（微生物学专业论文）维生素b12与丙酸分离耦合发酵的研究.pdf

摘要 摘要 维生素b 1 2 是我国重要的微生物发酵产品之一，广泛应用于医药、食品和畜牧业， 其生产主要通过微生物发酵得到。本论文从应用角度出发，初步研究了底物浓度、丙酸 对菌体生长和钴胺素合成的影响，探索在发酵工程中在线分离丙酸，解除有机酸( 丙酸) 对菌体细胞生长的抑制，期望为钴胺素发酵生产工艺的改进提供参考借鉴。本论文主要 进行了以下几个方面的研究。 1 底物浓度对维生素b 1 2 发酵的影响 考察了c 源浓度和n 源浓度对费氏丙酸杆菌发酵生产维生素b 1 2 的影响，实验结果 表明葡萄糖浓度维持在2 0 ，玉米浆浓度维持在4 0 时最有利于菌体生长。考虑到在 发酵过程中补料的可操作性，把葡萄糖浓度维持在1 0 3 o ，玉米浆浓度维持在3 0 4 0 较为合理。 2 丙酸对维生素b 1 2 发酵的影响 本实验研究了外加丙酸对费氏丙酸杆菌生长的影响，同时考察了用更换新鲜培养基 解除丙酸抑制后对费氏丙酸杆菌发酵生产维生素b 1 2 的影响。研究表明，外加丙酸的浓 度在0 0 5 时菌体的戤降为6 0 ，外加丙酸1 0 时菌体的岫掀降为3 0 。更换新 鲜培养基解除丙酸抑制后，生物量提高了7 4 5 ；脱氧腺苷钴胺素产量提高了4 0 7 。 3 反应与分离耦合的发酵工艺研究 初步探索了用离子交换树脂吸附解除有机酸抑制对费氏丙酸杆菌发酵生产维生素 b 。2 的影响。分别研究了利用固定床、扩张床定时吸附丙酸和扩张床在线吸附丙酸的发 酵工艺，可有效解除有机酸对细胞生长的抑制，实现了细胞的连续生长，为连续发酵的 生产工艺提供了借鉴。同时把新工艺应用于生产菌种，取得了良好的结果。 4 陶瓷膜对菌体细胞生长影响的初步研究 考察了陶瓷膜对菌体细胞生长活力的影响。实验表明发酵液通过陶瓷膜，菌体浓度 浓缩到一半之前不会对细胞的生长活力造成损害。本实验为陶瓷膜分离细胞应用于发酵 与分离耦合的工艺提供理论基础。 关键词维生素b 1 2 发酵分离耦合丙酸扩张床 i a b s t r a c t a b s t r a c t c o b a l a m i ni so n eo fi m p o r t a n tp r o d u c t i o n st h a ti sf e r m e n t e di nc h i n a i ti sw i d e l yu s e di n m e d i c i n ea n df o o di n d u s t r y i ti sp r o d u c t e dm a i n l yb yf e r m e n t a t i o n t h ei n f l u e n c eo fs e v e r a l o r g a n ss u b s t r a t ep r o p i o n i ca c i do np r o p i o n i b a e t e r i u mf r e u d e n r e i c h i ig r o w t ha n dv b l 2 f e r m e n t a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fr e m o v a lp r o p i o n i ca c i dw a sa l s o s t u d i e d t h es t u d yw a sb a s e do ni n d u s t r ya p p l i c a t i o n s ，w h i c hh a v es p e c i a lv a l u a b l er e f e r e n c e t oi m p r o v e m e n to fc o b a l a m i nf e r m e n t a t i o n 1 t h ei n f l u e n c eo fs u b s t r a t eo nd e o x y a d e n o s y l c o b a l a m i nf e r m e n t a t i o n t h ee f f e c to fd i f f e r e n t g l u c o s e c o n c e n t r a t i o na n dc o r nc o n c e n t r a t i o no nt h e p r o p i o n i b a c t e r i u mf r e u d e n r e i c h i ig r o w t hw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e g l u c o s eo f10 0g l - 3 0 0g li sm o r es u i tf o rg r o w t ho fc e l l t h ec o r no f3 0 0g l - 4 0 0g l i sm o r es u i tf o rg r o w t ho fc e l l 2 t h ei n f l u e n c eo fp r o p i o n i ea c i do nd e o x y a d e n o s y l c o b a l a m i nf e r m e n t a t i o n t h ee f f e c to fp r o p i o n i ca c i da d d e di nt h em e d i u mo np r o p i o n i b a c t e r i u mf r e u d e n r e i c h i i g r o w t hw e r ei n v e s t i g a t e da n dc h a n g i n gf o rf r e s hb r o t ht a k ep r o p i o n i ca c i do f fi nv i t a m i nb 1 2 ( v b1 2 ) f e r m e n t a t i o nb r o t hw a sa l s oe v a l u a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw h e nt h ep r o p i o n i c a c i dc o n c e n t r a t i o no fa d d i n gw a s0 0 5 ，t h ec e l l 戢w a s6 0 o fo r d i n a r yf e r m e n t a t i o n a n dw h e na d d i n g1 0 p r o p i o n i ca c i d ，t h ec e l ll x m 觚w a s3 0 o fo r d i n a r yf e r m e n t a t i o n t h e r e s u l t so fr e p l a c i n gf r e s hb r o t hr e s u l t e dh i g h e rc o n c e n t r a t i o no fc e l l ，c o m p a r e dt oo r d i n a r y f e r m e n t a t i o n t h eo do fc e l li m p r o v e d7 4 5 t h ey i e l do fd e o x y a d e n o s y l c o b a l a m i n i m p r o v e d4 0 7 3 t h er e s e a r c ho nc o u p l i n gf e r m e n t a t i o nt e c h n i c s t h ei n f l u e n c eo fa d s o r b i n gb yr e s i nz g a 3 3 0t ot a k ep r o p i o n i ca c i do f fi nv i t a m i nb 1 2 ( v b1 2 ) f e r m e n t a t i o nw a se v a l u a t e d t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fr e m o v a lo fp r o p i o n i ca c i d w a sa l s oe x p l o r e d i tc a r le f f i c i e n t l yr e l i e v et h ei n h i b i t i o no fc e l lg r o w t ha n dr e a l i z et h e c o n t i n u o u sg r o wo fb i o m a s s a n dt h er e s e a r c hr e s u l t sc a nb et h ef o u n d a t i o nf o rt h e t e c h n o l o g yo f c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n i i a b s t r a c t 4 t h ei n f l u e n c eo f e x t r a c t i n g t e c h n i c s b y m e m b r a n eo n p r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e i e h i ig r o w t h t h ei n f l u e n c eo fe x t r a c t i n gt e c h n i c sb ym e m b r a n eo np r o p i o n i b a c t e r i u mf r e u d e n r e i c h i i g r o w t hw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec e l lg r o w t hi sn o tr e s t r a i n e dw h e nt h e c e l lc o n c e n t r a t i o nb e f o r eu p t o5 0 0 u s i n gb ym e m b r a n ee x t r a c t i n g k e yw o r d s ：v b l 2 ；u n i t e df e r m e n t a t i o na n dr e m o v a l ；p r o p i o n i ca c i d ；e x p a n d e db e d i i i 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人己经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：日期：旦互年乏月上日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密母 ( 请在以上相应方格内打“4 ) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 的学位论文，是我个人在导师() 指导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人： 作者签名： 导师签名： 日期：1 年厶里日 日期：以年厶卫日 日期：年j 月l 日 第1 章文献综述 1 1 维生素b 1 2 介绍 第1 章文献综述 1 1 1维生素b 1 2 简介 钴胺素( c o b a l a m i n ) 又称维生素b 1 2 ( v i t a m i nb 1 2 ，v b l 2 ) ，是一类含有钴的咕啉 类化合物总称。 1 9 2 6 年m u r p h y 和m i n o t 从肝脏抽提物中发现了维生素b 1 2 ，为此获得了1 9 3 4 年诺 贝尔医学奖1 1 ； 1 9 5 6 年剑桥大学的d o r o t h yh o d g k i n 使用x 射线法阐明了维生素b 1 2 的晶体结构【2 1 。1 9 6 0 1 9 7 2 年，由瑞士的e s c h e n m o s e r 和美国的w o o d w a r d 共同努力， 完成了维生素b 1 2 的化学合成【3 1 。 维生素b 1 2 为深红色结晶性粉末或晶体，无味，吸湿性较强，可溶于水或乙醇中， 在乙醚、丙酮或氯仿中不溶【4 1 。维生素b 1 2 分子由三部分组成：中心咕啉环、c ob 配基 部分和一个含有核苷酸环的c oq 配基，结构如图1 1 所示。 c o b a l a m i n k o b a l l o n h 2 c o m n r i n g s y s t e m x ：一e 嘞 。c n n 图1 1 维生素b 1 2 分子结构 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo f v i t a m i nb 1 2 咕啉环轴向上方的c o1 3 配基不同，产生不同形式的钴胺素类物质。羟基钴胺素 ( h y d r o x y c o b a l a m i n ) 、脱氧腺苷钴胺素( d e o x y a d e n o s y l c o b a l a m i n ) 、甲基钻胺素 ( m e t h y l c o b a l a m i n ) 和氰基钴胺素( c y a n o c o b a l a m i n ) 是钴胺素主要存在形式【5 1 。在工业 l 河北人学理学硕十学何论文 提纯时通常用氰化物取代天然钴胺素而得到氰基钴胺素，商品形式的钴胺素多为氰基钴 胺素。甲基钴胺素和脱氧腺苷钴胺素是哺乳动物体内仅有的两种生物活性形式【6 】。 维生素b 1 2 在食品、医药和畜牧业领域应用广泛，工业上主要通过微生物发酵来生 产维生素b 1 2 。维生素b 1 2 在人体的生理代谢过程中具有重要作用，人体不能自身合成 维生素b 主要通过摄食动物源食品来获得丌。 1 1 2 维生素b 1 2 的生产 维生素b 1 2 有以下几种生产方式：污泥中提取、工业废液中提取和微生物发酵生产。 从污泥提取维生素b 1 2 的过程较为复杂，而且提取得到的维生素b 1 2 并不能直接进入食 品和制药工业，仅仅作为饲料添加剂。工业废液中维生素b 1 2 只是作为一种发酵副产物 被利用，其产量有限【6 】。利用微生物发酵来生产维生素b 1 2 弥补了这些缺点。具备合成 钴胺素能力的微生物主要为细菌和放线菌i s 】。产生钴胺素的细菌主要有：瑞氏丁酸杆菌 ( b u t y r i b a c t i u mr e t t g e r i ) 、乳酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sl a c t i s ) 、普通变形杆菌( p r o t e u s r u l g a r i s ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 、茄 黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u ms o l a r e ) 等。其中放线菌主要为链霉菌属，主要包括：橄榄色链 霉菌( s t r e p t o m y c e so l i v a c e u s ) 、金霉素链霉菌( s t r e p t o m y c e sa u r e o f a c i e n s ) 、抗生素链霉 菌( s t r e p t o m y c e sa n t i b i o t i c u s ) 、微白黄链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b i d o f l a v u s ) 。表1 1 列出 了具备一定工业应用价值的钴胺素生产菌种及生产过程【9 】。 表1 1 具有钴胺黍生产能力的菌种及其生产过程 t a b l e 1 - 1s p e c i e so f m i c r o b i a lp r o d u c e r sa n d m i c r o b i o l o g i c a lp r o c e s s e sr e c o m m e n d e df o rp r o d u c i n g _ v b i 2 钴胺素生产菌种培养琶 要成发酵条件p ：霉警 r _ r _ 一! 型坠影生l 一 瓮三翥；所 葡萄糖厌氧，添加d m b 2 0 6 o k 肋d 掣甜? m 佣傩葡萄糖添加d m b1 3 5 0 p r o p i o n i b a c t e r i u m s h e r m a n i i p s e u d o m o n a s d e n i t r i f i c a n s r h i z o b i u m c o b a l a m i n o g e n u m m i c r o m o n o s p o r as p s t r e p t o m y c e so l i v a c e u s a r t h r o b a c t e rh y a l i n u s 葡萄糖添加d m b 蔗糖 蔗糖 葡萄糖 葡萄糖 异丙醇 好氧，添加甜菜 好氧 添j j i d m b 添力i d m b 添= j i d m b 6 0 0 6 0 0 1 6 5 1 1 5 6 o 1 1 2 第1 章文献综述 费氏丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u mf r e u d e n r e i c h i i ) 和脱氮假单孢菌( p s e u d o m o n a s d e n i t r i f i c a n s ) 被广泛应用于工业发酵生产钴胺裂1 0 1 。 脱氮假单孢菌是最早应用于生产的菌种，法国r p r ( r h o n e p o u l e n er o r e r ) 实验室 通过诱变育种方法和基因工程手段成功改造了脱氮假单孢菌，使其产量达到约3 0 0 m g l 1 0 。 费氏丙酸杆菌在细胞生长过程中不产生内毒素和外毒素，符合美国f d a 的g r a s ( g e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ) 要求，可以安全应用于食品添加剂和医药工业，。此外费 氏丙酸杆菌发酵过程中几乎不需要通气，具有染菌概率小、能耗低等优势，目前利用费 氏丙酸杆菌发酵生产钴胺素越来越引起人们关注【l l 】。 1 1 3 维生素b 1 2 的检测方法 维生素b 1 2 的检测方法主要有：微生物法【1 2 1 、化学发光检测法【13 1 、高效毛细管电泳 法( h p c e ) 1 4 】、高效液相色谱法( h p l c ) i s l 等。微生物法基于乳酸杆菌1 e i c h m a n n i i ， a t c c 7 8 3 0 ) 的生长对维生素b 1 2 的依赖性。将待测样品接入菌种培养基，培养后用比浊 法测定微生物的生长情况，并依照标准曲线读出维生素b 1 2 含量。其操作复杂，测定周 期长。化学发光分析法适合于测定血浆和食品中的维生素b 1 2 ，且具有方法简单、迅速、 选择性好、重复性好等优点，但由于仪器昂贵，不适合推广。h p c e 其原理为根据混合 组分中各组分的迁移速度不同，在毛细管分离过程中形成了各自区带，通过在柱检测对 样品进行分离。高效液相色谱方法是利用物质在不同的两相中溶解、吸附、分配、离子 交换或其它亲和作用的差异，使混合物中各组分达到分离。h p l c 是目前最常用的分析 手段，能对维生素b 1 2 进行快速、灵敏、准确测定。h p l c 使用的溶剂经济，容易与其 它技术联用，需要的样品量小，而且可配备不同的检测器。目i ； 高效液相色谱已经广泛 应用于食品、药品及饲料添加剂中维生素b 1 2 的快速检测【1 5 】。 1 2 丙酸介绍 1 2 1丙酸简介 丙酸( p r o p i o n i ca c i d ，c 3 h 6 0 2 ) 及其丙酸盐是食品、饲料、医药、香料、农药、橡胶、 塑料、油漆、徐料、印刷等工业的重要原料。丙酸是世界上公认的最经济实惠、安全有 效的食用性防腐剂，可有效抑制霉菌、嗜氧芽孢杆菌，且对人畜基本无害，被广泛应用 于食品、饲料和谷物的防腐保鲜中。在医药领域，以丙酸为原料可制得丙氨酸，用来生 河北人理硕十。何论文 产维生素b 6 。在香料工业中，用丙酸可以制取丙酸异戊酯、芳樟酯、丙酸香叶酯、丙酸 乙酯、丙酸苄酯等，进而用作食品、化妆品、肥皂的香料。另外，丙酸在现代塑料工业 中被用于生产一种可生物降解的塑料醋酸丙酸纤维素( c a p ) ，是其重要的组成原料 【1 6 】。随着饲料、医药、食品等工业的快速发展，世界对丙酸的需求量也会日益增加。 1 2 2 丙酸的生产 丙酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。由于化学合成法污染大、操作 条件苛刻等缺点，同时由于石油资源的限制致使人们把目光再次转向微生物发酵法生产 丙酸。如何有效地解除丙、乙酸的抑制，一直是研究人员研究的重点，耦合发酵是一条 比较合理的工艺路线。许多研究人员j 下是从这一思路出发，设计了不同的反应器，采用 了不同的发酵工艺，及时将菌体产生的丙乙酸与细胞分离，解除抑制，从而提高丙酸的 产量。 p a t r i c l eb o y a v a l 等【1 7 1 使j 羽p r o p i o n i b a c t e r i at h o e n i i ( n c d o10 8 2 ) 菌发酵生产丙酸，利 用膜过滤装置将发酵体系中产生的丙酸在线与菌体细胞分离，培养基中营养成分返回到 反应器中重新利用，发酵结束时丙酸最高浓度达至a j 4 04 - 2g l ，但是超滤膜反应器易出现 堵塞问题，需要及时清洗，所以运行费用较大。 v g o s w a m 等【1 8 】将发酵罐改装，在搅拌轴上安装一个孔式过滤器，通过搅拌使营养 物质混合均匀，同时含高浓度丙酸的发酵液进入过滤器内侧，细胞原位滞留，实现了丙 酸与菌体分离，同时补加新鲜培养基实现了连续培养。v g o s w a m 等发现孔式过滤器的 孔径大小对实验的成败起到至关重要的作用。在连续发酵过程中，当孔式过滤器得直径 为1 01 t m 时虽然没有堵塞问题，但细胞滞留率仅为3 1 0 ，当为5 岬时细胞滞留率达到 5 0 0 ，丙酸产率达0 9g l i b ，提高了将近4 倍，而且连续操作8 天没有堵塞和污染问题。 z h o n g g u 等【1 9 1 采用固定化细胞的方法发酵生产丙酸，以海藻酸钙为固定细胞的介 质，利用中空纤维微滤膜过滤发酵液将丙酸与菌体细胞分离，当发酵液中的丙酸浓度控 制在3 l 以下时，丙酸产率为3 9g l h 。 1 2 3 丙酸的检测方法 丙酸的检测方法主要有：化学滴定法、气相色谱法【2 0 ) 、液相色谱法【2 1 ，2 2 1 、离子色谱 法【2 3 刀】、毛细管电泳法【2 5 2 6 1 。滴定法被用来测定总酸度；气相色谱法操作比较繁琐，首 先需要把有机酸转移到有机相( 通过液液萃取) ，其次使用醇类进行衍生化处理；离子 4 第1 章文献综述 色谱法对样品预处理比较简单，但是高浓度的无机离子会干扰有机酸根离子的测定，检 测结果误差相对比较大。高效液相色谱法分析有机酸具有检测快速、灵敏、准确等优点。 1 3 费氏丙酸杆菌发酵生产维生素b 1 2 1 3 1概述 费氏丙酸杆菌( m p 如，z f 6 口c 据一“聊甜如玎陀耙五打) 为革兰氏阳性、不游动不形成孢 子的杆菌，是- - 着e e 兼性厌氧细菌，在好氧条件下也能生长。在厌氧生长时菌体微小，近 似球状或链球状；在好氧或兼性厌氧条件下，生长初期呈弯杆状。 费氏丙酸杆菌厌氧发酵生产维生素b 1 2 有其独特的优势。发酵过程中，菌体细胞分 泌出大量丙酸，使得发酵液p h 值下降，从而降低了染菌的几率。因为是厌氧发酵，无需 供氧，减少了供氧设备的投入，节约了能耗【2 7 】。 费氏丙酸杆菌发酵培养基碳源一般选择葡萄糖为碳源，氮源一般选择玉米浆。研究 表明向培养基中添加c o c t 2 6 h ：! o 可增加维生素b 1 2 的产量，这是由于维生素b 1 2 中心钴 啉环的形成需要钴的参与【2 8 ，2 9 1 ，如添加5 ，6 二甲基苯并咪唑也可提高发酵单位，添加谷 氨酰胺可提高费氏丙酸杆菌氨基化能力，也可加快维生素b 1 2 的合成【3 0 1 。 1 3 2 发酵工艺研究 费氏丙酸杆菌发酵生产维生素b 1 2 包括厌氧培养增加菌体量以及积累维生素b 1 2 前体 物质和添力n d m b 使前体物质合成维生素b 1 2 两个阶段。费氏丙酸杆菌在生长时会产生大 量丙酸和乙酸，有机酸的积累会抑制菌体生长【3 l 】，延长了发酵周期。通过耦合发酵工艺 来解除有机酸抑制，提高菌体量和发酵单位是目前费氏丙酸杆菌发酵生产维生素b 1 2 的 研究热点。 1 3 2 1 间歇溶氧发酵法 工业上生产维生素b 1 2 一般采用厌氧发酵工艺。在厌氧条件下，费氏丙酸杆菌细胞 生长过程中会会代谢积累大量丙酸，抑制细胞生长。k a i m i n g l 3 2 3 3 】等发明了一种由厌氧、 好氧周期交替循环的间歇溶氧发酵工艺。在有氧发酵的体系中，丙酸被分解成丙酮酸盐 ( 或酯) 而被积累。同时一个短时间( 6 h ) 的有氧发酵后，细胞能够快速的生长，但是 长时间的有氧发酵( 大于6 h ) 对细胞的生长的是不利的。因此在维生素b 1 2 发酵过程中 阶段性的进行有氧发酵可以有效地解除厌氧发酵过程产生的丙酸对细胞的抑制，促进菌 体细胞生长，提高维生素b 1 2 的产量。 5 河北人理学硕 学何论文 1 3 2 2 膜反应器应用于维生素b 1 2 发酵工业 h a t a n a k a 等【3 4 1 曾建立了一套由中空纤维滤膜器和维生素b 1 2 发酵罐组成的膜反应系 统。在发酵过程中使用膜反应器将发酵液中的抑制物( 有机酸) 与菌体细胞分离，再通 过发酵液的循环流动，减小了因压力过大对细胞的负面影响。结果维生素b 1 2 的产量提 高了2 4 倍。但是在应用此系统过程中，营养物质会伴随丙酸一同透过滤膜而流失，造成 成了培养基的浪费。 1 9 9 6 年n a k a n o 等建立了由活性炭填装柱、和发酵罐组成的发酵体系。活性炭填 料柱和旋转陶瓷膜滤器可有效去除丙酸，并且能回收重复使用发酵细胞和培养基。发酵 液先经旋转陶瓷膜过滤，使细胞与丙酸分离，滤液再进入装填柱对丙酸进行吸附分离， 滤出液重新循环回发酵罐中，在接触丙酸的同时也不会造成浪费。但其总体成本偏高还 未能应广泛用于工业生产。 1 4 吸附法分离技术 吸附是溶质从液相或气相转移到固相的现象【3 6 1 。吸附包括物理吸附、化学吸附和离 子交换。 离子交换法因其具有选择性高，交换容量大，操作简便，易于自动控制等优而被广 泛应用与生物分离过程。 离子交换树脂按功能基分为：强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、强 碱性阴离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂【3 7 1 。强碱性阴离子交换树脂和弱碱性阴离 子交换树脂均可用于丙酸的吸附分离。因其发酵液中的组份复杂，同时含有丰富的氨基 酸，而强碱性阴离子交换树脂对氨基酸有较强的吸附作用。所以选取弱碱性阴离子交换 树脂作为在发酵过程中在线分离丙酸的介质。 1 5 扩张床吸附技术 _ l x l j 挽9 0 年代初，d r a e g e r 和c h a s 发明了扩张床吸附( e x p a n d e db e da d s o r p t i o n ， e b a ) 技术，简称e b a 3 8 1 。它是一种在产物捕获阶段实现过程集成的新型生物分离技术 【3 9 1 。料液中固体小颗粒能直接通过床层适度膨胀产生的较大空隙，从而目标产物能被介 质捕获。扩张床吸附技术集固液分离、浓缩和初期纯化于一个单元操作之中，能直接从 细胞培养液、匀浆液和含有固体颗粒的发酵液中捕获目标产物。具有操作步骤简单、提 取效率高等优点。通过十几年的发展研究e b a 技术以应用于细菌、酵母或动物细胞中目 6 第1 章文献综述 标物的提取【删。图1 3 比较了生物产品下游加工过程的一般处理流程，并显示了扩张床 吸附技术的集成化作用4 1 1 。 即粕c 弋 图1 3 扩张床吸附技术在下游加】：过程中集成化 f i g 1 3p r o c e s si n t e g r a t i o no fe x p a n d e db e da d s o r p t i o ni nd o w n s t r e a mp r o c e s s i n g 7 河北人学理学硕f j 学何论文 第2 章底物浓度对费氏丙酸杆菌生长的影响 2 1引言 费氏丙酸杆菌发酵过程中，培养基中底物浓度过高会对菌体细胞的生长产生抑制， 反之营养物质不充足也会影响细胞的生长。通过考察最适合菌体细胞生长的底物浓度对 耦合发酵后期补料提供依据。 2 2 实验材料 2 2 1菌株 费氏丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e i c h i i ) ，c i c c - 1 0 0 1 9 ，购自中国工业微 生物菌种保藏中心。 2 2 2培养基 种子培养基( ) ：葡萄糖3 5 ，玉米浆2 1 ，硫酸铵o 5 ，磷酸二氢钾o 4 ，碳酸 钙o 4 ，氯化钴0 0 0 0 5 ( 自来水配置，调p h 6 8 7 o ) 。葡萄糖单独灭菌。 发酵培养基( ) ：葡萄糖6 ，玉米浆4 ，磷酸二氢钾0 4 6 ，氯化钴0 0 0 1 2 7 。( 自 来水配置，调p h6 8 7 o ) 。 2 2 3主要仪器与试剂 a g i l e n t1 1 0 0 型高效液相色谱仪( 二极管阵列检测器) ，b e c k m a nc 1 8 ( 5 1 a m ，4 6m m x 2 5 e m ) 色谱柱，s i g m a3 k 3 0 型高速离心机，b e c k m a nj 6 m c 型大容量离心机，s a r t o r i u s a r i u m6 1 1u f 型纯水机，羟基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素、甲基钴胺素标准品购自美国 s i g m a 公司，乙腈( 色谱纯) ，氢氧化钠( 分析纯) ，磷酸( 分析纯) 。 2 3 实验方法 2 3 1费氏丙酸杆菌的发酵 取穿刺培养的费氏丙酸杆菌，使用生理盐水洗下茵体接入种子培养基，3 0 静置 培养5 0h 。种子液1 0 接种发酵培养基，3 0 静置培养，发酵过程中以氨水调节p h 保 持在6 8 7 0 范围内。发酵过程中加入5 ，6 二甲基苯并咪唑( d m b ) ，促使菌体合成脱 氧腺苷钴胺素。 第2 章底物浓度对费氏丙酸杆l 辑发酵的影响 2 3 2葡萄糖浓度对茵体生长的影响 设定l 、) l ，t 、2 叭、3w t 、4 叭、5 叭、6w t 几个葡萄糖浓度梯度，其它 因素的含量不变，当各梯度的糖浓度消耗一个百分点时，补糖至原浓度。其问每6h 取2 0 m l 发酵液，离心、取菌体称量干重( 6 0 烘干) 。发酵结束时测定丙酸和脱氧腺苷钴铵 素产量。 2 3 3 玉米浆对菌体生长的影响 设定1w t 、2 叭、3 、4w t 几个玉米浆浓度梯度，其它因素的含量不变， 当各梯度的玉米浆浓度消耗一个百分点时，补玉米浆至原浓度。其间每6h 取2 0m l 发酵 液，离心、取菌体称量干重( 6 0 烘干) 。发酵结束时测定丙酸和脱氧腺苷钴铵素产量。 2 3 4 分析方法 2 3 4 1 生物量的测定 发酵液取2 0m l ，1 0 0 0 0r m i n 离心、取菌体称量干重( 6 0 烘干) ，表示生物量。 2 3 4 2 葡萄糖浓度测定 d n s 法【4 2 1 2 3 4 3最大比生长速率测定 用o r i g i n 7 5 软件拟合菌体细胞对数生长期的线性关系，求得其斜率为最大比生长速 率【4 3 1 。 2 3 4 4 丙酸的测定 高效液相色谱法( h p l c ) ，色谱柱：b e c k m a nc 18 ( 5 p m ，4 6 m m x 2 5 c m ) ；色谱条件： 流动相i 为乙腈，流动相i i 为o 0 2m o l lk 2 h p o a 缓冲液( 浓磷酸调节p h 值为2 8 ) ， vi ：v i i = 8 ：9 2 ；柱温3 0 ；检测波长：2 1 5n n l ；流速：lm l m i n ；进样量：1 0 皿 【4 4 、4 5 】 o 2 3 4 5 腺苷钴胺素检测方法 发酵液于4 0 0 0r m i n 离心收集菌体。取湿菌体，配成1 5 比例的菌悬液，沸水浴1 0 m i n ，破碎细胞，使脱氧腺苷钻胺素释放，1 0 0 0 0r m i n 离心收集上清液，0 4 5 岬纤维素 滤膜过滤后使用h p l c 澳i j 定产量，为了防止其光解，整个操作过程中需避光进行。流动 相i 为乙腈，流动相i i 为醋酸钠缓冲液( p h 值为3 5 ) ；柱温2 5 ；检测波长2 5 4n i n | 流速1 0m l m i n ；进样量1 0p l 。洗脱条件：0 5m i n ，1 5 乙腈恒速洗脱；5 1 5r a i n ， 9 河j 匕大学理学硕十? 学何论文 1 5 3 0 乙腈梯度洗脱【矧。 2 4 实验结果与讨论 2 4 1葡萄糖对菌体生长的影响 微生物细胞浓度的自然对数与时间呈直线关系，斜率为“，在良好的培养条件下， 对数生长期微生物的比生长速率为最大比生长速率，。【4 3 】。 i n x , = i 以b m 式中“为菌体比生长速率( 1 h ) ；x 为菌体浓度( l ) ；t 为时间( h ) 由图2 1 菌体细胞在对数生长期的生物量，通过o r i g i n 7 5 软件拟合出菌体细胞对数 生长期的线性关系如图2 2 。其斜率即为菌体细胞的t t m 。x ，见表2 1 。 5 4 33 b o 、 1 12 h - 羞， 0 02 04 06 08 01 0 0 时间( h ) 图2 1 葡萄糖含量对生物量的影响 1 0 口2 0 a 3 0 4 0 5 0 6 0 f i g 2 - 1t h ee f f e c to fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nf o rf e r m e n t a t i o n 1 0 第2 章底物浓度对费氏丙酸杆荫发酵的影响 。 面 、- ， 1 矗 j h - 捡 翘 z o z 5 3 03 54 045,50 时间( h ) 图2 - 2 拟合菌体对数生长期的线性曲线 - k1 2 3 v4 5 口6 f i g 2 - 2t h el i n e a rc u r v eo ff i t t i n gl o g a r i t h m i cp h a s ec e l l 有表2 1 和图2 3 所示，不同葡萄糖浓度发酵体系中，葡萄糖维持在2 0 时，生 物量达到了4 4 2g l ，细胞达到了o 1 4 4 t l ，丙酸和脱氧腺苷钴铵素产量为1 2 2 6g l 和1 0 9 4m g l ，均为最高；同时有图2 1 所示葡萄糖维持在2 0 时，细胞在2 4h 进入 对数生长期，与其它几个浓度的相当；说明葡萄糖维持在2 0 时最有利于菌体生长。 葡萄糖浓度维持在1 0 和3 0 时，其生物量为4 3 8g l 和4 0 0g l ，细胞。为 o 1 2 8 1 1 和o 1 1 9 h ，丙酸产量为1 1 1 2g l 和1 0 8 8g l ，脱氧腺苷钴铵素产量为1 0 9 0 m g l 和1 0 7 8m g l ，均略低于2 0 的。 葡萄糖维持在4 0 、5 0 、6 0 时，生物量、细胞矾、丙酸和脱氧腺苷钴铵素 明显低于2 0 的，其原因是由于葡萄糖浓度过高，对菌体的生长产生了抑制作用。 葡萄糖维持在2 0 时最有利于菌体生长，但考虑到在发酵过程中补糖的可操作性， 把葡萄糖浓度维持在1 0 3 0 最为合理。 表2 - 1 不同葡萄糖浓度发酵体系中生物量、“。、丙酸和脱氧腺苷钴铵素产量 t a b l e2 - 1 t h ep r o p i o n i ca c i dy i e l dt h el a r g e s tg r o w t hr a t et h eb i o m a s sa n dv b l 2o ff e r m e n t i o nt h a ta d d i n g d i f f e r e n tg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n 葡萄糖浓度生物量( h )丙酸产量脱氧腺苷钴铵素 gl) 5 0 对照0 5 1 1 5 2 2 5 3 4 丙酸浓度 图5 - 3 添加丙酸对菌体合成v b l 2 的影响 f i g 5 - 3t h ee f f e c to fa d d i n gp r o p i o n i ca c i df o rv b 12 5 4 3固定床定时吸附丙酸对生产菌株发酵的影响 如图5 4 和表5 1 所示，发酵至3 0h 对其发酵液中丙酸进行吸附分离，茵体细胞 实现了较快生长。发酵结束时生物量o d 为3 3 9 ，比对照提高了7 5 ，v b l 2 产量为 2 4 6m g l ，比对照提高了1 4 7 ，丙酸产量达到2 7 9g l ，比对照提高1 7 7 。 时间( h ) 、 j 趟 疑 甾 瞌 图5 - 4 树脂吸附丙酸发酵与补氨发酵的过程曲线 生物量( 吸附) 丙酸( 吸附) 口生物量( 对照) 丙酸( 对照) f i g 5 - 4a d s o r p t i o no f p r o p i o n i ca c i db yr e s i n sf e r m e n t a t i o n sa n da d d i n ga m m o n i af e r m e n t a t i o n 星o o o q o v 删霉删 第5 章耦合发酵t 艺应用丁生产菌株发酵的初步研究 表5 1 同定床吸附丙酸发酵和补氨发酵的比较 t a b l e5 1c o m p a r i s o no f a d s o r p t i o no fp r o p i o n i ca c i db ym s m sf e r m e n t a t i o n sa n da d d i n ga m m o m a f e r m e n t a t i o n 5 4 4 扩张床定时吸附丙酸对生产菌株发酵的影响 如图5 5 和表5 2 所示，发酵至4 4h ，利用扩张床对其发酵液中丙酸吸附分离，解 除部分丙酸抑制后细胞实现了较快生长。发酵结束时生物量o d 为3 0 7 ，比对照提高了 3 9 ，v b l 2 产量为2 6m g l ，比对照提高了7 5 ，丙酸产量达到2 9 6g l ，比对照提 高了l o 5 。 时间( h ) j b o - 越 蠖 甾 眩 图5 5 树脂吸附丙酸发酵与补氨发酵的过程曲线 生物量( 吸附) 丙酸( 吸附) 口生物鼍( 对照) 丙酸( 对照) f i g 5 - 5o n - l i n ea d s o r p t i o no f p r o p i o n i ca c i db yr e s i n sf e r m e n t a t i o n s a n da d d i n ga m m o n i af e r m e n t a t i o n 3 5 星。o。oov删s划 河北大学理学硕 ：学侮论文 表5 2 扩张床吸附丙酸发酵和补氨发酵的比较 t a b l e5 - 2c o m p a r i s o no fo n - l i n ea d s o r p t i o no fp r o p i o n i ca c i db yr e s i n sf e r m e n t a t