（微生物学专业论文）抗foc4香蕉内生菌的筛选及菌株db09208的鉴定和防治效果研究.pdf

得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 ， 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担 论文作撇：爱考，学 日期：夕护，夕年月7 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南人 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权门属海 献差诊寸亦缸宓岳一挪亩 多矿秒，多爹， 保密论文在解密后遵守此规定 ，” 。 7 论文作者签名：勋，c 暂 导师签名：幼谚弓7 日期：p 1 0 年。莎月一7 日日期：夕，一年多月7 日 权益一锣砌尹 淼翟骆撬 言篓锄刃 摘要 由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的香蕉枯萎病是一种维管束土传病害，该病 的生物防治已经受到世界各国极大的关注，为获得性状优良的生防菌株，本论文 从生防菌的筛选鉴定、发酵条件，拮抗机制和盆栽应用等方面对一株具有香蕉枯 萎病生防效果的内生细菌进行了较系统的研究。 以香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型4 号生理小种( f u s a r i u m o x y s p o r u m s p c u b e r 坫er 撇4 ，f o c 4 ) 为靶标菌，从分离到的1 5 7 株内生细菌中筛 选出1 3 株对f o c 4 有拮抗活性的细菌，其中菌株d b 0 9 2 0 8 的抑菌率最强，达到 7 4 7 ，在温室盆栽防治试验中防效达到8 7 9 。结合菌株d b 0 9 2 0 8 的形态特征、 培养特征、生理生化特征、1 6 sr d n a 及其系统发育分析，鉴定为p a e n i b a c i l l u sp 鲫 d b 0 9 2 0 8 。 研究发现，菌株d b 0 9 2 0 8 分泌的活性产物可造成f o c 4 菌丝膨大、产生空 泡、破坏生长点、引起细胞内含物外泄以及阻碍分生孢子的萌发。 通过发酵优化明确了菌株d b 0 9 2 0 8 最佳培养基组成和发酵条件为：葡萄糖 2 o ，蔗糖1 5 ，酵母膏1 0 ，牛肉膏1 5 ，蛋白胨1 o ，k i - 1 2 p 0 40 5 ， m g s 0 4 7 h 2 00 0 4 ，初始p h 值7 0 ，种龄4 8 h ，接种量5 ，摇床转速为2 2 0 r m i n ， 培养温度3 0 ，2 5 0 m l 三角瓶装液量7 5 m l ，发酵培养6 0 h 。经过优化，菌株 d b 0 9 2 0 8 发酵无菌滤液抑菌圈直径从优化前的1 6 5 m m 提高到2 0 5 m m 。 对菌株d b 0 9 2 0 8 所产抗菌活性物的性质进行初步研究表明，该活性物具有 较好的热稳定性，日光稳定性和紫外光稳定性。当所产抗菌活性物在p h 3 0 - - - 9 0 条件下，抑菌活性变化不大，但当p h 值达到l o 时，活性消失。 关键词：内生菌香蕉枯萎病生物防治类芽孢杆菌分离鉴定拮抗 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a b s t r a c t f u s a r i u mw i l ti sad e s t r u c t i v es o i l - b o r n ev a s c u l a rd i s e a s eo ft h eb a n a n a m a n y c o u n t r i e sh a dp a i dm o r ea t t e n t i o nt ot h eb i o c o n t r o lo ft h ed i s e a s e i no r d e rt oo b t a i n s a t i s f a c t o r yb i o c o n t r o la g e n t sf o r t h ep r o d u c t i o no fs e r v i c e s t i l i ss t u d yr e a r c h s y s t e m a t i c l yae n d o p h y t i cb a c t e r i aw h i c hh a v et h ee f f e c t o fw i l tb i o c o n t r o lb yt h e p a r a m e t e r so ft h ed i s e a s ei n h i b i t i o n ，c o n d i t i o n sf o rf e r m e n t a t i o n ，p o te x p e r i m e n t a g a i n s tt h ep a t h o g e n u s et h ep o t e n t i a lb i o c o n t r o le n d o p h y t i cb a c t e r i aa g a i n s tf u s a r i u mo x y s p o r u m s p c u b e n s er a c e4 a st h et a r g e ts t r a i n s ，t h i r t e e ns t r a i n sw i t h i no n eh u n d r e d f i 盼s c v c n i s o l a t e sf r o mt h eb a n a n as a m p l e sw e r eo b t a i n e d t h e ys h o w e da n t a g o n i s t i ce f f e c t a g a i n s tt h ep a t h o g e n ，a n dt h es t r a i nd b 0 9 2 0 8w a si d e n t i f i e da sp a e n i b a c i l l u se l g i i e x h i b i t i n g7 4 7 a n d8 7 9 o fc o n t r o le f f e c t i v e n e s si np l a t ea n dp o te x p e r i m e n t r e s p e c t i v e l y s t r a i nd b 0 9 2 0 8i n h i b i t e dm y c e l i u mg r o w t ha n ds p o r eg e r m i n a t i o no f f o x y s p o r u mf s p c u b e n s el a c e4e f f i c i e n t l y i tw a si d e n t i f i e da sp a e n i b a c i l l u se l g i t h r o u g ht h ea n a l y s i so ft h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s ， p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，16 sr d n aa n dp h y l o g e n e t i c r e s u l t so fm i c r o s c o p eo b s e r v a t i o na n du va b s o r p t i o np e a ks h o w e dt h a t e x t r a c e l l u l a rm e t a b o l i t e so ft h es t r a i nd b 0 9 2 0 8c a nc a u s es w e l l i n go ff o c a m y c e l i u m ，v a c u o l e s ，d a m a g et h eg r o w i n gp o i n t ，c a u s ec e l l sc o n t a i n i n gs p i l l sa n d i n h i b i ts p o r eg e r m i n a t i o n t h r o u g h t h ef e r m e n t a t i o n p r o c e s so p t i m i z a t i o n , t h eo p t i m a l m e d i u m c o m p o s i t i o na n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fg e t t i n ga c t i v es u b s t a n c e so fs t r a i n d b 0 9 2 0 8w e r eg l u c o s e2 0 ，s u c r o s e1 5 ，y e a s te x t r a c t1 o ，b e e fe x t r a c t1 5 ， p e p t o n e1 o ，k 2 h p 0 4o 5 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 4 ，i n i t i a lp h 7 0 ，s e e da g e4 8 h ，5 i n o c u l a t i o na m o u n t , t h es i z e7 5 m li n2 5 0 m le r l e n m e y e rf l a s ka t2 2 0r r a i na n d3 0 f o r6 0 h t h ei n h i b i t i o nz o n ed i a m e t e ro fs t e r i l ef i l t r a t eo fs t r a i nd b 0 9 2 0 8i n c r e a s e d f r o m1 6 5 m mt ot o2 0 5 m ma f t e ro p t i m i z a t i o n r e s e a r c h i n gt h ec h a r a c t e r i s t i c so fa n t i b a c t e r i a lc o m p o u n d ss e c r e t e db ys t r a i n d b 0 9 2 0 8 ，t h eb i o a c t i v es u b s t a n c eo fd b 0 9 2 0 8h a v i n gh e a t ，l i g h ta n du l t r a v i o l e t r a d i a t i o ns t a b i l i t yw e r ed e m o n s t r a t e d w h e nt h ep hv a l u eo ft h ef e r m e n t a t i o nb r o t h w a s3 0t o9 0 ，t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yc h a n g e da l i t t l e ，b u tw h e nt h ep hr e a c h e d10 ， t h ea c t i v i t yd i s a p p e a r e d 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 k e y w o r d ：e n d o p h y t e ，f u s a r i u mw i l t ，b i o l o g i c a lc o n t r o l ，p a e n i b a c i l l u s ，i s o l a t e , i d e n t i f i c a i t o n , a n t a g o n i s m i l l 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 目录 摘要1 a b s t r a c t i i 目录 l 前言1 1 1 香蕉镰刀菌枯萎病的危害与防治l 1 1 1 香蕉镰刀菌枯萎病的发生及危害l 1 1 2 香蕉镰刀菌枯萎病的生物防治进展：2 1 2 植物内生细菌及其在植病生防中的应用。5 1 2 1 植物内生细菌概念5 1 2 2 植物内生细菌对植物病害的防治作用5 1 2 3 植物内生细菌在生物防治中的应用。9 1 3 本论文的目的与意义。1 2 2 材料与方法。1 3 2 1 主要试剂与溶液1 3 2 1 1 试齐日13 2 1 2 溶液1 3 2 2 供试病原菌1 4 2 3 供试香蕉苗1 4 2 4 培养基1 4 2 4 1 分离和培养用培养基1 4 2 4 2 发酵培养基：1 5 2 4 3 生理生化特征鉴定培养基1 5 2 5 内生菌的分离与鉴定1 5 2 5 1 样品的采集与处理1 5 2 5 2 抗f o c 4 内生细菌的筛选1 6 2 5 3 菌株d b 0 9 2 0 8 的分类鉴定1 7 2 5 4 菌株d b 0 9 2 0 8 的发酵优化及其活性物质的研究。2 3 2 5 5 菌株d b 0 9 2 0 8 拮抗机理的初步研究。2 6 2 5 6 生防菌株温室盆栽防病试验2 8 3 结果与分析。3 l 3 1 抗f o c 4 内生细菌的分离与筛选3 l 3 1 1 抗f o c a 活性菌株的分离与筛选3 l 3 2 菌株d b 0 9 2 0 8 的分类鉴定结果3l 3 2 11 6 sr d n a 序列测定及系统发育分析3 l 3 2 2 形态学特征3 3 3 2 3 生理生化特征3 4 3 2 4 菌株d b 0 9 2 0 8 的鉴定结果3 5 3 - 3 菌株d b 0 9 2 0 8 发酵工艺的优化其活性物质的初步研究3 5 3 3 1 培养基组分对菌株d b 0 9 2 0 8 抑菌活性的影响3 5 3 3 2 培养条件对菌株d b 0 9 2 0 8 抑菌活性的影响3 7 3 4 抗菌活性物质的稳定性研究4 l i v 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 4 1 热稳定性4 l 3 4 2 光稳定性4 l 3 4 3 酸碱稳定性4 2 3 4 4 紫外光稳定性4 2 3 5 菌株d b 0 9 2 0 8 拮抗机理的初步研究。4 2 3 5 1 平板对峙培养中拮抗带上f o c a 菌丝形态的变化情况4 2 3 5 2 菌株d b 0 9 2 0 8 无菌滤液对f o c 4 菌落生长的影响。4 3 3 5 3 菌株d b 0 9 2 0 8 在土壤中对的f o c a 抗性作用4 4 3 5 4 菌株d b 0 9 2 0 8 活性产物对f o c 4 孢子萌发的影响。4 5 3 6 生防菌株温室盆栽防病试验4 8 4 讨论4 9 4 1 植物内细菌的分离4 9 4 2 抗f o c 4 内生细菌筛选4 9 4 3 细菌的分类鉴定。5 0 4 4 菌株的发酵优化5 0 4 5 拮抗机制5l 4 6 温室盆栽5 2 5l 右论5 3 参考文献5 4 1 趺器，6 ：! 缩略j 司6 3 l 咐录“ j i i 谢6 5 v 1 前言 1 1 香蕉镰刀菌枯萎病的危害与防治 1 1 1 香蕉镰刀菌枯萎病的发生及危害 香蕉是著名的热带和亚热带水果，年产量约一亿吨，是世界第二大水果作物， 仅次于柑橘。全球共有1 2 0 个国家和地区种植，其中拉丁美洲和加勒比海地区的 种植面积占3 0 ，亚太地区占2 9 ( 魏岳荣，2 0 0 3 ) 。我国是世界香蕉生产的主要国 家之一，有悠久的栽培历史。2 0 0 4 年全国种植面积达到2 6 9 6 万l 瑚2 ，产量达至u 6 2 2 万吨( f a o ，2 0 0 4 ) ，成为世界第三大香蕉生产国。由此可见，香蕉产业在国民经 济中有着举足轻重的地位。然而，就在全世界香蕉产业迅猛发展的同时，也遭遇 到有史以来镰刀菌枯萎病最严重的威胁和挑战。 香蕉枯萎病又名巴拿马病、黄叶病，是由古巴尖孢镰刀菌( f u s a r i u m o x y s p o r u mf s p c u b e n s e ，f o c ) 侵染而引起维管束坏死的一种毁灭性香蕉真菌病 害和典型的土传病害。古巴尖孢镰刀茵( 下面简称镰刀菌) 属于半知菌类，梗孢目 痤孢科，镰刀菌属，是一种土壤习居菌( 姚一建等，2 0 0 2 ) ，感染植株后，植株在 苗期发病后可迅速死亡；成株期发病产生叶脉失绿和叶片下垂，植株生长缓慢、 下部叶片黄化、不定根形成、叶片和嫩茎萎焉、落叶、剩余叶片边缘坏死，最终 导致全株死亡( 刘波，2 0 0 4 ) 。香蕉枯萎病病菌根据宿主营养亲和性( v e g e t a t i v e c o m p a t i b i l i t yc r o u p ) 分有不同的4 个生理小种，分别为生理小种l 号、2 号、3 号和 4 号，1 号小种( f o c l ) 主要侵染和流行于大蜜哈( g r o sm i c h e la a a ) 种植园，同时 也能够侵染龙牙蕉类( g u s aa a b ) ，不侵染矮香蕉( d w a 矿c a v e n d i s ha a a ) ；2 号小 种( v o c 2 ) 主要分布在中美洲，仅侵染三倍体杂交种棱香蕉( b l u g g o ea b b ) ，不侵 染大蜜哈；3 号小种( f o c 3 ) 最早在哥伦比亚、哥斯达黎加、洪都拉斯和巴拿马被 报道侵染野生蝎尾蕉属( h e l i c o n i as p p ) ，专一性较强。4 号小种( f o c 4 ) 分布于热 带、亚热带地区，能够侵染矮香蕉( a 懈矿c a v e n d i s h 丸a a ) 和几乎其他所有的香 蕉品种，毁灭性最强。因此f o c 4 的出现和蔓延，引起各香蕉种植国的高度重视。 前国际香蕉改良网路组织主席e m i l ef r i s o n 在( n e ws c i e n t i s t s ) 杂志上曾给香蕉 业提出警示：香蕉可能会因为f o c 4 的危害在我们这个星球逐渐消亡。 香蕉枯萎病的危害性巨大，在许多国家和地区都有报道发生，香蕉枯萎病 最早于1 8 7 4 年在澳大利亚发现，1 8 9 0 传播到巴拿马，1 9 1 0 年巴拿马香蕉生产因该 病造成极大损失，1 9 3 5 - 1 9 3 9 年在中美洲和加勒比海的几个国家感染大蜜哈 ( g r o sm i c h e la a a ) 品种，给当地的香蕉种植产业带来了毁灭性的打击。随后香 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 蕉枯萎病通过出口蔓延到全世界，2 0 世纪5 0 年代期间，该病在中、南美洲的巴拿 马、哥斯达黎加、洪都拉斯、哥伦比亚等地发生严重，约有4 万h m 2 香蕉种植园 被毁。现在世界上除巴布亚新几内亚、南太平洋群岛和一些地中海沿岸国家外， 几乎所有有香蕉分布的地域均报道遭受该病的危害( 吴元立，2 0 0 3 ) 。我国的台湾 早在1 9 6 7 年就有香蕉枯萎病的报道( 舒肇苏，2 0 0 0 ) ，为害的f o c 4 几年内便侵袭 了台湾1 2 0 0 h m 2 蕉园，使台湾的香蕉种植面积从最高峰时期的5 万h m 2 巨_ 降至近几 年的6 0 0 0 一8 0 0 0 h m 2 ，而且其中的一半仍遭受镰刀菌枯萎病的危害，虽然经过多 年的研究和治理，但至今每年因镰刀菌枯萎病造成的香蕉产业损失仍达2 0 以上 ( n w a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 。枯萎病自2 0 世纪7 0 年代入侵我国内陆地区，在广东、福建、 广西和海南等省区均陆续发现该病( 高乔婉，1 9 9 6 ) 。以广东为例：1 9 9 5 年发生面 积约1 4 h m 2 ，而至u 2 0 0 2 年时发病面积猛增到1 4 万h m 2 ；至1 j 2 0 0 3 年时发病面积已经 增加到了2 万h n l 2 j 并有迅速蔓延的趋势( 胡莉莉等，2 0 0 6 ) 。2 0 0 5 年湛江的硇洲岛 的部分地块也因香蕉枯萎病的严重发生而改种其它的作物( 黎永坚等，2 0 0 6 ) 。 1 1 2 香蕉镰刀菌枯萎病的生物防治进展 香蕉镰刀菌枯萎病是典型的土传病害，侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残 体及带菌土壤。病原菌从寄主根部伤口侵入宿主，通过寄主维管束向假茎上部及 叶部蔓延，发病。由于病害发生于香蕉根和维管组织内，一般的外用杀菌剂不起 作用，防治难度大，国内外已针对香蕉镰刀菌枯萎病的防治召开过两次国际会议， 但尚未找到十分有效的防治措施，主要存在以下3 个方面的问题：现有的有效 措施难以推广应用，如通过控制感病材料的转移而降低病害的传播、香蕉抗病品 种的推广应用、降低容易感染镰刀菌枯萎病品种组培苗的种植面积、增强香蕉组 培苗病毒病的诊断能力、以及针对易感品种的防治措施等。对香蕉镶刀菌枯萎 病病害的认识有待进一步提高，包括香蕉镰刀菌枯萎病的抗性机制、抗病基因的 筛选与克隆、抗性标记筛选以及香蕉转化体系的建立、刺激香蕉植株产生抗镰刀 菌枯萎病的保护机制、香蕉品种室内抗性测定标准的制定、以及香蕉镰刀菌枯萎 病生物防治机制和枯萎病抑制性土壤的认知、还有简单的测量病原菌在土壤中数 量的技术等。对病原菌本身认识有限，如对香蕉镰刀菌枯萎病野生的和本土的 病害系统仍然知之甚少，以及应用现代技术对病原菌遗传多样性的解释等。 目前还没有找到一种有效的防治香蕉枯萎病的化学药剂，采用培育抗病品 种、改良栽培管理技术和生物防治是当前防治香蕉枯萎病比较有效的途径。由于 抗病品种的农艺性状不足，栽培管理和隔离病区时间过长，损耗过大，在实际生 产和应用中难以推广生物防治作为一种有效防治手段，利用能够损伤和杀灭病 原体的微生物，对植物病害形成有效的控制，其无公害、无污染环境和防治作用 2 海南大学2 0 10 届硕士学位论文 专化型等优点越来越受到人们的重视。 1 1 2 1 香蕉枯萎病生物防治国内研究进展 我国对香蕉枯萎病生物防治的研究起步较晚，有关利用拮抗微生物来防治香 蕉镰刀菌枯萎病的研究报道主要集中在细菌的应用方面：程亮( 2 0 0 5 ) 等从香蕉 土壤中分离出一株具有促生作用、能与植物根系良好适应、定殖量大的拮抗假单 孢杆菌( p s e u d o m o n a ss p ) ，在平板试验中能够造成香蕉枯萎病菌的菌丝顶端及中 间形成大量泡状体，以致整个菌丝由丝状变成串珠状，同时细胞内含物减少，原 生质外流，形成空泡，从而产生扭曲状芽管，芽管膨大，细胞破裂，不能形成正 常的侵入丝，产生明显的抑菌带。黄小光( 2 0 0 6 ) 等分离的荧光假单孢杆菌对古巴 尖孢镶刀菌4 号生理小种菌丝的生长表现出较好的抑制作用，用荧光假单孢杆菌 和x p 菌株混合后，抑制作用得到加强，令香蕉枯萎病菌丝不能向外扩展，菌丝 被抑制在原接种部位，但拮抗细菌只能对香蕉枯萎病菌起到抑制作用，不能起灭 菌作用。陈福如( 2 0 0 3 ) 等从土壤中筛选获得对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌有良好拮抗 作用的细菌8 株。广州市白云区农业科学试验中心和白云区农产品质量安全监督 检测中心采用山西大学光合细菌研究室防治香蕉黄叶病的光合细菌复合菌剂，在 广州市番禺区、东莞市等香蕉种植产区进行田问试验，利用光合细菌占优势情况 下可竞争性替代病原菌、有效改善香蕉根基土壤的营养、提高土壤肥力的特性， 有效抑制和推迟香蕉黄叶病的发生，防治效果达9 0 以上王振中( 2 0 0 6 ) 从香蕉 体内分离到一株地衣芽孢杆菌，室内对峙试验对香蕉枯萎病菌l 号和4 号小种均有 很强的拮抗活性，香蕉苗接种试验表明在接种古巴尖孢镰刀菌4 号生理小种4 0 d 后，防治效果达蛰j 8 0 。放线菌的应用方面：曹理想( 2 0 0 3 ) 等从健康粉蕉内分 离到的多株内生放线菌，其中分离出的玫瑰浅灰链霉菌对香蕉枯萎病病原菌尖孢 镰刀菌有明显的拮抗活性，并认为该菌对提高香蕉植株的抗病性具有一定的作 用。张桂兴( 2 0 0 7 ) 等从发病蕉园采集的土样为分离样品，从样品中分离到菌株灰 肉色链霉菌( s t r e p t o m y c e sg r i s e o c a r n e u $ ) 对镰刀菌4 号生理小种以及稻瘟霉都有明 显的抑菌活性。王兰英( 2 0 0 8 ) 等通过平板对峙试验，分离得到放线菌h n 3 抑制镰 刀菌效果明显，发酵液试验表明，其抑菌物质主要作用于菌丝内部。真菌上的 应用方面：李芳等( 2 0 0 5 ) 从染上根结线虫的番茄根围分离得到一株编号为 n h p l - 0 3 的淡紫拟青霉，其次生代谢产物对尖孢镰刀菌有显著的拮抗作用，主 要抗生机制是产生p 葡萄糖苷酶消解病原菌细胞壁，产生多糖与蛋白质性质的抗 生素抑制尖孢镰刀菌的孢子生成、萌发与菌落生长，具有很强的p 葡萄糖苷酶和 几丁质酶活性田连生( 2 0 0 5 ) 等报道，木霉生命力极强、繁殖速度快，对生存空 间和营养资源竞争能力极高，可排斥和抑制尖镣孢菌。木霉菌丝以缠绕、穿插、 3 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 紧贴等方式重寄生于尖镰孢菌菌丝上，通过吸器侵入尖镰孢菌菌丝体内吸取营 养，溶解细胞壁而穿入寄生菌丝并在其内生长，使尖镰孢菌菌丝变形，细胞变短， 最后断裂、解体。木霉在生长过程中产生的抗生物质( 如抗生素和酶) 能有效地抑 制尖镰孢菌生长和孢子萌发，使尖镰孢菌菌丝细胞质消解、原生质凝结，并逐渐 腐烂失活、解体。 1 1 2 2 香蕉枯萎病生物防治国外研究进展 早在1 9 3 2 年w e i n d l i n g 就发现对多种植物病原菌有抑制效果的木素木霉 ( t 1 i g n o r u m ) 通过重寄生、抗生、溶菌和生长竞争一系列的拮抗作用能有效地抑 制尖镰孢菌的活动。t h a n g a v e l u ( 2 0 0 4 ) 等在香蕉根际土中分离出对香蕉枯萎病菌 具有拮抗作用的哈兹木霉( t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ) ，其中菌株t h - 1 0 对香蕉枯萎病 菌的菌丝生长具有显著的抑制作用，在盆栽试验中对香蕉枯萎病的防效为4 8 - - 5 1 ，并发现脱水香蕉叶是菌株t h - 1 0 生长的最佳材料。s a r a v a n a n ( 2 0 0 3 ) 等对适用 于香蕉枯萎病生物防治的综合方法进行了研究，并通过试验筛选出八株对香蕉枯 萎病菌具有拮抗作用的菌株，其中荧光假单孢菌的菌株p f m 的抑制活性最高，用 该菌处理香蕉后，能诱导香蕉防卫基因的表达、保护蛋白积累、诱导体内酚类物 质以及保护酶苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、几丁质酶、p l ，3 葡聚糖酶活性增 加。他们的研究还表明，在使用拮抗菌的同时添加假楝树的压滤渣，拮抗效果会 更明显。k r e b s 等( 2 0 0 0 ) 利用枯草芽孢杆菌隰s u b t i l s ) 防治由r h i z o c t o n i as o l a n i 、 p y t h i u ms p p 和f u s a i u ms p p 引起的作物病害，取得较好的效果。c h e n 等( 2 0 0 4 ) 发 现具有几丁质酶活性的枯草芽孢杆菌f 2 9 3 对镰刀菌表现出良好的活性。g e t h a 等 ( 2 0 0 2 ) 在平板实验发现一株紫黑色链霉菌株g l o ( s v i l o a c e o n i g e rs t r a i no l o ) 的活 性产物对尖孢镰刀菌古巴专化型l ，2 和4 号生理小种表现很强的抗性，在盆栽试 验中施用1 0 3 c f u m l 的g 1 0 菌剂具有5 3 的防治效果。a y y a d u r a i 等( 2 0 0 6 ) 从香蕉根 际中分离到对香蕉枯萎病有很好抗生性的绿脓杆菌僻a e r u g i n o s ) ，该菌株产生的 2 ，4 - d i a c e t y l p m o r o g l u e i n o l ( d a p g ) 对病菌具有良好的抗生作用，用该菌株处理香 蕉能诱导植株球茎形成、分生芽生长，提高香蕉株高和减少由枯萎病菌危害而产 生的维管束变色，并且能产生含铁细胞、吲哚乙酸( t a a ) 及磷酸盐溶解酶，可作 生物肥及生防菌使用；此外，国外也有研究报道表明粘质沙雷菌( s e r r a t i a m a r c e s c e n s ) 和荚壳布克氏菌( b u r k h o l d e r i ag l u m a e ) 对香蕉枯萎病菌具有良好的抑制 效果f l i n ge ta ，2 0 0 3 ) 。 采取拮抗细菌防治香蕉枯萎病已成为目前的研究热点。许多学者成功分离了 一些对香蕉枯萎病具有拮抗作用的细菌，并进行了初步的田间试验，为香蕉枯萎 病的生物防治研究建立了一定的基础。生物防治作为具有一种无公害、低污染和 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 防治作用专化性等特点的防治方法，在香蕉镰刀菌枯萎病的应用中，尽管防治效 果还不理想、不稳定，但已表现出巨大的应用市场和开发潜力。 1 2 植物内生细菌及其在植病生防中的应用 1 2 1 植物内生细菌概念 植物内生细菌( c n d o p h y t i cb a c t e r i a ) 是指能在健康植物组织内栖居而对植物不 造成实质性危害并与植物建立了和谐联合关系的细菌( d if i o r e ，1 9 9 5 ) 。植物内生 菌的研究起始于1 9 世纪中叶，d eb a r y ( 1 8 6 6 ) 首先提出植物内生菌一词 “e n d o p h y t e 。在其后的几十年中，先后在几种牧草植物中发现了内生真菌，直到 1 9 7 7 年b a c o n 等人证实高羊茅内生真菌与牛的中毒症状相关后，内生菌才引起 广泛关注。内生菌对寄主植物的生物学作用，到2 0 世纪8 0 年代以后才引起人们 的注意。2 0 世纪9 0 年代以后，植物内生菌的研究范围开始扩大，不再仅仅局限 于牧草植物内生菌的研究，也开始从其他不同植物中分离内生菌，研究其生物多 样性、生物学作用、侵染途径以及与宿主之间的关系等。特别是1 9 9 3 年s t r o b e l 首次报道了从短叶紫杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 的树皮中分离出一株能够产紫杉醇 ( t a x 0 1 ) 的内生真菌，自此掀起了从植物内生菌中寻找新物质的热潮，一些新的抗 肿瘤、抗菌、抗虫物质先后从内生菌中分离出来。在以往的研究中，内生菌所涉 及的大都是内生真菌，最近扩展到了内生细菌、内生放线菌等范畴( 郭良栋， 2 0 0 1 ) 。内生菌具有多种生物学功能，能产生多种生物活性物质，特别是在寻找 新的抗菌抗癌物质、抗植物病虫害物质方面，植物内生菌为我们提供了一个新的 生物资源。在农业方面，施用植物内生菌生产的抗菌剂、抗虫剂及生长素对植物 病害起到了很好的防治及促生作用。这样既减少了化学农药对环境的影响，又保 证了农产品的品质。在医药领域，能产生抗生素的内生菌为抗生素的生产提供了 新的丰富资源，有望满足日益扩大的抗生素需求量并解决因滥用抗生素而造成的 抗药性等问题。 1 2 2 植物内生细菌对植物病害的防治作用 作为内生细菌主要来源的根际生长细菌在合适条件下能进入植物体内，成为 植物内生细菌( c h e r te ta l ，1 9 9 5 ；b c n h a m o ue ta 1 ，1 9 9 6 a b ；m p i g ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。关 于植物内生细菌生防植物病害的机制，大多数研究者认为，其防病机制与植物根 际生长细菌基本相类似，主要通过拮抗作用( s t e i i i ，2 0 0 2 ) 、竞争作用( y a y a ，2 0 0 0 ) 、 诱导系统抗性( i s r ) ( 陈志谊，2 0 0 1 ) 和促进植株生长( 徐进，2 0 0 4 ) 等方面。 5 1 2 2 1 拮抗作用 海南大学2 0 10 届硕士学位论文 拮抗作用是指生防菌分泌代谢产物直接杀死或抑制病原菌的生长，或是形成 一个不利于病原菌生长的环境和条件从而间接抑制病原菌的生长。拮抗作用是植 物内生细菌在植病生防中主要和明显的作用，也是在筛选利用生防细菌时首先要 考虑的问题。 植物内生细菌产生的具有拮抗作用的代谢产物已报道的主要有：脂多肽 ( 1 i p o p e p t i d e ) 、吡咯菌素( p y r o h l i t r i n ) 、氰化氢( h y d r o g e nc y a n i d e ) ，以及几丁质酶和 葡聚糖酶等( 孔庆科等，2 0 0 1 ) 。通常可从芽孢杆菌中分离获得的脂肽类和多肽类 抗生素，如枯草芽孢杆菌m 5 1 分泌的脂肽类抗生素i t u r i na 2 ( t a n g , 1 9 9 6 ) ：从枯 草芽孢杆菌t g 2 6 分泌物中分离纯化得到的抗真菌小肽l p 2 1 等( 刘颖等，1 9 9 9 ) ， 对植物病原真菌都有很强的抑制作用。蛋白类抗菌物质通常包括几丁质酶和葡聚 糖酶等一些抗菌蛋白。几丁质酶是一种分解聚n 乙酰胺基葡萄糖分子的糖苷酶， 它们是通过破坏病原真菌的细胞壁而达到抗菌防病作用。分离自橡树的活性内生 细菌的某些菌株可产生几丁质酶，抑制病原真菌的生长( b r o o k s ，1 9 8 8 ) 。用内生拮 抗荧光假单胞菌( p s e u d o m n a s f l u o r e s c e n s ) 防治水稻稻瘟病时发现，其产生的几丁 质酶和葡聚糖酶的水平与防治效果有密切的关系( v e l a z h a h a ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。将几 丁质酶的编码基因转入内生细菌表达，可提高受体内生细菌的防病效果( d o w n i n g e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。夏正俊等( 1 9 9 7 ) 研究表明，棉花接种内生细菌后，接种点附近棉茎 中各同工酶的活性增高，含酶量增加。 植物内生细菌产生的其他抗菌物质还包括嗜铁素、氨基酸的氮氧衍生物、挥 发性物质和酚类化合物等多种抗菌活性物质。 1 2 2 2 竞争作用 竞争作用通常包括与植物病原菌夺取营养、水分来对营养物质的竞争和对空 间位点的争夺以削弱或排除同一生态环境中的病原物，起到防治病害的作用。 研究表明，内生细菌进入寄主植物的位点与病原菌侵入植物的位点基本相同 ( s t u r ze ta 1 ，2 0 0 0 ) 。接种内生细菌后，由于内生细菌预先占领了病菌侵入寄主植 物的位点，从而可以阻止病菌的侵入。m a i i 等( 1 9 9 6 ) 研究发现，来自番茄和红辣 椒的短小芽孢杆菌( b a c i l l u sp u m i l u s ) 3 p p e 和解淀粉芽孢杆菌( b a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 2 t o e 对梨灰霉病所表现出的防治效果，不是由于产生抗菌物 质的作用，而是通过营养竞争作用来实现的b a c o n 等( 2 0 0 1 ) 分离的玉米内生枯 草芽孢杆菌与玉米病原真菌串珠镰刀菌( f u s a r i u mm o n i l i f o r m e ) 有相同的生态位， 枯草芽孢杆菌能在玉米体内迅速定殖和繁殖，可有效降低串珠镰刀菌及其毒素的 6 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 积累。另外，芽孢杆菌能在植物叶部和根基长期存活，并不断繁殖，从而影响植 物根围和叶围等的微生态环境。 1 2 2 3 诱导植物系统抗性( i s r ) 诱导抗性是指植物在受到生物或非生物因子刺激后，获得了广谱的对病虫害 具有抵抗能力的现象。诱导抗性概念首先是由c h e s t e r ( 1 9 3 3 ) 提出的，当时他称之 为生理获得性免疫( a c q u i r e dp h y s i o l o g i c a li m m u n i t y ) ，现该概念已有多种不同的称 谓，如系统性获得抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ，s a r ) ，转移抗性( t r a n s l o c a t e d r e s i s t a n c e ) 及植物免疫( p l a n t i m m u n i z a t i o n ) 等( r o s s ，19 61 ；h u r b e r te la l ，19 6 7 ； t u z u ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。由根际细菌诱导的抗性称为诱导系统抗性( i s r ，i n d u c e s y s t e m i cr e s i s t a n c e ) ，而其它诱导剂诱导的抗性称为系统性获得抗性( s a r , s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ) ( v a ne la 1 ，19 9 8 ；r a m a m o o r t h ye la 1 ，2 0 01 ) ；i s r 或 s a r 均是在病原菌接种后，诱导寄主潜在的抗性机制活性的表达( v a ne la 1 。 1 9 9 7 ) 。s a r 诱导表达的最高水平可导致寄主植物的坏死( c a m e r o ne la 1 ，1 9 9 4 ) 而 由根际促生细菌( p g p r ) 诱导的i s r 对寄主植物不会引起任何坏死症状( v a ne la 1 ， 1 9 9 8 ) 内生细菌对寄主植物也能产生诱导抗性，并且诱导寄主产生系统抗性还是 内生菌防病的主要机制之- - ( q u a d t h a l l m a n ne l a l ，1 9 9 7 b ) ，而且内生细菌由于存 在植物体内