（植物学专业论文）银杏雌雄株性别差异的比较研究.pdf

摘要 银杏属于银杏科( “门 聊c e a e ) 银杏属( 甜仃 譬西，是严格的雌雄异株植物，具有多种 用途。因此对银杏的性别决定机制进行研究， 定的机制，而且在实践上也具有重要的意义。 不仅在理论上能够阐明雌雄异株植物性别决 本文用雌雄银杏做材料，采用核型分析、同 工酶分析及r a p d 分析等技术分别对银杏的雌雄株进行了差异性比较，以期为雌雄异株植 物的性别决定机制提供理论依据，在实践上为雌雄异株植物的性别鉴定提供可靠的指标， 主要结果如下： 1 、通过对银杏的雌株和雄株的核型分析得出，银杏性别的决定机制属于z w 型，雄 株为z z ，雌株为z w 。 2 、 对银杏进行同工酶分析结果表明，过氧化物同工酶和苹果酸脱氯酶同工酶在雌雄 之间有差异，可以作为性别鉴定的参考指标；酯酶同工酶，在银杏雌雄幼叶之间有差异， 而在成熟叶中没有差异，所以，酯酶同工酶不能作为鉴定性别的指标；谷氨酸脱氢酶同工 酶在银杏的雌雄之间没有差异，不能作为鉴定性别的指标。 3 、通过r a p d 分析从6 8 个随机引物中筛选出2 9 个引物，在这2 9 个引物中，扩增出 有差异条带的是引物s 2 ，扩增出的特异片段大小约1 0 8 0 b p ，为雄性基因组特有。堑 s o u t h e r n 杂交，进一步证明了此差异，对该特异片段进行测序发现，该序列富含a t 碱基，经在n c b i 数据库中用b l a s t 进行核酸和氨基酸序列检索和分析后，未见同源序列，表明该特异片段 是一个新发现的多态性片段，可能与性别决定有关。将该序列注册至g e n e b a n k 数据库， 注册号为：a y 9 7 1 5 7 7 。 关键词：银杏；性别决定；染色体核型；同工酶； r a p d a b s t r a c t g i n k g ob i l o b ab e l o n g st og 加置9 0 口口8a i l dg f 胛置9 0 ni s 埘c td i o e c i 锄p l a n ta n d h a sm a n y u s e s i nm i sp 印e r ，t h ed i 船r e n c e s 锄o n gf e m a l ea n dm a l eg i i l l 【g ob i l o b aw e r es t u d i e dt h r o u g l l t h ea i l a l y s i so fc h m m o s o m e s ，i s o z y m ea i l dr a p do fg e n o m i cd n a ，i no f d e rt op r o v i d et h et h e o r y a s s l l r a i l c ef o rs e xd e t e m i m 时o na i l dt l l ep o s s i b i l i 哆i nt l l es e xi d e n t m c a t i o no fg i n k g ob i l o b a ，廿1 e m a i nr e s i l l t sw e r ea sf 1 0 l l o w 8 1 、t l 啪u 曲a n a l y s i so f t l l ec l l r o m o s o m e so f f e m a l e ，m a l eg i n k g ob i l o b a ，t h es e xd e t e r r i l i n a t i o n m e c m i l i s mb e l o n gt oz w ，f b m a l ei sz w ，m a l ei sz z 2 、t h er e s u l t so f i s o 巧m e 锄_ a l y s i sr e v e a l e dt h a tm e r ew e r em a r k e dd i f r e r c i l c e si np o d a i l d m d h i s o z y m ep a t t e m 唧o n gm a l e o rf e m l es 吲l l so f g 试k g ob i l o b a ，s om e yw e r eu s e dt 0s e x i d e n t i f i c a t i o n ；t 1 1 ee s ti s o z y m ep 毗e m se x i s t e ds p e c i f i c a l l yi nt h ey o i l i l gl e a v e sb u td i 血ti n m a n l r el e a v e so f m a l eo rf h n a l eg i i l k 9 0b i l o b a ，s oi tc o i l l dn o tb ct h em a r k e ri ns e x i d e 鲥f i c a t i o no f g i n k g ob i l o b a 廿1 eg l d hi s o z y m ep 眦e m sw e r ei d e n t i c a la m o n gm a l e o r f b m a l es 仃血so f g i i l k g ob i l o b a ，s o “c o u l da l s on o tb et h em a m e ri ns e xi d e r n i f i c a t i o no f g i n k g ob i l o b a 3 、t h eg e n o m i cd n ao fm a l ea n df e m a l ew e r ed e t e c t e db yu s i i l gr a p d( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y n l o 咄i cd n a ) t e c 衄q u e ，o n l ys 2p f i m e rc o u l d 啪p l i 母d i 胝n tb a i l d ，a n dm e 如再n e n tw a ss p e c 矗c 矗”i n a l e ，i t ss i z ew 豁1 0 8 9 b p ，b 韶e do nt h es o u 妇1 锄d o tb l o ta n a l y s i s ， i n d i c a t i n g 也es p e c i cg e n em a r k sr e l 砷e dt os e x e si d e n 枷= i c a t i o no fm a l e 锄df b m a l eg i n k g o b i l o b ai s r e l i a b l e ；t h es p e c i f i c 矗a g m e n tw 鹊s e q u e n c e d 趾d眦a l y z e d ，m e r ew e r er i c ha t i nt h es p e c i n cf m g m e ms e q u e n c e ，b yb l a s t c o n s u l t i n g 蛐db i o l o g i c a li n f o m 谢c sa i l a l y s i s ，h a d n 0s i i i i i l a rs e q u e n c e 嘲) 0 r t e d ，s oi tm a yb en e wa i l dh a dp o s s 主b l er e l a t i o nt os e xd 洲n a t i o n ， 血es p e c i f i c 行a g m e n tw a sr e g i s t e r c di i lg e n e b a n ka n dm en u m b e rw a sa y 9 7 1 5 7 7 i i k e yw o r d s ：g f 堙o6 f z d 6 口： s e xd e t e r m i i m t i o n ； k a r ) r o t ) 甲eo fc h m m o s o m e ；i s o 珂m e r a p d i p o d p a g e t e t h e s r a p d a f l p c t a b e s t g d h m d h n b t 缩写词( a b b r e v i a t i o n ) p e r o x i d a s ei s o e n ，可m e 过氧化物酶同工酶 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 t e b u f f e r t e 缓冲液 t r i s ( h y d r o 珂m e t l l y l ) a m i o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 r a n d o ma m p h f i e dp o b 恤o r p 址cd n a 随机扩增多态d n a a m p h f i e df h g m e n t l e n g t hp o b m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 c e t y i t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e e s t e r a s ei s o e n 码7 m e g l u t a m a t ed e h y d 阳g e 曩s ei s o e n z y m e 溴代十六烷基三甲胺 酯酶同工酶 谷氨酸脱氢酶同工酶 m a i a t ed e h y d m g e n a s ei s o e 巧m e 苹果酸脱氢酶同工酶 n “r ob l u et e t 眦o h u mc h l o r i d e 氯化硝基四氮唑兰 银杏雌雄株性别差异的比较研究 1 前言 在高等植物中，绝大多数植物属于雌雄同体种类，雌雄异株的植物物种仅占植物物种 总数的4 “2 3 ，例如：大麻属、律草属、菠菜属、麦瓶草届等。出于不l 司性别的植株在 形态学、生物学特性、经济价值等方面存在一定的差异，所以，长期以来，探究雌雄异株 植物的性别决定机制和开发新的雌雄异株植物性别鉴定方法一直是人们不断探索和亟待 解决的一个富有挑战性的科学命题。 1 1 雌雄异株植物性别决定机制研究进展 1 1 1 性染色体决定植物性别 性染色体是由美国学者m c c l u n g ( 1 9 0 2 ) 在蝗虫中首次发现，随后a l l e n 于1 9 1 7 年在钱 苔属植物中也发现性染色体的存在，但直到1 9 2 3 年人们才确认了植物性染色体的存在。1 ， 迄今己知有2 5 科7 0 余种植物含有性染色体”1 。 目前的研究资料表明，在大多数雌雄异株植物中，通常雄性为异配性别( x y ) ，雌性为 同配性别( x x ) 。例如白麦瓶草( 尉括 d 舾i ) ，它是严格的雌雄异株，长期咀来被认为是 性别决定研究的模式植物，研究认为，在白麦瓶草性染色体中y 染色体比x 染色体大，x 与y 染色体的同源区域( 图1 中i v 区) 只占染色体长度的很少一部分，其余为假同源区。 在y 染色体上具有雄性活化基因( 图1 中t i 区) 、雌性抑制基因( 图l 中i 区) 及对花粉的 存活与育性起关键作用的雄性可育性基因( 图1 中i i i 区) 。其中雌性抑制基因与雄性活化 基因表现完全连锁。在x 染色体上缺乏上述基因，但具有雌性特异基因( 图1 中v 区) 。因 此，雄性个体中由于y 染色体的存在，而抑制了x 染色体上雌性特异基因的表达，保证雄 花正常发育，即使x 染色体增加也不能改变其雄性特征”1 。具有相似性染色体的植物还有 石竹科的女娄菜( 阡h n 咖f 口玷g a r c k e ) 也属于x y 型性别决定“1 ，它的y 染色体大于 x 染色体，y 染色体携带决定雄性的基因，x 染色体上大部分为决定雌性的基因。此外还有 大麻( c h 竹协妇跚f f w 职l t ) 、菠菜( 印i n 船蛔d k m 咖l ) 、银杏( g 加咖6 洳妇l ) 等6 ，7 ，引， 这些植物中的y 染色体均具有强烈的雄性活化作用”1 。 芦笋( 一删m g w 谚i c 删拈l ) 的性别决定方式也是x y 型，一般情况下为雌雄异株植 物。但与白麦瓶草不同的是，芦笋具有形态学上一致的性染色体。芦笋二倍体染色体组成 为2 n = 2 0 = 1 8 a + x y ，x 染色体与y 染色体的大小、形态几乎完全一致，y 染色体上具有与 自麦瓶草y 染色体相似的雄性活化基因和雌性抑制基因“叫”。 白麦瓶草y 染色体相似的雄性括化基因和雌性抑制基因“叩”。 银杏雌雄株性别差异的比较研究 u u l 图l性别决定基因在白麦瓶草 y 染色体上的区域定位( 仿w e s 【e 删，1 9 5 8 ) x 0 型的雌性含两个x 染色体，雄性个体只有x 染色体，缺少y 染色。如苔草( 招f o ) 1 2 ，1 粥、花椒( 心r f c 唧f 聊朋聍肪瞰叫) 1 钔、薯蓣属中的某些种1 5 3 就属于x o 型性别决定 方式，该类型的植物较少。 金老梅( 乃“f f c 础& 蛹zl ) 等少数雌雄异株植物的性别决定方式为z w 型，即雌性 为异配性别( z w ) ，雄性为同配性别( z z ) 1 t 1 。 还有一些严格雌、雄异株的植物，因其体细胞中染色体较小，数日较多，很难区分出 性染色体1 引。 1 1 2 基因决定植物的性别 性别决定基因的研究是研究雌雄异抹植物性别分化和性别决定的最高水平，也是彻底 解决性别决定机制的关键所在。在性别的基因决定理论中主要包括单基因决定性别，如石 刁柏；双基因决定性别，如葡萄( 阳括v 加自妒加l ) 、树莓( r “6 淞 妇e 螂l ) ；多基因决 定性别，如草莓( f ，馏哪蛔加f f d ，e 仃h ) ；复等位基因决定性别，如喷瓜( 6 日f ? i 绷8 肠把r f 研l l ) 、东方草莓( n q 静一口d ，f b n 细倦l o s ) 等5 ，1 殳捌。 m a t s u n a g a 等报道，用差异筛选法从白麦瓶草中分离得到4 个雄性繁殖器官特异c d n a 克 隆：删、脚咀馏、出獭钳、删，并研究了它们的表达。发现胁卿儡喇录本 2 仞纠囫翰暾叼翰改吲，、 ii，ll1，j 银杏雌雄栋性别差异的比较研究 在发育早期的雄花芽中积累，而脚，和胴砌在发育晚期的雄花芽和开放的雄花的花药 中积累，捌；s c u t t 等用减法杂交和差异筛选相结合的方法分离到8 个雄性特异c d n a 克隆 ( m e n l 8 ) ，其中m e n l 与 劂酣同源，m e n 4 与m 朋馏同源。分离到的m e n 基因都不在y 染色体 上，但它们的表达直接或间接地受到y 染色体上的性别决定基因的诱导。不同的m e nc d n a 的时空表达模式各异，它们可以作为白麦瓶草性别决定的分子机理研究的发育性标记物 1 ：王晓梅等通过r a p d 技术发现了一个银杏雄株的性别标记，可以为早期鉴别银杏的雌 雄性别提供理论基础1 ：印度学者p a r a s n i s 等用微卫星和微小卫星标记对番木瓜性别进 行标记研究，发现一个5 k b 的特异带仅出现在雄株中啦3 ：此外，从猕猴桃c 咖 加拍加e 珊括 l ) 2 6 、葡萄m 、大麻( q 矾口6 括棚r f l wl ) 2 胡中，也都获得了相关性别的特异片段。 目前，雌雄异株植物的特异基因的研究还不够深入，性别决定的分子机理还没有被完 全阐明，但随着分子生物学手段的不断进步，生物大分子分析技术的发展，这一机理最终 会被揭开。 1 1 3 性别决定中的基因平衡理论 在对果蝇的研究中发现，果蝇的雌性决定因子位于x 染色体上，而雄性决定基因并不 位于y 染色体上，而位于常染色体上，并且不止一个晗蚰。因此，果蝇的每个个体性别的 最终表现取决于x 染色体数日与常染色体倍数之间的平衡，即决定于雌性基因占优势还是 雄性基因占优势，即果蝇的性别是由基因平衡来决定的口”。 在有些雌雄异株植物中虽然也有性染色体，其性别决定方式类似于果蝇的性别决定。 即这些植物在进化过程中采用了x 染色体与常染色体之间的基因平衡决定其性别3 1 。 如捧草属的啤酒花( 胁册砌玎脚删缸) 2 n = 2 0 = 墙a + x y 是严格的雌雄异株植物。但有时雌 性植株上形成不育雄花，究其原因发现这与植物体细胞内x 染色体与常染色体组的比值有 关。再如酸模及一些近缘种中，虽然也具有x y 染色体，但植株性别主要由x 染色体与常 染色体之间的平衡决定，y 染色体对性别决定没有影响。当x a = 1 时，表现为雌性，当 x a 耋1 2 时，表现为雄性，当l 2 n 等，有利于雄性的发生 4 9 ，5 0 ，5 1 。 虽然植物性别表达的分子生物学研究已成为这一研究领域的核心，但园艺等植物的性 别分化是一个复杂的生物学现象，单一学科无法解决这个问题。只有多学科的综合研究， 才能解开性别分化之谜，并为生产实践中调节控制性别、进一步提高其产量提供有效途径。 高等植物性别研究的进展必将推动农业、林业、果树业、蔬菜业及花卉业等向前发展并创 造出更符合人类需求的品种。同时，这一领域的深入研究在理论上也是前景诱人的，因为 高等植物特有的结构及表现性别的模式为生物发育研究提供了优良的天然实验系统，这一 系统的深入研究必将为解决生物学中重大理论问题之一的发育问题带来曙光。高等植物性 别表达的分子生物学研究仍将是这一领域研究的核心，积极探寻控制性别分化的性别基因 及其表达调控的机制将是这一问题的关键所在m ，5 3 ，川。 1 3 银杏的性别决定机理及其研究概况 银杏雌雄株性别差异的比较研究 1 3 1 银杏的性别与形态的关系 我国唐代段成式的酉阳杂俎、宋代吴怿的种艺必用都述及银杏“树有雌雄”。 明代李时珍的本草纲目指出：“须雌雄同种，其树相望乃结实”。国外关于植物有性的 概念是1 8 世纪由k 1 u e d o t 和l i n n a e u s 奠定的。我国对银杏为雌雄异株植物的认识远比国 外为早。 王涛在银杏生产实践的基础上经过总结，分别从发芽和落叶的迟早、主干与主枝的夹 角大小、同龄树冠形成时间的早晚、成龄树短枝的长短、叶片大小及缺刻深浅、花芽大小 和花序形态等7 个方面进行了阐述。日本的阪本荣作通过对银杏雌雄株叶柄的大量镜检， 发现雌株叶柄下方维管束周围有油状空隙，而雄株时柄下方维管束周围都没有油状空隙” 5 6 研究结果表明银杏雌雄株有以下特征：在苗木时期，雌株比雄株小，粗壮，横生枝多， 叶小且裂刻少，秋季叶黄时期早。在大苗时期，雄株枝下垂，并生有乳状突起。雌株枝直 立，无乳状突起，但也有雌株开张角度大，枝条平展的情况。雌株一般叶基分叉，而雄株 一般不分叉，雄株裂叶较雌株深得多。雌株在苗高6 0 厘米时，根部有乳状突起。对于已 结果的成龄树，雄株树体高大，轮生枝明显，短枝较少，长枝发达，枝角较小，枝条垂直 向上，大多数为塔形树冠。而雌株树冠为广卵形，短枝密集。雌花序瘦而稍尖；雄花序大 而饱满，顶部稍平。雄花序为柔荑花序状，每朵雄花具1 个短柄，上有3 0 个以上花药柄， 每柄上有一对花药。每l 朵雌花有1 个珠柄，珠柄上端着生2 个胎座，每胎座着生1 个胚 珠。银杏种子的核圆形有= 棱的为雌株，核尖头有三棱的为雄株。虽然凭外部形态特征来 鉴别银杏性别，方法简单易行，但要等植株达到一定年龄，一定大小，因而早期鉴定存在 一定难度，而且形态指标差距甚大，缺少数字化和图谱的明确标准，易发生错误5 7 3 5 钔。 1 3 2 银杏性剐决定的细胞遗传学研究 有关银杏性别决定的细胞遗传学研究始于上世纪初，h e r z f e l d 对银杏前胚形成的研究 认为，雌雄染色体在结构和分裂行为上可能存在着差异晒钔。e i c h o r n 观察到染色体有随体 的存在，并认为该结构可能与性别决定有关。s a x 等首次报道银杏的核型，未发现性染色 体哺。t a n a k a 发现雄株染色体稍大于雌株染色体，但也不能直接证明有性染色体的存在 6 。 n e w c o m e r 仅观察雄株小孢子染色体，指出其一对大染色体有二种类型，约一半为中部着丝 点染色体，另一半为亚中部着丝点染色体，他推测这种现象可能与性别决定有关嗽3 。 c l l e e ( 李正理) 及p o l l o c k 对大量银杏雌雄株的有丝分裂和减数分裂细胞的染色体进行 6 银杏雌雄株性别差异的比较研究 了观察，发现雌株有4 条染色体有随体，雄株只有3 条染色体有随体，他指出银杏的性别 决定机制是x y 型，第1 2 对染色体为性染色体。在雄株中的1 对最短的亚端部着丝粒染色 体中，只有其中的l 条染色体上出现随体，因此认为这一对染色体即为性染色体哺3 州 。 陈瑞阳和h o n g 研究认为，最长的1 对中着丝粒染色体短臂上的随体的形态及c 带显带在 雌雄株中是不同的，雄株为z z ，随体大小相等，雌株为z w ，随体大小不同，第l 对染色 体为性染色体哺5 ，矧。陈学森研究认为性别决定机制为x y 型，但认为性染色体是第1 0 对 染色体，雌株4 条染色体上有随体，雄株3 条染色体上有随体。雌株第1 0 对亚中部着丝 粒染色体的长臂上各有1 个随体，而雄株第1 0 对亚中部着丝粒染色体的长臂上仅有1 个 随体，属异型染色体哺 。上述研究认为，银杏的性染色体识别特征集中反映在随体的数 目和形态变异上。何梅、李懋学认为n o r ( 随体) 的数目或大小均不能作为性染色体区别 的特征，因为个体或居群之间n o r 具有多态现象瑚1 。关于银杏的性染色体，在光学水平 下从形态和结构上是很难区分的，因此，需要进一步从分子水平开展研究。 1 3 3 银杏性别决定的分子标记研究 上世纪8 0 年代发展起来的分子标记技术是组可以检测出大量d n a 位点差异性的分子 生物学技术，它是在遗传信息的载体d n a 水平上研究不同生物个体间的差异，不受环 境条件、发育阶段、不同器官和组织的影响，而且基因组d n a 的变异非常丰富，分子标记 的数目几乎是无限的，因此，利用分子标记技术，寻找两性间的差异，为雌雄异株的性别 鉴定和性别决定机制提供可靠的理论和实践依据成为一条有效的途径嘲7 0 ，7 。 谭晓风等对1 5 个银杏品种进行了r a p d 分析，结果表明5 个品种之间在分子水平上存在 很大差异，并且构建了银杏r a p d 分子遗传图谱 羽。王晓梅、陈瑞阳等利用r a p d 技术，探 讨银杏两性间的基因组差异，筛选与性别相关的分子标记，只有一个单引物的一个位点表 现出性别差异阻扪。王晓梅、陈瑞阳等还利用a f l p 技术筛选与银杏性别相关的分子标记， 经s o u t h e r n 点杂交证实有两个标记为银杏雌性基因组所特有盯”。张建业等为探索银杏性 别鉴别的方法，克隆了银杏雄株l f y 全长基因，为在分子水平上研究银杏开花调控机理奠 定了良好的基础口朝。刘叔倩等应用r a p d 标记技术分析银杏2 8 个变异类型( 品种) 的遗传分 化及其遗传多样性水平，结果显示供试银杏样品遗传多样性水平较低，样品间遗传关系较 近阿酗。而陈月琴等通过对银杏雌株的研究认为：形态上仅有很少变化的银杏，其个体之间 有明显的分子差异，表明该类植物形态上的变化与分子进化的不一致1 。r u h u lh k u d d u s 等从美国本土不同地区采取了银杏的叶片，通过r a p d 分析和s o u t h e r n 杂交，探讨了不同地 区银杏的遗传多样性7 钔。m u r i e l 等通过p c r 技术研究发现，m a d s b o x 基因在银杏的基因 7 银杏雌雄株性别差异的比较研究 组里面的表达呈多样性，通过种系分析，认为g b m 5 基因是a g a m 0 u s 的同源基因，随后对 g b m 5 基因的克隆、测序、分析，详细研究了其结构，又通过反转录p c r 技术发现其主要在 花和茎里面表达例。 银杏雌雄株之间的差异归根结底是d n a 分子之间的差异，利用分子生物学技术在d n a 分子水平上去研究雌雄株之间的差异性，从中找到鉴别雌雄株的特异性d n a 片段，对此进 行测序，进而制备d n a 探针或试剂盒，使得人们在幼苗期就能够对银杏雌雄株的性别进行 鉴定。同时，分子生物学鉴定也将成为一种可靠的鉴别途径，也可能是最终解决银杏雌雄 株鉴定、确定其性别差异机理的最好办法渤，8 1 皿3 。 此外，还通过对银杏的生理生化8 3 ，8 钔、同工酶8 5 8 酏、特异蛋白质8 7 ，8 83 等研究来鉴 别银杏的雌雄。 1 4 研究意义 银杏属于银杏科( 贷m 譬n a c e ) ，此科仅有银杏属( 矗抽g 曲。银杏又名白果，其种子 形态似杏而种皮和胚乳为银白色，遂命名为银杏。银杏是现有世界上种子植物中最古老的 孑遗植物，也是起源于中国的特有珍贵树种，在第四纪冰川期后，由于山脉隆起，世界各 地银杏灭绝，只孑遗一个种留在了中国，现日本、朝鲜以及欧美所有的银杏，均系直接或 间接从中国引种的啪1 。因此在学术界银杏一向被称为“活化石”，在植物学研究中具有重 要的科学价值蛾9 0 ，9 1 翔1 。 银杏是多用途树种，在营莠、医疗保健、观赏绿化和生产用材等方面都具有重要的价 值。它的材质优良，是雕刻、建筑、家具、装潢等高级用材。种仁内含有丰富的营养成分 和独特的化学物质，是著名的高档营养保健食品、药品，也是我国传统大宗出口商品之一。 银杏树寿命可达3 0 0 0 多年、树姿挺拔、秀丽、树形古雅、叶形特异、抗病抗虫抗污染能 力、环境适应性能都比较强，是当今国内外园林绿化、美化、盆景加工欣赏等的理想树种。 尤其是在银杏叶中含有黄酮、双黄酮及银杏内酯等多种生理活性物质，是重要的医药、化 妆、美容药物的原料，具有扩张血管、改善血液循环、降低脑血管阻力、抑制血栓形成、 改善脑细胞代谢水平及清除人体内的自由基等作用，特别是在治疗老年心脑血管系统疾病 和抗衰老方面具有独特疗效9 3 彤，5 ，们。 银杏现已在我国2 0 多个省、市、区、普遍种植栽培哼 。但是由于银杏是严格的雌雄 异株树种，雌株在果实成熟时具有一种特殊的臭味，落果污染城市和行人，因此，城市园 林绿化不宜多种，而以生产白果为目的银杏栽培主要需要雌株。但要想分辨出雌雄性别， 必须要等到性器官的成熟，而银杏的实生苗定植后般需要2 0 3 0 年才能开花结果，分 r 银杏雌雄株性别差异的比较研究 出雌雄，这样不仅浪费了土地和时间，而且浪费了人力和物力。因此，弄清楚银杏雌雄之 间性别决定和性别分化的机理和机制，摸索出一套快速、准确、简便、易行的银杏性别鉴 定的方法，不仅具有重要理论意义，而且也具有重要的实践价值。 其次，研究银杏的性别决定机制，不仅在理论上为银杏乃至雌雄异株植物之间的性别 决定机制提供理论依据，也在实践上为早期、快速、可靠的鉴别银杏的雌雄性别提供可行 性参考。 2 材料与方法 2 1 材料 银杏的雌株和雄株分别采自于国家自然保护区龙池曼南麓的嵩县白河乡下寺村的唐 朝银杏林、嵩县国家森林公园自云山的五马寺千年银杏林、河南师范大学生物园地成年银 杏树、河南师范大学一号教学楼前成年银杏树。银杏的性别通过其花的结构来鉴定。 2 2 方法 2 2 1 雌雄株的染色体制片与观察 ( 1 ) 取材：于三月中旬分别取河南师范大学生物园地和国家自然保护区龙池曼南麓 的嵩县白河乡下寺村的唐朝银杏林成年的已知性别的雌雄株幼叶、雌株的胚珠。 ( 2 ) 固定：用o 0 2 秋水仙素预处理4h ，转入卡诺氏固定液( 无水乙醇：冰醋酸= 3 ：1 ) 中固定2 4h ，然后转移到7 0 酒精中保存。 ( 3 ) 染色与制片：在室温条件下，取保存的银杏材料，蒸溜水冲洗，而后用1 m o l 几 盐酸解离5 0 m j n ，取出用蒸溜水冲洗几遍，取叶基部，制片，滴上改良品红染液染色3 0 m i n ， 压片。 ( 4 ) 观察：选择分散好、处于分裂中期的染色体进行染色体数目的确定，同时进行 核型分析，按l e v a n 蚓的核型标准进行染色体分析。 2 2 2 花粉母细胞的减数分裂制片与观察 ( 1 ) 取材：取河南师范大学生物园地和河南师范大学一号教学楼前成年银杏树的雄 株的雄花序，以及嵩县白河乡下寺村的唐朝银杏林。 ( 2 ) 固定与保存：在卡诺氏固定液中固定2 4h ，然后转移到7 0 酒精中保存，待用。 ( 3 ) 制片：在室温条件下，取一个雄花序，蒸溜水冲洗，挤压出花粉母细胞，改良 品红染液染色3 0m i n ，压片，显微镜观察，拍照。 9 银杏雌雄株性别差异的比较研究 2 2 3 雌雄株的同工酶研究 ( 1 ) 提取：取嵩县国家森林公园白云山的五马寺千年银杏林雌雄株的幼嫩和成熟叶 片。把适量新鲜叶片置于冰冻过的研钵中，加t r i s - h c l 提取缓冲液( p h 7 5 ) ，充分研磨， 然后在1 0 0 0 0 r p m 和4 条件下离心2 0 m i n ，取上清液，放入一2 0 冰箱保存备用，用时以 l o ：l 的比例加入溴酚蓝( 溴酚蓝为1 ) 作为指示荆。 ( 2 ) 凝胶制备：用电泳槽前，先把玻璃板洗净，擦干，装好，以备用，然后配7 的分离胶，灌注胶柱，待分离胶凝固后，配制3 的浓缩胶，直接倒去水，用滤纸条吸干 水分，灌好浓缩胶，插上梳子，3 0 m i n 胶即可凝固。 ( 3 ) 点样：采用1 0 孔梳子，加入上样缓冲液2 0 u l 孔，此过程中，要先加入t r i s g l y 电极缓冲液( p h 8 7 ) ，再点样。 ( 4 ) 电泳：采用浓缩胶7 0 v 电压，分离胶1 3 0 v 电压条件下，进行电泳，等到样孔中 的黄色物质跑到接近下线后即可拆板。 ( 5 ) 染色： 过氧化物酶染色：用醋酸联苯胺法：用1 2 5 m l 醋酸联苯胺溶液( 0 1g 联苯胺加入o 9 m 1 醋酸，再加入3 6 m l 水) ，加入0 5 m 13 的h 。0 ：，再加2 3 m l 水，室温染色2 3 m i n ，即可 观察到棕红色的过氧化物酶带，染色充分，倒掉染液，用蒸馏水冲洗2 3 次，照相。 酯酶染色：把胶放入染液( t r i s h c l 5 m 1 ，p h 6 o + 4 5 m 1 水+ q 一萘乙酸2 m l + b 一萘乙酸 2 m l ，摇匀) ，放到暗处，室温，1 5 i n ，再加入固蓝r r 盐溶液( 1 0 9 几) 1 0 m l ，3 7 保温5 m i n ， 出现酶带后，倒掉染液，用蒸馏水冲洗2 3 次，照相。 谷氨酸脱氢酶染色：2 5 l 的o 0 5 m 的t r i s h c i 缓冲液( p h 8 o ) ，加入1 6 滴o 5 m 的l 一谷氨酸钠，再加入0 0 2 5 9 的氯化钙，再加入8 滴1 n a d 、8 滴l n b t 、2 滴1 p m s ， 充分混匀后即成谷氨酸脱氢酶染色液。电泳完毕后取出凝胶，先置于谷氨酸脱氢酶染色液 中室温下暗处温育、过夜，至出现清晰条带为止，显色完毕后，然后拍照。 苹果酸脱氢酶染色：先配制a 和b 缓冲液。a 为o 2 m 的t r i s h c i 缓冲液( p h 8 o ) ，b 为0 0 1 m 的碳酸钠和o 0 1m 的苹果酸缓冲液，然后将1 0 m 1a 缓冲液，5 m 1b 缓冲液，2 5 m g 辅酶i ( n a d ) ， 1 5 m g 氮蓝四唑( n b t ) ，2 m g 吩嗪甲硫酸( p m s ) 和3 5 m l 蒸馏水充分混匀即成 苹果酸脱氢酶染色液。电泳完毕后取出凝胶，先黄于苹果酸脱氢酶染色液中3 7 染色1 5 h ，至出现清晰条带为止，显色完毕后，然后拍照。 以上四种同工酶染色后记录迁移率( r f ) 值，r f = 酶带迁移距离溴酚蓝迁移距离。 1 0 银杏雌雄株性别差异的比较研究 2 2 4 雌雄株的r a p d 研究 2 2 4 1 基因组d n a 提取( c t a b 法) 取下寺村的银杏雌雄各1 0 株，然后取o 4 9 银杏幼叶在液氮中迅速研磨，将粉状物转 入7 m 1 离心管后，加入2 m 16 5 的2 c t a b 提取介质，再加2 0 u 1b 一巯基乙醇，混匀， 放入6 5 水浴保温6 0 m i n ；冷至室温加入等体积的氯仿异戊醇( 氯仿：异戊醇= 2 4 ：1 ) ，缓 慢翻转离心管，使内含物充分混匀后形成乳浊液，在6 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 使分层，取出水 相转入另一离心管；重复上一步，直到中间的白色界面消失，在抽出后的水相中加入2 3 体积冰冷的异丙醇，置一2 0 3 0 m i n 或过夜，在1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 收集沉淀，室温下晾 干；将此沉淀溶于合适体积的( 2 0 0u l 3 0 0 u 1 ) o 1 t e 缓冲液，转入1 5 m l 离心管中， 加入2 3u l 的r n a s e 储备液( 1 0 g 1 ) ，在3 7 保温1 h ；保温后用等体积的氯仿异戊 醇再抽提一次，将水相转入另一离心管，加入1 5 体积1 0 m 0 1 l 的n u c ( 使其浓度为 2 m o l l ) ，然后加入2 体积冰冷的9 5 乙醇，在一2 0 放置至少3 0 m i n ；在1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ， 收集沉淀；加入7 0 乙醇洗沉淀( 6 0 0 0 r p m 离心1 0 i n ) ，在温室下晾干；视沉淀的多少而 溶入适量的( 2 0 0 3 0 0 u l g 新鲜组织) o 1 t e 缓冲液，分装后放入一2 0 储存或放入4 待 用。 2 2 4 2 电泳分析检测d n a 的完整性 取5u ld n a 样品，l u l6 上样b u f f e r 在p ”a f i l m 膜上混匀，在o 8 的琼脂糖凝胶 上电泳，髓染色，在紫外透射反射仪上观察并用数码照相机拍照。 2 2 4 3p c r 扩增 引物、d n t p 、t a q d n a 聚合酶均购自上海生工公司； 2 5 u l 反应体系： 1 0 p c rb u 抒打2 5 u l m g c l 2 ( 2 5 m n l o l l ) 2 0 l l l t a g d n a e5 洲 o 3 u l o 5 u lm o l ，l 引物 o 5 l l l d n t p1 0 n 蚰o l l o 6 u l 基因组d n a ( 1 0 l o o n 曲 o 5 u l d d h 2 0 18 6 u l p c r 反应程序： 9 8 6 m i n ： 1 1 银杏雌雄株性别差异的比较研究 共4 0 个循环 8 个循环，9 4 l m i n ，3 6 1 m i n ，7 2 2 m i n 3 2 个循环，9 4 3 0 s ，3 6 1 m i n ，7 2 2 m i n ； 7 2 8 m i n ： 2 2 4 4 扩增产物的电泳检测 取1 0u 1 反应产物，与2u 1 上样b u f f e r ( 含0 2 5 溴酚蓝，4 0 蔗糖水溶液) 混匀，点 入含0 5u g 1e b 的1 8 琼脂糖凝胶中，在6 0 v 电场强度下电泳2 5 h ，取出凝胶，在紫 外透射分析仪上观察、拍照。 2 2 。5 特异片段的回收、克隆与测序 2 2 5 1 特异片段的回收 将p c r 产物在1 5 的琼脂糖凝胶上电泳，同时加s m 0 3 2 1d n a r k e r ( 购自上海生 工) ，然后用u n i q 一1 0 柱式d n a 胶回收试剂盒( 购自于上海生工公司) 回收特异片段，操 作步骤如：用琼脂糖凝胶电泳将目的d n a 片段与其它d n a 尽可能分开，然后用干净的手术 刀割下含需要回收d n a 的琼脂块，放入1 5 m 1 离心管中。判定d n a 片段的位置时尽可能使 用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短；4 0 0 u l 1 0 0 m g 琼脂糖凝胶的比例加 入b i n d i n gb u f f e r ，置于5 0 6 0 水浴中1 0 m i n ，使胶彻底融化。加热融胶时，每2m i n 混匀一次；将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的u n i q _ l o 柱中，室温放置2m i n 。8 ， 0 0 0 r p m 离心1m i n ；取下u n i q 一1 0 柱，倒掉收集管中的废液，将u n i q l o 柱放入同一个 收集管中，放入5 0 0 u lw a s hs 0 1 u t i o n ，8 ，0 0 0 r p m 室温离心lm i n ；重复一次；取下u n i q 一1 0 柱，倒掉收集管中的废液，将u n i q 一1 0 柱放入同一个收集管中，1 2 ，0 0 0 r p m 室温离心1 5 s ； 将u n i q 一1 0 柱放入一根新的1 5 m l 离心管中，在柱子膜中央加3 0 u le l u t i o nb u f f e r 或 水( p h 7 0 ) ，室温或3 7 放置2m i n ；1 2 ，0 0 0 r p m 室温离心1m i n ，离心管中的液体即 为回收的d n a 片段，可以使用或保存于一2 0 冰箱中备用。 2 2 5 2 特异片段的克隆 ( 1 ) 回收产物的连接： 回收的产物连接到p g e m t ( 购自p r o m e g a 公司) 载体上，标准反应如下： t 4d n a 连接酶的2 快速连接缓冲液5 p 1 p g e m 舻t 载体( 5 0 n g ) l “1 p c r 产物 3 肛l t 4d n a 连接酶( 3w e i s s 单位“1 ) 1 p l 上述体系混匀后在p c r 仪里2 0 保温9 0 m i n ，再放入4 冰箱里过夜。 1 2 银杏雌雄株性别差异的比较研究 ( 2 ) 感受态细胞的制备方法( c a c l 。法) 从l b 平板上挑取j m l 0 9 单菌落，接种于2 0 m ll b 液体培养基中，3 7 下振荡培养 ( 2 0 0 r p m ) 1 2 h 左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1 ：1 0 0 1 ：5 0 的比例接种于5 0 m l l b 液体培养基中，3 7 振荡培养( 2 0 0 3 0 0 r p m ) 2 3 h 至o d 6 。= 0 5 左右；在无菌条件下 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的7 l 离心管中，在冰上放置1 0 分钟， 使培养物冷却至o ；于4 下以4 0 0 0 r p 离心1o i i l i n ；倒掉培养液：以1 4 m l 用冰预冷 的o 1 m o l l c a c l 。重悬每份沉淀，放置于冰浴上3 0 m i n ；于4 用4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ；倒 出培养液；每7 m 1 初始培养物用2 4 0 u 1 冰预冷的0 1 m o l l c a c l ：重悬每份细胞沉淀，放置 1 2 4 h 后使用，或加入1 5 甘油。 ( 3 ) 连接产物转化大肠杆菌 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取2 0 0 u 1 转移到无菌的微量离心管中， 每管加d n a 体积 1 0 u 1 ，d n a 5 0 n g ，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置3 0 m i n ；将管放 到预加热到4 2 的水浴中，放置9 0 s ，不要摇动试管；快速将管转移到冰浴中，使细胞冷 却l 2 m i n ；每管加8 0 0 u 1l b 培养基。用水浴将培养基加温至3 7 ，然后将管转移到3 7 摇床上( 1 5 0 r p m ) ，温育4 5m i n 使细菌复苏，并表达质粒编码的抗生素抗性基因( 彳皿矿) ； 将上述菌液摇匀后取2 0 0 u 1 涂布于含a p 的筛选平板上，正面向上放置3 0 m i n ，待菌液完全 被培养基吸收后倒置培养皿，3 7 培养1 6 2 4 h ，可出现菌落。 ( 4 ) 阳性重组克隆的筛选与鉴定 挑取含氨苄青霉素的l b 固体培养平板上长好的单菌落，置于5 m ll b 液体中，振荡培 养1 2 h ，高温( 9 9 ) 裂解菌液后，取l u l 作为模板进行p c r 反应，反应条件同2 2 4 3 ， 然后取1 0u 1 反应产物，与2u l 上样b u f f e r ( 含o 2 5 澳酚蓝，4 0 蔗糖水溶液) 混匀，点 入含o 5u g m le b 的1 8 琼脂糖凝胶中，在6 0 v 电场强度下电泳2 5 h ，取出凝胶，在紫 外透射分析仪上观察并用数码照相机拍照。 ( 5 ) 碱裂解法提取质粒 取l m l 阳性克隆菌液4 以1 2 0 0 0 r p 离心3 0 s 吸去培养液；将细菌沉淀重悬于1 0 0 u 1 用冰预冷的溶液i ( 5 0 舢0 1 l 葡萄糖，2 5 硼0 1 l t r i s c l ，1 0 衄o l le d t a ) 中，剧 烈振荡，冰上放置1 0 m i n ，加2 0 0 u 1 预冷的溶液i i ( 0 2m 0 1 ln a o h ，l s d s ) ，快速颠 倒离心管5 次，冰上放置5 1 0 m i n ；加1 5 0 u 1 预冷的溶液( 5m 0 1 l 乙酸钾6 0 m 1