（植物学专业论文）花生白藜芦醇合酶基因表达的rna原位杂交研究.pdf

内容提要花生白藜芦酊台酶蛙表达的r n a 原位杂交研究 内容提要 本文前部分较详细地综述了白藜芦醇合酶( r e s v e r a t r o ls y n t h a s e ，r s ) 基 因的研究进展及r n a 原位杂交技术( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，i s h ) 的发展和应 用。本研究主要是利用该技术，对花生根、茎和叶器官组织内r sm r n a s 进行原位杂交定位，研究该基因的表达特性以及酵母提取物对该基因表达的 诱导表达特性。本研究不仅可以作为选育鉴定高抗转基因作物品种的方法， 而且剥白藜芦醇药物的丌发生产都具有重要的指导意义，具有很好应用前 景。r s 基因的诱导表达及其调控机制的研究，能为提高转基因农作物的抗 病性提供理论及实践指导。 实验结果发现：r s 基因在根的韧皮部有表达，大田实生苗的表达量相 对更多，其它组织细胞中都未见表达。试管茁的茎中没有转录表达；而大田 实生苗能见到明显表达：经过酵母浸提物后，表达量更多且更明显，表达部 位也是在韧皮部。r s 基因在大田实生苗的叶片中只有少量表达，主要是在 叶肉细胞以及叶脉维管束中的韧皮部：在试管苗的叶片中也没发现表达。 初步分析，我们认为白藜芦醇合酶基因的转录表达主要在韧皮部细胞和 叶肉细胞，具有组织上的特异性。经过酵母浸提液处理后，基因转录表达在 茎中大大加强，表明该基因的转录表达还具有诱导性。 关键词：花生；白藜芦醇合酶：基因表达；原位杂交； a b s t r a c t r n a ns i t uh y b r i d i z a t i o nt os t u d yr e s v e r a t r o ls y n t h a s e ( r s ) g e n e e x p r e s s i o ni nv e g e t a t i v eo r g a n so fp e a n u t 似r a c h i sh y p o g a e al ) a b s t r a c tr e s v e r a t r o ( a sap h y t o a l e x i n ) i sa na n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e ，w h i c h a c c u m u l a t e si nr e s p o n s et oap a t h o g e na n de n h a n c e st h er e s i s t a n c ew f l h i na p l a n t i ti sak i n d o fs t i l b e n e st h a tw a sf o u n di nal i m i t e dn u m b e ro fu n r e l a t e dp l a n t s p e c i e s ，s u c h a s p e a n u t s a n dg r a p e v i n e s n e wr o l e s o fr e s v e r a t r o la sa n a n t i o x i d a n ta n da n t i m u t a g e n i ca g e n to fh u m a nh e a l t hb e n e f i t s ，w a sf i r s ts h o w nt o a c ta si t sa s s o c i a t i o nw i t hr e d u c e d 血er i s ko fc o r o n a r yh e a r td i s e a s ea n dh a s d e m o n s t r a t e dt h e r a p e u t i ca c t i v i t i e si nav a r i e t yo ft u m o r s 7 f h i st h e s i sd e t a i l st h e r e s e a r c hp r o g r e s so ft h er e s v e r a t r o ls y n t h a s e ( r s ) g e n e ，a n dd e v e l o p m e n ta n d a p p l i c a t i o no l i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( 1 s h ) t h i sr e s e a r c hn o to n l yc a nb eam e t h o d t oi d e n t i f i e dm a db r e e dt h et r a n s g e n i cf a r mc r o p ，b u ta l s oh a v et h ei m p o r t a n t l e a d i n gm e a n i n gt ot h ed e v e l o p m e n to ft h er e s v e r a t r o lm e d i c i n e u s i n gr e s v e r a t r o ls y n t h a s eg e n eo fa r a c h i sh y p o g a e aa sat e m p l e t ，s y n t h e s i z e d i g o x i g c n i n l a b e l e d a n t i s e n s er n ap r o b ei nv i t r o t r a n s c r i p t i o n w i t hr n a p o l y m c r a s e su t i l i z i n gt h ep r o b et od e t e c ts p e c i f i cr sg e n ec x p r e s s i o nw i t h i n t i s s u es e c t i o n so fp e a n u tv e g e t a t i v e o r g a n sa n dr e g u l a t i o no f t h eo u t s i d e r i n d u c e m e n tf a c t o rt ot h eg e n ee x p r e s s i o n 知s i t uh y b r i d i z a t i o na n a l y s i sr e v e a l e d t h a tt h ee x p r e s s i o no fr sg e n ew a sa s s o c i a t e dw i t hp h l o e mo f 、，a s c u l a l t i s s ua n d m e s o p h y 1c e t l s r st r a n s c r i p t sw e r ep r e d o m i n a n ti np h l o e m b u tr e s t r i c t e dt o o t h e rt i s s u e st r e a t e dw i t h y e a s te x t r a c t ，t h eg e n et r a n s c r i p t i o n l e v e lw a s i n c r e a s e ds ow eb e l i e v e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fr sg e n eh a st i s s u es p e c i f i c e x p r e s s i o np a t t e r na n di n d u c i b l ee x p r e s s i o np a t t e r n k e yw o r d s ：a i a b h & h y p o g a e a ；r e s v e r a t r o ls y n t h a s e ；r n a ；i ns i t uh y b r i d i z a t i o n 致谢 y7 6 9 0 0 6 值此论丈完成之际，谨向我尊敬的导师陈由强教授和朱锦懋教 授致以最诚挚的谢意，感谢他们多年来对我工作、学习上的鼓励和 悉心指导，特别是在生活上给予的莫大关心和帮助。 三年前，当我从中学教师迅速转变为一名在校研究生时，对现 代分子生物学了解甚少，是老师孜孜不倦地教诲和亲身引导，使我 逐步认识、理解和掌握了分子生物学研究的方法和意义。这三年来， 是两位老师以他们渊博的学识、严谨的学风、踏实勤恳的工作和执 着的追求精神激励着我。他们乐观的生活态度以及待人的热情和诚 恳深深感染了我，这对我今后的工作和学习都有极大的教益，使我 受益终身。我希望在将来的学习和工作生涯中能取得更多更好更优 异的成绩，并以此作为报答两位老师的最好礼物。 在我的课题研究中，常常得到以下老师的热忱帮助，他们是： 张彦定、叶冰莹、黄儒珠、林丹军、李凤玉和黄飞等老师，以及福 建农林大学的庄伟建教授，在此一并向他们表示最真挚的感谢! 我还要感谢实验室的师弟师妹，还有师兄师姐，尤其是郭晋隆 和黄骐两位师兄，谢谢他( 她) 们在我研究3 - 作中给予许多好的建议 和悉心帮助。 最后，衷心感谢我的女友董倩，无论在学习工作中，还是在生 活上，一直鼓励我，关心和支持我。同时，我还要感谢我的妹妹和妹 夫给予的关怀和鼓励。我更要将此文献给我的父母，感谢他们的养 育之恩和对我的支持，使我可以心无旁骛的专心求学，为此他们忍 受孤寂并付出了巨大的牺牲。谢谢! 黄国强 二零零五年五月于福州 绣f 砑 职 j 综述 花生白藜芦醇台酶箨刚表达的r n a 蟓位杂交t i d i 白藜芦醇合酶( r e s v e r a t r o ls y n t h a s e ，r s ) 和银松素合酶( p i n o s y l v i n s y n t h a s e ，p s ) 是芪合酶( s t i l b e n es y n t h a s e ，s t s ) 中的两火炎。其中，r s 以p 一香豆酰辅酶a ( p - c o u m a r o y l c o a ) 为底物合成多酚类化什物白藜 芦醇( r e s v e r a t r 0 1 ) ( f l i e g m a n ne ta 1 ，1 9 9 2 ) 。该化合物大都足 ! j l 物r s 基因在 真菌和真菌的分泌物或其他病原体侵染等生物因素诱导下表达并进一步合 成的，属诱导型化合物：也可在非生物因素诱导下合成，如一定的外岁胁迫 压力，植物体损伤等。在实验条件下，经紫外光、臭氧处理、激素炎物质( 如 乙烯) 、酵母提取物以及无机盐( a 1 c 1 3 ) 等诱导后都能得到诱导表达。白藜 芦醇对病原体具有毒性，是植物防御机制的一部分，属植保豢类。 目前已经在2 1 个科、3 1 个属的7 2 种植物中发现了白藜芦酵( j a n ge ta l 1 9 9 7 ) ，常见的有葡萄科的葡萄属，如葡萄( 所廊v i n i r e r 口) ( 1 e a n d e te ta 1 ， 1 9 9 1 ) ，豆科的落花生属如花生( a r a c h 曲h y p o g a e a ) 、决明属、枕属( i n g h a m ， 1 9 7 6 ；m a n n i l ap ，a l 】9 9 3a n d m u n e k a z ue l a l ，19 9 5 ) ；还在虎枞、藜芦、掌叶 大黄( j r 艇z l 柳，口砌州，p o l y g o n a c e a e ) 等中发现( k a s h i w a d ae ta l 19 8 8 ) 。 1 白藜芦醇合酶基因的研究进展 1 1 花生白藜芦醇合酶基因序列的研究 1 9 8 8 年，从花生( a r a c h i sh y p o g a e a ) 中得到两个r sc d n a 克隆： p g s c l ：1 1 8 5 b p ，蛋白质大小：3 8 9a a ，分子量：4 2 7 3 3 d a ；p g s c 2 ：1 1 3 0b p ， c d s ：3 8 - - 9 7 9 ，蛋白质大小：3 1 3a a ，分子量：3 3 9 6 8d a 。它( f l - i 于鉴别两个 基因组d n a 克隆：p g s g l 0 ( 1 2 2 8b p e x o n ：1 1 7 8 i n l r o n ：1 7 9 5 4 7 e x o n ：5 4 8 - 1 2 2 8 ，蛋白质大小：3 8 9a a ，分子量：4 2 7 3 3d a ) 和p g s g il ( 9 5 1 b p ， 蛋白质大d 、：3 8 9a a ；分子量：4 2 7 3 3d a ) 。序列分析显示在两克隆p g s c l 、 综述 花生白藜芦醇台酶綦闻表选的r n a 原位杂交研究 p g s c 2 近等同序列区有大区段的重叠，且包含p g s g l 0 的5 。端和p g s g l l 的 3 1 末端区，序列含单一内含子，预测蛋白质大小为4 2 7k d a ，与聚丙烯酰胺凝 胶电泳条带显示大小相同( 4 3k d a ) 。其后的研究中把e d n a 等同于 p g s c 2 ，r s l 等同于p g s g l 0 ，r s 2 等同于p g s g l l ( s c h r 6 d e re l ( ，f ，1 9 8 8 ) 。 1 9 9 0 年，又从花生( a r a c h i sh y p o g a e a ) 中克隆出2 条r s l 因序列：r s 3 、 r s 4 。r s 3 包含完全的r s 基因，其只缺乏5 喘1 6 b p 的蛋白舸码区，单一内 含子与r s l 内含子所在位胃相同，序列分析显示两个内含予有2 6 不同， 在蛋白解码区，r s 3 与r s l 有9 4 的同源性。另一克隆r s 4 包含的d n a 序列与r s l 第二外显子与一小部分内含子有同源性，序列的上游测序显示与 任何r s 基因的外显予( 即r s 的第一外显予) 无任何相似性，在r s 4 中发 现r s 外显予的丌放性读码框中一碱基g 变为t ，导致形成终止密码予，这 一碱基的改变和外显子的缺失暗示r s 4 是无功能性基因( y a m a z a k ie ta l ， 2 0 0 1 ) 。经过比对发现，葡萄的r se d n a 与花生具有极高的同源性。至2 0 0 2 年，从花生中克隆的基因序列7 条；2 0 0 0 年，又克隆出花生r s 基因r s 3 ， 长度为：1 5 0 0 b p ，坠：1 0 - - 1 8 7 ，5 0 0 - - 1 4 9 1 ，蛋白质大小：3 8 9a a ，分子量： 4 2 7 1 5d a ( y u ne ta l ，2 0 0 0 ) 。2 0 0 2 年本实验室得到白藜芦醉合酶基因的 c d n a 全编码区片段，该基因与美国专利( u s 一5 6 8 9 0 4 6 ) 等和有关文献的基 因相比，其核苷酸序列同源性分别为9 5 、9 3 牙1 19 2 ，氨j i 序列同源性 为9 5 、9 4 和9 3 ，测序结果已登录o e n b a n k ( 登录号为a y l 7 0 3 4 7 ) 。 1 1 1r s 与c h s ( 查尔酮合酶) 基因序列的比较 将花生中的r s 与来自七种植物的c h s ( 包括花生) 的同源序列进行比 较，发现同源性达到7 9 ，r s 中的内含子位簧与c h s 的保。、川q 含予在同一 位置，然而，r s 与c h s 保：j ：蛋白质序列有很大数日的氨基陵笼片，两种脯 可能具有结合底物和进行该类型酶反应的普遍支架，不同的氩熬酸则与不同 产物的形成有关( s c h r 6 d e re t a l ，1 9 8 8 ) 。 综述 花生自藜芦醇含酶挂冈表达的r r a 原位杂交1 1 j f 究 1 1 2 白藜芦醇合酶基因启动子的研究 对启动子的研究却以葡萄克隆v s t l 基因为主，对花生白藜芦醇启动子 研究较少。1 9 9 7 年从葡萄、松和兰科植物中分离的r s 基因， 诞据它们对外部 信号包括来源于真菌的病原体信号的反应进行分组，筛选出一系列基因的启 动子，并对转基因植物的病毒侵染和葡萄原生质体的瞬时表达进行分析，分 析显示这些启动予包含w 盒，此结构作为诱导反应区，幽位于t a t a 盒上 游的3 0 0 - - 6 0 0 个核苷组成，对由真菌化合物诱导的信号转导链! 陆别的敏感。 用臭氧诱导r s 表达，分析相应的v s t i 基因的启动予，以g u s 基因为 报告基因，以臭氧单脉冲( o 1 m l l ，1 0 h ) 处理，可诱导g u s 基因的表达增 加1 1 倍，对g u s 基因的组织化学定位分析显示，在整个叶面有一些小点分 布，叶组织杂交部分晁示v s t l 启动子在栅栏组织和海绵组织中表达，但在 表皮细胞中表达更少，5 咏端外切后发现在v s t l 基因中，臭氧诱导区域与 病原体诱导区域不同，- - 4 3 0 到2 8 0 碱基序列为臭氧诱导区域，- - 2 8 0n - 1 4 0 碱基序列病原体诱导区域( g e h u b e re ta i ，1 9 9 7 ) 。白藜芦醇合酶启动子主 要位于基因序列的- - 4 0 0 位上下，不同的白藜芦醇合酶都有对胁迫敏感的不 同的启动子。 1 2 花生白藜芦醇合酶基因的转基因研究 从花生( a r a c h mh y p o g a e a ) 、葡萄( 加v i n i f e r a ) 中克隆出的r s 基因 已转入烟草、水稻、大麦和小麦，该基因稳定嵌合于基因组中并遗传给后代 ( h a i ne ta 1 ，1 9 9 0 ；1 9 9 3 ) ；发现葡萄提高t x 寸灰霉( b o t r y t i sc i n e r e a ) 感染 的抵抗力；水稻增强了对稻瘟病的抵抗力( s t a r k e ta 1 ，1 9 9 7 ) ；火麦增强了对 灰霉的抗病性( l e c k b a n da n dl o r z ，1 9 9 8 ) ；小麦增强了对白粉病的抗性 8 】。 2 0 0 0 年，将花生中的r s 基因导入苜蓿( m e d i c a g os a t i v a ) ，剥哞0 基因苜 蓿的r s 表达进行深入的研究。通过对转基因植物的各个部分的m r n a 水平 进行n o r t h e r n 检测发现：在3 5 s 启动予作用下，根中的g u sm r n a 水平与 叶和茎相似，而转基因植物中r sm r n a 表达水平在根中却相对低：用大豆 的1 8 sr r n a 克隆探针检测，发现在每一个检测组中总r n a 含量都相同，原 因可能是不同来源的启动子在根系中的表达水平不同，或是在根中形成r s 的信号不稳定，或是构建的载体基因不同所致。同时转基因植株中没有检测 到游离的白藜芦醇，而检测到浓度不等的一种新的次生代谢物白藜芦醇 甙( 白藜芦醇葡糖苷) 。该化合物在转基因苜蓿的叶和茎中含量较高，在嫩 叶中最高( 1 5 m g g 鲜重) ，在老茎的节间也比较多( 10 m g g 鲜重) ，而 在根中仅有痕量( 们互：oj)i霉罢。若。k0j2曲占一。1i们一q且。专。_。iis h h 乱 u每基。jj一仨。i暑2们一薯岫。口。dig蓦扫。c。甾2j【口o岳unu盘譬；。g。面2 h o 鲁 仨一日啦日哪里旨d鼍d暑nsp口。一右一与曲譬譬1bcj。8c05f嚣$2 i(u1，专拦ls皇口。1。 ddi=j岳o卜li厶矗di。二帕专一誊瘩k拦等口。lh垴。c。=u。c【ou c。厶j叫毫h甍q口o 暑-。套。u翌5享。一i gol甚。iido-。暑一。一+)一ll卜蔓b芑日。g一矗口暑j= |(乱o。li量器鲁叽c口。一甍皇ld2 k。ci暑一8 ufl皿u【|卜(口。一益lj。sc窭1j h。盘。11。2ipo葛。i口一事宝-v。口曲nu盘。苦勺c付。譬廿u墨苗ls-ui置。i厶gc硝ci芒。u =6一u3厶e。毒口警一矗q厶d一心口n。pl基竹卫岛高in2【3日一+z i i d 1 8 叽u n i 厶 co#o=口o-i_c一 三口c | h 、0爱lluuoohuououu_luu_lo日pollu西，；ooouu_o口一百h。囊百houlluuou+： ：uooo叠oohpooo。口盟uujhon苛o：；ooo叠utlooquo阿目臼qq。|o_oollo_luho卜oo一：价 一c c i ) 一比o d 山 一心心。曲啦r c_，oc沂ooc中：口o一芷 _(nni)-一竺l!墨 寸n1_v_出ou瞄卜饥小)|h1i口口!高峪卜口一叫o)( 均v h l 暑 c 9 v h g 卜【)寸2)|口nvoi)l卜n啦一。肖 =们。忻仃013flco口cco；3i暑o叱 n o n 0on也o 卜on0n1 i叫o00k c i u 幅一 寸寸n0卜卜nnu15ijo o c i 卫c i v ducg竹ls-u!暑oide一cioo卜；一n竹1ooo。叱 o ；i r 0磊1 t 0 0 0 n o 0 3 0 u j o j d n 卜：j卫oeojd卜卜 竹o r 0寸卜【 竹毋，、o寸nq啊一 r寸寸0i， c一秘ijo一+r_ 寸丘一+比1一+譬vm臣 je芍e2皿nl； = 删 c；l，叫h删训叫h吲_百吲训吲矧洲吲刘引hh叫川引一ho卜卜卜卜!ou卜。|驯利川川叫剑uu卜uo=)ouou+ ；o-卜oou卜o卜卜。卜卜： 3 i s uuuuooooa川川剐训。刑剑。卜hv、，oudd渊_凡i=吲川酬剥闹洲训硎川剐叫吲州训叫吲圳!。n o 删 +l叫oeori乱卜il n卜i啦心一co竹o。coo盯田ii。o clocm瞅 o v m sn o 卜”o ) | o幅。一u：co口cu co；uijhmz nn0日non芷叱。 一口4 ) ih o l l ) (i l o _ 。嚣 富o 0oj30eojn o 旦 寸卜ir，；卜onlui 6 1 1 0 u 3 c l 卫c i u moc口ls2 u l 三3 l c l e 侣 _ d n l】nhoo：s世 。磊l _ 0 16l，j芎eojd竹ji 寸000noj_oi_=o，lq h 卜 0nho 000q。zu旦寻q0nl，u151jo一+)s 一寸cl一+舯叱，一十y一cl = | l u _ i f c 舟 a p p e n d i x4 1 d e p c h 2 0 ： d e p c1 m i d d h 2 0 1l s h 口k eo rs t i ru n t i ld e p cw a sw e l ld i s t r i b u t e d , l e a v eo v e r n i g h ta n d a u t o c l a v en e x ld a y 2 f a a ： 1o o e t h a n o l5 0m l ( 5 0 o ) a c e t i ca c i d 5m i ( 5 o ) 3 7 f o r m a l d e h y d e 10m l ( 3 7 ) w a t e r ( d e p c h 2 0 ) 3 5m l ( 4 1 3 ) f i n a iv o l u m e ：10 0m l ， 3 e t h a n o i5 0 。6 0 ，7 0 ，8 5 ，9 5 ，10 0 4 2 5 x y l e n e ：7 5 e t h a n 0 1 5 0 x y l e n e ：5 0 e t h a n o l 7 5 x y l e n e ：2 5 ；e t h a n o i 1 0 0 x y l e n e 5 p a r a f f i nc h i p s 【p r e p a r ei n d e xc a r d s ( 3 x 5c m ) f o re m b e d d i n gt i s s u e 】 6 o 0 1 p l l ( p o l y - 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