（植物学专业论文）绿豆胰蛋白酶抑制剂的基因克隆及其表达.pdf

摘要 摘要 许多有生物活性的蛋白质与多肽是由它们的前体通过前体蛋白加工酶的加工水解 而获得最终活性的。这些前体加工酶成为生物体内重要的生理病理过程的调控者。 f u f i n 作为第一个被发现和研究最为深入的哺乳动物前体加工酶广泛存在于体内，与许 多相关疾病和病原体感染有密切关系，特别是在炭疽病菌的侵入以及艾滋病病毒 h i v - 1 的感染。前者曾作为恐怖主义者的武器威胁人类安全，后者严重危害人类健康。 因而，展开对前体蛋白加工酶尤其是f u r i n 的特异性抑制剂的研究有可能找到一种药 物，为一些病原体相关疾病的治疗开辟一条新的途径。 迄今已有的对f l l r i n 的特异性抑制剂除合成的一些短肽外，大多是基于其它类型蛋 白酶抑制剂改造而来。属于丝氨酸蛋白酶抑制剂b o w m a n b i r k 家族的绿豆胰蛋白酶抑 制剂( m u n gb e a nt r y p s i ni n h i b i t o r , m b t i ) ，由于其第一个活性中心的p 1 位l y s 2 0 及：p 4 位a r 9 1 7 符合前体蛋白加工酶底物的基本要求，具有可能改造为f u r i n 抑制剂的潜能。 利用蛋白质工程手段实现将绿豆胰蛋白酶抑制剂改造成为f u r i n 的强抑制剂，就首先需 要对绿豆胰蛋白酶抑制剂成功进行基因克隆及其表达。 本论文综述回顾了近几年前体加工酶及其抑制剂研究领域的一些新进展。包括： 前体蛋白加工酶的结构；组织与细胞水平的表达分布：前体蛋白加工酶与疾病的关系； 前体加工酶与病原体感染；前体加工酶抑制剂的研究等。论文实验部分的主题是绿豆 胰蛋白酶抑制剂的基因克隆及其蛋白表达的研究。 从天然中纯化的绿豆b o w m a n - b i r k 抑制剂( m b t i ) 具有较强的对k e x i n 的抑制活 力，其i ( i 达到1 0 1 0 m ( 接近1 0 。1 m ) 的水平，而对f u r i n 的抑制活力较低，其碰仅 约为1 3p m 。根据已知的抑制剂蛋白质序列，选择同源保守区域设计引物，采用r a c e 方法，从发育的绿豆种子的总r n a 中克隆了它的c d n a 并进行了序列测定。其开放 阅读框编码一个1 0 6 个氨基酸的全长基因，其中包括2 0 个残基的信号肽及1 2 个残基 的前体肽和7 4 个残基的成熟肽。对其基因组序列的克隆和测定结果显示其内部没有内 含子。已知的基因序列为今后进一步蛋白质的改造提供了便利。 构建了重组质粒p m a l r m - p 2 x - e k m b t i - 与p m a l r m - p 2 x - e k - p r o m b t i 并在转入大肠 杆菌菌株b l 2 1 后诱导表达分泌出融合蛋白。融合蛋白被在引入的c n t e r o k i n a s e 酶切位 点充分酶切水解后去除m b p ，分离纯化了由7 4 氨基酸残基组成的绿豆胰蛋白酶抑制 剂。测定了绿豆胰蛋白酶抑制剂融合蛋白m b p - e k m b t i 及n 端带有1 2 个氨基酸残基 前体肽的融合蛋白m b p - e k p r o m b t i 对胰蛋白酶的抑制活力，发现前体肽对绿豆胰蛋 白酶抑制剂在大肠杆菌中的分泌表达没有明显作用。在与天然提取绿豆胰蛋白酶抑制 摘要 剂的抑制活力比较后，它们对胰蛋白酶的抑制解离常数磁都约为3 4 n m ，从而确定 了活性绿豆胰蛋白酶抑制剂成功得到表达。 关键词：前体蛋白加工酶；f u r i m 绿豆抑制剂；m b p 融合蛋白。 l i a b s t r a c t a b s t r a c t m a n yb i o l o g i c a l l y a c t i v e p r o t e i n sa n dp e p t i d e sa r e o f t e ng e n e r a t e d b y i n t r a c e l l u l a rl i m i t e d p r o t e o l y s i so fi n a c t i v ep r e c u r s o r s t h e s ep r e c u r s o rc o n v e r t a s e s ( p c s ) a r ek e yr e g u l a t o r si n m a n yp h y s i o l o g i c a l l ya n dp a t h o l o g i c a l l yi m p o r t a n tp r o c e s s e s a m o n gt h e m ，a st h e f i r s t f o u n da n dt h eb e s ts t u d i e dp ci nm a m m a l i a ，f u r i ni su b i q u i t o u si na l lt i s s u ea n dc e l ll i n e s e x a m i n e da n dc l o s e l yr e l e v a n tt om a n yd i s e a s e sa n dp a t h o g e n e s i s ，e s p e c i a l l yt h ei n t r u s i o n o fa n t h r a xt h a tw a so n c eu s e da sat o o lo fb i o t e r r o r i s tt ot h r e a tt h eh u m a ns e c u r i t ya n d i n f e c t i o no fh i v - 1t h a ts e r i o u s l yh a r m st h eh u m a nh e a l t h a c c o r d i n g l y , t h ef u r t h e rs t u d i e s a b o u ti n h i b i t o r so f p c s ，e s p e c i a l l yi n h i b i t o r so ff u r i n ，m a k e i tp o s s i b l et oe x p l o r ean e w w a y t oh e a lt h o s ed i s e a s er e l e v a n tt op a t h o g e n s of a r , t h e m a j o r i t y o ft h ek n o w n s p e c i f i c i n h i b i t o r so ff u r i n ，e x c e p tf o rs e v e r a l s y n t h e s i z e ds h o r tp e p t i d e s ，a r ep r o t e i n d e r i v e di n h i b i t o r st h a th a db e e n m o d i f i e db yp r o t e i n e n g i n e e r i n g t h em u n g b e a nt r y p s i ni n h i b i t o r ( m b t i ) ，w h i c hb e l o n g st ob o w m a n b i r k f a m i l yo fs e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r , h a sp o t e n t i a l t ob ee n g i n e e r e dt oap o t e n ti n h i b i t o r b e c a u s et h el y s 2 0a tp 1p o s i t i o na n d a r g l 7 a tp 4p o s i t i o ni ni t sf i r s tk sa c t i v ed o m a i n s a t i s f y t h eb a s i cr e q u i r e m e n to fs u b s t r a t eo fp c s h o w e v e r ，i t sn e c e s s a r yf o rm b t ig e n et ob e c l o n e da n de x p r e s s e df i r s t l ys oa st ob i o e n g i n e e rt h em b t ib yp r o t e i ne n g i n e e r i n g t h et h e s i sr e v i e w ss o m er e c e n tp r o g r e s s e sa n dd e v e l o p m e n t si nt h es t u d yo fp c sa n d t h e i ri n h i b i t o r s i ti n c l u d e st h ef o l l o w i n ga s p e c t s ：t h es t r u c t u r eo fp c s ，t h et i s s u ea n d c e l l u l a r d i s t r i b u t i o no fp c s ；t h er e l a t i o n s h i po fp c sa n dd i s e a s e ；t h er e l a t i o n s h i po fp c sa n d p a t h o g e n ，a n dt h es t u d yo nt h ei n h i b i t o r so fp c s i nt h ee x p e r i m e n t a l s e c t i o no ft h et h e s i s ， t h es t u d i e sf o c u so i lt h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o no fm b t i g e n e t h eb o w m a n b i r ki n h i b i t o rp u r i f i e df r o mt h em u n gb e a ns e e d sd i s p l a y ss t r o n gi n h i b i t o r y a c t i v i t yt o w a r dk e x i nw i t hak i o f1 5 3 1 0 。”m b u tl o wi n h i b i t o r ya c t i v i t yt o w a r df a r i n w i t hak io f1 3 3x1 0 5 m p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e dr e g i o n so ft h e d e t e r m i n e da m i n oa c i d s e q u e n c e o ft h e i n h i b i t o r b y t h em e t h o do f r a c e ( r a p i d a m p l i f i c a t i o no f _ c d n ae n d s ) ，t h ec d n a o fm u n gb e a nt r y p s i ni n h i b i t o ri sc l o n e df r o mt h e t o t a lr n ao fd e v e l o p i n gm u n gb e a ns e e d sa n dt h eg e n ee n c o d i n gt h eb o w m a n 。b i r k i n h i b i t o ri si d e n t i f i e d t h eo r f ( o p e n r e a d i n gf r a m e ) e n c o d e s1 0 6r e s i d u e si n c l u d i n ga i l l a b s t r a c t s i g n a lp e p t i d e ( 2 0r e s i d u e s ) ，ap r o p e p t i d e ( 1 2r e s i d u e s ) a n d am a t u r ep e p t i d e ( 7 4 r e s i d u e s ) d n a s e q u e n c ea n a l y s i so ft h eg e n o m i c c l o n er e v e a l st h a ti tc o n t a i n sn oi n t r o n t h eg e n e s e q u e n c e o fm b t i p r o v i d e sc o n v e n i e n c e f o rf u r t h e r p r o t e i ne n g i n e e r i n g s t u d i e s t h ef u s i o n p l a s m i d s o fp m a l r m p 2 x e k - m b t ia n dp m a l r m - p 2 x - e k - p r o m b t ih a v e b e e nc o n s t r u c t e d t h e i rc o r r e s p o n d i n gm b p f u s i o np r o t e i n sc o n t a i n i n ga r e c o g n i t i o ns i t eo f t h es p e c i f i cp r o t e a s ee n t r o k i n a s eb e t w e e nm b pa n dt a r g e tp r o t e i na r ei n d u c e dt oe x p r e s s a n d e x p o r t e dt op e r i p l a s ma f t e rb e i n g t r a n s f o r m e di n t ob 1 2 1l i n eo fe s c h e r i c h i ac o i lm b p i sc l e a v e df r o mf u s i o np r o t e i na f t e rc o m p l e t el i m i t e dp r o t e o l y s i sw i t he u t e r o k i n a s ea n dt h e m b t i c o m p o s e d o f7 4r e s i d u e si sf i n a l l yp u r i f i e d t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e st o w a r dt r y p s i n o f t h e t w o f u s i o n p r o t e i n s ，o n e o f w h i c h h a sa 1 2 一r e s i d u e p r o p e p t i d ea t t a c h e d t o n t e r m i n u s o fm b t i ，a r em e a s u r e da n dt h e r ei sn oe v i d e n c et h a tp r o p e p t i d eh a sp l a y e dak e yr o l ei n t h ee x p r e s s i o no fm b t ii ne s c h e r i c h i ac o i lb y m a k i n gc o m p a r i s o nb e t w e e nn a t u r a lm b t i a n dt h et w of u s i o np r o t e i n s ，t h e yn e a r l yh a v et h es a m ei n h i b i t o r ya c t i v i t yt o w a r dt r y p s i na s n a t u r a lm b t i ，w i t hk io f3 1 4 1 0 m s o ，i ti sc l e a r l yi n d i c a t e dt h a tt h em b t ii nf u s i o n p r o t e i nh a s b e e ns u c c e s s f u l l ye x p r e s s e da n d p u r i f i e d k e yw o r d s ：p r e c c u r s o rc o n v e r t a s e ( p 6 3 ；f u r i n ；m u n gb e a ni n h i b i t o r ；m b pf u s i o np r o t e i n i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在同济大学蛋白质研究所戚正 武院士及西北师范大学宋占午副教授指导下，合作进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 西北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。 躲掣蜂嘿半咽 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：导师签名： 日期： 第1 章前体加工酶及其抑制荆的研究进展 第1 章前体，j n - r 酶及其抑制剂的研究进展 1 1 前体加工酶家族的发现和成员的分类 1 1 1 前体加工酶研究简史 1 9 6 7 年，c h r e t i e n 、s t e i n e r 【1 ，2 】等人分别提出多肽类激素的前体加工概念。即 生物体内活性形式的多肽类激素都是以较大分子量的前体形式合成的，随后经过蛋白 水解酶的剪切加工而成熟。这两个实验室分别通过实验例证，暗示了这类蛋白水解酶 的加工模式，即这种加工主要发生在单个或双碱性氨基酸残基的c 端。在随后的许 多年里，人们发现这样的加工规律广泛地存在于大量多肽和蛋白质的成熟过程中，这 类蛋白水解酶的底物不仅仅包括肽类激素，神经递质，还包括生长因子，细胞表面受 体蛋白，血浆蛋自，基质金属蛋白酶，病毒外壳糖蛋白及细菌外毒素等等。基于对这 类酶重要性的认识，研究者们尝试从组织中加以分离与纯化。然而，由于其细胞内极 低的表达量且不稳定，以及缺乏可靠的检测手段，这些尝试都未成功。 直到八十年代中期，美国j t h o m e r 实验室发现一个酵母突变株k e x 2 不能正常产 生的两种因子，即酵母成熟因子和杀伤毒素，它们都是由各自前体蛋白在双碱性氨基 酸位点后的剪切) m i 而形成的，与哺乳动物细胞中肽类激素的成熟非常相似。于是他 们利用缺陷型互补的方法，克隆到了编码该加工酶的基因，并将其命名为k j e x 2f 3 1 。 实验表明，哺乳动物来源的前体蛋白在酿酒酵母体系中表达时能完成正常的前体加工 【4 】，艇船基因在p o m c ( p r o - o p i o m e l a n o c o r t i n ) j f l i 缺陷型细胞( 如b s c 4 0 ) q b 的表达可 以使该细胞系获得对p o m c 的加工活力【5 。这些实验都表明，k e x i n 不仅是酿酒酵 母中的个蛋白质前体加工酶( p r o p r o t e i np r o c e s s i n g p r o t e i n a s e ) ，而且极可能是哺乳动 物细胞中前体加工酶的原型。 k e x 2 基因的发现及k e x i n 功能的阐明，大大加速了蛋白质前体加工酶的研究。 根据k e x i n 与哺乳动物蛋白质前体加工酶在功能上的相似性，它们在一级结构上也可 能具有较大的同源性。于是，通过蛋白质一级序列同源性的比较，并借助同时发展起 来的分子生物学方法如p c r 及c d n a 文库筛选，源于各种物种的蛋白质前体加工酶 的基因被相继发现。其中最早被发现的哺乳动物前体加工酶是f u r i n 。 f u f i n 的基因最初是在1 9 8 6 年由r o e b r o e k 发现的 6 。由于f u r i n 基因位置位于原 癌基因c - f e s p s 的上游( c - r e s i n su p s t r e a mr e g i o n ) 因而被命名为f u r 基因，其蛋白产 物即为f u r i n 。直到1 9 8 9 年，f u l l e r 通过对基因序列数据库的同源搜索，发现k e x i n 与 b a r i n 在其催化结构域以及附近区域有很高的同源性，从而确认了第一个哺乳动物前 第1 章前体加工酶及其抑制剂的研究进展 体加工酶 7 。在此同时，另一个前体加工酶家族成员p c z 的基因( p r o h o r m o n e e o n v e f l a s e ) 从人胰岛瘤 8 】和鼠垂体【9 】细胞中，用p c r 方法克隆。在这之后，通过 同源序列设计p c r 简并引物的方法相继发现了p c i 【9 】，p a c e 4 【1 0 ，p c 4 【1 1 】，p c 5 【1 2 1 ，p c 7 【1 3 】等一系列前体加工酶基因。 经过6 ，7 年的时间，哺乳动物的前体加工酶家族成员被逐一发现，这些酶识别 和加工的序列有这样的特点，b p ( a r g c l r s ) 一n 一_ 地，u 通常为0 ，2 ，4 或6 ，x 可 以是除c y s 外的任意氨基酸( p r o 也较少见) 。它们通过单独或者相互组合的方式， 参与脑部，腺体，及其他外周组织中大量生物活性多肽或蛋白的加工成熟。由于该家 族成员众多，许多是在不同实验室发现，因而在各种文献中，每个酶的命名有所不 同。为了便于本文的叙述和阅读，命名原则归纳于下表： t a b l e1 n o m e n c l a t u r eo fm a m m a l i a n p r o p r o t e i nc o n v e r t a s e s n a m eu s e di nt h i sr e v i e wn a m eu s e di no t h e rl i t e r a t u r e s f u r i n p c i p c 2 p a c e p c 4 p c 5 p c 7 f u r i n ，s p c i ，p a c e p c i 3 ，s p c 3 p c 2 s p c 2 p a c e 4 ，s p c 4 p c 4 s p c 5 p c 5 6 ，s p c 6 p c 7 ，p c 8 ，l p c ，s p c 7 生物体内的活性多肽及蛋白以前体形式合成，经过剪切加工而成熟的方式是十分 普遍的现象，针对碱性氨基酸的识别和加工并不是唯一的。近两年来，研究者发现一 种在进化上保守，作用于非碱性氨基酸的前体加工酶【1 4 】，它识别并剪切其c 末端的 氨基酸包括a l a ，s e r ，t h r ，m e t ，v a l ，以及l e u 。由于它的催化结构域与枯草杆菌蛋白酶 有较高的同源性，该酶被命名为s k i 一1 ( s u b t i l i s i n k e x i n i s o z y m e ) 。它在功能上可 能与胆固醇和脂肪代谢的调控，以及某些神经退化性疾病，如老年痴呆症的发生有 关。随着s k i - 1 的发现，蛋白质前体加工酶新家族的研究必将继续深入。 1 1 2 前体加工酶的分类 现在发现的前体加工酶通常识别并加工碱性氨基酸的c 末端，但不同的前体加 工酶对所加工的底物在酶切位点附近的序列有不同的要求。一般说来，前体蛋白依据 其在被加工位点附近的序列可以分为以下四类：( 如表2 ) 2 第1 章前体加工酶及其抑制剂的研究进展 1 ) 含有r - x ( k r ) 一r l 序列的前体蛋白。包括生长因子，神经营养因子，某些受体， 细菌外毒素，病毒外壳蛋白等，此外，还有p c 2 成熟过程中的分子伴侣7 8 2 。在 这个系列的前体蛋白的p 2 位点常可找到脂肪族的氨基酸，如v a l ，i l e ，l e u 。 2 ) 含有( 刚k ) 一( k r ) 双碱性位点的前体蛋白。有时，在p 4 或p 6 位点可以找到另外 的碱性氨基酸残基，如l y s ，h i s ，或a r g 。这类前体包括多肽激素，如p o m c ， p r o l n s u l i n ，p r o e n k e p h a l i n ；以及白蛋白前体。 3 ) 含有单个r l 的前体蛋白。但常常在p 4 ，p 6 甚至p 8 位点找到另外的碱性氨基酸残 基。这类前体包括多肽激素，如p r o d y n o r p h i n ，p r o s o m t o s t a t i n 等，以及生长因 子，如p r o l g f ( i ，i i ) ，p r o e g f 。 舢此类与前三类的区别在于，在加工序列的p 2 位存在一个碱性氨基酸残基。这类 蛋白包括激素前体，如p r o m i s ；胰脏分泌的激素，如p r o g l u c a g o n ，p r o p a n c r e a t i c p o l y p e p f i d e 。 t a b l e2 p r e c u r s o rc l a s s i f i c a t i o nb a s e do nc l e a v a g em o t i f s p r e c u r s o rp r o t e i n c l e a v a g es i t es e q u e n c e t y p eip r e c u r s o r 【r x 一( x r ) 一r 】 p r o b n g f l e p t i np r o r e c e p t o r i n t e g r i nu 6 h i v 一1g p l 6 0 p r e f e r t i l i na p r e 一7 8 2 t y p ei ip r e c u r s o r 【( k r ) 一( k r ) 】 p o m c ( c u m s h c l i p ) ( y l p h 0 k n d ) p r o i n s u l i n ( b cc h a i n ) ( c ac h a i n ) p r o r e e i n p a c a p r p i n t e g r i na 4 p 6p 5p 4p 3p 2p 1 【x - x r x k i r - r t h r 。h i s a r g 。s e r 。l y e 。a r g g l n v a l a r g g i u l y e a r g a s n 。s e r - a r g 。l y s 。l y e 。a r g v a l - - g l n - a r g g i u - - l y s - a r g g l n s e t a r g m e t a r g a r g g i u 。a r g - a r g 。l y s 。a r g 。a r g p 6p 5p 4p 3 p 2p i 【x x x - x k r - ri p r o v a l g l y - l y s - l y s - a r gl p r o - p r o l y e - a s p l y s - a r gl t h r - p r o l y s - t h r - a r g - a r gj g l y s e e l e u - g l n l y e a r g0 s e r - g l n p r o - m e t l y s - a r gl a l a p r o l e u t h r l y e a r gl h i s v a l i l e s e r l y s - a r gl p 1 p 2 。 x x l s e r s e r l e u a s p g 1 u i l e a l a v a l a 1 a a 1 a s e r v a l p 1 p 2 x x l a r g p r o t y r g 1 y g 1 u a 1 a g 1 7 一i l e l e u t h r h i s s e r s e r - t h r 3 羔堡堂- 丝墅堂堂堂堕坠 p r o f e r t i l l n8 s e r c y s l y s l e u l y s 。a r g la r g - g l y t y p ei i ip r e c u r s o r g p 8p 7p 6 p 5p 4 p 3p 2p l 【s i n g l e r 】 p r o d y n o r p h i n ( c - p e p t i d e ) p r o a n f p r o s o m a t o s t a t i n ( s s - 2 8 ) p r o - i g f - i p r o 一工g f i i p r o e g f ( n t e r m i n a l ) p r o e g f ( c t e r m i n a l ) t y p e 工vp r e c u r s o r s p 2 。；r k p a c a p r p p r o m u l l e r i a ni n h i b i t i n gs u b s t a n c e p r o g 1 u c a g o n p r o i g f i 工 【b ) 一x i b ) 一x - 【b ) 一x x r a r g g l n p h e - l y s v a l v a l t h r a r g a r g a l a l e u l e u t h r 。a l a p r o a r g g l u m e t a r g l e u g l u - l e u g l n a r g l e u l y s p r o - t h r l y s a l a a l a a t 9 a l a t h r p r o a l a l y s s e t g l u a t 9 g l u a s p g i y h i s - h i s l e u a s p a t 9 a s p l e u a r g t r p t r p 。g i u l e u a t 9 l l l l l p 1 p 2 x x s e r g i n s e r l e u s e r a 1 a s e r 一工l e a s p - v a l a s n s e r i h i s - a l a p 8p 7p 6 p sp 4 p 3p 2 p 1 t b 卜x 一【b ) 一x - ( b 卜x 。b 卜r k l e u a l a a l a v a l - l e u g i y l y s a t 9 g l u g l y a r g g i y a r g a l a g i y a r 9 g l n t r p l e u m e t a s n t h r l y s a r g g i u a l a p h e a r g g i u a l a l y s a r g p 1 。p 2 lx r k lt y r l y b ls e r l y n a s n a r g h i s a r g p r o p t p ur e c e p t o r v a l g l u g l u g l u a r g p r o a t 9 一a r g it h r l y 8 一一一 通过将前体加工酶与前体蛋白做胞内共表达，以及点突变等实验方法，对其中几 种前体加工酶的加工序列偏好性有了较为系统的研究，总结如下表： t a b l e3 f u r i np r o c e s s e sm o s tt y p e 1p r e c u r s o r s ，w h e r e a sp c i a n dp c 2c l e a v e m a n yt y p e p r e c u r s o r s a n dp c 5 - ac a nc l e a v et y p e i vp r e c u r s o r s precurso。rt、precursorcleavedc一onvertase p r e c u r s o r t y p e g r o w t hf a c t o r s n e u r o t r o p h i n s b l o o dc o a g u l a t i o nf a c t o r s p r o t g f b p r o n g f ，p r o b d n f ，p r o n t 3 p r o v o n w i l l e b r a n df a c t o r , p r o f a c t o r sv i i ， i xa n d x 4 第1 章前体h 口_ r - 酶及其抑制剂的研究进展 p c i p c 5 a i n t e g r i no r - c h a i n r e c e p t o r s m e t a l l o p e p t i d a s e s v i r a le n v e l o p e g l y c o p r o t e i n b a c t e r i a ls u r f a c e p r o t e i n s v i t e l l o g e n i n s p o l y p e p t i d eh o r m o n e s e n z y m e s p o l y p e p t i d eh o r m o n e s p o l y p e p t i d e h o r m o n e s r e c e p t o r s 0 3 ，砸，蛄，a n dc t v i n s u l i n r e c e p t o r s t r o m e l y s i n 一3 ，c a r b o x y p e p t i d a s e e h 1 v g p l 6 0 ，r s v - p r 9 5 。”，c m v g b ， i n f l u e n z a h a ，n d v f p af r o mb a n t h r a c i sa n dd i p h t e r i at o x i n d t f r o m m o s q u i t o a e d e sa e g y p t i p o m c ( 3 l p h & a c t h ) h u m a np r o l n s u l i n ( d e s3 1 ，3 2 ) ，p r o t r h ( t r h ) ，p r o d y n o r p h i n ( d y n1 - 1 7 ) ，p r o g l u c a g o n ( g l p 一1 ) ，p r o m c h ( m c h ) ，p r o n e u r o t e n s i n ( y r a n d b i gn n ) ， e n k e p h a l i n h u m a n p r o r e n i n p o m c ( 1 3 e n d o r p h i n a n dc t m s h ) ，h u m a n p r o l n s u l i n ，p r o d y n o r p h i n ( d y n1 8a n dc p e p t i d e ) ，p r o l h r h ( l h r h ) ， p r o g l u c a g o n ，p r o n e u r o t e n s i n ( n t n n ) ，p r o e n k e p h a l i n ( m a n dl e n k e p h a l i n s ) p r o m u l l e r i a ni n h i b i t i n gs u b s t a n c e ( m i s ) r p t p i f u r i n 是家族中最早被发现的成员，对它的研究最为深入。它在各种组织中广泛 地表达，主要定位于反面高尔基体网络( t g n ，t r a n s g o l g in e t w o r k ) 。倾向于识别并加工 第一类的前体蛋白，但也能加工其他类别的某些蛋白。p c i 和p c 2 主要表达于内分 泌组织中，胞内定位于t g n 之后的分泌小体中，它们主要加工第二类的激素前体。 表中所列的p c 5 一a 是p c 5 的m r n a 在剪接过程中产生的一种异构形式( 较短，缺 失跨膜区等) ，另一种异构形式是p c 5 b ( 膜蛋白，较长) 。p c 5 一a 表达分布较 广，如肾上腺体，内皮细胞等，主要加工第四类的前体蛋白。 5 第1 章前体k z - 酶及其抑制剂的研究进展 1 2 哺乳动物前体加工酶的结构 1 2 。1 一级结构 f i g1 - 1 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ff a m i l yo fm a m m a l i a np r e c u r s o rc o n v e f l a s e sa n d c o m p a r i s o nw i t ha n c e s t r a ls u b t i l i s i nb p n a n dy e a s ti 【e x i n 自从1 9 8 4 年发现k c x i n 以来的十多年间，哺乳动物p c ( p r e c u r s o rc o n v e r t a s e ) 家 族的成员已经增长到7 个，它们分别是：p c i ，p c 2 ，f u r i n ，p a c e 4 ，p c 4 ，p c 5 ， p c 7 。f i g l - 1 显示了这几种蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶( s u b t i l i s i nb p n ) 以及酵母k e x i n 在结构上的异同。所有的p c 都包含信号肽，前体肽，催化结构域以及p 结构域。 f u r i n ，p c 5 和p a c e 4 都含有一个半胱氨酸丰富区，k e x i n 则含有一个丝氨酸苏氨酸丰 富区；f u r i n ，k e x i n 和p c 5 的一种异构体p c 5 b 都含有一个跨膜区和胞浆区：p c i 和 p c 2 无跨膜区，却岔有一个两性螺旋区，一侧亲水，另一侧疏水，其作用与跨膜区相 似。 1 2 2 高级结构 利用不同的表达体系，f u r i n ，k e x i n 等前体加工酶都已获得了成功的表达f 1 5 ，1 6 1 。 在此基础上，人们经过将近1 0 年的努力，于2 0 0 3 年终于对它们进行了成功的结晶， 并解析出它们的晶体结构 1 7 ，1 8 l 。其间，s i e z e n 等人还利用同源模建的方法以枯草杆 菌蛋白酶b p n 和t h e r m i t a s e 晶体结构为基础，成功的模建了f u r i n 催化亚基的高级结 6 第1 聿前体加工酶及其抑制剂的研究进展 构【1 9 】。这些成就极大地帮助研究者从微观的角度考察f u r i n 的作用机理，为底物和 抑制荆的设计提供了重要的结构基础。 f i g 1 2 是k e x i n 的晶体结构图，它显示了k e x i n 的p 区域和催化区的三维结构。 p 区域由九个b 折叠片组成，侧面带有糖链。催化区含有两个c a 离子，其中一个是 酶活力必需的。同时显示出p 1 位是大的残基是k e x i n 所不喜好的。f i g 1 3 是f u r i n 的 晶体结构图，它的p 区域由八个b 折叠片组成。催化区也含有两个c a 离子，其中一 个也是酶活力所必需的，它解释了f u r i n 底物在p 1 和p 4 位喜好精氨酸，而p 2 位是赖 氨酸的原因。也显示出在p 3 、p 5 和p 6 位点对碱性残基的偏爱。 f i g l - 2r i b b o nd i a g r a mr e p r e