（微生物学专业论文）纤维堆囊菌菌株的分子鉴别及埃博霉素合成酶基因的克隆.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：幺晦矗刍两 日期：基皇堕：! ：! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 、 论文作者签名：弛师签名组日 期：挫! ：盟 山东大学博士学位论文 壁：里：里墅堕竺! ! ! ! ! ! ! 竺! 竺g 坐! ：竺堕 a b s t r a c t t h i sw o r kd e s c r i b e st h er e s u l t so f t h ep c r a m p l i f i c a t i o n o f t h e i n t e r g e n i es p a c e rr e g i o n s ( i s r li nt e nc e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i a ；g i v e sac l e a ru n d e r s t a n d i n ga b o u tt h en u m b e ro f r r n a o p e r o n sa n d t h es e q u e n c eo ft h ei s r si nc e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i a ；a n dd e m o n s t r a t e s t h eu s e f u l n e s so fi s r sa sat o o lt od i f f e r e n t i a t e c l o s e l yr e l a t e dm y x o b a c t e r i a ls t r a i n s a c c o r d i n gt ot h ed a t ar e p o r t e di ng e n b a n k ，i ti st h ef i r s tt i m et h a tt h e1 6 s - 2 3 sr d n a i n t e r g e n i cs p a c e rr e g i o n sh a v e b e e n s t u d i e da n d p u b l i s h e d i nc c l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i ao ri n a n yo ft h ed e l t ad i v i s i o no fp r o t e o b a c t e r i & f i n a l l yt h i sw o r ks u g g e s t sa na p p r o a c ho f i s o l a t i o na n da n a l y s i so f m o d u l e so f t h e e p o t h i l o n eg e n e c l u s t e r f o rc l e a ru n d e r s t a n d i n go ft h ew o r k ，m o r p h o l o g i e sa n dp h y l o g e n e t i cc l a s s i f i c a t i o no f m y x o b a c t e r i ai ng e n e r a la n dp a r t i c u l a r l yo fe e l l u l o l y t i em y x o b a c t e r i ai sr e v i e w e df a s t t a x o n o m y o f m y x o b a c t e r i ad e p e n d sm a i n l yo n t h em o r p h o g e n e t i cc h a r a c t e d s t i c s ，s u c ha s t h es h a p eo f v e g e t a t i v ec e l l s ，t h es h a p eo fm y x o s p o r e s ，f o r m a t i o ns p o r a n g i o l e s ，e s p e c i a l l y f r u i t i n gb o d i e s 。a l lm y x o b a c t e r i a h a v ea d e v e l o p m e n t a lc y c l e i nw h i c ht e n so f t h o u s a n d so f c e l l s a g g r e g a t et o g e t h e rt o f o r mb r i g h t l yc o l o r e d f r u i t i n g b o d i e s t h e r ei ss t i l ls o m e d i s a g r e e m e n ta m o n g t a x o n o m i s t sa st ot h e p r e c i s ep l a c e m e n to f m a n yg e n e r a a n d s p e c i e s i n m y x o b a c t e r i a , t h e r e a r et w o s u b o r d e r s - c y s t o b a c t e r i n e a e a n d s o r a n g i n e a e a n d1 2 g e n e r a - a n g i o c o c c u s ,a e c h a n g i u m ，c h o n d r o m y c e s ,c o r a l l o c o c u s ，c y s t o b a c t e r , s t i g m a t e l l a p h y l o g e n e t i c a l l y , t h em y x o b a c t e r a l e sa 豫l o e a t e x t i nt h ed e l t ad i v i s i o no f p r o t e o b a c t e r i a b a s e do nt h e a n a l y s i s o ft h e1 6 s r d n as e q u e n c e s a l l c e l l u l o l y t i c m y x o b a c t e r i aa r eu n i t e di nas i n g l eg e n u ss o r a n g i u mw h i c hi sd i s t i n c tf r o mp o l y a n g i u m a p a r tf r o m s o m ed i f f e r e n c e so b s e r v e di nt h e m o r p h o l o g i e s o f t h e c e u u l o l b i cm y x o b a c t e r i a w h i c ha l eu s e di ng r o u p i n ga n ds u g g e s tt h a tt h e r ei sm o r et h a no n es p e c i e si nt h eg e n u s s o r a n g i u m ，e e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i a a r ev e r ys i m i l a ri nt h e i r1 6 s r d n at h es e q u e n c e s t h e ! 坠：望：望堕翌垡! ! ! 垡兰皇型竺量望坠! ! 竺堕 一一 e v o l u t i o n a r y d i s t a n c e so ft h e1 6 s r d n as e q u e n c e sa r e l e s st h a n 3 s u g g e s t i n gt h a t c e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i a a r ev e r yc l o s e l yr e l a t e d p h y l o g e n e t i ct r e e sc o n s t r u c t e du s i n gt h e e v o l u t i o n a r yd i s t a n c e sb a s e do nt h e 1 6 sr d n a s e q u e n c e s ，h a v ec o n f n m e dt h ep r e v i o u s c o n c l u s i o n s ：t h em y x o b a c t e r i aa sac o h e r e n tg r o u pa n dt h ec e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i aa r e c l o s e l yr e l a t e db a c t e r i a m y x o b a c t e r i aa r ea m o n g t h o s eb a c t e r i aw h i c h p r o d u c en u m e r o u s s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，a n ds o r a n g i u m c e l l u l o s u mi sa p o t e n t i a lc a n d i d a t ei n t h i sw a y t h e1 6 s - 2 3 s i n t e r g e n i cs p a c e rr e g i o n s ( t s r s ) a r e m o r ev a r i a b l ei ns e q u e n c ea n dl e n g t h t h a nt h e1 6 s r d n a s e q u e n c e s i nb a c t e r i a , u s u a l l y1 6 s ，2 3 s ，a n d5 s r d n a f o r ma no p e r o n t r a n s c r i b e di nas i n g l ep o l y c i s t r o n i cm r n a w i t ht h ep u r p o s et oi n v e s t i g a t et h en u m b e ro f r n a o p e r o n sa n du n d e r s t a n dt h ec o m p o s i t i o n o ft h ei n t e r g e n i cs p a c e rr e g i o n s ( i s 鼬i n c e l l u l o l y t i cm y x o b a e t e r i a ，t h eg e n o m i c d n ao f t e n c e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i a w a se x t r a c t e d u s i n g t h es o f t w a r ec l u s t a lx w e a n a l y z e ds o m ep r i m e r s i nt h el i t e r a t u r er e l a t e dt ot h ep c r a m p l i f i c a t i o no ft h e 1 6 s - 2 3 s r d n ai n t e r g e n i cs p a c e rr e g i o n s w ec o m p u t e ds e q u e n c e h o m o l o g yp e r c e n t a g e so nb o t hs i t e sf l a n k i n gt h e 1 6 s 2 3 s r d n ai s r a c c o r d i n gt ot h e p e r c e n t a g eo fs i m i l a r i t yc o n n e c t e d t ot h ed i s t a n c eb e t w e e nt h et w op r i m e r s ，a n dt h et m ，a p a i r o fp r i m e r sw a sc h o s e n t h ea n n e a l i n gt e m p e r a t u r ew a so p t i m i z e dt h r o u g ht h e e x p e r i m e n t s a n dc a l c u l a t e d u s i n gs p e c i f i c f o r m u l a t h u s w ea s s a y e d t h e d i v e r s i t y o f l 6 s - 2 3 s r d n a i n t e r g e n i cs p a c e rr e g i o n so s r ) a m o n gc e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e f i a ls t r a i n s u s i n gt h e e x t r a c t e dg e n o m i cd n aa sat e m p l a t e ，t h ep c r - a m p l i f i c a t i o no ft h ei n t e r g e r d cs p a c e r r e g i o n s w a s h e l d a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s o f p c r a m p l i f i c a t i o np r o d u c t sf r o m t e ns t r a i n s s h o w st h a tt h e r ea r ea tl e a s tf o u rc o p i e so f r r n a o p e r o n s i nt h e g e n u s5 盟丝氆吐避，b a s e do n t h e i rs i z ea n dr e s t r i c t i o ne n z y m a t i c d i g e s tm a p s f u r t h e r m o r e ，s e q u e n c e so f i n t e r g e n i cs p a c e r r e g i o n si nt w oc l o s e l yr e l a t e dc e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i a ls t r a i n sw e r ed e t e r m i n e d t h e r e s u l t ss h o wf o u rs e q u e n c e sf o rt h es u a ms 0 9 8 81a n dt h r e e s e q u e n c e s f o rt h es t r a i n s 0 9 7 3 3 1 s e q u e n c ea n a l y s i so ft h ei s rr e v e a l e dt w os e q u e n c eo r g a n i z a t i o np a t t e r n s ： 2 p h d d i s s e r t a t i o no f s h a n d o n g u n i v e r s i t y t r n a n t r n a “l c o n t a i n i n gi s ra n dt r n a 1 a c k i n gi s r t h et r n a c o n t a i n i n gi s r sa r e t l i g l l ys i m i l a ra m o n gs t r a i n sa n dw i t h i nas t r a i n ( m o r et h a n 9 8 s i m i l a r i t y ) a n dc o n t a i nt h e e s s e n t i a lf u n c t i o n a lr e g i o n s ，s u c ha sar i b o n u c l e a s ei i ir e c o g n i t i o n s i t ea n da na n t i t e r m i n a t o r r e c o g n i t i o n s i t eb o x a t h e t r n a l a c k i n gi s r h a sn os u c hf u n c t i o n a ls i t e st h a ta r ei m p o r t a n t f o r y i e l d i n g m a t u r e r r n a ，w h i c h s u g g e s t s t h a t t h i s t y p e o f r r n a o p e r o n m i g h t b e d e g e n e r a t e t h e t r n a l a c k i n g i s ri sd i v i d e di n t ot w o t y p e sb a s e do nt h e i rs i z e sa n ds e q u e n c e s ，w h i c h e x h i b i ta b o u t 9 0 s i m i l a r i t yw i t h i ne a c ht y p e t h u s ，t h et r n a - l a c k i n gi s r p o l y m o r p h i s m s c a i lb cu s e dt od i s c r i m i n a t ea m o n g d i f f e r e n ts t r a i n so f s o r a n g i a ls p e c i e s p o l y k c t i d es y n t h a s e s ( p k s ) a r ef a s c i n a t i n gm u l t i f u n c t i o n a le n z y m e s ，t h e yc a t a l y z et h e b i o s y n t h e s i so fac l a s so fm i c r o b i a ln a t u r a lp r o d u c tk n o wa s p o l y k e t i d e si n w h i c ht h e c a t a l y t i cs i t e sf o rt h ev a r i o u ss t e p si nt h eb i o s y n t h e s i sa r ec a r d e da sd o m a i n s a l o n g t h ef e n g t h o fm u l t i f u n c t i o n a l p r o t e i n s ：a c y lt r a n s f e r a s e ( a ：i ) ，k e t o s y n t h a s e ( k s ) ，a c y l c a r r i e r p r o t e i n ( a c p ) k e t o r e d u e t a s e 噼r ) ，e n o y l r e d u c t a s e ( e r ) o f t h et h r e em a j o rt y p e so f p k s ，t h e t y p e 1w h i c h c a t a l y z et h eb i o s y n t h e s i so f t h em o s to f n o n a r o m a t i c p o l y k e d d e s i so r g a n i z e di n am o d u l a rf a s h i o n e a c hm o d u l ea c t i v a t ea n d i n c o r p o r a t e at w o c a r b o n ( k e t i d e 、u n i tb u i l d i n g b l o c ki n t ot h ep o l y k e t i d eb a c k b o n e e a c h p r o t e i nh a so n eo rm o r em o d u l e s ，e a c hm o d u l e w i t hd i s c r e t ed o m a i n sf o ra c t i v i t i e s r e q u i r e df o rt h ee l o n g a t i o na n dp r o c e s s i n go ft h e p o l y k e t i d e c h a i n at h i o e s t e r a s e ( t e ) a n da m e t h y l t r a n s f e r a s e ( m t ) m a y b e p r e s e n t p o l y k e t i d ee p o t h i l o n e ，ap o t e n t i a la n t i t u m o rp r o d u c t ，i sp r o d u c e db ys o r a n g i u mc e l l u l o s u m t h eo r g a n i z a t i o no ft h ee p o t h i l o n eg e n ec l u s t e rh a s ，b e e ns t u d i e da n di sw e l lk n o w n t h e e p o t h i l o n e i ss y n t h e s i z e d b yt y p e ip k s ( p o l y k e d d e s y n t h a s e ) t h ee p o t h i l o n eg e n ec l u s t e ri s o r g a n i z e di nam o d u l a rf a s h i o n i nt h ep u r p o s et ou n d e r s t a n dt h eo r g a n i z a t i o no ft h e b i o s y n t h e t i cg e n e c l u s t e ro f e p o t h i l o n ei nt h et w oc l o s e l yr e l a t e dc e l l u l o l y t i cm y x o b a c t e r i a s 0 9 8 8 1 a n ds 0 9 7 3 3 - 1 ，t h el a m b d ag e n o m i cl i b r a r i e so ft w oc l o s e l yr e l a t e ds t r a i n sw e r e c o n s t r u c t e d t h es i z eo f t h ee x t r a c t e dd n a f r a g m e n t s w a sd e t e r m i n e d b y p f g e g e n o m i c 3 山东大学博士学位论文 d n aw a ss a u 3 a ip a r t i a l l yd i g e s t e d t h er e s u l t i n gd n a f r a g m e n t sw e r er e s o l v e d e l e c t r o p h o r e t i c a l l ya n df r a g m e n t s f r o m9t o2 3k b w e r er e c o v e r e da n dt h e n l i g a t e d t ob a m h i e m b l 3l a m b d av e c t o r s t h el i g a t e d p r o d u c t w a s p a c k a g e d i nv i t r oa n du s e dt oi n f e c te c o l i t h ep a c k a g i n ge f f i c i e n c yw a s9 9 10 5p f u u g ，s h o w i n ga c c e p t a b l ec a p a c i t yo ft h el i b r a r y t h ec o n s t r u c t e dl i b r a r yw a ss c r e e n e di nt h eo r d e rt os e a r c ht h ee p o t h i l o n eg e n ec l u s t e r u s i n g t w op r o b e sc o r r e s p o n d i n gt ot h ek s qo fc p o aa n dp c po fe p ob w eu s e dp l a q u e s h y b r i d i z a t i o na n dt e s t e d2 4 0 0 0p l a q u e sf r o mt h el a r n b d ag e n o m i cl i b r a r yo fs 0 9 7 3 3 - 1 ， s e v e n t y - e i g h tt e s t e dp o s i t i v ew i t ht h ek s qp r o b e ，a m o n gs e v e n t y - e i g h to n l yf o u rg a v e d o u b l e p o s i t i v es i g n a l sw i t h b o t h p r o b e s e x t r a c t i o no f d n a o f t h ef o u rr e c o m b i n a n t p h a g e s w a sp e r f o r m e d ，f o l l o w e db ys a l id i g e s t i o n t h er e s t r i c t i o nd i g e s t e dm a p so f t h e s ec l o n e s w e r ec o m p a r e dw i t ht h ep r e v i o u s r e p o r t e di n f o r m a t i o na b o u t t h ee p o t h i l o n eg e n ec l u s t e r a c o m p a r i s o n o f t h e c o m p u t e r - a s s i s t e da n a l y s i so f t h es a l ld i g e s tm a po f e p o aa n de p o b ，a n d t h ee x p e r i m e n t a ls a l id i g e s t e d m a p ，a d d e d t ot h er e s u l t so f t h e h y b r i d i z a t i o n ，a l l o w e du st o c o n c l u d ea b o u tt h ei d e n t i f i c a t i o na n dt h ei s o l a t i o no f t h ec l o n ew h i c h m a y b e s e q u e n c e d a n d a n a l y z e d k e yw o r d s ：c e u u l o l y t i cm y x o b a c t e r i a ，点鲤旦型基鲤，1 6 s - 2 3 sr d n a i n t e r g e n i cs p a c e r r e g i o n s ( i s r ) ，p h y l o g e n y , e p o t h i l o n e ，b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r , g e n o m i cl i b r a r y , c l o n i n g 4 山东大学博士学位论文 堕：垒望三苎! 垡些呈! ! 塾型! 堡竺璺堡! 堡墅 中文摘要 本论文的研究工作主要分为两个部分： 1 ) 纤维堆囊菌菌株的分子鉴定 粘细菌分类主要依靠形态学特征，如营养细胞形状、粘孢子形状、小孢子囊形成 等，其中最重要的是子实体。所有的粘细菌都有分化发育潜力：在不良环境条件下， 大量的粘细菌营养细胞聚集，并发育形成鲜艳的休眠性子实体结构。尽管对粘细菌的 某些种属准确分类地位仍有争议( 原核生物第2 版。1 9 9 3 和伯杰氏细菌鉴定手 册第9 版，1 9 8 9 ) ，但依赖于形态学特征，如营养细胞的形态、大小，粘孢子的形 态、大小，子实体的形态，菌落的形态等，粘细菌可分两个亚目孢囊杆菌亚目 ( c y s t o b a c t e r i n e a e ) 和堆囊菌亚目( s o r a n g i a e a e ) ，1 2 个属囊球菌属( a n g i o c o c c u s ) 、 原囊菌属( a r c h a n g i u m ) 、软骨霉状菌属( c h o n d r o m y c e s ) 、“珊瑚球菌属 ( c o r a l l o c o c u s ) ”、孢囊杆菌属( c y s t o b a c t e r ) 、“单囊菌属( h a p l o a n g i u m ) ”、蜂窝囊 菌属( m e l i t t a n g i u m ) 、粘球菌属埘5 , x o c o c c u s 、小囊菌属( n a n o c y s t i s ) 、多囊菌属 ( p o l y a n g i u m ) 、“堆囊菌属( s o r a n g i u m ) ”和标桩菌属( s t i g m a t e l l a ) 。近年来，基于 1 6 sr d n a 序列的系统发生分析表明，粘细菌属于p r o t e o b a c t e r i a 类群的6 分支。根据 食性不同，粘细菌可以分为两个类群，一个是溶纤维素类群，该类群不能降解活的微 生物细胞，但能够高效降解纤维素；另一个类群是溶细蔚类群，该类群不能降解纤维 素分子，但能够降解活的微生物细胞。目前，根据形态学特征，所有的溶纤维素粘细 菌均被归于一个属堆囊菌属( s o r a n g i u m ) ，尽管该属在伯杰氏细菌鉴定手册 中仍被归于多囊菌属( p o l y a n g i u m ) ，但与非降解纤维素的多囊菌属有显著差异。根据 我们前期的研究结果表明，溶纤维素粘细菌的形态上可以较为明显地分为两个类群， 山东大学博士学位论文 ! ! ：竺：望翌竺塑! ! 堕! ! 竺! 竺g 坐生! 堡丝 一个是紧实堆囊菌( & c o m p a c t a t u m ) ，另一个是纤维堆囊菌( & c e l l u l o s u m ) 。但溶纤 维素粘细菌的1 6 sr d n a 序列分析表明，不同形态的溶纤维素粘细菌极为相似，其1 6 s r d n a 序列进化距离小于3 。使用1 6 sr d n a 序列的进化距离构建的系统发生树证实 了如下结论：粘细菌是相关类群，且溶纤维素粘细菌是密切相关的粘细菌。由于纤维 堆囊菌是重要的药源菌，生物活性次级代谢产物的合成具有很强的菌株特异性，因此， 对于1 6 sr d n a 序列高度同源的不同菌株，有必要开展进一步的分子鉴别分析。 本文对1 0 株溶纤维素粘细菌的i s r ( 1 6 - 2 3 sr d n a 间区) 进行了p c r 扩增，结 果明确指出了溶纤维素粘细菌的r r n a 操纵子数目和i s r s 的序列信息，并证实了i s r s 作为区分密切相关粘细菌菌株工具的有效性。根据g e n b a n k 中报道的数据，这是首次 在溶纤维素粘细菌或任何p r o t e o b a c t e r i a 类群6 分支中对1 6 2 3 sr d n a 间区进行研究和 报道。细菌的1 6 s 、2 3 s 和5 sr d n a 通常形成一个连续的操纵子结构，由于1 6 s 2 3 s 间区序列( i s r s ) 比1 6 sr d n a 序列的保守性低，变动大。我们的菌株分子鉴别工作 即以i s r 序列为分析的目标。我们提取了1 0 株溶纤维素粘细菌的基因组d n a 。使用 c l u s t a l x 软件分析比较了文献中与1 6 s 一2 3 sr d n a 间区p c r 扩增有关的一些引物。为 了研究溶纤维素粘细菌的r n a 操纵子数目和间区( i s r ) 组成，并计算1 6 s 2 3 sr d n a i s r 两侧的序列同源性。根据序列同源性、两个引物间的距离和t m 值，我们选择了 一对引物，并计算退火温度，通过实验对其进行优化。以提取的基因组d n a 作模板 进行间区的p c r 扩增，我们得到了溶纤维素粘细菌的1 6 s - 2 3 sr d n a 基因间区( i s r ) 的多样性。1 0 株菌p c r 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析表明：基于r r n a 操纵子的 大小和限制酶图谱，堆囊菌属的菌株细胞中至少含4 个拷贝的r r n a 操纵子。进一步， 我们测序鉴定了两个密切相关的溶纤维素粘细菌菌株的间区序列。结果表明s 0 9 8 8 1 菌株有4 个i s r 序列，s 0 9 7 3 3 1 有3 个i s r 序列。i s r 序列分析揭示有两种序列组织 6 山东大学博士学位论文 ! ! ：旦：旦堕! 璺苎! 竺! ! ! ! 竺塑! 竖! ! 堡竺塑 模式：含t r n a i t t r n aa 1 8 的i s r 和不含t r n a 的i s r 。含t r n a 的i s r s 在两个菌株间 和一个菌株内是高度相似的( 同源性超过9 8 ) ，该i s r s 含基本功能区，如核糖核酸 酶i 识别区和抗终止子位点b o x a 。而不含t r n a 的i s r 不存在这类对产生成熟r r n a 很重要的功能位点，这表明它们的r r n a 操纵子可能是退化的。根据大小和序列，不 含t r n a 的i s r 可分成两种类型，每个类型内同源性约为9 0 。因此，不含t r n a 的 i s r 多态性可用于区分纤维堆囊菌的不同菌株。 2 ) 埃博霉素合成酶基因的克隆分析 粘细菌可产生大量的次级代谢产物，其中，由纤维堆囊菌产生的聚酮类化合物埃 博霉索是一种强的抗癌物质，具有巨大药用开发潜力。目前已报道了埃博霉素基因簇 的组成。埃博霉素是由i 型p k s ( 聚酮合酶) 和n r p s ( 非核糖体肽合成酶) 杂合基 因簇合成的。埃博霉素p k s 基因簇是多功能酶，以模块形式组织。每个模块负责一个 二碳单元的衍生步骤。我们提取了纤维堆囊菌的染色体组d n a ，并通过p f g e 确定了 d n a 片段的大小。基因组d n a 用s a u 3 a i 部分消化后，经电泳分离并回收9 - 2 3 k b 片 段，后与b a m i - i ie m b l 3 九载体连接。连接产物体外包装后感染大肠杆菌。包装效率 为9 9 x1 0 5 p f u p g 。我们分别构建了两个菌株的九噬菌体基因组文库n 根据埃博霉素 合成酶基因的序列信息，我们设计了相应于e p o ak s q 和c p o bp c p 的两种探针，并 对构建的文库采用噬菌斑杂交法筛选埃博霉素基医簇。从s 0 9 7 3 3 - 1 丸基因组文库得到 了2 4 0 0 0 个噬菌斑，其中7 8 个用k s q 探针测试为阳性，仅有四个噬菌斑用两种探针 测试均为阳性。对这四个重组噬菌体提取d n a ，用s a l l 酶切，对消化图谱进行了计 算机辅助分析。并对消化得到的小片段进行了亚克隆，正在进行进一步的测序分析 关键词：溶纤维素粘细菌，堆囊菌，1 6 s 2 3 sr d n a 间区( i s r ) ，系统发生，埃博霉 素，合成酶基因簇，基因组文库，克隆 山东大学博士学位论文 ! ! ：2 ：望堕坚! ! ! ! ! ! ! 型竺g ! ! ! ：竺l 翌 c h a p t e r1g e n e r a li n t r o d u c t i o n 1 1a b o u tt h em y x o b a c t e r i a 1 - 1 - - 1d e f i n i t i o na n dt a x o n o m y m o r p h o l o g i e sa n db e h a v i o r t h em y x o b a c t e r i aa r eu b i q u i t o u sm i c m p r e d a t o r so rs a p r o p h y t ei ns o i le n v i r o n m e n tt h a t h a v eag l i d i n gm e a n so fm o t i l i t y , c o m p l e xs o c i a li n t e r a c t i o n sa n di n t r i g u i n gm o r p h 0 1 0 每c a l d e v e l o p m e n tc u l m i n a t i n gi nt h ep r o d u c t i o no f t h ef r u i t i n gb o d i e sa n dm y x o s p o r e s ( l 2 ) b a c t e r i aa r ec l a s s i f i e da ss t r i c ta e r o b e s ( o x y g e ni sn e c e s s a r yf o rg r o w t h ) ，f a c u l t a t i v e a n a e r o b e s ( o x y g e ni sn o tn e c e s s a r yb u tr e s u l t si nf a s t e rg r o w t h ) ，a e r o t o l e r a n ta n a e r o b e s ( o x y g e nh a sn oe f f e c t o ng r o w t h ) ，s t r i c ta n a e r o b e s ( o x y g e np r e v e n t sg r o w t h ) ，o ra s m i c r o a e r o p h i l i c ( 1 0 wc o n c e n t r a t i o n so f o x y g e na r er e q u i r e df o rg r o w t h ) o x y g e n - d e p e n d e n t i n t r a c e l l u l a rp r o c e s s e si na c t a b l eb a c t e r i aa r em e d i a t e db yo x i d a s ea n do x y g e n a s ee n z y m e s m o s tm y x o b a c t e r i aa n da c f i n o m y c c t e sa r ee x a m p l e so fs t r i c ta e r o b e s g r o w t ho fa e r o b i c b a c t e r i au n d e rm i e r o a e r o b i c ( 1 0 wo x y g e n )