（有机化学专业论文）壳低聚糖制备及其生理活性研究.pdf

硕士擘位论文 m a s t e r st h e s i $ 中文摘要 不同分子量的壳聚糖性质差异很大，并且壳聚糖许多独特功能只有分子量降低 到一定程度时才表现出来。但是在通常情况下，低分子量的壳聚糖在保存过程中容 易变质，不易保存。寻找能够规模化生产具有生物活性的稳定的壳低聚糖方法引起 了许多国家关注。 本文概述了国内外近几年来在壳低聚糖的制备和生物活性功能等方面的研究 进展。运用高效液相色谱( h p l c ) 、傅立叶红外光谱( f t 取) 、核磁共振光谱( h n m r ， c n m r ) 、热重分析( t g ) 和差热分析( d t a ) 等现代分析手段表征酶法制备的壳 低聚糖的分子量和化学结构。使用昆明种小鼠进行体内实验研究不同分子量壳聚糖 在小鼠体内的组织分布以及对小鼠体内微量元素的影响。 主要研究内容和结论如下： 1 o 淀粉酶催化水解壳聚糖制备系列壳低聚糖。3 壳聚糖重量的a 淀粉酶在 6 h 内能够将脱乙酰度为8 5 5 的壳聚糖降解成水溶性的壳低聚糖。壳聚糖降解前后 脱乙酰度基本不变。高效液相色谱分析表明，这些酶催化水解壳聚糖可能主要是以 内切方式作用于壳聚糖分子。热分析结果显示降解得到的壳低聚糖分子量降低，热 稳定性减弱。 2 壳寡聚糖在通常情况下容易变色变质，只能低温保存。运用紫外可见光谱研 究各种可能影响壳寡糖变色的因素，如温度、时间、p h 、相对湿度、氧气以及还原 剂。随着温度的升高，壳寡聚糖褐变加快：一定的相对空气湿度有利于壳寡聚糖褐 变：p h 对褐变有很显著的影响。红外光谱和溶解性实验结果表明，壳寡聚糖的褐 变对其结构和性能有很大的影响，褐变后产物的结构发生了改变，其溶解性和吸湿 性也随之变差。因此，我们提出保存壳寡聚糖的适宜条件：低温，低的相对湿度， 无氧，p h 低于4 或高于1 0 。 3 以稀盐酸溶液为溶剂溶解壳聚糖，研究在水解酶的作用下降解壳聚糖的条件 以及产物的结构。当盐酸与壳聚糖的氨基摩尔比等于0 9 0 时，比较适合酶对壳聚糖 的降解。所得产物寡糖盐酸盐的热稳定性强于相应的醋酸盐，其在保存过程中不易 发生褐变。该方法降解过程简单，产物处理方便，成本低以及产物性质稳定，是一 种比较理想的适合大规模生产壳寡糖的方法。 4 为了研究壳聚糖的分子量及其水溶性对其在胃肠道的吸收以及体内的分布 的影响，我们采用三种不同分子量m w ( h c s7 6 0 x 1 0 5 ，m c s3 6 0 x 1 0 4 和l c s 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 5 3 0 x 1 0 3 ) 系列壳聚糖和一种水溶性的壳聚糖( w s c ，m w3 9 1 x 1 0 4 ) 为实验材料，探讨 其在体内的吸收和分布。结果表明：壳聚糖能够被小鼠吸收，其吸收情况受分子量 和水溶性的影响。随着壳聚糖分子量的增加，其肠道吸收减弱；壳聚糖溶解性增加 能够增强肠道对其吸收。壳聚塘分布到肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、心脏、血液和肺 中，但在肝脏中的浓度明显高于其他组织，说明壳聚糖在肝脏中有一定的累积。 5 以昆明小鼠为实验对象，采用口服的方法使小鼠持续服药9 0 天，剂量 1 5 0 9 ( k g b w d a y ) ，探讨分别长期服用不同分子量壳聚糖对体内微量元素的影响。结 果表明：长期服用中等分子量壳聚糖( m w3 6 0 x 1 0 4 ) 对体内肝脏和脾脏中的微量元 素f e 和z n 的含量都有提高，而分别服用高分子量的壳聚糖( m w7 6 0 x 1 0 5 ) ，水溶性 中等分子量壳聚糖( m w3 9 1 x 1 0 4 ) ，低分子量壳聚糖( m w5 3 0 x 1 0 3 ) ，对体内所测的 微量元素均无明显影响。 关键词：壳聚糖；壳寡糖；酶水解；结构表征：分子量；热稳定性；体内分布； 生物活性；微量元素 i i 硕士学位论文 m a s t e r sr h e s i s a b s t r a c t c h i t o s a n ，t h ed e a c e t y l a t e dd e r i v a t i v e so fc h i t i n ，i so n eo ft h en o n t o x i ca n d b i o d e g r a d a b l ec a r b o h y d r a t ep o l y m e r , a n dh a sr e c e i v e dm u c ha t t e n t i o na saf u n c t i o n a l b i o p o l y m e rf o rd i v e r s ep h a r m a c e u t i c a l s c h i t o s a nu n d e r g oe n z y m a t i ch y d r o l y s i st o g i v et h ec h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sw i t hg r e a tw a t e r - s o l u b i l i t y c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sa r e k n o w nt oh a v eb i o l o g i c a la c t i v i t i e ss u c ha sa n t i t u m o u ra c t i v i t y , i m m u n o - e n h a n c i n g e f f e c t s e n h a n c i n gp r o t e c t i v ee f f e c t sa g a i n s ti n f e c t i o nw i t hc e r t a i np a t h o g e n si nm i c e , a n t i f u n g a la c t i v i t y t h e r ei sad e f e c tt h a tt h e s ec h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sp r o d u c t se a s i l y t u mb r o w n i n gi nt h ep r o c e s so fp r e p a r a t i o n , t h e r m a ld r y i n ga n dp r e s e r v a t i o n t h e s e u n d e s i r a b l ee f f e c t sm a yb em i n i m i z e db yf r e e z e d r y i n ga n dp r o p e rs t o r a g ec o n d i t i o n s i n l a b o r a t o r ys c a l e t h el a r g e s c a l ep r o d u c t i o no fc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，t ob e e c o n o m i c a l l yf e a s i b l ea n dt e c h n i c a l l ya c c e p t a b l e ，n e e dt ob es t u d i e d t h er e c e n t p r o g r e s so nt h ep r e p a r a t i o no fc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sa n dt h e i r p h y s i o l o g i c a la c t i v i t yw a sr e v e i v e di n t h i sp a p e r t h em o d e ma n a l y s i sm e t h o d s i n c l u d i n gh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g h a p h y ( h p l c ) ，f o u r i e rt r a n s f o r m i n f r a r e d ( f t - i r ) ，m a g e n e t i er e s o n a n c es p e c t r o s c o p y ( h - n m r ，“c - n m r ) ，e l e m e n t a l a n a l y s i s ，t h e r m o g r a v i m e t r i ca n a l y s i s ( t g ) a n dd i f f e r e n t i a lt h e r m a la n a l y s i s ( d t a ) w e r e u s e dt oc h a r a c t e r i z e dt h es t r u c t u r eo f p r o d u c t t h ef o l l o w i n ga r et h em a i nc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n s ： 1 c h i t o s a nw a sh y d r o l y z e dt o g i v ec h i t o o l i g o s a c e h a r i d e sb ya l p h a a m y l a s e t h e c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sw a sa c h i e v e df r o mc h i t o s a nw h i c hw a sd 印o l y i i l e r i z e db y3 a l p h a - a m y l a s ef o r6 h t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o u l dn o tc h a n g et h es 仇l c t u r eo f c h i t o s a n ，b u tr e s u l ti nt h ed e c r e a s eo f t h c r m o s t a b i l i t y 2 c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e st u mb r o w n i n ge a s i l yd u r i n gt h ep r o c e s so fp r e s e r v a t i o n t h e f a c t o r si n f l u e n c i n gt h eb r o w n i n go fc h i t o o l i g o m e r sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h e b r o w n i n g w a sa t t r i b u t e d t o t h es t r u c t u r e c h a n g e o f c h i t o o l i g o s a c c h a r i d c s t h ew a t e r - s o l u b i l i t y a n d m o i s t u r e - a d s o r p t i o n o f c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sd e c r e a s e d 谢t ht h ei n c r e a s eo f b r o w n i n g t h et i m e ，t e m p e r a t u r e ， p h ，m o i s t u r e ，o x y g e na n dr e d u c t a n ta l lh a de f f e c to nt h eb r o w n i n go f c h i t o o l i g o m e r s t h eo p t i m a lp r e s e r v a t i o nc o n d i t i o nf o rc h i t o o l i g o m e r ss h o u l db ea tl o wt e m p e r a t u r e 1 1 1 a n dh u m i d i t y , a tp hb e l o w4o ra b o v e1 0 ，a n di na b s e n c eo f o x y g e n 3 t h ec h i t o s a nw a sd e g r a d e db yt h ec h e a p ，e f f i c i e n ta n dc o m m e r c i a l l ya v a i l a b l e e n z y m e si nh y d r o c h l o r i ca c i ds o l u t i o n t h ee f f e c to fm o l a rr a t i oo fa d d e dh c lt o _ 2o fc h i t o s a no nt h ed e g r a d a t i o nw a si n v e s t i g a t e d ，a n dt h ef a v o r a b l er m i ow a s b e t w e e n0 5 0a n do 9 5 t h ec h i t o o l i g o m e rh y d r o c h l o r i d e sw e r ed i r e c t l yp r e p a r e db y t h e s i m p l em e t h o d t h ec h i t o o l i g o m c rh y d r o c h l o r i d e sw e r ec h a r a c t e r i z e db y t h e r m o g r a v i m e t r i ca n a l y s i s ，d i f f e r e n t i a l t h e r m a la n a l y s i sa n df o u r i e rt r a n s f o r m i n f r a r e d t h e s er e s u l t ss h o wt h a tt h eo b t a i n e dc h i t o o l i g o m e rh y d r o c h l o r i d e sw e r e m u c hm o r es t a b l et h a nt h ec h i t o o l i g o m e ra c e t a t e s t h i sp r e p a r a t i o np r o c e d u r eo f c h i t o o l i g o m e rh y d r o c h l o r i d e sw a ss i m p l ea n dc h e a p ，a n dh e l p f u lt op r e s e r v a t i o no f c h i t o o l i g o m e r s 4 c h i t o s a n ，ac a t i o n i cp o l y s a c c h a r i d e ，h a sb e e nw i d e l yu s e di nb i o m e d i c a lf i e l d s a l t h o u g hn u n l e r o u ss t u d i e sh a v ef o c u s e do ni t sa p p l i c a t i o n sa sc o n t r o l l e dr e l e a s eo r b i o a c t i v er e a g e n t s ，t h ee f f e c to f m o l e c u l a rw e i g h ta n dw a t e r - s o l u b i l i t yo f c h i t o s a no n i t si n t e s t i n a la b s o r p t i o n ，b o d yd i s t r i b u t i o na n db i o a c t i v ep r o p e r t i e ss t i l ld e s e r v e dt ob e i n v e s t i g a t e d a s ap r e l i m i n a r y s t u d y , w ei n v e s t i g a t e d t h em o l e c u l a rw e i g h t - d e p e n d e n t i n t e s t i n a l a b s o r p t i o n a n d b o d y d i s t r i b u t i o n p a r e r n s a f t e ro r a l a d m i n i s t r a t i o no fw a t e r - s o l u b l ec h i t o s a n ( w s c ，m w3 9 1 1 0 4 ) a n dt h r e ef r a c t i o n s o f c h i t o s a n sw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i r g h tm w ( h c s7 6 0 x1 0 5 ，m c s3 6 0 x1 0 4 a n dl c s5 3 0 1 0 3 ) t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc h t i o s a n sc o u l db ea b s o r b e d ，a n dt h e a b s o r p t i o na n db o d yd i s t r i b u t i o n w a ss i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e d b yi t sm wa n d w a t e r s o l u b i l i t y a st h em wd e c r e a s e d ，t h ea b s o r p t i o ni n c r e a s e d ，h i g hm o l e c u l a r w e i g h tc h i t o s a n ( 7 6 0 1 0 ) w a sr a r e l ya b s o r b e db yi n t e s t i n a l t h ec o n c e n t r a t i o no f l c si nb l o o dw a s3t i m e sa n d7t i m e sh i g h e rt h a nm c sa n dh c sr e s p e c t i v e l ya to 5 h f o u rf r a c t i o n so fc h i t o s a n sw e r ed i s t t 5 【b u t e dt oa l lt e s t e dt i s s u e ss u c ha sl i v e r , k i d n e y , s p l e e n ，t h y m u s ，h e a r ta n dl u n g a sm wi n c r e a s e d ，t h ec o n c e n t r a t i o ni nl i v e ri n c r e a s e d a t0 5 ha f t e ra d m i n i s t r a t i o n i nc o n s i d e r a t i o no fd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n s i nd i f f e r e n tb o d yd i s t r i b u t i o nm a n n e r ，c h i t o s a nm a yb ee m p l o y e da sm a t e r i a lf o rd r u g d e l i v e r yo rc o n t r o l l e dr e l e a s e dr e a g e n t si nb i o m e d i c a la p p l i c a t i o n s 5 i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fc h i t o s a no nt h et r a c ee l e m e n tl e v e lb yo r a l a d m i n i s t r a t i o n ，t h ek u n m i n gs t r a i nm i c ew a su s e da se x p e r i m e n to b j e c t ( 1 0m i c ei n e a c hg r o u p ) a n do r a l l ya d m i n i s t r a t e df o r9 0d a y sa td o s eo f1 5 0 i g ( k g b w d a y ) t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h el e v e l so fc u ，f ea n dz ni nl i v e ra n ds p l e e nw e r e s i g n i f i c a n t l yr a i s e d ，b yo r a la d m i n i s t r a t i o nm i d d l em o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ( m w 3 6 0 x i 价f o rl o n gt i m e t h a tw a sn o ts i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e db yo r a la d m i n i s t r a t i o n l o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ( m w5 3 0 x10 3 ) ，h i g hm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ( m w 7 6 0 x 1 0 5 ) a n dw a t e r - s o l u b i l i t yc h i t o s a n ( m w3 9 1 x 1 0 4 ) f o rl o n g - t e r m ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：c h i t o s a n ；e h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；m o l e c u l a r ； t h e r m a l - s t a b i l i t y ；d i s t r i b u t i o n ；p h y s i o l o g i c a la c t i v i t y ；t r a c ee l e m e n t v 硕士擘位论文 m a s ie r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得 的研究成果。除文中已经标明b 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：肇襟汾 日期：妒7 年t 月 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中师 范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位 论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：肇株待 日规坤t 月加日 导师签名：劣勃焉 日期油年岁b 幽日 ， 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回耋迨塞埕童卮澄卮! 旦圭生 旦二生i 旦三生筮查! 作者签名：肇棘涛 日期：卅年，月狮日 导师签名：霎铽i 日期：如年j b 山日 硕士学住论文 m a s r r e r st h e s i s 引言 甲壳素( c h i t i n ) 是地球上仅次于纤维素的第二大天然高分子多糖，广泛存在于节 肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物及真菌和藻类的细胞壁中，其 年生物合成量约为1 0 0 多亿吨【1 2 】。甲壳素和壳聚糖是由2 一乙酰氨基2 脱氧一d 一吡 喃葡萄糖和2 氨基一2 脱氧d 吡喃葡萄糖通过1 3 一( 1 _ 4 ) 糖苷键连接的二元线性聚合 物，可认为是纤维素c 2 位羟基被乙酰氨基或氨基所取代。图1 1 显示了纤维素， 甲壳素和壳聚糖的结构示意图。 瀚h h o 。州h h o 0 o l t t o s a n 图1 1 纤维素，甲壳素和壳聚糖的结构示意图 天然甲壳素c ，2 位并非1 0 0 的是乙酰氨基，还有约1 8 的是氨基。另外，在生 产过程中用稀碱除蛋白质时又有部分乙酰基被脱掉，故商品甲壳素实际上有1 5 2 0 的脱乙酰度。一般将n - 脱乙酰度大于7 0 的甲壳素称为壳聚糖。事实上，得到l o o 脱乙酰度的壳聚糖是很困难的。由于壳聚糖中氨基的存在，人们对其商业价值具有 浓厚的兴趣。因为其它诸多天然多糖如纤维素、果胶、琼脂、角叉藻是中性的或者 是酸性的。 甲壳素不溶于水和大多数常用有机溶剂，限制了其应用，故对甲壳素进行化学 改性。壳聚糖可溶于醋酸、甲酸、稀盐酸水溶液中。5 0 左右乙酰化的甲壳素【3 】和 分子量小的壳低聚糖可溶于水。 1 1 壳低聚糖的制备 第一章绪论 研究表明不同的材料，不同的用途和不同的加工方法对壳聚糖分子量的要求是 不一样的。分子量不同的壳聚糖性质差异很大，壳聚糖的许多独特功能只有分子量 降低到一定程度时才表现出来。因此，选择适当的方法对壳聚糖进行降解尤为必要。 目前，国内外学者提出的壳低糖制备方法主要有化学降解法、物理降解法和酶催化 水解法。但是化学法制备的产物分子量分布宽，五聚体以上的壳低聚糖收率低，制 备的水溶性低聚糖结构被修饰。另外，反应过程中脱乙酰反应发生，难于得到甲壳 低聚糖。物理法制备低分子量的壳聚糖由于成本高，产物结构复杂，没有实际应用 价值。酶法制备过程温和，分子量分布相对容易控制，产物结构可能改变最小，是 一种比较理想的制备壳低聚糖的方法，也是目前工业生产中广泛采用的方法。 酶法降解是用专一性的甲壳素酶 4 8 】和壳聚糖酶 9 】，以及非专一性的其它酶 种来对甲壳素或壳聚糖进行生物降解。据报道甲壳素和壳聚糖除被甲壳素酶，壳聚 糖酶和溶菌酶降解外，还有大量的商业酶制剂包括葡萄糖酶、蛋白酶，脂酶、纤维 素酶、淀粉酶、半纤维素酶和果胶酶等3 0 多种酶在室温下有效地水解壳聚糖和甲 壳素。 1 1 1 甲壳素酶 甲壳素被水解成g i c n a e 是由甲壳素水解酶体系来完成的 4 8 】。该酶系一般被 诱导为多酶复合体。传统上被分为两大类：a ) 内切甲壳素酶( e n d o e h i t i n a s e 。e c 3 2 1 1 4 ) ，随机将甲壳素降解，最终产物主要为甲壳二糖和少量甲壳三糖：b ) n 一乙 酰葡萄糖胺酶f n a c e t y lg l u c o s a m i n i d a s e ，e c 3 2 1 3 0 ) ，有时也称为甲壳二糖酶 ( c h i t o b i a s e ) ，将甲壳二糖降解为游离态的g i c n a c ，其中一些酶能从甲壳素链的非 还原末端水解生成g l c n a e 。 有些人提出存在第三类酶，即外切甲壳素酶( e x o c h i t i n a s e ) ，该酶从甲壳素链的 非还原末端水解连续释放出甲壳二糖或低聚糖 1 0 1 。 m u z z a r e l l i 1 1 依据甲壳素酶的基因系列研究结果，把甲壳素酶分为两类：一类 具有相同的大小，平均有3 0 0 个氨基酸残基，一级结构相似，都来源于植物；另一 2 类氨基酸残基为2 9 0 8 2 0 ，大小差异很大，但都有一个包含几个高度保留区域的中 心部位，它们存在于细菌，真菌和动物体中。这两类酶对应于糖基水解酶的1 8 和 1 9 族。 植物几丁质酶分子量一般在2 5 - 4 0 k d a ，按其蛋白质氨基酸序列结构特征及同源 性又分为六类，即c l a s si - v i 1 2 。 上世纪九十年代初，在海洋弧菌( v i b r i of u r n i s s i i ) 中发现一种未知酶，它只能水 解聚合度为4 6 的甲壳低聚糖，却不能水解甲壳素或甲壳二糖和三糖。这种酶被称 为甲壳糊精酶( c h i t o d e x t r i n a s e ) 1 3 】。 当然，能够水解g i c n a e 糖苷键的酶种类比国际生化协会酶委员会已命名的种 类的数量要多得多，这就需要更加仔细研究酶的纯化，探讨各种底物与酶相互作用 的方式。同时注意粗酶在规模生产中的可行性。 h o l l i s 等人研究发现【1 4 】，大麦几丁质酶对( g i c n a e ) 6 水解后的产物为两分子的 ( g l e n a c ) 3 或者为一分子( g i c n a e ) 4 和一分子( g l c n a c ) 2 ，这两种情况概率相当。 甲壳素酶水解甲壳素时，水解部位是无规则的；而壳聚糖为底物，在均态下水 解部位是规则的，可获得较高聚合度的低聚糖。壳聚糖具有部分n - 乙酰基葡萄糖残 基，而甲壳素酶能识别n 一乙酰基残基，所以水解产物是由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡 萄糖残基组成的寡糖，它们可以通过乙酰化作用转化为甲壳低聚糖0 5 。 甲壳素酶的水解速率随乙酰化度的增加而增加，但它不水解氨基葡萄糖序列。 因而选择甲壳素酶水解高乙酰化度的壳聚糖制备低聚合度的低聚糖，而水解低乙酰 化度的壳聚糖制得的是高聚合度的低聚糖 1 6 】。 来源于a e r o m o n a ss p n o l 0s 一2 4 的甲壳素酶i i 1 7 】水解部分n 乙酰化的壳聚糖 的产物结构分析显示，甲壳素酶水解g l c n a c g l c n a c 键及g i c n a c g l c n 键，一般 来说甲壳素酶需要在水解键的两端至少有一个g l c n a e 基团。 1 1 2 壳聚糖酶【5 l 壳聚糖酶( e c 3 2 1 9 9 ) 1 8 是一种不同于甲壳素酶的酶，它对胶态几丁质不水解， 但是能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖。它主要存在于真菌和细菌的细胞中，在单子 叶和双子叶植物的不同组织中也发现有该种酶 1 8 】。 一般来说壳聚糖酶与甲壳素酶没有绝对的不同，两者均能降解不同乙酰度的壳 聚糖 1 9 2 1 。甲壳素酶优先降解高乙酰度的聚合体，但同时也对低乙酰度的聚合体 降解有效 2 2 2 3 1 。 大多数壳聚糖酶分子量在1 0 - - 5 0 k d a 范围内，最适p h 在4 o 一8 0 之内，最适 温度为3 0 一7 0 0 c 之间。 根据壳聚糖酶的作用模式，可分为内切和外切两种类型。内切型壳聚糖酶以释 放二聚体，三聚体或低聚糖为主；外切型壳聚糖酶从壳聚糖或壳低聚糖的非还原末 端产生单糖残基。至今发现的大多数壳聚糖酶是内切型酶。 不同来源的壳聚糖酶优先水解不同的底物。b a c i l l u sc i r c u l a n sm h k 1 对8 0 脱 乙酰度壳聚糖具有最高活性 2 4 1 ，b a c i l u sl i c h e n i f o r m i su t k 优先作用于6 5 8 0 脱乙 酰度壳聚糖 2 5 】，而b a c i l l u ss p 水解高脱乙酰度壳聚糖 2 6 】，它专一性地水解 g l e n - g l e n 键。用b a c i l l u s p u m i l u sb n - 2 6 2 和s t r e p t o m y c e ss p n 1 7 4 产生的壳聚糖酶 降解壳聚糖得到寡糖的还原端含有g i c n a c 或者g i c n 基团，非还原端只含有g l e n 基团，表明这些壳聚糖酶切断壳聚糖的g i c n a c g l e n 和g l e n g l e n 糖苷键 2 7 2 8 。 p e n i c i l l i u mi s l a n d i u m 产生的壳聚糖酶切断g l c n a e g l e n 基团，得到寡糖还原端只有 g i c n a e 基团 2 9 1 。b a c i l l u ss p 7 - m 产生的壳聚糖酶只特异性地切断g i c n - g i c n 糖苷 键 2 6 】，而sg n s e u sh u t 6 0 3 7 2 7 和b c i r c u l a n sm h k 1 1 2 2 产生的壳聚糖酶不仅切 断壳聚糖的g l c n g l c n 糖昔键，而且切断g l e n - g i c n a e 糖苷键，因而寡糖还原末 端只有g l e n 基团。 自然界中甲壳素和壳聚糖被微生物降解，从而避免了来自死亡动物和真菌中的 多糖堆积在陆地和海洋，维持碳、氮元素的循环。近2 0 年来，已经从微生物中开 发了许多甲壳素酶和壳聚糖酶，它们能用于制备寡糖，而且可以控制聚合度及端基 结构。然而这些酶生产成本昂贵，实现商业化还需进一步寻找新的菌株和方法。 1 1 3 溶菌酶 溶菌酶能降解甲壳素和部分n - 乙酰化壳聚糖 2 9 1 。溶菌酶的结构已被阐明，有 6 个活性结合部位，在催化反应中，6 个亚基结合六个糖环，并需要有g i e n a c 糖基。 溶菌酶对部分n 一乙酰化壳聚糖的水解能力随其乙酰化度的增加而提高，它不能催化 脱乙酰度高于9 5 的壳聚糖水解。 周桂以脱乙酰度4 0 9 6 的水溶性壳聚糖为底物，研究了鸡蛋白溶菌酶的水解 动力学，结果表明溶菌酶一壳聚糖体系遵循米氏方程式【3 0 】；r a g n h i l d 进一步研究 了鸡蛋白溶菌酶和人体溶菌酶的结构相似性和差异性，说明了其差异使得人体溶菌 酶与鸡蛋白溶菌酶在结合亲和性和降解时的速率上可能有不同 3 l 】。人体中溶菌酶 对部分脱乙酰度壳聚糖有明显降解作用【3 2 。3 3 】。a i b a 研究了溶菌酶对具有不同乙酰 基分布模型的壳聚糖的水解作用，他用由非均相脱乙酰化反应得到的1 0 r 3 0 乙 酰度( d a ) 的壳聚糖( m d c ) 与具有相同d a 而由均相脱乙酰化反应得到的壳聚糖 4 硕士学位论文 m a s r l e r st h e s i s ( p a c h ) 进行比较。其结果表明m d c 水解的初速度大约为p a c h 的4 倍，他认为 这主要是由于m d c 中有连续3 个以上的g i c n a e 残基，而p a c h 中的n 一乙酰基则 是随机分布。由于溶菌酶能识别乙酰氨基葡萄糖序列，因此可以从低脱乙酰度的壳 聚糖获得高聚合度( n 5 ) 的甲壳低聚糖【3 4 】。在大多数的哺乳动物中，甲壳素的降解 主要是由溶菌酶所引起的。在人乳和人体血清中也含有丰富的溶菌酶。在体内溶菌 酶对壳聚糖的催化水解速度随着脱乙酰化度的升高而降低，脱乙酰化度达到1 0 0 的壳聚糖贝难于在体内被溶菌酶催化水解 3 5 1 。因而医用植入材料的壳聚糖脱乙酰 化度控制在7 0 左右 3 6 1 。 目前，商业化溶菌酶的生产主要来自于蛋品加工厂，这种酶在酶法规模制备甲 壳低聚糖中应该具有潜在的价值。 1 1 4 非专一性酶 周桂研究发现 3 0 】，酶与底物比率较低时，菠箩蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白 酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂酶制剂比商业甲壳素酶和溶菌酶更能有效地催化壳 聚糖的水解。虽然同是纤维素酶，但并非不同来源的酶都有降低底物粘度的作用。 酶活性与酶的来源、储存、纯度均有关系，不能笼统地比较酶对壳聚糖的降解活性 大小。 壳聚糖和纤维素结构相似，纤维素酶对壳聚糖也显示了相似的降解作用 3 7 3 8 。来自木霉的纤维素酶水解高脱乙酰度壳聚糖，得到较高产率的六至八聚壳 寡糖 3 9 1 。a i b a 等用低成本的纤维素酶和半纤维素酶制剂制备高聚合度的低聚糖， 高效液相层析h p l c 测到六糖和七糖的产率分别超过2 0 和l o 4 0 1 。 m u z z a r e l l i 等人【4 1 】发现木瓜蛋白酶降解壳聚糖，聚合度最高的壳聚糖部分被优 先降解，木瓜蛋白酶主要作用于氨基葡萄糖与n - 乙酰氨基葡萄糖之间的糖苷键。壳 聚糖底物的n 乙酰化度对酶活力也有影响。中性蛋白质水解壳聚糖的研究结果表 明，随着脱乙酰度的增加，酶促反应速度下降，认为中性蛋白酶降解壳聚糖时，可 能要求d 1 ，4 糖苷键的一端是g i c n a c 。 m u z z a r e l l i 等人对麦胚脂肪酶的降解壳聚糖进行了研究 4 2 4 3 ，认为酶解反应 并不改变乙酰化度。a i b a 等用低成本的脂酶制剂制备六糖和七糖产率约2 0 的低聚 糖 4 0 】。 v i s h uk u m a r 指出，一些聚糖酶对壳聚糖的降解效果显著，木瓜蛋白酶和单宁 酶也有较强的降解能力 4 4 】。s h i n - y a 报告了果胶酶降解壳聚糖时，提高乙酰度，会 增加初始水解速率 4 5 1 。 由非专一性酶组成的复合酶，进行水解壳聚糖的研究也日益增多。如用纤维素 酶、a 一淀粉酶和蛋白酶复合可提高水解效率【4 6 】，但其作用机理尚需进一步探讨。 一些非专一性酶的水解效果与甲壳素酶、壳聚糖酶的水解效果相比毫不逊色。 一般来说，文献中报道的商业酶制剂大都未经过进一步的纯化，因而是否降解由酶 杂质所引起，也引起了人们的关心。 1 1 5 固定化酶 游离态的酶与底物反应，不利于酶的再回收利用，同时也给后续的产品纯化工 艺增加了难度，固而人们设想用酶的固定化技术来生产壳低聚糖。 m i n g 等人【4 7 】对壳聚糖酶( 产自n o c a r d i ao r i e n t a l si f o1 2 8 0 6 菌株) 用不同的载 体和方法固定化后，该酶的最适温度从游离酶时的6 0 。c 降到了4 0 5 0 。c ，同时也提 高了酶的热稳定性，而且可连续生产。 f u 4 8 等将产于e n t e r o b a c t e rs p g 1 菌株的壳聚糖酶固定在不同的载体上进行 连续水解壳聚糖实验，固定在f e 3 9 0 1 ( 阴离子交换树脂) 上的酶具有最大的活性； 固定在几丁聚糖株上的酶在经过半个月的连续生产后，酶活性仍为最初的5 0 ， h y i n a 4 9 等报告了一个两步水解法，使用交联甲壳素固定化壳聚糖水解酶( 产于& k u r s s am o r i ir c m a c 1 5 0 4d 菌株) 在p h4 6 和6 2 介质中分两步水解脱乙酰度8 5 的壳聚糖得到水溶性产物，固定化酶可用8 0 批次以上，产物中蛋白质含量低于 0 0 0 2 。 j e o n 等人 5 0 】使用甲壳素固定来自b a c i l l u sp u m i l u sb n - 2 6 2 菌株的酶，在双反 应器系统( 固定化酶反应器，超滤膜分离反应器) 制备壳寡糖，得到较高聚合度的寡 糖。与批式反应器相比，反应后的产物经膜分离出去后，减少了再次降解的几率， 可以通过控制进料量和流速提高相应聚合度的寡糖含量。 不过，酶固定化后，酶活性有所降低。由于酶固定在载体上一般是因为静电作 用、氢键和分子间作用力，所以酶也容易脱落，控制反应条件解决这些问题是生产 工艺中所必需的。 1 2 壳低聚糖的生物活性功能 1 2 1 降低体重 s u g a n o 研究显示，喂食大鼠1 0 壳聚糖的饮食会导致体重增长下降【5 1 】，s h i a u 报道，喂食甲壳素和壳聚糖的鱼与对照组比较，其体重增长下降 5 2 1 。 硕士学位论文 m a s r e r st h e s i s s c h i l l e r 通过对5 9 位肥胖的人进行双盲试验来评价壳聚糖的减肥作用，每天中 晚餐前各服1 5 9 壳聚糖或安慰剂，无其它特殊饮食要求，8 周后服安慰剂组成员平