e s ) ，“理想的环 硬士擘位论交 研a s t e r st h e s i s 境化合物 ( i d e a le n v 衲n m 吼t a lc h e i n i c a l s ) 、“生物调节剂一( b i o r e g i l l a t o 哟。“抑虫剂一 ( i 璐e c t i 蚴i c s ) 。“抗虫剂 ( a n t i i n s e c ta g e l l t s ) 、“环境和谐农药( e l l _ y 的n l n e n ta c c 印t a b l e p e s t i c i d e s0 re n v 咖e n t 箭e n d l yp e s t i c i d e s ) 等。尽管有不同的表达，但农药的内涵必 然是“对害物高效，对非靶标生物及环境安全”。 1 1 1 除草剂的发展史 根据用途的不同，一般把农药分为四种主要的类型：杀虫剂、除草剂、抑菌剂 和植物生长调节剂【l o 】。下面以除草剂为例，简单介绍一下农药的发展简史。 用以杀死或控制杂草生长的农药称之为除草剂。用化学的方式在农田中除草的 历史可以追溯到1 9 世纪5 0 年代【1 1 】。1 8 9 5 年，法国葡萄种植者m l b o 衄e t 观察到从 葡萄杆滴落下来的c u s 0 4 h 2 0 喷洒液对野胡萝卜及芥末有杀灭作用，并于第2 年在燕 麦地里进行喷洒。紧接着法国、英国也采用硫酸铜来大面积选择性防除野胡萝卜和 芥末，这一偶然发现是农田化学除草的开端。在同一时期，美、英、法、德等国家， 除了使用硫酸铜除草外，还使用硫酸亚铁、氯酸钠、硫酸及砷化物等无机化合物除 草。直到上个世纪3 0 年代初，人们使用的除草剂都是无机的金属盐或酸，它们主要 是依靠其腐蚀性除草，主要特点是用量大，选择性差，杀草谱窄，成本高，并且使 用麻烦。 有机化学除草剂时期始于1 9 3 2 年选择性除草剂二硝酚的发现。1 9 3 2 年，第一个 有机除草剂二硝酚( d n o c ，2 甲基4 ，6 一二硝基酚) 在法国发现。二硝酚其实在1 8 9 2 年就已经在水果种植地作为杀虫剂使用，其除草性能的发现类似于硫酸铜的发现， 是人们观察到双子叶植物滴上二硝酚后很快枯死的现象时发现的。二硝酚的发现使 除草剂进入了有机化合物的时代，虽然这些化合物的选择性不强，仅能局部杀死杂 草植株，不能斩草除根，但却使除草剂的发展向前迈进了一大步。 1 9 4 2 年，内吸传导性除草剂2 ，禾滴( 2 ，禾二氯苯氧乙酸) 的发现开创了除草剂发 展史上的新纪元。它不仅除草效果好，杀草谱广，而且对单双子叶植物具有显著的 选择性，因而迅速在农业生产中得到广泛使用。在这一重大突破的影响下，除草剂 工业得到迅猛的发展，世界上许多化学公司竞相研究和开发新的除草剂，极大的促 进了除草剂产业的发展。1 9 7 1 年合成的草甘磷，具有杀草谱广、对环境无污染的特 点，是有机磷除草剂的重大突破。1 9 8 0 年，除草剂占世界农药销售额的4 1 左右。 随后，世界除草剂发展渐趋平稳，主要发展高效、低毒、广谱、低用量的新品种， 对环境污染小的一次性处理剂成为发展的主流。 2 硬士学位论文 m a s t e r s ? h e s l 8 1 1 2 除草剂按作用靶标分类及其特点 除草剂是一些有着复杂化学结构的一类化合物，而每一个化合物都具有独特的 物理和化学性质。具有相似化学结构的除草剂具有许多共同的或者是相似的特点， 相同的作用靶标和作用模式，以及对植物造成相同的或者相似的伤害症状。然而， 具有不同化学结构的除草剂，虽然具有不同的物理化学性质，但也可能具有相同的 作用靶标。了解不同除草剂的作用靶标，对合理有效的使用除草剂和控制杂草，延 缓杂草抗性的产生有着极其重要的作用。 对除草剂按其作用靶标进行分类，一般将常见的商品化的除草剂分为2 8 组， 其中6 组目前还尚未确定其作用靶标【1 2 ，1 3 ，1 4 1 ，见表1 1 表1 1 除草剂的分类 编号作用靶标除草剂类型抑制类型 l乙酰辅酶a 羧化酶抑制芳氧苯氧丙酸类 剂 2乙酰乳酸合成酶抑制 剂 3微管抑制剂 4合成植物激素 环己烯二酮类 磺酰脲类 咪唑啉酮类 磺酰胺类 嘧啶水杨酸类 二硝基苯胺类 哒嗪类 苯氧羧酸类 抑制乙酰辅酶a 羧化酶的 活性，阻断脂肪酸的生物 合成： 抑制乙酰乳酸合成酶的 活性，阻断支链氨基酸的 生物合成； 阻止微管蛋白进入微管 聚合，抑制微管形成，微 管是细胞分裂和细胞壁 合成所必需的； 合成植物激素通过破坏 激素平衡和蛋白质合成 干扰植物的生长。确切的 作用模式尚不清楚，认为 这类除草剂有多个作用 靶点； 苯甲酸类 5抑制光合作用于光系吡啶羧酸类 统i i喹啉羧酸类 三嗪类这3 类除草剂通过堵塞光 3 硕士学位论交 耐a s t e r s r h e g i 雷 6 光系统i i 一不同于5 的 结合靶点 7光系统i i 一不同于5 和 6 的结合靶点 三嗪酮类 脲嘧啶类 腈类 苯并噻二唑类 苯基哒嗪类 脲类 酰胺类 8抑制类脂合成硫代氨基甲酸酯类 9抑制e p s p 合成酶 1o抑制谷氨酰胺合成酶 1 1 抑制类胡萝卜素合成，三唑类 靶点未知( 白化) 抑制类胡萝卜素合成哒嗪酮类 1 2于八氢番茄红素去饱其它 4 系统i i 的电子传递破坏 植物的光合作用，它们与 光系统i i 途径中同一个 蛋白质结合，但表现出不 同的结合特征； 硫代氨基甲酸酯类除草 剂抑制类脂的合成，确切 的作用靶点和作用模式 尚不清楚，认为可能具有 多个作用靶点： 草甘膦抑制5 一烯醇丙酮 酸基莽草酸一3 一磷酸酯合 成酶破坏芳族氨基酸的 合成： 谷氨酰胺合成酶是植物 中铵转化为氨基酸的关 键酶。草铵瞵抑制谷氨酰 胺合成酶导致植物组织 中n h 。的积累，使植物中 毒； 三唑类除草剂抑制类胡 萝卜素合成，但靶点未 知。类胡萝卜素的主要作 用是保护叶绿素不被光 氧化。这类除草剂使敏感 植物失去叶绿素变成白 色，所以又称白化除草 剂； 这类除草剂通过抑制八 氢番茄红素去饱和酶来 磺士学位论文 m a s t e r st h e s i s 和酶 1 3抑制二萜合成( 白化)异嗯唑烷二酮类 1 4抑制原卟啉原氧化酶二苯醚类 1 5未知 1 6未知 1 7 未知 1 8 抑制二氢蝶酸合成酶 酞酰亚胺类 三唑啉酮类 氯乙酰胺类 氧代乙酰胺类 苯并呋喃类 有机砷类 氨基甲酸酯类 1 9抑制吲哚乙酸作用邻苯二甲酰胺类 2 0 抑制纤维素合成腈类 2 l抑制细胞壁合成苯甲酰胺类 2 2抑制光系统i 一电子联吡啶类 转移 2 3 抑制有丝分裂氨基甲酸酯类 5 抑制类胡萝卜素合成； 抑制各种二萜的合成，导 致植物白化死亡； 这类除草剂抑制原卟啉 原氧化酶，导致原卟啉原 i x ( p r o t oi x ) 的累积，产 生单线态氧，导致植物组 织快速降解； 作用靶标未知； 抑制二氢蝶酸合成酶，干 扰叶酸的合成； 确切的作用机理还不清 楚，但有证据表明这类除 草剂抑制植物激素( 吲哚 乙酸) 的传递； 抑制纤维素合成以阻止 细胞壁的合成； 抑制纤维素合成以阻止 细胞壁的合成： 这类除草剂截取通过光 系统i 的电子，然后将这 些电子传递给另外的物 质，导致形成过氧化氢破 坏细胞的完整性； 这类除草剂抑制细胞分 裂过程中的有丝分裂； 地乐酚被认为阻断了呼 磺士学位论文 磁a s t e 砭 st h e s 璐 对除草剂作用机理的研究进展仍然比较缓慢，目前人们对有关植物体内敏感靶 标部位的性质尚了解不多，商品化除草剂的作用靶标也相当有限，而且大多数除草 剂的作用位点集中在少数几个靶标上，造成交互抗性的存在，而导致抗性形成速度 加快，因此寻找新的除草剂作用靶标显得尤为重要【1 5 】。 1 1 3 新世纪农药发展的战略及趋势 农药的研究与使用是2 0 世纪的一项重大的发明与贡献【1 6 1 ，从上世纪4 0 年代开 始化学农药在农作物上大规模使用，极大地提高了农作物的单位面积的产量，推动 了农业的迅速发展。随着社会的发展，化学农药对人类和环境的影响也逐渐被人们 认识和关注，人类开始从生态学的角度树立“害虫综合治理”的新概念，但在多种 防治手段中，如化学、生物、遗传工程、物理以及耕作防治等中，使用化学农药仍 是目前耗能最低、防治最迅速、效果最佳的作物保护措施，是现阶段高效农业发展 的必由之路，当有害生物爆发成灾时，化学防治几乎是唯一可采取的措施【1 7 1 引。 我国目前拥有1 3 亿人口，如何用占世界耕地面积7 的土地来养活占世界人口 2 2 的人【l 引，是国民经济的首要任务，其主要的措施就是通过化肥和农药来提高单 位面积的产量。目前，从国内外农药发展的战略而言：预计2 1 世纪5 0 年代以前化学 合成农药仍是农药的主体，虽然目前生物农药的呼声很高，前景也很好，但目前生 物农药仅占世界农药产量很小的一部分，且对大多数农业有害生物的防治，特别是 大面积的快速防治仍然显得无能为力，所以生物农药很难在近期内成为农药的主力 军，在我国尤其如此。 就化学农药本身的发展趋势而言，化学农药将进入一个超高效、低毒、无污染 的新时期，农药工业将会发生大的变革，超高效农药的发展将使农药使用量由每毫 升几百克或者几十克降到十克以下，使农药成为一种精细化学品。 因此，新世纪的农药发展有战略和趋势有以下几个特点： 6 项士学位论文 m a s t e r st h 笆s r s 1 重视设计生物合理性农药，着手开发生物农药 从上世纪8 0 年代起生物合理性农药得到迅速发展，这些产品适宜于综合昆虫治 理( d m ) 或低投入的持续农业( l i s a ) 计划，这一计划的核心是要求这类农药必须保持 天然的捕食性生物和寄生生物间的平衡，且不伤害它们，例如：害虫快速进食剂、 生物杀菌杀线虫剂、抗蒸发剂以及性外激素为主的产品，均得到推广应用，同时基 因工程的开发和基因工程的推广也成为目前农药开发的热点。 2 含氟化合物在农药上得到广泛的应用 据统计超高效的农药中约有7 0 为含氮杂环，而在含氮杂环化合物中又几乎有 7 0 的为含氟化合物，研究发现含氟化合物的特异生物活性，使原有的杀虫杀菌、 除草和植物生长调节剂增添了新的活性，同时具有选择性好、活性高、用量少、毒 性低的特性。 3 手性农药的使用更加普遍 二十世纪9 0 年代后，出于对提高农药有效活性同时又保护环境的考虑，国外一 些农药行政管理部门只登记认可有效的单一光学活性异构体，不允许将无效的异构 体施放到环境中去污染环境，因而在农药工业的合成工艺上大力开发单一光学活性 异构体的合成技术成为一种趋势，目前已开发了一批以单一光学活性异构体形式出 现的除草剂、杀虫剂、杀菌剂、植物生长调节剂。 4 积极开发符合生态学要求的新农药 从生态学的角度出发，提倡将害物造成的损失控制在经济允许的范围内，不是 最大限度的杀灭有害生物，而是调节和控制有害生物种群密度，例如昆虫生长调节 剂的开发和推广，代表这种新观念的树立。 倡导绿色农药，大力开发绿色化学技术和绿色农药制剂成为农药工业可持续发 展战略的选择。 1 2 新型农药的创制及d 1 蛋白酶的介绍 1 2 1 新农药的创制过程 农药是发展农业最重要的生产资料之一，农药在保护农作物生长中，发挥了巨 大的作用，促进了农业发展，给人类带来了巨大的经济效益。1 9 0 0 年，亚砷酸铜在 美国成为世界上第一个登记立法的农药【2 0 1 ，一个世纪以来，化学农药得到长足的发 展。据1 9 9 8 年m e 姗及h a n 的报道，世界农药3 2 0 亿美元的总销售额中化学农药 占9 8 9 ，表明化学农药在世界各地都得到了广泛的应用。继1 9 4 0 年瑞士科学家p 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s m u n e r 发现d d t 的杀虫活性之后【2 l 】，有机合成杀虫剂进入迅速发展阶段，大量有 机氯、有机磷、氨基甲酸酷及拟除虫菊酷类杀虫剂相继问世。而二硫代氨基甲酸盐 等保护性杀菌剂的应用以及2 ，4 - d 特殊生理效应的发现，亦加速了有机合成杀菌 剂、除草剂的发展进程。但是长期使用单一的农药品种，往往会带来生态的变化和 抗性的产生等问题，因此农药产品具有需要经常更新的特点。而且，随着环境保护 法规及可持续发展战略的贯彻执行，一些高毒、高污染的品种将被淘汰。我国现有 的农药产品开发，多为仿制国外开发的品种，其中高毒高污染品种占产量的一半。 为保证环境保护法规的贯彻施行，我国农药产品面临更新换代的挑战，急需根据我 国主要病、虫、草害开发出高效、低用量、有特定选择性以及对环境友好的新农药 品种【2 2 】。新农药创制是一门高新技术，更是一门专业跨度大，学科交叉性强的系统 工程l z 引。新农药候选品种的研制过程如图1 1 所示。 匪囹一l 兰兰型卜 主竺 o - - - _ - _ _ - - - _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ - _ _ 一 r - _ _ _ p _ _ - _ l ，- - - - _ - ， _ p ，一r 。_ _ _ _ 。o 。o 1 l 优化结构l 卜l 构效关系i l 活性测定1 _ _ - _ _ _ _ _ _ i - - _ - - _ _ - j - - _ _ _ - - 一 匝丽习一匦五阑一陌磊司 、_ _ _ _ _ i _ _ _ - _ - 、- _ _ _ - - _ _ _ 一l l _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - - 图1 1 新农药候选品种的创制过程【刎 一个新农药从活性结构( 先导化合物) 的发现到开发成功，先后要经过分子设计、 合成、筛选、结构优化和衍生化、活性测定、田间试验及药效推广、化工工艺开发、 安全与环境评价以及注册登记等多个环节，需要化学、化工、农学、生物学、环保 学、计算机技术等多学科的密切配合，而新型农药的开发中最主要和最关键的一个 环节就是新型作用靶标的发现。 1 2 2 发现新型作用靶标 药物发现是药物研发的初始阶段，是人们主动寻找和认识物质药用价值的实践 过程。而现在已进入依照药物靶标合成阶段，也就是在研究方法和手段方面已经采 用了现代高科技技术，建立了根据药物的分子结构和生物活性相关性的研究方法和 手段( q s a r ) ，使药物的合成更具有目的性和定向性并大大加快了研究和合成的速 8 琐士学位论文 m a s t e r s r h e s l s 度，摆脱了过去单纯的大量化学合成和大量生物筛选的传统方法，我国在这一领域 也已取得了进展。 所谓药物靶标是指存在于组织细胞内与药物相互作用，并赋予药物效应的特定 分子。农药在当今农业生产中占有重要地位，对于保证农业实现稳产增收具有重要 意义。近年来，由于昆虫对农药的抗性增加【2 5 1 、社会和环境对农药品种安全性的要 求，很多农药品种已经被列入禁用名单【2 6 j ，实际上在市场上使用的农药品种数在相 对地减少。因此，开发高效、低毒、对环境安全的新型农药显得尤为迫切。然而， 药物靶标的发现和确认是新药研发的起点和“源头”。靶标的识别、筛选以及先导 化合物的优化是药物发现的早期步骤。 绝大多数药物靶标是蛋白质，药物靶标鉴定的通常策略是利用蛋白质组技术， 通过分析病理过程前后或生理病理组织、细胞的蛋白质表达谱的改变与差别，寻找 药物作用的靶标【z 碓引。利用这种研究策略，研究人员已经在人肠上皮细胞中鉴定了 细胞分裂素可以作为免疫疾病治疗的靶标，在肺上皮细胞中鉴定出转录生长因子p 可以作为肺病治疗的潜在靶标1 2 纠。 当一个蛋白质被确证为新的药物靶标时，从理论上说它的天然配体就是一个新 的药物候选物，同时对配体和靶标的结合与生物活性关系的研究又为设计新的药物 分子提供信息。 蛋白质组学与药学研究关系密切，正逐步成为发现新的药物治疗靶标、鉴定先 导化合物、论证药效、研究代谢规律及毒副作用的有效方法。这些研究方法将极大 地提高药物发现和药物研发的速度和效率。药物靶标的发现对创新药物的研究具有 决定性的意义，在寻找药物作用靶标时，蛋白质组学通过检测疾病和药物处理前后 蛋白质表达谱和蛋白质一蛋白质相互作用的变化，可发现和确认药物作用的新靶标【3 0 】。 先导化合物的筛选和优化是药物研发过程中的重要步骤。蛋白质组学技术能够 促进药物靶标的发现，在此基础上，有助于先导化合物筛选模型的建立。如高通量 药物筛选，将组合化学、基因组学和蛋白质组学、生物信息学和自动化仪器等先进 的技术进行有机的组合，形成一种发现药物的新程序。又如计算机虚拟筛选及计算 机辅助设计，采用三维药效基团模型搜寻或分子对接方法，在化合物数据库中寻找 可能的活性化合物，一旦获得某一特定的蛋白质靶标，利用射线衍射和多波长不规 则衍射m a d ) 等技术，通常可获得纯化的蛋白质晶体结构，利用虚拟筛选就可以进 行基于靶标结构的筛选以及基于药效基团的筛选，从而迅速有效地发现以及优化先 导化合物，为新药研发开辟了新途径【3 l 】。 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 近年来，人们根据蛋白质组学在药物研究中的应用提出了药物蛋白质组学( 或称 化学基因组学) 。其研究内容包括基础和临床两个方面：基础研究主要包括药物靶点 的发现与确认、候选化合物的筛选、药物临床前评价以及药物作用机制的探讨等； 临床研究主要包括将疾病特异性蛋白作为有效药物选择的依据和临床疾病诊断的 标志物，以及临床患者的个体化治疗【3 2 1 。此外，化学蛋白质组学和结构蛋白质组学 在药物发现过程中也有着重要的应用价值。化学蛋白质组学是利用特定的化学小分 子探针研究靶蛋白的生物学功能，或通过筛选小分子配体与蛋白的结合验证可能的 靶。结构蛋白质组学旨在为所有蛋白提供三维结构信息并为大量未注释蛋白的功能 研究提供线索。化学蛋白质组学、结构蛋白质组学能够帮助认识某种蛋白质的结构， 预示其生物学功能，并评价其作用药物靶标的潜能，从而实现对药靶的发现和确认， 并提高药物筛选的成功率p 引。 图1 2 显示了药物发现的整个过程，从结构基因到功能基因，然后到功能蛋白， 之后到确定药物靶点，针对药物靶点设计出药物。 陌矾 - j ， 图1 2 药物发现过程【3 4 j 为了提高了整个药物研发效率的，新药研发除了靶标发现的确认外，还包括药 物作用机制研究，先导化合物选择，小分子化合物筛选和优化，生物活性研究等方 面的内容。 1 2 3 靶标导向的药物发现 从2 0 世纪9 0 年代开始，随着各种学科的发展，药物设计进入了一个新的阶段， 即合理药物设计的阶段。所谓合理药物设计，是依据生物化学、酶学、分子生物学、 遗传学、信息学以及计算化学等学科的研究成果，针对这些基础研究中所揭示的包 l o 硬士学位论文 磁a s ? e r ，s r h e s l s 括酶、受体、离子通道以及核酸等潜在的药物设计靶点，并参考其他内源性配体或 天然产物底物的化学结构特征设计出合理的药物分子，以发现选择性作用于某种靶 点的新药，这是目前新药发现的主要方向。 生命科学基础研究结果表明：内源性活性物质或者外源性小分子药物( 广泛称为 配体( 1 i g 锄d ) ) 作用于机体内的靶标( t a l 翟e t ) ，从而引起生物活性；基于对疾病过程的 分子病理生理学的研究，机体的酶、受体、离子通道、核酸等为潜在的药物作用靶 标或靶点，广义地称为受体( r e c 印t o 3 5 】。配体与受体结合时，彼此存在静电相互作 用、氢键相互作用、范德华力相互作用和疏水相互作用。配体与受体结合必须满足 互补匹配原则( 见图1 3 ) ，即配体与受体几何形状互补匹配、静电相互作用互补匹配 ( 正电荷对应负电荷) ；氢键相互作用互补匹配( 氢键供体对应氢键受体) 、疏水相互作 用互补匹配( 疏水区对应疏水区) 。在配体与受体对接过程中，通过上述两者的形状 互补、性质互补，两者各自改变其构象，以适应对方的要求而达到对接的契合状态， 这就是所谓的“诱导契合”。 o e 静电相互作用 d - 一o 氧键相互作用 d - o 藏永相互作用 图1 3 配体一受体互补匹配示意副3 6 】 合理药物设计就是根据靶标生物大分子三维结构，考查配体小分子( 内源性配 体、天然药物、或合成小分子) 的化学结构特征，寻找和设计合理的药物分子，以发 现选择性作用于靶标，又具有生物活性的药物先导化合物，或根据靶标三维结构直 接设计具有生物活性的配体。由此发现，设计的药物先导化合物，可以进一步设计、 研制出药物，这种药物往往活性强，作用专一，副作用低，称为合理药物设计t i o n a l d 1 1 l gd e s i 鲥。 如果根据其对物质结构与功能关系的了解，借助于计算机，将生化、分子生物 硕士学位论交 m a s t e r st h e s i s 学、药物化学、药理等知识综合起来，进行新型药物的计算机辅助分子设计，就能制 成数以万计的新化合物，进行定向筛选，将会大大提高新生化药物研制的成功率。 1 2 4 新型除草作用靶标d 1 蛋白酶的介绍 农药在当今农业生产中占有重要地位，对于保证农业增收具有十分重要的意 义。自从2 0 世纪4 0 年代发现选择性植物激素类除草剂以来，经典的盆栽与喷洒筛 选方法已经获得了2 7 0 品种、1 7 种作用模式的除草剂【3 7 l 。近年来，由于植物对农药 的抗药性的增加、社会和环境对农药品种安全性的要求越来越高，很多品种农药已 经被列入禁用名单，实际上在市场上使用的农药品种数在相对的减少。因此，开发 高效、低毒、对环境安全的新型农药显得尤为迫切【2 8 1 。然而，发现新的作用靶标是 开发农药新品种的瓶颈之一。 一般而言，一个理想的作用靶标应该满足四个基本条件：一是该靶标只存在与 植物体内且高度敏感；二是该靶标在杂草中普遍存在；三是该靶标是杂草体内某一 新陈代谢唯一途径的一个环节；四是对该靶标的结构及其与底物的相互作用已经有 了比较充分的认识【j 引。 植物光合系统i i ( p si i ) 是植物进行光合作用，进行新陈代谢的必须部分【3 9 】。 包括两种同源的多肽链，d 1 蛋白和d 2 蛋白，这两种蛋白被认为在最基本的光化学 反应中是不可缺少的【矧。p si i 中的d 1 蛋白存在于所有的利用氧化光合成来进行新 陈代谢的有机体内。这些生物体内电子传输的电子来源是水，而水氧化为分子氧的 这一过程是发生在与d l 多肽链有关的四核锰簇上。d l 蛋白用于光合作用中锰簇 合物的组装，在光合作用过程中具有高速新陈代谢功能( 半寿命只有几秒) ，被认 为是代表光合系统i i 的损伤一修复循环过程，因此d l 蛋白是光合作用系统i i 中的关 键，是植物光合作用链中不可或缺州4 1 1 。 1 9 7 8 年，g r e b a m e r 等利用一维解蛋白成图技术【4 2 1 ，该技术在成图之前利用简单 的电泳技术分离膜的组分，并且直接进行放射性标记的与提纯出来的天然蛋白碎片 的比较。g r e b a l l i e r 等利用这项技术鉴定了分离得到的玉米叶绿体的三个多肽的信息 ，发现3 4 5 l 【d a 的蛋白是3 2 勋蛋白的前体形式。l9 8 2 年r e i s f e l d 等在s d s ( s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t es t a bg e l sc 0 n t a i l l ga1 0 2 0 伊a d i 锄to f p o l y a c r y l 锄i d e 谢t l la3 s t a c 虹n gg e l ) 上进行了蛋白的电泳实验，揭示了螺旋纤丝中体内和体外合成的 3 3 5 k d a 与类囊体上的3 2 k d a 蛋白的前体和产物之间的关系【4 3 】。1 9 8 5 年m i n a l l l i j b 等也利用电泳及荧光标记法确认了菠菜中d l 蛋白都是以分子质量大于产物的前体 形式在类囊体上表达【4 4 1 。1 9 8 4 年m a r d e f 等研究叶绿体蛋白3 2 k d a 的分子构造时，在 1 2 硬士学位论文 m a s t e r st h e s i s 切割后成图发现把蛋白固定在类囊体上的部分是富含憎水性的氨基酸残基，而蛋白 表面则是富含极性氨基酸残基，这表明载固定蛋白的部分是n h 2 端，而裸露的表面 则是c o o h 端。在c o o h 端被切割处理保证了得到结构正确的成熟蛋白【4 5 1 。1 9 8 8 年 d i n e r 等在进行d 1 蛋白的处理时，在斜栅藻p s i i 中组装发生氧分子的配合物中的作 用时，提出l f l 突变异种不具备光合成显性就是因为羧基终端未被切割，并提出了 两种切割模式f 删。 在不同的植物中，d 1 蛋白的羧基端切割情况不同。1 9 8 8 年儆a l l a s l l i ，m ， s h i r a i 出，等发现在菠菜中，会切割9 个氨基酸残基，剩下a 1 a 3 4 4 作为羧基端1 4 。 在蓝藻中有1 6 个氨基酸残基被切割，而在高等植物中都是9 个氨基酸残基被切割 ，且所有的切割位点都是在d 1 a l a 3 4 4 的羧基端【4 引。如果d 1 蛋白未被正确的切割 ，则会影响锰离子的组装，从而导致光合作用的失败【4 9 】。 在这些处理中，起到催化切割进程作用的酶即d 1 蛋白酶( d 1c t e m i n a l p r o c e s s i n gp r o t e a s e ) 。研究得出：d l 蛋白酶的作用是剪切