（动物学专业论文）特异性tetrodotoxin亲和微珠的制备及其吸附性能的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：壁壅丝叠 日 期：型! 堑垒! 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：e 垄琏登 日 期：型! ! 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 特异性t t x 亲和壳聚糖微珠的制备及其吸附性能的研究 中文摘要 本文采用悬浮交联法制备出了一种新型的壳聚糖衍生物微珠，探讨了不同反 应操作条件对微珠形成的影响，并测定了该微珠的某些物理、化学性质，用扫描 电镜对合成的微珠进行了形貌观察。结果表明许多因素如2 5 戊二醛用量和乳 化剂t w o ：n 6 0 用量、壳聚糖乙酸溶胶浓度等因素对微珠合成和理化性能有直接 的影响；反应在4 0 c 6 0 c 能顺利进行；合成的微珠对热和一些有机溶剂、弱 酸、弱碱等有很高的化学稳定性。 在第一部分完成的基础上，应用正交设计以及统计分析软件s p s s l 3 0 ，进行了 特异性河豚毒素( t e t r o d o t o x i n ，t t x ) 亲和壳聚糖微珠的合成和分析，目前尚无 此类报道。用通用的小鼠生物法检测毒素量，考马斯亮蓝检测杂蛋白。相对于活 性炭对邢( 的吸附，特异性t t x 亲和壳聚糖微珠对于r r x 的吸附具有较强的 特异性，吸附量为1 0 9 9 g 左右( 湿珠) ；回收率高于活性炭提取分离方法，同时 对于除去杂蛋白也有很好的效果，提取t 1 x 粗毒液收率达8 5 ，杂蛋白降低3 倍左右，毒素损失1 5 左右；直接处理粗提液回收率达到8 0 ，杂蛋白降低了4 倍，毒素损失2 0 左右。 壳聚糖分子中含有大量的氨基和羟基，可与c u 2 + 形成稳定的络和物，对c u 2 + 的富集作用非常突出，具有极强的选择分离效果，可应用于水处理，c u 2 + 的回收 等。本文研究了c u 2 + 浓度、p h 、吸附时间、温度、微珠用量等不同吸附条件下 特异性1 t x 亲和壳聚糖微珠对c u 2 + 吸附的影响，探讨了吸附的可能内在机理。 用分光光度法测定吸附前后溶液中c a 2 + 浓度。实验结果表明该微珠吸附容量可达 1 7 8 m g g ，而且再生方便，可重复使用，是性能良好的c a 2 + 吸附剂。 由于壳聚糖是溶菌酶的底物，所以理论上推断其衍生物对溶菌酶应有较强的 亲和力。应用两种强弱阳离子交换树脂( d 7 2 4 , d 1 5 5 ) 和特异性1 1 x 亲和壳聚 糖儆珠吸附鸡蛋清中的溶菌酶。所得结果：特异性t 1 x 亲和壳聚糖微珠提纯溶 菌酶，所得酶比活力为最高7 7 9 3 u m g 蛋白，纯化倍数为3 6 2 倍，效果优于 d 7 2 4 ，d 1 5 5 的纯化效果。微珠吸附量也比两种树脂高，同时残留的杂蛋白较少， 本实验为壳聚糖的应用于鸡蛋清溶菌酶的提取研究莫定了初步的基础。 关键词壳聚糖，吸附，微珠，椰( ，溶菌酶 妻室堑蔓查兰! ! ! ! 星堡主兰焦兰苎 s t u d i e so nt h ep r e p a r a t i o na n da d s o r p t i o no f t h e t e t r o d o t o x i n s p e c i f i ca f f i n i t ym i c r o s p h e r e s a b s t r a c t an e wm e t h o do f s y n t h e s i sm i c r o s p h e r ew 船p m p a r e db yt h er e a c t i o no f 2 5 g l u t a r a l d e h y d ew i t hc h i t o s a ni na c e t i ca c i ds o l u t i o n t h ee f f e c tf a c t o r sw e l ed i s c u s s e d i nd e t a i l t h ec o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a na n dc o n n e c t o ra r ei m p o r t a n t 丘咖r sf o rt h e q u a l i 母o fs y n t h e t i cc h i t o s a nm i c m s p h e r e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e a c t i o nw a s c a r r i e do u ta t4 0 c 6 0 c a n da l s op r o v e dt h a tt h e3 o o f c h i t o s a ni na c e t i ca c i d s o l u t i o na n dt h eh i g h e rc o n i l e c t o rv o l u m ea r ea p p r o p r i a t ec o n d i t i o n sf o rt h eo u t p mo f s y n t h e t i cc h i t o s a nm i c r o s p h e r e s t h es y n t h e t i cc h i t o s a nm i c r o s p h e r e sa r ei n s o l u b l e i nm a n yk i n d so f s o l v e n t sa n da r e s t a b i l i t yf o rh e a t ，d i l u t e da c i d 、d i l u t e db a s ea n d o r g a n i cs o l v e n t t h ep r o d u c th a sag r e a ti m p r o v e m e n tp e r f o r m a n c eo f e a s y r e g e n e r a t i o n t h ec r u d ee x t r a c t i o no f t r xw 舔o b t a i n e db yt h ea c e t i c a c i d e t h a n o ls o l u t i o nf r o m t h eo v a r yo f f u g uo b l o n g - u s t h e nd e f a t t e d 、) l r i t hc h l o r o f o r m t h ec r u d ee x t r a c to f t t x w a sa b s o r b e db ya c t i v a t e dc h a r c o a la n df l _ i t h e rp u r i f i e db yt h ea f f i n i t ya d s o r p t i o n c h i t o s a nm i c m s p h e r e s t h ea d s o r p t i o nc a p a b i l i t yo f t t xw a sm e a s u r e dw i t i lt h e m o u s eb i o a s s a y t h ea d s o r p t i v ec a p a c i t yo f t h ea f f i n i t ya d s o r p t i o nc h i t o s a n m i c r o s p h e r e sr o a c h e da b o u t1 0 i t g t t x g ( w e t ) ，t h er e c o v e r yr a t ew a sa b o u t5 1 a n d 8 0 ，a n dt h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a sl o w e r e da b o u t3a n d4t i m e s ，c o m p a r e dw i t h t h ea c t i v a t e dc h a r c o a l t h ep u r i f i c a t i o ne f f i c i e n c ya n dt h er e c o v e r yr a t eo f t h ea f f m i t y a d s o r p t i o nc h i t o s a nm i c r o s p h e r e sa r eh i 曲e rt h a no f t h ea c t i v a t e dc h a r c o a l t h en o v e lc h i t o s a nm i c r o s p h c r e sa r e a l s ou s e dt oa d s o r p tt h ec u z + i ns o l u t i o n t h ec u 2 + c o n c c n t r a t i o na n dt h ea d s o r p t i o nt i m e 、p h 、m m p m t u r e 、d o s a g eo f c h i t o s a n m i c r o s p h e r e so nt h ea d s o r p t i o ne f f e c t sw e 陀i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e c h i t o s a nm i c r o s p h e r e sh a dh i g h e ra d s o r p t i o np r o p 鲥i e sf o rc u 2 + , t h e a d s o r p t i o n c a p a c i t yr e a c h e d1 7 8 m g g ，a n dc a nb er e u s e ds e v e r a ll i m e sa f t e rs i m p l er e g e n e r a t i o n 2 南京师范太学2 0 0 5 届硕士学位论文 t h ei y s o z ：y m ep u r i f i c a t i o nf r o me g gw h i t ew a sc a r r i e do u ta n dc o m p a r e dw i t ht h e t h r e ea d s o r b e n t s ：c h i t o s m lm i c r o s p h e r e s ，d 7 2 4a n dd 1 5 5r e s i n a so nac o l u m n t h e m o s to f p r o t e i n sa l er e m o v e df r o me x t r a c t i o ns o l u t i o nb yh e a t - d e n a t u r a t io n i s o e l e c t r i cp o i n tp r e c i p i t a t i o n r e g u l a t i n gt h ep - 3 5w i t hh a c ，t h e nt h e y s o z - y m e f l i u dw a sf u r t h e rd e s a l t e d t h ec o l l e c t e da c t i v a t e df r a c t i o nw a sd e t e c t e db y s d s - p a g e t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec h i t o s a nm i c r o s p h e r e s a b s o r b t i o ni sm o r er a p i da n de f f e c t i v ea n dt h ep r o t e i n sw e r ea l m o s ts e p a r a t e d t h e i y s o z y m ea c t i v i t yw a s7 7 9 3 u m gp r o t e i n ，i t sp u r i t yw a sr a i s e d3 6 2f o l d sb yu s i n g b i o a c t i v i t ya s s a y c o m p a r i n gw i mt h ed 7 2 4a n dd 1 5 5r e s i n a si o ne x c h a n g e a d s o r p t i o n , t h i sc h i t o s a nm i c r o s p h e r c sc a r tr e d u c ed e n a t u r e da l b u m i na n dd e c r e a s e i m p u r i t yo f r e s i d u ee g gw h i t et h a tc a nb er e u s e di ns o m ew a y ，s ot h e y s o z y m e p r o d u c t i o nc o s tw i l lb el o w e r e d k e y w o r s ：c h i t o s a n ，a d s o r p t i o n ，m i c r o s p h e r e s ，r d ( ，l y s o z y m e 3 妻室些蒸查兰! ! ! ! 鱼堡主兰竺兰兰 第一部分 综述 一壳聚糖及其衍生物研究进展 1 8 2 3 年，一位法国科学家a o d i e r 从甲壳类昆虫的翅鞘中分离出类似纤维素 的物质，命名为c h i t i n ，经过1 0 0 年时间的研究，表明了其单体为n 一乙酰氨基葡 萄糖 1 。9 】。c h i t i n 这个词由希腊文衍变而来，原意是被膜，铠甲，中文译为甲壳素， 又称为几丁质、壳质、几丁糖等。甲壳素是由n 乙酰一2 一氨基一2 脱氧一d 一葡萄糖以 3 - 1 ，4 糖苷键形式连接而成的天然n 乙酰化的氨基直链多糖，从结构式可以看出， 如果将糖基上的乙酰氨基置换成羟基，就成为纤维素她7 9 ，1 0 1 。1 8 5 9 年，法国 人c r o u g e t 将甲壳素浸泡在k o h 溶液煮沸一段时间，取出洗净后发现其可溶于 有机酸中；18 9 4 年，e h o p p e s e i l c r 确认这种可溶性产物是部分脱乙酰基的甲壳 素，把它命名为c h i t o s a n 中文称壳聚糖，又称之为壳多糖、脱乙酰甲壳质、可溶 性甲壳素、甲壳糖、几丁聚糖等【2 - 9 】。一般认为脱去5 5 以上的n 乙酰氨基就可 以称之为壳聚糖，或者能溶于1 乙酸或1 盐酸的甲壳素都可以称之为壳聚糖 9 1 。作为有实用价值的工业品壳聚糖，脱乙酰度必须在7 0 以上。甲壳素广泛存 在于甲壳纲动物虾、蟹的甲壳、昆虫的外骨骼、真菌( 酵母，霉菌) 的细胞壁和 一些植物的细胞壁中【3 乱。壳聚糖是白色或灰白色无定形、半透明、稍有珍珠光 泽的固体，不溶于水、碱溶液、稀硫酸和磷酸，但可溶于稀盐酸、硝酸等无机酸 以及多数有机酸【3 ，5 9 1 。在稀酸溶液中，壳聚糖的主链分子会缓慢水解，溶液的粘 度会逐渐降低，相对分子质量逐渐降低，最后被水解成一系列低聚糖、二糖、三 糖直至氨基葡萄糖，粘度降至最小，所以壳聚糖溶液应该随用随配。 壳聚糖分子中的氮基在稀酸中容易发生质子化，由一n h2 质子化成一n h 3 ， 从而破坏了分子间的氢键和立体规整性，使- - o h 与水分子发生水合作用，导致 壳聚糖分子膨胀而溶解。利用壳聚糖的这一特性，就可以研究壳聚糖的一系列溶 液的性质以及许多方面的应用。一般而言，脱乙酰度越高，相对分子质量越小， 越易溶，另外酸的种类和浓度也影响壳聚糖的溶解u ，z 3 , 5 , 1o 】。 壳聚糖分子中的氨基结合氢质子后形成n h 4 + 阳离子，可与阴离子表面活性 荆( 十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠等) 发生静电结合，产生聚两性电解质 絮凝沉淀。壳聚糖分子中的氨基和羟基都是电子给予体，能为多价金属离子提供 电子对，形成配位键的配位化合物，对金属离子( 铜、锌、铁、钴、镍、铬以及 4 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 铝、超铀元素、锕系元素、镧系元素等离子) 具有螯合作用，这种作用具有很重 要的应用价值，可用于制造药品、保健品、重金属废水处理等1 ，2 ，3 ，5 ，1 0 1 。 壳聚糖分子中的氨基能与醛类发生缩合反应生成西佛碱；羟基能与多种有机 酸的衍生物如酸酐等发生酯化反应，形成有机酸酯；另外氨基也可发生酯化反应， 生成酰胺 1 , 2 , 3 , 5 , 1 0 】。 壳聚糖与含氧无机酸的酯化反应，酯化试剂主要是浓硫酸，其次是磷酸、硝 酸、二氧化硫、三氧化硫、氯磺酸、黄原酸化( 用碱处理后与二硫化炭发生复杂 的反应) ，生成的主要酯化物有硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯等【1 0 ，3 ，5 1 0 1 。 壳聚糖的醚化反应，羟基可与烃基化试剂反应生成醚，包括o 烃基化、o 羟乙基化、羟丙基化、o 羟甲基化、羟乙基化，o 氰乙基化、n 衍生物、氨基的 n 烷基化、西佛碱的形成、季铵盐的形成、n 酰化”土3 ，5 ，1 们。 壳聚糖羟基的氧化反应，在氧化剂作用下，可以氧化羟基为醛基、羧基、羰 基，甚至发生部分脱氨基或者脱乙酰氨基。由于壳聚糖中氨基的反应活性比羟基 大，酰化反应往往首先在氨基上发生 1 , 2 , 3 , 5 , 1 0 】。 壳聚糖能进行接枝共聚反应，生成以多糖链为主链和以合成聚合物为侧链的 半合成聚合物，兼具天然聚合物和合成聚合物的某些性质，从而满足特殊需要。 接枝共聚反应一般分为化学法、射线辐照法和机械法等1 1 , 2 , 3 , 5 , 1 0 。 壳聚糖的交联反应，壳聚糖可由双官能团的醛或者酸酐进行交联，得到网状 结构的不溶产物，性质比较稳定，这对于用作载体十分重要。交联剂有醛类( 戊 二醛、甲醛、乙二醛等) 、环氧丙烷类( 环氧氯丙烷、环硫氯丙烷等) 、聚乙二醇 类( p e g - 4 0 0 、p e g b 等) 、冠醚类( 双羟基中环二胺氮杂冠醚等) f 3 t 9 ，1 1 ，12 ，1 3 1 。 壳聚糖分子上众多的氨基和羟基表现出了壳聚糖突出的化学吸附性能，可以 吸附卤素( 碘、溴等) ；对醇类也有很好的吸附作用( 乙醇等) ；壳聚糖也能吸附 醛类( 糠醛等) 、氨基酸( 组氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、色氨酸等) 、多肽 和蛋白质( b s a 、c b p 、乳铁蛋白、内毒素、腊蛋白、免疫球蛋白、凝集素、溶 菌酶等) 、核酸等f 1 1 3 1 。 直接把壳聚糖作为吸附剂使用并不方便，理论和实践上常利用上述各化学反 应制各各种物理化学性能优良和具有特异吸附功能的衍生物 1 - 1 3 】； 一般将产物 加工制成珠状臣9 , n , 14 1 ”6 , 1 7 , 1 8 。实验室少量制各珠状树脂的方法是将壳聚糖溶于 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 一定浓度的稀酸液( 1 盐酸) 中，制成一定浓度的溶胶( 2 5 壳聚糖盐酸溶液) ， 用针形注射器滴注入凝结液中( 通常是碱液和醇液的混合液，如2 0 氢氧化钠 和3 0 甲醇) ，然后经水洗，丙酮洗真空干燥( 5 0 c ) 等工序，得球形壳聚糖。 将此球形产物置于戊二醛溶液中，室温下进行磁力搅拌若干小时以上，用水和丙 酮反复洗涤，真空干燥，即得交联珠状壳聚糖。通常的制冬方法类似于琼脂糖凝 胶树脂，即把壳聚糖溶解于一定浓度( 3 的乙酸) 的稀酸溶液中，配制成一定 浓度的溶胶，加入壳聚糖溶胶中一定体积比的油相( 有机分散相，悬浮液) ，再 加入少量致孔荆、乳化剂，在5 0 下高速搅拌使反应混合物成乳状，维持一段 时间，然后升高温度至6 0 ，加入适量甲醛进行交联，反应3 0 r a i n 后加入甲醛 一半量的戊二醛，并调节体系的p i - i 值为碱性，升温至8 0 再反应1 h ，过滤， 用有机溶剂( 如煤油) 充分洗涤，无水乙醇抽提除去残留的有机物，最后在8 0 下干燥。轻研成均匀的粉末【3 9 , 1 1 | 4 1 5 1 6 1 7 , 1 8 】。 二河豚毒素的提取研究进展 河豚毒素( t t x ) 又称蝾螈毒素、东方豚毒素等，是神经细胞膜生理研究不可缺 少的工具药物，其价格昂贵，生理活性很强，用作药物的潜力很大，具有极高的经 济价值和医疗价值，能特异性的阻断神经传导过程的钠离子通道，而对其它离子 如钙和钾离子基本上无影响【悖3 1 】。对河豚毒素的化学研究始于2 0 世纪初，1 9 0 9 年田原采用经典化学方法从河豚卵巢中获得粗素，纯度仅为2 ，并将其命名为 t e t m o d o n t o x i n ；2 0 世纪5 0 年代横尾首次从红鳍东方豚卵巢获得了t t x 结晶； 接着津田、荒川及平田也分别获得了n x 结晶 1 9 , 3 1 j 2 1 。1 9 6 4 年以来，由w o o d w a r d 、 平田一后藤、津田及m o s c h e r 等分别独立地测定了t t x 的结构口3 州至1 9 7 2 年人 工合成1 1 x 取得成功。河豚毒素( 码主要存在于豚毒鱼类体内，另外，从某些蝾 螈类、螗类、章鱼、贝类等亲缘关系疏远的近百种动物中也分离出了一些1 1 x 类似物，据谷氏的研究表明，河豚毒素主要集中于豚毒鱼类的卵巢、肝脏、皮肤和 肠内【3 弼嘲。o g a t a 采用s e p h a d e xg - 5 0 凝胶过滤河豚肝脏的提取物，得到无毒高分 子量组分，但经r n a 酶1 2 消化而变成有毒，表明t r x 在体内很可能与r n a 结合 形成复合体。通过对t 1 x 的微生物起源的研究，森等( 1 9 8 7 ) 发现河豚皮肤中的假 单胞菌、多棘槭海星中的溶藻弧苗等均能产生m ( 或其衍生物 3 9 - 4 2 。 6 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 t 1 x 是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，其特点是分子中含有较多的极性基 团，一个炭环，一个胍基，六个羟基，具有较强的极性，p k a 值为8 7 6 ，呈弱碱 性，分子式为c l l h l 7 n 3 0 8 ，为白色结晶状固体，除溶于酸性水溶液外，不溶于其它溶 剂，对热和酸稳定( 1 9 , 3 1 , 3 2 1 。在水中t 1 x 和无水t 1 x 可相互转换，因而不能用再沉 淀法得到纯品，可以通过其苦味酸盐的氨解制备纯品。另外，t r x 经亚硫酸钠及磷 酸混合液( r , n 5 5 ) 处理，可使其内酯环反应消失而无毒化，半胱氮酸也可与t 1 x 作 用使其无毒化。 河豚毒素的提取分离研究首先是结晶化问题，自从田原于1 9 0 9 年首次分离 到t 1 x 的粗品以来，经过了4 0 年，直到横尾( 1 9 5 0 ) 、津m ( 1 9 5 2 ) 、荒) q ( 1 9 5 6 ) 、平 m ( 1 9 5 7 ) 等人，才分离出t 1 x 结晶，目前常规的分离方法分别为：横尾法( 氧化铝柱 层析) 、津田一河村法( 圆形滤纸层析法) 、津田一河村大规模生产法( 活性炭层 析法) 、平田一后藤法( 离子交换树脂一活性炭吸附法) 等【3 2 】。 现代分离河豚毒素多采用层析法，其具体方法如下：首先，把富含毒素的样品 绞碎，与含1 醋酸的甲醇液一起匀浆以抽提河豚毒素，匀浆液经5 0 0 0 6 0 0 0 r m i n 离心1 0 1 5 m i n ，沉淀物再用以上方法重复两次，合并上清液，减压浓缩，并用氯仿 除去脂肪，之后经过冷冻干燥或再减压浓缩，浓缩液经b i o g e l p 2 或c m s e p h a d e x c 2 5 ( n t h + ) 或a m b e r l i t e lr c 5 0 f n u , 3 层析，用o 1 o 4 m o l l 醋酸洗脱，合并有毒 成分，浓缩后再经b i o - r e x 7 0 ( h 十) 层析，以o 1 o 3m o l l 醋酸洗脱，然后再重复一次， b i o - r e x t 0 ( h 3 柱层析，即可得到纯度非常高的样品；苦味酸盐法的氨解也可制备 t 1 x 纯品，其步骤如下：将粗品毒素( 3 2 9 ) 和苦味酸( 2 3 9 ) 溶于2 9 m l 沸水之中，趁 热过滤。冷却滤液，分离结晶沉淀，此沉淀在热水中重结晶3 次，得黄色针状结晶的 n 苦味酸盐( 4 s g ) ，此盐在2 0 0 c 以上变黑，但不溶，元素分析样品需于8 0 ( 2 1 0 0 c 真空干燥2 0 h ，用4 7 9 苦味酸盐在热水中溶解，以氨水调节p h 至9 ，冷却后， 过滤出沉淀固体并加水洗涤，再溶于少量稀醋酸，加入氨水再沉淀，可得到纯 t t x 2 6 9 ；高效液相层析法对分离朝衍生物及同位素标记或荧光标记的丁1 很有用，1 1 x 经偏高碘酸钠氧化生成c 1 1 去甲基河豚毒素，去甲基河豚毒素可用 来制备光活化t 1 x 或荧光标记t 1 x ，去甲基1 还可与赖氨酸结合，通过高效 液相层析法分离，方法是将n x 氧化后于4 1 2 加入醋酸铅l k g 并离心l o m i n ，上 清液于反相层析柱上分离去甲基r d ( ，回收率在9 0 以上；气相层析法也可用 7 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 于t 1 x 的分离，甲硅烷基化试剂为n ，o 双( 甲三基甲硅烷基) 三氟乙酰胺及甲三 基氯硅烷；国内学者黄致强等用高压液相色谱分离，再经离子交换树脂纯化t 1 x ； 易瑞灶等采用微滤、超滤、纳滤和反渗透等多种前沿膜分离技术，进行河豚毒素 的规模化提取制各并得到河豚毒素结晶；张荣庆等利用从河豚卵巢中分离的河豚 毒素高产菌株，通过微生物发酵产生河豚毒素，并运用生化分离技术从发酵产物 中超滤、离子交换柱层析及h p l c 相结合的技术提取得到高纯度的河豚毒素；宫 庆礼等用高效液相法精制河豚毒素等【3 2 ，4 3 彤，4 5 j 6 1 4 7 , 4 8 , 4 9 t s 0 , 5 q 。 三壳聚糖衍生物对铜离子的吸附研究进展 壳聚糖分子中大量的氨基和羟基，可与c u e + 形成稳定的络和物【9 , 5 2 1 ，对c a 2 + 的富集作用非常突出，具有极强的选择分离效果，这种特性可应用于净水处理， 工业废水处理，c u 2 + 的回收等，这方面的研究报道较多【5 3 。6 9 1 ，而且和其它水处理剂 相比，壳聚糖可生物降解，对环境无二次污染。但壳聚糖是弱碱性聚合物，在酸性 条件下会流失、溶解，因此近年来国内外不少学者对壳聚糖的化学改性进行了广 泛的研究，制备了许多理化特性不同的壳聚糖衍生物，在提高其抗酸碱性能的同时 吸附c u 2 + 5 4 , 5 5 5 6 - 5 7 ，5 8 ，5 9 ，6 3 ，“，6 5 ，6 6 , 6 7 , 6 8 。 袁彦超等1 1 3 l 以壳聚糖为原料，甲醛为预交联剂，环氧氯丙烷为交联剂，通过 反相悬浮交联法制备出新型壳聚糖树脂，树脂对c u p 的饱和吸附量9 8 3 m m o v g ， 而且力学强度好、孔隙率较高。陈天等 6 1 t 进行了壳聚糖吸附铜离子动力学和吸附 等温线的研究，结果表明在2 0 时，直径为1 0 0 1 5 0 肛m 的壳聚糖颗粒对铜离子 的吸附速率很快，吸附饱和容量可达2 3 5 e , & g 。陈湘平等旧荆用壳聚糖c 2 位上的 活泼氮基与水杨醛进行缩合反应，合成了n 亚水杨基壳聚糖s c h i f f 碱树脂并测 定了该树脂对c u 2 + 的吸附性能。结果表明该树脂对c u 2 + 的吸附量较高，3 2 7 m g g ， 吸附速度快，在2 h 内吸附率可达8 5 ，并具有一定的选择性。曲荣君等【叫以铜离 子为模扳剂，合成了一系列模板离子含量不同的乙二醇双缩水甘油醚交联的壳聚 糖树脂，并研究了该类吸附剂对几种过渡金属离子的静态吸附性能，结果表明， 该类吸附剂对c u 2 + 吸附容量分别为2 5 5 m m o l g 。曹佐英等嘲报道了微波辐射下 乙二醛交联壳聚糖的制备，用红外光谱等方法对其交联产物进行表征，考察了不 同溶剂对交联度的影响，测定了交联壳聚糖对铜离子的吸附量，实验结果表明， 微波辐射下交联后的壳聚糖对铜离子有较好的吸附。林友文等【醯】以羧甲基壳聚糖 8 塑塞壁蔓查兰! 塑! 旦堡主兰垡丝塞 一 r c m c s ) 为原料、戊二醛为交联剂，利用戊二醛与c m c s 中游离氨基形成希夫碱 而交联，制备一种新型壳聚糖阳离子型树脂，研究了其对c u 2 + 的吸附作用，新型 壳聚糖阳离子型树脂不溶于水、酸和碱，5 m i n 内对c u 2 + 的吸附趋于平衡吸附 容量为9 2 2 2 m g g ，再生重复使用6 次，吸附容量基本不变，对c u 2 + 的吸附等温 线符合l a n g m u i r 或f r e u n d l i e h 等温方程。李琼等例研究了壳聚糖对c u 2 + 的吸附 特性，考察了c u 2 + 的浓度、壳聚糖用量、吸附时间以及体系p h 等不同吸附条件 下，壳聚糖对废水中c u 2 + 的吸附效果。当质量分数为o 8 的壳聚糖的用量为 0 4 m l ，吸附时间为3 0 m i n ，p h 为5 5 6 5 时，对c u 2 + 浓度为0 1 1 0 3 m o l l 的 去除率可达9 8 3 。 四溶菌酶制取的研究进展 本世纪初曾报道枯草杆菌能产生一种溶菌因子，不久又有人指出鸡卵白的强 烈净溶菌能力是由于一种酶的作用。学者们从鼻液、泪水、唾液、植物组织以及 微生物中，都证实了这种溶菌因子的存在，并命名为溶菌酶。目前已研究过的有 细菌细胞壁溶解酶、酵母和霉菌细胞壁溶解霉等三种。溶菌酶( e c 3 2 1 7 ) 是糖 苷水解酶，能水解n 乙酰葡萄糖胺之间n 乙酰葡萄糖胺和n 乙酰胞壁酸之间的 bp 1 ，4 糖苷键，分子量为1 4 3 0 7 ，由1 2 9 个氨基酸构成，其分子式为：g l y l 2 a l a 1 2 ，s e r l 0 ，t h r 7 ，c y s 8 ，m e t 2 ，p r 0 2 ，v a l 6 ，l e u 8 ，l l e u 6 ，p h e 3 ，t y r 3 ，t r y 6 ，g l u 2 ，g i u n 3 ，l y s 6 ，a r g l l ，h i s l ，a s p n l 3 , a s p 8 ，从分子式可以看出，溶菌酶含有的碱性氨基酸比酸性的多， 等电点为l o 7 1 1 3是一种强碱性蛋白【7 0 7 ”。溶菌酶成品是白色冷冻干粉或结 晶，溶于水，不溶于丙酮、乙醚，无臭、味甜，能分解黏多糖，可通过水解细菌细胞壁 的肽聚糖来溶菌，水溶液遇碱易被破坏，最适p h 6 5 。溶菌酶占蛋清中蛋白量的 0 3 左右，与其它蛋清中蛋白相比，较耐热、耐酸，易结晶，特别是与氯化物易形成结 晶盐。在酸性条件下，耐热性很强，并对甲壳素等底物表现亲和力。溶菌酶广泛存 在于禽类的卵清、哺乳动物的眼泪、乳汁以及其它体液，某些植物如木瓜、无花 果、卷心菜中也含有丰富的溶菌酶【7 0 1 。 溶菌酶具有广泛的用途，如食品的防腐保鲜，微生物发酵与生物工程技术中的 菌体裂解及临床药物和诊断上的应用等，它能催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多 糖水解可生成可溶性黏肽，是一种具有杀菌作用的天然抗感染物质，在医学上有 抗菌、抗病毒、止血、消肿、镇痛、加快组织修复等功能，且对人体无任何毒副 9 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 第二部分壳聚糖微珠合成实验 第一章新型壳聚糖徽珠的合成方法 一实验仪器和材料 8 1 0 0 紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪器) ，t h z 一8 2 气浴恒温振荡器( 江 苏省金坛医疗仪器厂) ，p h s 2 型精密酸度计( 上海雷磁仪表厂) ，8 0 2 型离心机( 上 海分析仪器厂) ，壳聚糖( 本实验室合成，脱乙酰度大于9 0 ) ，戊二醛( 2 5 ) ，生化 试剂，吐温- - 6 0 ，c p ；2 8 0 0 型扫描电子显微镜( 日本科技公司) ，s h a - b 水浴恒 温振荡器，江苏国华仪器厂产品；其它化学药品均为分析纯。 二实验方法 1 壳聚糖乙酸溶胶的制备 取1 0 9 壳聚糖溶于9 0 m l 0 5 m o l l 的乙酸溶液中，搅拌混匀，静置一天后离 心取其上清液，褥上清液抽真空脱去其中的空气泡，用1 0 的n a o h 溶液调节 上清液p h 值至出现大量灰白色沉淀。离心弃上清，收集沉淀，取少量沉淀进行 常规水分测定。取一定量的湿胶溶于一定质量分数的乙酸溶液中，制备一定浓度 的壳聚糖乙酸溶胶，备用。 2 新型壳聚糖微珠的制备 将液体石蜡，四氯化碳，色拉油这四种液体以1 3 ：5 ：8 的i 二例均匀混合作 为有机相，取1 2 0 m l 有机相放入5 0 0 m l 圆底烧瓶中，再取投料质量比为7 的表 面活性剂t w e e n - 6 0 加入有机相中，在4 0 水浴中1 0 0 0 r m i n 搅拌2 0 m i n ，然后加入 1 5 m l 的含致孔剂碳酸钙和羧甲基壳聚糖的壳聚糖乙酸溶胶，1 5 0 0 r m i n 搅拌 6 0 r a i n ，使其充分分散为均匀的小液滴。将水浴温度升至5 5 ，1 5 0 0 r r a i n 搅拌， 半分钟后加入2 0 m l5 的n a o h 溶液调节体系的p h 至微碱性。5 m i n 后5 0 0 r m i n 搅拌，溶液颜色由浅黄变为乳白，最后变为深褐色时，停止搅拌。将溶液通过尼 龙膜( 2 5 0 目) 过滤，用四氯化碳洗涤有机杂质，再用乙醚除去四氯化碳，最后 用蒸馏水冲洗多次，得到棕褐色壳聚糖微珠。壳聚糖微珠加适量蒸馏水，在2 5 戊 二醛存在下，加入配基，常温搅拌2 4 h , 获得的产物再与k b i - h 在5 0 c ，微碱性条 件下搅拌反应2 h 将残存的醛基还原为羟基，水洗后放入0 1 m 的盐酸中。浸泡 4 0 m i n 左右，除去致孔剂碳酸钙，水洗至中性制得t 1 x 亲和微珠。取部分湿的亲和 微珠，室温干燥后备用。扫描电镜观察。 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 3 新型壳聚糖微珠含水量测定 准确称取一定量产物，在1 0 0 c1 1 0 c 条件下恒温烘干至恒重，称量质量变化， 计算含水量。 4 新型壳聚糖微珠机械强度的测定 将一定粒数的壳聚糖微珠放入烧杯，加入适量蒸馏水，搅拌8 h ，转速为 2 0 0 0 r r a i n ，根据微珠破碎的数目多少计算完好率，测其搅拌稳定性；取另一定粒 数的微珠放入离心管中4 0 0 0 r r a i n 离i i , 3 0 r a i n ，计算完好率，方法同上，测其离 心稳定性。 完好率( 徇= 未破碎微珠数目总微珠数目x1 0 0 三实验结果 3 1 新型壳壳聚糖微珠的含水量 含水量是新型壳聚糖微珠重要性能指标之一，是壳聚糖微珠交联度和功能基 数目的标志，壳聚糖微珠交联度越低、功能基数目越多则含水量越高。含水量结 果见表1 。另外取少量干燥微珠置于2 0 0 c 烘箱中加热，发现该微珠不熔化，不 分解，说明此类微珠具有优良的耐热性。 3 2 反应条件对新型壳聚糖微珠成珠的影响 新型壳聚糖微珠的粒径大小和吸附性能等受多种因素的影响，其中交联度的 大小由反应时间、温度、交联剂的用量这三者确定。为了获得最佳的反应条件， 我们探讨了交联剂2 5 戊二醛的用量，壳聚糖一乙酸溶胶浓度，搅拌时间，温度， 体系的p h 等几种因素对壳聚糖微珠形成的影响。 3 3 体系的p h 对新型壳聚糖微珠成珠的影响 体系的p h 值对新型壳聚糖微珠有很大影响，体系为弱碱性对珠体的形成 有利，可得到直径分布均匀、表面光滑的珠状微粒；若体系为酸性，成珠率低， 且表面不光滑，主要是在酸性溶液中珠与珠易发生粘连而变形。 3 4 壳聚糖一乙酸溶胶浓度对新型壳聚糖微珠成珠的影响 壳聚糖一乙酸溶胶浓度对溶液粘度的影响很大，粘度随着浓度的增大而增加。 保持反应体系诸条件不变，改变溶胶浓度，壳聚糖一乙酸溶胶浓度质量分数分别 1 4 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 为2 、2 5 ，3 0 ，3 5 进行实验，结果见表l 表1 壳聚糖乙酸溶胶浓度对新型壳聚糖微珠形成的影响 实验壳聚糖反应体系有机相体积微珠特点得率 含水率 编号乙酸溶胶 性质 ( m l ) ( )( ) 浓度 ( ) 12 0 微碱性 1 2 0无法成珠，有絮状 0 - 22 5微碱性1 2 0可成珠但有托尾现象。 微珠粘连融合，珠表面 6 59 4 6 不规则 33 0 微碱性 1 2 0 成珠均匀，珠紧密 表面光滑，色泽深 8 09 3 7 43 5 微碱性 1 2 0 溶胶粘度大。无法成珠 0 从表l 中可以看出，壳聚耱一乙酸溶胶浓度浓度为3 o 时，可制各直径约 为1 7 0 1 a m 的壳聚糖微珠。随着壳聚糖一乙酸溶胶浓度的增加产物颜色逐渐加深， 这是由于浓度增加使水相粘度增大，互相聚集不易分散导致粒度增大，比表面积减 小，更多的交联剂集中交联在壳聚糖微珠表面所致。壳聚糖微珠的含水量下降摊 砌密度和骨架密度增加，孔度稍有下降，这是因为浓度越大，壳聚糖微珠内部结构 越紧密所致。同时，交联剂更难进入壳聚糖微珠内部反应，从而保留了较多的自由 氨基。故壳聚糖一乙酸溶胶浓度质量分数以3 o 为佳。 3 5 温度对新型壳聚糖微珠成珠的影响 壳聚糖一乙酸溶胶的粘度受温度影响很显著，温度低则粘度大，造成壳聚糖 微珠粒径大小不均匀。且有明显拖尾。所以，一般采用实验温度为4 0 c 6 0 c ， 此温度下壳聚糖一乙酸溶胶粘度较小，可满足制各直径为壳聚糖微珠的要求，而 且壳聚糖微珠的粒径大小相对较为均匀，拖尾不明显。 3 62 5 戊二醛用量对新型壳聚糖微珠成珠的影响 壳聚糖分子中含有大量的自由氨基，能在弱酸性条件下与戊二醛发生交联反 应和加成- 消去反应。当戊二醛与壳聚糖分子同一链上的氨基发生反应时，则导致 分子内的交联；当交联剂与不同链上的氨基发生反应时，则导致分子间的桥链反 南京师范大学2 0 0 5 届硕士学位论文 应。如果壳聚糖分子被充分交联，则壳聚糖液滴球体形态将很快固定下来并得以 保持，避免了相互粘结。同时，由于弱酸对戊二醛的活化作用( h 2 c = o h + ) ，增大了羰 基碳的正电性，使具有较强亲核性的氨基易于向其进攻( 生成r n h c h 2 - o 田，进而 脱水生成西佛碱( 对归c h 2 ) ，因此可以起到保护氨基的作用。固定壳聚糖的质量分 数为3 的溶液，其它实验条件不变，改变2 5 戊二醛的用量进行实验，结果见表2 。 表22 5 戊二醛用量对新型壳聚糖微珠的影响 2 5 戊二醛用量微珠外观 ( m l ) 3 浅黄色，易碎 4 深棕色，表明光滑，强度好 5 深棕色，粘连 由表2 可见，2 5 戊二醛用量对壳聚糖微珠性能影响较大，以4 m l 为宜a2 5 戊二醛用量太少时，体系发生易碎现象，不能制备出均匀壳聚糖微珠。2 5 戊二醛 用量较多时，2 5 戊二醛本身过多地与氨基发生交联反应，造成粘结，降低了氮基 的配位能力。 3 , 7 搅拌速度对新型壳聚糖微珠成珠的影响 保持反应体系诸条件不变( 质量分数为3 0 壳聚糖一乙酸溶胶，2 5 戊二醛 用量4 m l ，t w e e n 6 0 溶液5 滴) ，改变反应体系搅拌速度进行实验，结果发现当搅拌 速度提高时，壳聚糖微珠的粒径减小而导致含水量下降，孔隙减小。说明搅拌速度 提高导致分散在介质中的壳聚糖小液滴粒径减小，液滴数目增多，比表面积增大， 与交联剂接触面积增加，交联度相应增大，从而导致壳聚糖微珠内部结构更加紧密， 自由氮基含景减少。 3 8 表面活性剂t w e e n - 6 0 用量对新型壳聚糖微珠成珠的影响 在用反相悬浮技术制备壳聚糖微珠的过程中，搅拌剪切力和壳聚糖一乙酸溶 胶与分散介质之间的界面张力对成球作用影响相反。在一定的搅拌强度和界面张 力下，大小不等的液滴通过一系列分散和会并的过程，构成动态平衡，向反应体系 中加入适量的表面活性剂t w e e n 6 0 ，可以有效地使形成的液滴在交联固化之前保 持较好的球体形态，避免相互粘结、破乳和长大。保持反应体系诸条件不变( 质量 分数为3 壳聚糖溶液，戊二醛用量4 m l ，搅拌速度1 5 0 0 r r a i n ) ，改变反应体系表面 活性剂t w e e n - 6 0 ( 每滴约0 0 3 3 1 9 ) 用量进行实验。实验结果表明t v c e e n - 6 0 用量对