（植物学专业论文）植物细胞包被系统酸性降解及生物学效应.pdf

摘要 摘要 以烟草叶片为培养材料，进行愈伤组织诱导培养试验，研究植物细胞包被系统酸性 降解。利用光学显微镜、透射电镜、原子力显微镜和荧光显微镜观察整个愈伤组织诱导 过程中细胞包被系统的形态学变化。应用酶联免疫法( e l i s a ) 和高效液相色谱法同发检 测培养材料的细胞内源激素和单糖、多糖含量变化。探讨植物细胞发生脱分化的外部环 境条件和细胞内所发生的生物学效应。研究发现在酸性培养基上植物材料的细胞包被系 统发生酸性降解是细胞发生脱分化的关键环节。 分别取两种培养条件下的正常烟草叶片，即盆栽实生苗和组培继代苗的叶片外植体 进行诱导培养。在愈伤诱导培养过程中，使用激光共聚焦显微镜和p h 计同步测定了发 生脱分化过程中细胞内和培养基的p h 值。发现在烟草叶片外植体愈伤组织诱导过程 中，盆栽实生苗和组培继代苗的培养基的初始p h 值低于正常细胞内的p h 值，说明进 行诱导培养的外植体细胞生长于酸性条件下。并且利用光学显微镜、透射电镜、原子力 显微镜和荧光显微镜观察了烟草盆栽实生苗和组培继代苗的叶片外植体愈伤诱导过程中 细胞壁、质膜和微管的形态学变化。在诱导愈伤初期，细胞内p h 大幅度降低与形态学 观察发现的细胞壁和质膜变得粗糙微管解聚开始发生降解的时间吻合。说明细胞内的 h + 大量集中在细胞壁的某个区域导致细胞壁降解，进而引起细胞的酸性生长。在诱导末 期，细胞内p h 值先骤然降低后大幅度升高与具有胚性愈伤组织形成的时间相吻合。 分析了两种不同培养条件下的盆栽实生苗和组培继代苗的内源激素a b a 、g a 。 z r 、i a a 含量和a b g a 3 比值和单糖、多糖的含量变化。结果发现g a 3 在诱导培养初 期大量增加，与细胞内p h 大幅度降低的发生时间一致，表明内源g a 3 是培养初期细胞 内p h 值降低的直接影响因子。内源a b a 在诱导培养末期与细胞内p h 的变化相近，表 明a b a 在培养末期与细胞内p h 关系密切。a b a 含量越高越容易促进胚性愈伤组织的 发生，a b a 、a b g a 3 、g a 3 与愈伤组织的胚性发生呈正相关，是诱导胚性愈伤组织发 生的必要条件。z r 的强烈合成有利于愈伤组织的诱导，但是一旦愈伤发生，其需求量 可能也随之降低，只要维持愈伤组织的生长即可。组培继代苗的内源i a a 在诱导培养 中与愈伤组织的发生成正相关，盆栽实生苗的i a a 含量始终处于下降趋势，可能是由 于材料的生长条件不同造成了内源激素表达上的差异。对于单糖和多糖的测定结果表 明，当细胞包被系统容易发生酸性降解时，细胞内葡萄糖、蔗糖和果糖的含量增加，说 明细胞包被系统的酸性降解使得一部分细胞壁多糖纤维分解为易被细胞吸收的糖，也使 得细胞更易吸收外界多糖并且将其分解为单糖。细胞包被系统的酸性降解同时也需要葡 萄糖和蔗糖等的填充。 关键词植物细胞包被系统：酸性降解；脱分化；胚性愈伤组织；内源激素 a b s t r a c t i n d u c e dt h ec a l l u so 。l o b a c c o 锄ds t u d l e dt h em e c h a m s mo f p l a i l tc e l ld e d i 腩r e n t i a t i o n a 1 1 df i l n h e rv e r m e dt h et h e o r yo fp l a l l tc e l lc o a t ss y s t e ma c i dd e g r a d a t i o n ，t h em o r p h o l o g i c v a r i e t i e so fc e l lc o a t ss y s t e md u r i n gt h ec o u r s eo ft h ei n d u c i n gc a l l u st i s s u ew e r eo b s e n r e d t h m u 曲t h el i 曲tm i c m s c o p e ，t r a l l s m i s s i o ne l e c t r o nm i c m s c o p e ，a t o m i cf o r c em i c r o s c o p ea l l d f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e t h el e a fe x p l a n t sw e r em e a s u r e dt 1 1 e e n d o g e n o u sh o m l o n e s 埘t l l e l i s aa i l da n a l y z e dm o n o s a c c h a r i d ea n dd i s a c c h a r i d ea n dp o l y s a c c h a r i d e s 、j mh p l c t h i s s t u d yi n v e s t i g a t e dt l l ee x t r a c e l i u l a re n v i r o n m e n tc o n d i t i o n sa n d t l l ei n 仃a c e l i u l a rb i 0 1 0 9 ye 岱：c t s i 1 1t h ep r o c e s s i o no fc e hd e d i 虢r e n t i a t i o n t h er e s u l to fa n a l y z i n ga c i dd e g r a d a t i o no fc e l l c o a t ss y s t e mo fp l a n te x p l a n t sc u l t u r e di na c i dm e d i u mw e r e 也ek e yf 她t o r st og e n e s i so f p l a | l tc e l ld e d i 疵r e n t i a t i o n n l et w ok i n d so ft o b a c c o1 e a fb l a d eg r o w e di ns o i la n dc u l t u r em c d i u mr e s p e c t i v e l yw e r e c u l t u r e dt oi n d u c e dc a l l u s l a s e rs c 姗i n gc o f o c a lm i c r o s c o p e ( l s c m ) w a sa d o p t e dt od e t e c t t 1 1 ei n t m c e l l u l a rp ho ft w ok i n d so fl e a f “p l a n t sa n dc u l t u r em e d i u mw a sd e t e c t e db yp h d e t e c t i o nd u r i n gm ec o u r s eo fi n d u c i n gc a l l u s i nm i ss t u d yt 1 1 eb o t hp hv a l u eo fc u i t u r e m e d i u mw a sl o w e rt h a nn o n n a ll e a fi n t m c e l l u l a r ，i n d i c a t i n gl e a fe x p l a n t sc a l l u s t i s s u ew a s i n d u c e du n d e rt t l ea c i dc o n d i t i o n t oo b s e et h em o r p h o l o g i cv 撕e t i e so fc e l lw a l l ，p l 猢a m e m b r a l l ea n dm i c r o t u b u j et h r o u 曲t h el i g h tm i c r o s c o p e ，t i 锄s m i s s i o ne l e c t r o n1 i l i c r o s c o p e ， a t o m i cf o r c em i c r o s c o p ea n dn u o r e s c e n c em i c m s c o p e f i n d i n gt h ep e r i o do ft i m ew a si n u n i s o nb e t w e e nt l l et i m ew h e ni n t m c e l l u l a rp ht o o kp l a c ev i o i e n td i v e r s i n c a t i o na 1 1 dm e g e n e s i so fa c i dd e g r a d a t i o na n de m b r y oc a l l u s t or e v e a la 夸e a tn u m b e ro fi n t r a c e l l u l a rh 十 g a t h e r e di ns o m er e g i o no fc e l lw a l la n dr e s u l ti nc e l l w a l la c i dd e g r a d a t i o nt of h r t h e rc a u s e a c i dg r o w t l l m e a s u r e dt h ee n d o g e n o u sh o r i n o n e sc o n t e n to fa b a ，g a 3 ，z r ，n aa n dt h cr a t eo f a b g a 3 ，a n da n a l y z e dm ec o n t e n to fm o n o s a c c h a r i d ea n dd i s a c c h a r i d ea i l dp o l y s a c c h a r i d e s a 直1 a l y z e dt h ee n d o g e n o u sh o 咖o n e sc o n t e n ti nt w ok i n d so fl e a fe x p l a n t sc a l l u s 丘o md i 丘e r e m g r o w me n v i r o m e n t ，m ec o n t e n ta f l dm i x t u r er a t i oo fe n d o g e n o u sh o 兀i l o n e s 、v e r eo n eo ft 1 e k e yf a c t o r st h a tc a na 毹c tm eg e n e s i so fc a l l u sa i l de m b r y oc e l l a sar e s u l t ，t h et i m em a t e n d o g e n o u sg a 3i n v o l v e dal a r g ei n c r e a s ea tm eb e g i r u l i n go fi n d u c e dc u l t u r ew a sc o n f o 瑚e d t om a tag r e a td e c r e s eo fi n t r a c e l l u l a rp h ，w h i c hs h o w e dt l l ei n t r a c e l l u l a rp hw a sd i r e c t l y 珊b c t e db ye n d o g e n o u sg a 3 t h ee n d o g e n o u sa b aa l s ow a ss oc l o s e l yi d e n t i f i e dw i 1 i n t r a c e l l u l a rp ha tt h ee n do fi n d u c i n g i nd i 仃c r e mc a l l u s ，t h ec o n t e n to fe n d o g e n o u sa b a ， g a 3a i l dm er a t eo fe n d o g e n o u sa b a g a 3s h o w e dg r e a tp o s i t i v er e l a t i v i t yt ot h ee m b r y o g e n e s i s 1 1 1 ei n t e n s es y n m e s i so fe n d o g e n o u sz rw a sb e n e f i c i a lf o ri n d u c e dc a i l u s ，b u tt t l e d e m a l l dq u a n t i t yt oe n d o g e n o u sz r 、v o u l dr e d u c ew h e ni th a sb e e ni n d u c e dt h ec a l l u s t h e c o n t e mo fe n d o g e n o u si a ai t h el e a fe x p l a n t sg r o w e di nc u l t u r em e d i u r ns h o w e dp o s i t i v e r e l a t i v 时t ot h ec a l l u sg e n e s i s b u tt h ec o m e n to fe n d o g e n o u si a a i nt h cl e a fe x p l 卸t sg m w e d i ns o i l 、v a sa l w a y sf m l t h ed i f r e r e m i a t i o no fe x p r e s s i o no fe n d o g e n o u sh o n n o n em a yb e c a u s e d i 虢r e n tg r o w i n gc o n d i t i o n so f p l a l l tl e a t h er e s u l t st h a tt h ei n c r e a s i n gc o n t e n to f g l u c o s ea 1 1 d s u c m s ea i l df m c t o s ew b e np l a i l tc e l lc o a t ss y s t e mw a se a s yt oa c i dd e g r a d a t i o ni n d i c a t e dt h e d e g r a d a t i o nm a d ep o l y s a c c h a r i d e ss e p a r a t ei n t ot h em o n o s a c c h a r i d et ob ea b s o r b e de a s i l yb y c e hw a l i t h e r e f o r ec e l lc o a t ss y s t e mn e e d e dt ob ef i l l e dw i t hg l u c o s ea n ds u c r o s ei nt i m eo f a c i dd e g m d a t i o n k e ) w o r d s p l a n tc e l lc o a t ss y s t e m ； a c i dd e g r a d a t i o n ；d i d c f r e r e n t i a t i o n e m b i y oc a l l u s ； e n d o g e n o u sh o 衄o n e 1 1 1 l 绪论 1 绪论 1 1 植物细胞包被系统( p l a n tc e l lc o a t ss y s t e m ) 的概念及形态结构 早在1 9 4 0 年c h 锄b e r s 提出细胞膜表面有一薄层附着命名为“c e uc o a t ”，1 9 6 6 年 j o n e s 对“c e l lc o a t ”的功能进行了研究旧】。植物细胞包被系统( p l a mc e l lc o a 乜 s y s t e m ) 最初是由d a v e y 在2 0 0 3 年提出的i “j ，主要包括细胞壁、质膜和微管。植物细胞 包被系统不仅是细胞的一个支持骨架，保护细胞不受侵染和机械损伤，而且还参与细胞 的生长、分化、信号识别和代谢等。 1 1 1 细胞壁 对植物细胞壁结构进行研究最早可以追溯到植物细胞的发现。自从r o b e r th o o k e r 在1 6 6 5 年用他自制的复式显微镜观察木栓切片时，发现了组成木栓的特有，j 、室，一 一细胞壁，后来的学者对细胞壁进行了大量的解剖学研究，研究结果表明，细胞壁是具 有一定弹性和硬度，存在于细胞质外并界定细胞形状的复杂结构。 在光学显微镜下，细胞壁可分为三个主要的层：中胶层( m i d d l el a y e r ) 、初生壁 ( p r i m a r yw a l l ) 和次生壁( s e c o n d a r yw a l l ) 。随着先进的分子生物学技术的广泛应用，人们 对细胞壁也给予了相当的关注。因为新技术的应用，细胞壁不再被认为是一个机械的支 架，而是一个活跃的代谢结构，积极参与细胞的生长、分化、识别、抗病等一系列过 程。人们对细胞壁的认识，更趋全面和客观，也更加符合细胞壁的真实面貌。 细胞壁不再是一种环绕植物细胞的惰性结构，而是在植物生长和发育过程中起着动 力学作用【7 】。植物细胞壁的结构和化学组成主要由多糖，其次也具有蛋白质和脂类物质 共同组成的浓厚的基质，大分子排列成三维网状结构1 8 】。不仅不同细胞的细胞壁具有不 同组成，不同的多糖成分在细胞壁的不同层次上分布也不同，甚至在单个细胞壁的不同 区域乃至不同面上的分布具有差异1 9 】。不同类型细胞的细胞壁，除了蛋白质的异质性以 及碳水化合物的组成具有特殊的表达模式外，还有一些其它的组分也表现出高度的可调 控性，这种变化在特定细胞的不同部位的细胞壁中也有表现 10 1 。细胞壁的许多成分随着 发育进程而发生变化。细胞壁不再是机械的惰性结构，而被誉为调整植物发育的软环境 【1 0 l2 1 1 1 2 质膜 质膜的结构非常复杂，主要是由脂质和蛋白质两类物质组成的复杂的超分子动态系 统。1 9 7 2 年s i n g e r 和n i c 0 1 s o n 提出的液态镶嵌模型，目前已得到人们的承认。液态 镶嵌模型认为质膜是一种可流动的、嵌有蛋白质的脂类双分子层结构。嵌入其中的蛋白 质具有多种功能，如离子通道、受体、及各种酶等。构成质膜的脂类主要有甘油磷脂、 鞘磷脂、类固醇和糖脂。这些脂类除了类固醇外，都有亲水的极性的头部和疏水的非极 绪论 性的尾部。脂类分子极性头部向外，疏水的尾部在内，构成质膜的基质脂双分子层。 质膜严格而有序地控制着细胞与外界环境之间的物质、能量及信息交换。担负质膜 各种特异生理功能的是膜结合蛋白【i ”，包括质膜结合a t p a s e 、质膜氧化还原系统、离 子通道等，其主要功能有质子跨膜运输、膜电位的建立、离子及其它溶质的吸收和转 运、信号传导、抗性等。 1 。1 。3 微管 微管( m i c r o t u b u l e s ，m t s ) 是真核细胞中普遍存在的蛋白结构，其与微丝 ( m i c m f i l 锄e n t ) 、中间纤维( i m e 珊e d i a t en l 锄e m ) 共同构成细胞质中三维网络结构的骨架 体系统( c y t o s k e l e t o n ) 。1 9 6 3 年，l e d b e n e r 和p o r t e 一”j 最先报道在植物细胞中存在微管 结构。随后微管被分离和纯化，并利用免疫荧光显微技术和电镜技术对植物微管进行了 广泛的研究，部分基因顺序也已测定。微管除了有骨架功能外，还在有丝分裂、胞质流 动、能量转换、信息传递、细胞分化、细胞伸长、极性确定和细胞壁的构建等方面起重 要作用，是当今细胞生物学研究中十分活跃的领域l l 6 j 。 微管是由微管蛋白组成的中空管状结构，直径约2 4m ，管壁厚约5n m ，中央空腔 直径1 5m ，其长度则变化很大。组成微管的基本结构单位为微管蛋白异二聚体 ( h e t e r o d j m e r i c ) ，其分子量约为i o o ，o o o 道尔顿微管蛋白异二聚体是由一微管蛋自、b 一微 管蛋白通过非共价键连接而成。两者的分子量都约为5 0 ，0 0 0 道尔顿。微管蛋白异二聚体 通过疏水键头尾相连形成直径为4 5 啪原丝( p r o t o f i l 狮e n t ) ，1 3 条原丝通过侧向连接形 成微管的壁。微管蛋白异二聚体的头尾相连形成了微管内在的结构极性，微管的这种极 性特征对微管行使功能至关重要。 微管在许多生理过程中发挥作用，因此微管在动植物细胞中展现出不同的排列方式 就不足为怪了。微管并非一种刚性结构，大多数微管是一种动态结构，能够快速的进行 聚合、解聚，并在空间上以特定的方式排列，而且随时重排以适应不断变化的外界环境 和细胞的自身要求。从早期的电镜研究来看，微管在细胞内的排列并非随机，而是围绕 着一个或多个特定的位点组织起来，这些位点即微管组织中心( m i c m t u b u l eo r g l l i z i n g c e n t e r m t o c ) 。高等植物细胞的m t o c 很可能是核膜m ”j 。也有人认为周质微管的组 织中心位于细胞的边缘区域【l9 】。微管组织中心不仅是微管组装的起始位点，而且是游离 微管末端的锚定位点，微管的组装是受微管组织中心控制的。 1 2 植物细胞包被系统的酸性降解与植物生长发育的关系 1 2 1 植物细胞包被系统酸性降解的理论 自gh a b e r l a i l d t ( 1 9 0 2 ) 提出的细胞全能性理论以来，植物组织培养技术得到了 迅速发展，其理论和方法逐渐趋于完善和成熟，并广泛应用于农业、林业、园艺、医药 等行业，产生了巨大的经济效益和社会效益。然而，对于植物组织培养的细胞学观察及 机理探讨均集中于外植体第一次无丝分裂或第一次有丝分裂之后的过程，第次分裂之 1 绪论 前是胚性细胞形成( 即脱分化) 的过程，这一过程一直受到研究者的忽视。祖元刚 ( 2 0 0 5 ) 等人研究提出植物细胞壁是控制植物细胞完成正常细胞周期的信号载体。并且 发现植物叶片的正常细胞在组织培养基和原生质体制备液的酸性环境下首先发生细胞壁 降解，进一步可能会促使去壁的原生体出现酸性快速分裂【2 l 趣l 。实验观察了拟南芥叶片 细胞壁和质膜在酸性条件下酶促降解和细胞内p h 值变化的过程。对喜树叶片外植体组 织培养过程中进行解剖学观察和p h 值检测，发现p h 值为5 8 的酸性培养基和喜树叶片 薄壁细胞内的酸性成分白泌可能共同诱导了细胞壁的酸性降解【2 ”】。植物细胞包被系统 的酸性降解使植物细胞器重组并产生新的原生质体成为可能【2 6 l 。l i l l l 【( 1 9 9 8 ) 刚曾提到 细胞伸长和生长需要较低的p h 值，但当胚性细胞发生时需要略高一些的p h 。祖元刚等 人在分子水平上检测了诱导愈伤的组织培养过程中b e c t l i n 基因的表达，表明烟草叶 片愈伤组织形成过程中可能产生了细胞程序化死亡，其结果可能导致烟草叶片原初形态不 同、功能各异的细胞在脱分化阶段形成了形态结构和功能完全相似的胚性细胞【2 8 1 。 关于细胞壁降解的问题已经有许多学者在研究【2 9 刊】。r a m o s ( 1 9 9 4 ) 【3 2 】研究鹰嘴豆 ( c f f e ，4 r 埘伽“研l ) 上胚轴细胞壁在p h 为1 时的酸性降解过程与p h 为5 5 时发生的细胞 壁由于酶的作用的自溶过程，发现两个过程所释放的较多的多糖量不同。在酸性降解过 程中主要释放高比例的醛酸多糖类，主要是阿拉伯糖，可能由于质子直接影响对p h 敏感 的富含半乳糖醛酸的胶质多糖。而酶参与降解的自溶过程主要释放的是单糖如半乳糖。 提出酸性降解在本质上不是由于酶引起的而是由于h 质子攻击细胞壁中对p h 敏感连接的 直接效果。c o s 汀o v e ( 2 0 0 1 ) 口3 】指出细胞壁包含一些酶可以改变壁结构，如糖苷酶可以 消除侧链，允许多糖骨架间更大的连接：转糖基酶可以切断或连接多糖之间的连接；酯 酶可以消除多糖间的酯连接等。这些酶可以改变壁结构进而调节细胞壁的扩展。水解酶 可以使壁本身变得微弱，但不能诱导壁扩展。扩展蛋白可以诱导细胞壁的扩展和压力的 缓解，但不能水解细胞壁基质的主要多糖也不能增加次胞壁可塑性和细胞壁多糖的灵活 性，作用在细胞壁上的物理效应是很微弱的。 祖元刚等人通过对拟南芥和喜树的细胞壁、质膜和微管的研究，在2 0 0 5 年首先提 出细胞壁酸性降解口3 0 5 1 ，进一步研究提出细胞包被系统酸性降解【2 “。植物细胞包被系统 酸性降解是指植物细胞包被系统在酸性环境下，由于质子作用于细胞包被系统结构组成 中对p h 敏感的连接键，使细胞包被系统的化学结构组成发生变化，进而引起一系列生 物学效应。本文以烟草为研究对象进一步进行验证。 1 2 2 植物细胞壁酸性降解与植物发育 现在普遍认为生长素影响细胞壁的强度，促进细胞伸长和分裂。这一作用机理可用酸 性生长假说( a c i dg m 州ht h e o r y ) 解释：( 1 ) 原生质膜上存在着非活化的质子泵( h + 一a t p 酶) ，生长素作为泵的变构效应剂，与泵蛋白结合后使其活化；( 2 ) 活化了的质子泵消耗 能量( a t p ) ，将细胞内的h + 泵到细胞壁中，导致细胞壁基质溶液的p h 下降：( 3 ) 在酸 性条件下，h + 一方面使细胞壁中对酸不稳定的键( 如氢键) 断裂，另一方面( 也是主要的方 1 绪论 面) 使细胞壁中的某些多糖水解酶( 如纤维素酶) 活化或增加，从而使连接木葡聚糖与 纤维素微纤丝之间的键断裂，细胞壁松弛；( 4 ) 细胞壁松弛后，细胞的压力势下降，导 致细胞的水势下降，细胞吸水，体积增大而发生不可逆增长。 1 2 2 1 决定细胞的命运 已有试验证实细胞壁在决定细胞命运中发挥作用。墨角藻的合子和二胞原胚中细胞 壁的存在，对胚胎早期极性轴的建立和模式建成是必要的【2 4 1 。当用激光破坏整个基细胞 时，剩余顶细胞只能发育成胚体，当只破坏基细胞的原生质部分而留下细胞壁时，顶细 胞连同基细胞的剩余细胞壁一起发育成完整的胚，且生成的胚柄可以不止一个。为了进 一步证实细胞壁的作用，用激光切割技术将形成假根的细胞去掉，保留完整的细胞壁， 结果己注定成为叶状体的细胞不断分裂和增殖，当其后代细胞接触到腾空的假根细胞壁 时，这些注定成为叶状体的细胞就改变发育命运，转变成假根细胞。用激光破坏基细胞 的细胞质和一部分细胞壁，结果显示，与假根细胞残留细胞壁相邻的叶状体细胞发育成 了假根，而与假根细胞被破坏的细胞壁部分相邻的叶状体细胞仍按原来的方向发育。由 此可见，其影响细胞分化的作用因子可能存在于细胞壁中，或与细胞壁的复杂成分尤其 是糖蛋白成分的存在有关1 3 4 ，3 ”。 重复的试验表明，空细胞壁确实能够决定那些接触到它的细胞的命运【2 2 j 。在拟南芥 的研究中，发现只有那些位于两个细胞之间的结合部位才能生长根毛。即使将两个相邻 的皮层细胞杀死只留下腾空的细胞壁，接触到皮层细胞之间的结合部位的细胞，仍然能 生长根毛。作者认为最符合逻辑的解释为：留下的才是皮层细胞真实的骨架，特化细胞 命运的信使位于细胞壁内【3 “。过去1 0 年，通过单克隆抗体的研究表明，在不同的类型 的细胞中，壁的成分随着发育的时间不同而表现出差异刚。m i c l l a e lh a l l n 认为：“很清 楚，植物合成的成分中含有大量的代谢能量，以便在特定的时问和地点流入壁中。如果 其目的只是为了形成一个支持植物细胞的空盒子，那还有什么必要? ”。有研究表明细胞 壁的不对称性作为一种位置信号启动一系列的极性事件，在高等植物的胚胎发生过程 中，细胞壁是否对胚胎发育命运产生影响需要进一步深入研究。 1 2 2 2 充当细胞发育的信使 细胞壁蛋白被认为是重要的质外体信号分子，在植物的生长发育中充当重要的信 使，主要有细胞壁结构蛋白、酶蛋白、功能尚未确定的蛋白质三大类。植物细胞壁的伸 展蛋白( h r g p s ) 、富含甘氨酸的蛋白( g r p s ) 、富含脯氨酸的蛋白( p r p s ) 和阿拉伯蛋白半 乳糖蛋自f a g p s ) 是植物组织中研究最为详细和深入的几种细胞壁蛋白滞j 。 阿拉伯半乳聚糖蛋白( a g p s ) 在植物发育调控上的重要性受到广泛关注，它们在发育 的不同阶段，在不同器官、组织、细胞中分别表达，从而使不同时间、空间存在的细胞 甚至同细胞的不同位置都具有异质性。a g p s 自有其复杂而又特殊的分布定位模式， 这种分布模式的产生与胚胎发生的潜力、细胞增殖的状态以及发育时期有着密切的关联 【”枷】。最近研究表明拟南芥的r s h 基因编码一个h y p r j c h 糖蛋白类型的细胞壁蛋白， r s h 定位在从少数几个单细胞到胚胎的整个发育阶段的细胞壁，对于胚胎的正常生长是 绪论 非常必需的【4 l 】。 1 2 。2 3 细胞壁影响胚性细胞早期的定向发育 细胞壁膨胀的空间调节在一个细胞内和不同类型的细胞之间有着巨大的区别，这种 差别大部分通过定向分泌来调节1 4 2 ，4 3 】。对墨角藻合予形态发生过程中细胞壁的分布状况 研究表明，合子不同部位细胞壁的超微结构具有很大区别1 4 。采用冰冻固定方法对烟草 合子细胞壁的研究表明，烟草合子珠孔端出现不规则排列加厚的细胞壁【4 5 】。拟南芥 e m b 3 0 突变体细胞壁的组成具有缺陷1 4 ”，如果可以探明拟南芥e m b 3 0 突变体的合子 和卵细胞细胞壁方面的缺陷，将是十分有意义的工作【4 8 】。植物细胞壁依赖它的分泌途径 来运送多糖复合物到特定位置，植物的分泌途径和细胞壁均因发育时期和组织的特异性 而发生改变【4 9 】。拟南芥g n o m 突变体合子的第一次不等分裂受到了影响，g n o m 蛋白参 与转运小泡的方向性运输，这种特异的运输可以稳定胚胎的顶一基极性，顶一基极性起 源于合子的极性，结果导致细胞的不均等分裂【5 5 2 】。k n o l l s 突变体则不同，在胚胎 发生的过程中表现细胞分裂的缺陷，胚胎不能通过培养进行拯救，而且细胞壁过量积累 胼胝质【5 。一种被称为膨胀素的结构蛋白引起了许多研究者的极大兴趣【5 4 1 ，在细胞生长 过程中，其细胞壁分泌一种膨胀素蛋白，以此解开细胞壁多糖网络，允许细胞的生长 h 。e x p a n s i n 基因在特定时间和特定地点特异表达，以此来发挥控制生长的功能。利 用装载有纯化扩张蛋白的珠子，诱导西红柿茎端生长点产生类叶状结构，而且植物的其 它部分还把诱导出的叶片认为是植株的真实结构1 5 ”。作者指出：“这就可以着手一项发 育程序，使非分化的细胞转变成叶，利用膨胀素能改变发育机制的特性，使其成为细胞 壁的一种决定成分”。 细胞分裂和拉长的比率和方向是植物胚胎发育过程中采用的关键机制。拟南芥合子 最初直径只有2 0 肚m ，但是在不等分裂之前顶一基轴向上伸长了三倍1 5 6 l 。细胞的伸长包 括细胞壁的物质沉积，机械压力的膨胀或者细胞壁的松弛。在烟草合子的休眠期间内， 合子经历了一系列精细的变化，纵轴和横轴之比、合子体积、细胞核的定向迁移、细胞 器的极性分布，这一系列的事件均可能与烟草的胚胎发育密切相关。在定向生长导致极 性建立的过程中，细胞壁的结构和成分是否随着时间和空间的变化而变化，这方面的系 统研究将为全面了解极性建立过程中细胞壁变化提供详实证据。 1 2 3 植物细胞质膜酸性降解与植物发育 随着高纯度质膜分离技术的发展和成熟【5 l “】及经二十年的研究，使植物质膜氧化还 原系统的普遍存在得到了证实，并使人们对其结构和功能有了深入的认识。质膜氧化还 原系统是指存在于质膜中的电子传递链( 包括电子供体氧化酶、电子载体和电子受体还 原酶等) ，通过氧化还原酶的作用和电子载体的氧化还原反应，将电子从供体物质传递 到受体物质。此过程在能量传递、许多合成或分解代谢的运转、营养物质吸收、生长发 育、信息传导和解毒、抵御病原物等方面起着重要作用【5 9 1 。 根据酸生长学说( a c i dg r o h h y p o t h e s i s ) ，植物细胞分泌的h + 可以酸化细胞壁，使 绪论 细胞壁联结松弛、水解酶激活，从而促进细胞生长f 6 0 】。由于质膜氧化还原系统释放h + 的特性，该系统也被认为与植物的生长有关【6 l “】。有不少文献报道也证实了上述观点。 b r i 曲t r n a n 【6 3 】研究指出，生长素可以刺激质膜氧化还原系统活性。 c a “c a m 拮抗剂能抑制跨膜电子传递和质子分泌1 6 2 1 ，证明了c a 2 + c a m 作用相关联 的生理生化过程与氧化还原系统的关系。有研究用e p r 技术进一步证实了c a ”- c a m 对 氧化还原系统的调控作用，从而证明了氧化还原系统与植物生长发育的关系。 1 - 2 4 植物微管酸性降解与植物发育 1 2 4 1 植物微管在植物有丝分裂中的作用 当细胞从间期进入分裂期时，间期细胞胞质微管网架崩解，微管解聚为管蛋白，经 重组装形成纺锤体，介导染色体运动。分裂末期，纺锤体微管解聚为微管蛋白，经重组 装形成胞质微管网。 纺锤体微管可分为以下类型：( 1 ) 着丝点微管：连接着丝点与两极的微管；( 2 ) 极微 管：从一极到另一极的连续微管；( 3 ) 中体微管：子染色体之间的微管；( 4 ) 星体微管： 组成星体的微管。 1 2 4 2 植物微管与细胞的生长 植物激素可以通过改变微管的排向控制纤维素微纤丝( c m f ) 在细胞壁中的排向， 排向上的差异决定着细胞的扩张或延伸方向。在伸长中的细胞内，细胞壁里所沉积的 c m f 与伸长轴互相垂直，而细胞壁中新形成的成圈的c m f 则限制生长中细胞宽度的再 增加，而膨压则促进细胞长度的增加。茉莉酸( j a ) 和茉莉酸甲酯( m e j a ) 则通过使 微管解聚而促进鳞茎膨大j 。 m u r c h i s o n 和k i r s c h e s 【6 5 】确认洋葱叶鞘细胞膨大导致鳞茎形成过程中包括微管 ( m t ) 的解聚。但f l t i n o 等 6 6 】研究马铃薯侧枝的近顶端区组织从伸长转为膨大时，只 看到m t 从t 型向l 型的转变。k o d a 【6 7 】用m e j a 气体 2 1 0 。6 m 0 1 ( 3 0 0 m 1 ) 处理马铃薯 侧枝2 4 h 后，其伸长量下降4 2 尽管也可看到m t 从t 型转变为l 型，但却看不到预 期中的细胞扩展以及结薯现象。这提示除了m t 排向的改变之外，还需有其他生理过程 的配合，才能引起细胞扩展。 f i s h e r 和c y r 【6 8 1 认为还应考虑信息的双向流动。他们发现用纤素合成抑制剂 ( i s o x a b e n ) 处理烟革细胞时，细胞不能伸长，周质微管也不能形成。除去后细胞又可以伸 长了，周质微管也重新形成。因此他们认为除了通常认为的周质微管的排列为伸长质膜 上的纤维素合成酶提供信息以外，微纤丝的合成及细胞的伸长也为周质微管的形成提供 信息。 w y m e r 等6 9 1 的实验表明，微管是植物细胞感应外力的成分。他们把烟草细胞原生 质体包埋在琼脂糖里，然后施加离心力。结果发现很多细胞中的微管的方向与施加的离 心力方向平行，而细胞伸长的方向则与离心力方向成6 0 。一9 0 。角。用微管解聚剂甲胺磷 短暂处理后，原生质体也伸长，但不再以某一方向为主。这些结果表明外力可以影响周 l 绪论 质微管的聚合，微管的聚合本身又是响应外力的成分。 1 2 4 3 植物微管与气孔保卫细胞的分化的关系 在保卫母细胞分成两个子细胞后和腹壁加厚之前，微管集中分布在腹壁中央区域以 内的质膜内侧，以后在此进行细胞壁的加厚。此处还可看到微丝与微管的平行排列，在 壁的加厚过程中微管的数量增加1 7 ”。 在洋葱和豌豆气孑l 保卫细胞的分化和发育过程中，椭圆形变成长哑铃形也是由于微 管排列方向改变引起微纤丝在轴方向上沉积的结果。在保卫细胞发育早期，应用秋水仙 素处理可全部破坏微管，结果细胞壁微纤丝的沉积纷乱1 7 “。 1 2 5 植物微管酸性降解与植物细胞质膜的关系 在细胞中，周质微管与质膜之间存在密切联系1 7 ”，有关这方面的报道很多，但还不 清楚微管和质膜是如何连接的，理论上有两种可能：( 1 ) 以多聚赖氨酸将原生质体粘到 载玻片上时，原生质体留在载玻片上的膜片段中有周质微管成分存在，说明微管可能直 接与质膜相连接【7 4 l ：( 2 ) 微管与质膜之间可能是通过内在膜蛋白或外周膜蛋白连接，但 目前这种蛋白还没有被发现。推测可能是一种外周桥蛋白在质膜的疏水区与膜上的微管 蛋白结合，而在亲水的周质环境中与微管结合，从而将质膜与微管联系起来。简令成等 【7 5 j 对小麦叶肉细胞周质微管的电镜观察发现周质微管与质膜之间存在密切联系，两者之 间有连丝结构( “桥”) 存在，但这种“桥”的成分还不清楚。此外周质微管与质膜相结合在 周质微管控制纤维素微纤丝的沉积方向中起作用【7 ”。 1 2 6 植物微管酸性降解与细胞壁的关系 1 2 6 1 微管参与细胞壁构建 植物细胞壁可分为初生壁与次生壁两部分。l 锄p o r t 和e p s t e i n 【7 7 】提出细胞壁结构的 “经纬”模型假说。即认为细胞壁是由两个交联在一起的多聚物一纤维素微纤丝网络( 经) 和伸展素网络( 纬) 交织而成，并悬浮在亲水的果胶半纤维素胶体中。以氢键结合在微纤 丝上的半纤维素木葡聚糖可能作为门锁控制微纤丝的滑动。当其发生转换时，门锁打 开，微纤丝在伸展素网孔之间滑动，因而细胞伸展生长。已有大量的研究表明，周质微 管与细胞壁微纤丝的沉积有密切的关系。一般认为信息是从周质微管传递到纤维素合成 复合体，从而形成微纤丝有序沉积【7 8 1 。研究较多的植物材料是导管、气孔保卫细胞、棉 纤维等。导管、气孔保卫细胞的优点是在细胞壁的特定部位上发生纤维素的沉积加厚。 棉纤维的特点是能持续不断地伸长，最长可达3 4c m ，轴比可达l ：1 0 0 0 3 0 0 0 ，是研究 细胞伸长及微管在参与细胞壁构建方面所起作用的良好材料。 1 2 6 2 微管排列与导管细胞壁的加厚 许多观察结果表明，微管的分布部位与导管壁微纤丝的沉积部位相对应1 7 ”“，因此 认为微管对壁的加厚起着指令性作用。p i c h e t th e a p s1 8 3 】最先试验秋水仙素对导管形成的 影响，结果表明，在导管建成的早期，经秋水仙素处理后，微管数量减少，从而阻止了 导管壁特定加厚类型的形成：在导管建成的后期，秋水仙素处理则无明显效果。进步 绪论 的试验显示，在导管的分化初期，经秋水仙素破坏微管后，形成的导管壁普遍加厚，微 纤丝的排列不规则。免疫化学方法研究百日草叶肉细胞悬浮培养物中导管形态建成的试 验显示，在细胞壁加厚前，微管先在特定的地方形成带，然后按照微管束带的相应部位 沉积微纤丝，药物处理的微管改变，细胞壁加厚类型也改变【8 1 ，8 2 j 。 1 2 6 3 微管参与细胞壁构建的机理 微管参与细胞壁构建的机理目前还不清楚。有报道【8 4 】认为微纤丝的排列方向是直接 由微管连接纤维素合成酶决定的，纤维素合成酶连在微管上，并通过与微管相连的微丝 肌动蛋白的作用使合成酶沿着微管移动，因此合成的微纤丝方向与微管相平行【8 ”。也有 文献【8 n ”】认为微管与质膜连接后，膜的流动性发生改变，因而纤维素合成酶沿着微管的 平行移动得到控制。s o n e s s o n 等人【”1 认为，要了解微管如何控制微纤丝沉积，分离连接 在质膜上的微管成分是主要的。他们用t r i t o nx 1 1 4 处理花椰菜质膜，再用免疫印迹法 分析微管在两相中的分配。结果发现，约有一半与质膜结合的微管溶于t r i t o n x 一1 1 4 ，有 1 0 一1 5 在去垢剂中( 表明它们是疏水性的) ，其余3 0 一4 0 在水相中。如果提高盐浓 度，这些疏水性蛋白即释放出来，并且保存疏水性。提高盐浓度后再次抽提，不溶于 t r i t o nx 1 1 4 的部分中，有相当多的疏水性微管蛋白会被释放出来。这提示疏水性微管 是与一种高盐敏感的蛋白相连的，它可能是周质微管结合于质膜上的结构。 1 2 7 植物激素对微管和细胞壁构建的影响 植物激素作为生长调节物质，它可通过改变微管束的组织行为来调控细胞的生长状 态。 赤霉素( g a ) 可促进细胞的伸长，这其中便有微管束的参与。对豌豆节间的表皮细胞 以g a 处理，发现周质微管由纵向改为横向排列 8 9 l 。对于洋葱外鞘细胞g a 不仅可增加 横向微管的数量，同时还阻止秋水仙素及低温对微管的解聚唧j 。许多实验表明，对植物 器官加以g a 处理，不仅可导致微管的重排，而且还可增加其稳定性。但对后者也有一 些不同的结果。s h i b a o k a t 为此提出，到底是具稳定性的微管发生重排，还是重排后的 微管具稳定性，这过程并不清楚。或许是g a 通过改变微管与质膜间的联系改变了微 管的稳定性。因为微管作为传递空间信息的感受器，只有加强微管与质膜及细胞壁的联 系才能使信息传递更有效。 脱落酸( a b