（植物学专业论文）硫酸盐还原菌和无色硫细菌的分离纯化及鉴定.pdf

内蒙古师范大学硕士学位论文 中文摘要 本研究对污水处理厂厌氧池、曝气池、巴盟铜矿等废水样品进行 脱硫菌的分离纯化，共得到7 株脱硫菌。分别对7 株脱硫菌做了形态 学、生理生化及分子生物学鉴定，并考察了环境因素对其生长的影响， 从而得出最适生活环境。实验结果如下： 1 采用平皿夹层厌氧法、焦性没食子酸法、h u n g a t 滚管三种方 法对污水处理厂厌氧池和巴盟铜矿的水样进行筛选，通过液体富集与 固体纯化相结合的方法对菌种进行分离纯化，得到6 株分离菌，分别 命名为s r b 1 、s r b 2 、s r b 3 、s r b 一4 ，s r b 5 和s r b 6 。 2 6 株分离菌的个体形态特征为杆状、单个排列、革兰氏阴性、 无芽孢和荚膜；液体培养基生成f e s 沉淀并产生h 2 s ，具有硫酸盐还 原菌的典型分类特征；在不含f e 2 ，的固体培养基中菌落为白色，而在 含f e 2 + 的固体培养基中，菌落均为黑色，菌落直径比不含f e 2 + 的大； v - p 试验、甲基红试验、吲哚试验呈阴性；都能利用葡萄糖、蔗糖、 乳糖并产气；都具有过氧化氢酶活性。 3 6 株s r b 属于中温菌，其最适生长温度3 6 - - 一3 5 ；最适p h 值 为7 0 + 8 0 ；耐受盐浓度为7 5 。6 株s r b 在硫酸盐异化作用过程 中能以乳酸钠、葡萄糖和乙酸钠等有机物作电子供体，以硫酸盐、亚 硫酸盐和硫代硫酸盐作为电子受体。 4 采用好氧培养方法从污水厂的曝气池水样中分离筛选了1 株 无色硫细菌，命名为c s b l 。菌落为白色圆形，表面光滑湿润，中心 凸起；延长培养时菌落变为黄色，菌落中心褐色。菌落表面有硫沉淀 生成而变干；该菌株革兰氏染色呈阴性；短杆状；无芽孢、有荚膜； c s b 1 属于中温菌，最适生长温度为3 0 ；最适p h 值为7 o ；无氧 条件下无法生存。 5 通过16 s r d n a 序列分析，构建系统发育进化树，结合形态特 征、生理生化特征研究，认为s r b 2 、s r b 一3 和s r b 4 属于柠檬酸细 菌属( c i t r o b a c t e r ) ，s r b 1 和s r b 6 属于志贺氏菌属( s h i g e u a ) ，s r b 5 属于梭菌属( c l o s t r i d i u m ) ，c s b 1 属于硫杆属( t h i o b a c i l l u s ) 。 内蒙古师范大学硕士学位论文 关键词：硫酸盐还原菌，无色硫细菌，形态鉴定，1 6 s r d n a ，影响因 素 a b s t r a ct i nt h i sr e s e a r c h ，d e s u l f u r a t i o nb a c t e r i af r o mw a s t ew a t e rs a m p l e si n s e w a g et r e a t m e n tp l a n t sa n a e r o b i cr e a c t o r s ，a e r a t i o nt a n ka n db a y a n n a o e r c o p p e rw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e d ，a n ds e v e ns t r a i n so fd e s u l f u r a t i o n b a c t e r i aw e r eo b t a i n e d a l lo ft h e mw e r ei d e n t i f i e db ym o r p h o l o g i c a l ， p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s t h e nt h e e f f e c t so fe n v i r o n m e n t a le l e m e n t so nt h e i rg r o w t hw e r e i n v e s t i g a t e d i n o r d e rt op r o c u r eo p t i m u ml i v i n ge n v i r o n m e n t t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 a n a e r o b i cp l a t es a n d w i c hm e t h o d ，p y r o g a l l i ca c i dm e t h o da n d h u n g a tr o l lt u b em e t h o dw e r eu s e dt os c r e e nt h ew a t e rs a m p l e sf r o m s e w a g et r e a t m e n tp l a n t sa n a e r o b i cr e a c t o r sa n db a y a n n a o e rc o p p e la n d t h e n l i q u i de n r i c h m e n tm e t h o da n ds o l i dp u r i f i c a t i o nm e t h o dw e r e c o m b i n e dt oi s o l a t ea n dp u r i f yt h es t r a i n s 。s i xi n d i v i d u a ls t r a i n sw e r e o b t a i n e da n dn a m e ds r b 一1 ，s r b 一2 ，s r b 一3 ，s r b 一4 ，s r b 5a n ds r b 6 s e p a r a t e l y 2 t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s es i xi n d i v i d u a ls t r a i n s w e r e r h a b d i t i f o r m ，s i n g l ea r r a n g e m e n t ，g r a m n e g a t i v e ，w i t h o u ts p o r ea n d c a p s u l e t h ep r e c i p i t a t i o no ff e sa n dt h eg a sh 2 sw e r ep r o d u c e di nl i q u i d m e d i u m t h e yh a dt h et y p i c a lt a x o n o m i cf e a t u r e so fs u l f a t er e d u c i n g b a c t e r i a t h ec o l o n i e sw e r ew h i t ei ns o l i dm e d i u mw i t h o u tf e 2 + b u tb l a c k i ns o l i dm e d i u mw i t hf e z + t h ed i a m e t e r so ft h ec o l o n i e sw i t hf e 2 + i n s o l i dm e d i u mw e r el a r g e rt h a nt h a to fd i a m e t e r sw i t h o u tf e 2 + t h er e s u l t s o fv _ pt e s t ，m e t h y lr e dt e s ta n di n d o l et e s ts h o w e dn e g a t i v e a 1 lo ft h e m u s e dg l u c o s e ，s a c c h a r i n ea n dl a c t o s et op r o d u c eg a s t h e ya l s oh a dt h e c a t a l a s ea c t i v i t i e s 内蒙古师范大学硕士学位论文 关键词：硫酸盐还原菌，无色硫细菌，形态鉴定，1 6 s r d n a ，影响因 素 a b s t r a ct i nt h i sr e s e a r c h ，d e s u l f u r a t i o nb a c t e r i af r o mw a s t ew a t e rs a m p l e si n s e w a g et r e a t m e n tp l a n t sa n a e r o b i cr e a c t o r s ，a e r a t i o nt a n ka n db a y a n n a o e r c o p p e rw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e d ，a n ds e v e ns t r a i n so fd e s u l f u r a t i o n b a c t e r i aw e r eo b t a i n e d a l lo ft h e mw e r ei d e n t i f i e db ym o r p h o l o g i c a l ， p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s t h e nt h e e f f e c t so fe n v i r o n m e n t a le l e m e n t so nt h e i rg r o w t hw e r e i n v e s t i g a t e d i n o r d e rt op r o c u r eo p t i m u ml i v i n ge n v i r o n m e n t t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 a n a e r o b i cp l a t es a n d w i c hm e t h o d ，p y r o g a l l i ca c i dm e t h o da n d h u n g a tr o l lt u b em e t h o dw e r eu s e dt os c r e e nt h ew a t e rs a m p l e sf r o m s e w a g et r e a t m e n tp l a n t sa n a e r o b i cr e a c t o r sa n db a y a n n a o e rc o p p e la n d t h e n l i q u i de n r i c h m e n tm e t h o da n ds o l i dp u r i f i c a t i o nm e t h o dw e r e c o m b i n e dt oi s o l a t ea n dp u r i f yt h es t r a i n s 。s i xi n d i v i d u a ls t r a i n sw e r e o b t a i n e da n dn a m e ds r b 一1 ，s r b 一2 ，s r b 一3 ，s r b 一4 ，s r b 5a n ds r b 6 s e p a r a t e l y 2 t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s es i xi n d i v i d u a ls t r a i n s w e r e r h a b d i t i f o r m ，s i n g l ea r r a n g e m e n t ，g r a m n e g a t i v e ，w i t h o u ts p o r ea n d c a p s u l e t h ep r e c i p i t a t i o no ff e sa n dt h eg a sh 2 sw e r ep r o d u c e di nl i q u i d m e d i u m t h e yh a dt h et y p i c a lt a x o n o m i cf e a t u r e so fs u l f a t er e d u c i n g b a c t e r i a t h ec o l o n i e sw e r ew h i t ei ns o l i dm e d i u mw i t h o u tf e 2 + b u tb l a c k i ns o l i dm e d i u mw i t hf e z + t h ed i a m e t e r so ft h ec o l o n i e sw i t hf e 2 + i n s o l i dm e d i u mw e r el a r g e rt h a nt h a to fd i a m e t e r sw i t h o u tf e 2 + t h er e s u l t s o fv _ pt e s t ，m e t h y lr e dt e s ta n di n d o l et e s ts h o w e dn e g a t i v e a 1 lo ft h e m u s e dg l u c o s e ，s a c c h a r i n ea n dl a c t o s et op r o d u c eg a s t h e ya l s oh a dt h e c a t a l a s ea c t i v i t i e s 内蒙古师范大学硕士学位论文 3 t h es i xs r bs t r a i n sw e r em e s o p h i l i cb a c t e r i a ，a n dt h e i ro p t i m u m g r o w t ht e m p e r a t u r ew e r ea m o n g3 0 3 5 。c ，a n dt h eo p t i m u mp hv a l u e w e r eb e t w e e n7 0 8 0 t h ec o n c e n t r a t i o no fs a l tt o l e r a n c ew a s7 5 a 1 1 t h e s es i xs r bs t r a i n st r e a t e do r g a n i c sl i k es o d i u ml a c t a t e ，g l u c o s ea n d s o d i u ma c e t a t ea st h e i re l e c t r o nd o n o r s ，w h i l et h e yt r e a t e ds u l f a t e ，s u l f i t e a n dt h i o s u l p h a t ea se l e c t r o na c c e p t o r s 4 a e r o b i cc u l t u r em e t h o dw a su t i l i z e dt oi s o l a t ea n ds c r e e no n es t r a i n o fc o l o r l e s ss u l f u rb a c t e r i a ，w h i c hw a sn a m e dc s b 一1 t h e s ec o l o n i e sw e r e w h i t ea n dr o u n d ，a n dt h e i rs u r f a c e sw e r es m o o t ha n dm o i s t ，a n db u l g ei n t h e i rc e n t r e s t h ec o l o r so fc o l o n i e sw e r et u r n e dy e l l o ww h e ne x t e n d i n g t h ec u l t u r et i m e t h ec e n t r e so fc o l o n i e sb e c a m eb r o w n t h es u r f a c eo f t h e s ec o l o n i e sp r o d u c e dp r e c i p i t a t i o ns u l f u ra n dm a d e t h ec o l o n i e s d r y c s b 1w a sg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ，s h o r tr o d ，w i t h o u ts p o r e b u tw i t h c a p s u l e c s b - 1 w a s m e s o p h i l i cb a c t e r i c a ，w h o s eo p t i m u mg r o w t h t e m p e r a t u r ew a s3 0 。c i t so p t i m u mp hv a l u ew a s7 0 t h ec s b l b a c t e r i a c a nn o ts u r v i v ew i t h o u to x y g e n 5 t h r o u g ha n a l y z i n gt h e16 s r d n ag e n es e q u e n c e s ，t h ep h y l o g e n e t i c t r e ew a sc o n s t r a c t e d t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r ei n t e g r a t e dt od of u r t h e rr e s e a r c h s r b 一2 ，s r b 一3a n ds r b 一4w e r ec o n s i d e r e dt ob e l o n gt oc i t r o b a c t e r , w h i l es r b - la n ds r b 一6t os h i g e l l a s r b 一5b e l o n g e dt oc l o s t r i d i u m ，a n d c s b 1b e l o n g e dt ot h i o b a c i l l u s k e yw o r d s ：s u l f a t er e d u c i n gb a c t e r i a ，c o l o r l e s ss u l f u rb a c t e r i a ， i d e n t i f y ，16 s r d n a ，e f f e c t i v ee l e m e n t s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果，尽我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含本人为获得内蒙古师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。本人保证所呈交的论文不侵犯国家机 密、商业秘密及其他合法权益。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 签名：舅豇羝：| d 年芍r 弓de l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解内蒙古师范大学有关保留、使用学 位论文的规定：内蒙古师范大学有权保留并向国家有关部门或机 构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子 文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：茵苕 导师签名：事悔 日期：2 0 0 年芗月矽日 1 引言 1 引言 1 1 硫在自然界的存在及循环 1 1 1 硫的循环 在自然界中硫以元素硫、二氧化硫、亚硫酸盐、硫酸盐和气态的硫化物等多 种形态存在，通过化学和生物作用进行相互之间转化而构成硫的循环【。大气中 的s 0 2 和h 2 s 主要来自化石燃料的燃烧、火山喷发、海面散发以及有机物分解 过程中的释放。s 0 2 和h 2 s 转变成s 0 4 2 时能进入土壤，被植物吸收和利用。硫 化物经降水形成硫酸和硫酸盐，又经过食物链成为各级消费者的氨基酸成分，动 植物被细菌分解以h 2 s 释放出来，再次进入植物体内而形成硫的循环。经地表径 流进入海洋中的硫形成海底沉积岩，不再进入陆地生态系统的硫循环【2 - 5 】。所以， 硫的循环既属沉积型，也是气体型。 硫是生物有机体蛋白质氨基酸的组成成分，是蛋白质所必需的原料，以硫键 连接蛋白质分子。虽然所需的硫量很少，但却非常重要。 1 1 2 硫的微生物转化 硫有s 厶、s 2 2 、s 、s 4 + 、s 6 + 等不同的价态。金属元素和s 2 。与$ 2 2 - 形成硫化物 是矿产的重要资源。硫的微生物转化过程需多种微生物参与作用，如图1 一l 所示。 有氧时，硫化物被氧化为硫酸盐从而被微生物吸收后转化为含硫的有机化合物， 厌氧时，则硫酸盐产生h 2 s 。h 2 s 被无色硫细菌氧化为s ，并进一步氧化为硫酸 卦【6 - l l 】 卫札 。 微生物将含硫的有机化合物如蛋白质、氨基酸、磺氨酸等转变为硫化氢，从 而进入含硫有机物的无机矿化过程。如果分解不彻底时，暂时以硫醇形式积累， 再转化为h 2 s 。在微生物分解中，既产生h 2 s 也产生n h 3 是因为含硫有机物大 都含有氮。如变形杆菌可将半胱氨酸水解为n h 3 和h 2 s 。微生物分解含硫有机物 的反应如下【1 2 】： c 3 h 7 0 2 n s + 2 h 2 0 _ c h 3 c o o h + h c o o h + n h 3 + h 2 s h 2 s + f e s 0 4 _ h 2 s 0 4 + f e s h 2 s + p b ( c h 3 c o o ) 2 2 c h 3 c o o h + p b s 内蒙古师范大学硕士学位论文 硫的氧化( s u l u f ro x i d a t i o n ) s o s 2 。 s 0 4 2 t上细(b菌act、er植ia,物a同ni化ma，。舭d p 图1 1 硫的微生物循环 - f i g 1 1t h eb i o l o g i c a ls u l f u rc y c l e r e d u c t i o n ) l a n t s ) 在有氧条件下，通过硫细菌的作用，将h 2 s 或硫化物氧化为元素硫，再进而 氧化为硫酸。参与这个作用的微生物有硫杆菌和硫磺细菌。 硫杆菌属细菌从氧化硫化物中的元素硫为硫酸盐的过程中获得能量，同化 c 0 2 合成有机物1 4 1 。反应如下： 2 h 2 s + 0 2 _ 2 h 2 0 + 2 s + 能量 5 n a 2 s 2 0 3 + h 2 0 + 4 0 2 _ 5 n a 2 s 0 4 + h 2 s 0 4 + 4 s + f l 皂量 2 s + 3 0 2 + 2 h 2 0 2 h 2 s 0 4 + 能量 2 f e s 2 + 7 0 2 + 2 h 2 0 _ 2 f e s 0 4 + 2 h 2 s 0 4 c 0 2 + h 2 0 _ 【c h 2 0 + 0 2 硫磺细菌也是化能自养型细菌，从氧化硫化物和元素硫过程中取得能量。 2 h 2 s + 0 2 叶2 h 2 0 + 2 s + f i 皂量 2 s + 3 0 2 + 2 h 2 0 一2 h 2 s 0 4 + 能量 1 2 硫酸盐还原菌 硫酸盐还原菌( s u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i u m ，s r b ) 是能进行硫酸盐还原代谢反 应的细菌的统称【1 5 j8 1 。s r b 是一类形态、营养多样化，以硫酸盐作为电子受体 的严格厌氧细菌。18 9 5 年b e i j e r i n c k 首次发现硫酸盐还原菌，迄今已经有百多 2 1 引言 年的历史【1 9 】。1 9 0 3 年d e l d e n 发表了关于海水中耐盐菌种的报道【2 0 】，1 9 2 5 年e i l o n 发现了一种嗜热s r b ，1 9 3 0 年b a r r s 比较系统地讨论了s r b t 2 。1 9 3 6 年b u n k e r 、 1 9 4 9 年b u t l i n 等分别对这些早期的研究结果进行了总结，他们认为s r b 是严格 厌氧菌，且有些菌种能在没有硫酸盐的环境中通过发酵而获得能量，但目前已知 的s r b 都不能以氧作为电子受体，氧抑制s r b 的生长【2 2 1 。与一般的土壤或水体 微生物相比，s r b 的生长速率缓慢，但生存能力较强，分布广泛，它们存在于 土壤、稻田、海水、盐水、自来水、温泉水、地热地区、油井和天然气井、含硫 沉积物、河底污泥、污水、绵羊瘤胃和动物肠道等环境中【2 3 ，2 4 1 。 1 2 1 硫酸盐还原菌的分类 到目前为止，关于硫酸盐还原菌的分类研究结果并不多，主要是因为硫酸盐 还原菌除能还原硫酸盐外，其他特征不太明显。据不完全统计，目前提出了4 0 个硫酸盐还原菌属。其中细菌中种类最多的是6 _ 紫色光合细菌门中的脱硫弧菌 属( d e s u l f o v i b r i o ) ，共有4 2 种已被发现，该门另外还有3 3 个属的5 9 种被发现： 厚壁菌i ( f i r m i c u t e s ) 有2 个属2 6 个种( 其中d e s u l f o t o m a c u l u m 共有2 3 种) 被发现： 硝化螺菌f - ( n i t r o s p i r a ) 只有嗜热脱硫弧菌属( t h e r m o d e s u l f o y f 6 r 幻) 中的2 个种被发 现，而热脱硫菌f ( t h e r m o d e s u l f o b a c t e r i a ) 有2 个属5 个种被发现【z 引。自然界中 存在的硫酸盐还原菌主要分布于脱硫弧菌( d e s u l f o v i b r i o ) 、脱硫肠状菌 ( d e s u l f o t o m a c “觑，z ) 和脱硫单胞菌( d 船“扣川d 以鲫) 三个属1 2 6 j 。 根据生理生化特性，s r b 分为异化硫酸盐还原菌和异化硫还原菌1 27 1 。异化 硫酸盐还原菌中如脱硫弧菌属( d e s u l f o u i b r i o ) 、脱硫单胞菌属( d e s u l f o m o n a s ) 、 脱硫肠状菌属( d e s u l f o t o m a c u l u m ) 和脱硫叶菌属( d e s u l f o b u l b u s ) 等属的细菌可利 用乳酸、丙酮酸盐、乙醇和h 2 等做为作为碳源和能源，将硫酸盐还原为硫化氢。 异化硫还原菌中如脱硫八叠球菌属( d e s u l f o s a r i c i n a ) 和脱硫线菌属( d e s u l f o n e m a ) 等属只能还原元素硫或者其它含硫化合物( 如亚硫酸盐、硫代硫酸盐等) 。根据营 养代谢产物不同，s r b 可分为完全氧化型和不完全氧化型：前者最终代谢产物 为c 0 2 和h 2 0 ，如d e s u l f o n e m a ；不完全氧化型的最终产物为乙酸，这些s r b 都 不能利用乙酸。d e s u l f o v i b r i o 属的许多物种都属于不完全氧化型【2 引。根据s r b 对生长温度的要求，可将其分为中温菌和嗜热菌两类，这两类菌不能完全相互转 化，但它们对温度和盐浓度有较高的适应力。诸多学者依据s r b 利用不同底物， 而将其分为4 类【2 9 3 3 】： 内蒙古师范大学硕士学位论文 氧化氢的硫酸盐还原菌( h s r b ) h s r b 4 h 2 - b s 0 4 2 $ 2 - + 4 h 2 0 氧化乙酸的硫酸盐还原菌( a s r b ) a s r b c h 3 c o o i - i + s 0 4 2 。s 2 + 2 c 0 2 + 2 h 2 0 氧化高级脂肪酸的硫酸盐还原菌( f a s r b ) f a s r b c h 3 c h 2c o o h + 0 5s 0 4 2 _ c h 3 c o o h + 0 5 s 2 、c 0 2 f a s l m c h 3 c h 2c o o h + i 7 5 s 0 4 2 。_ 1 7 5 s 2 - + 3 c 0 2 + 3 h 2 0 氧化芳香族化合物的硫酸盐还原菌( p s r b ) 1 2 2 硫酸盐还原菌代谢机理 s r b 代谢可分为合成代谢和分解代谢，对合成代谢的了解不多，硫酸盐还 原属于分解代谢。分解代谢一般分阶段进行，可以简单地分为3 个阶段3 4 。3 6 1 ，如 图1 2 所示： 第一阶段为分解代谢过程。在厌氧状态下进行有机物碳源的降解，同时通 过底物水平磷酸化( 即直接利用底物分子中的能量生成a t p ) ，产生少量a t p 和高 能电子。此阶段产生的a t p 不足以支持细胞的生长。 第二阶段为电子传递过程。第一阶段产生的高能电子通过s r b 中固有的 电子传递链( 如细胞色素c ；黄素蛋白等) 逐级传递，产生大量a t p 。 第三阶段为生物氧化过程。最后阶段中电子传递给氧化态的硫化合物，将 其还原为s 2 。，此时消耗a t p 提供能量。从这一过程可看出，有机物不仅是硫酸 盐还原菌的碳源，也是能源。硫酸盐( 或其它氧化态的硫元素) 仅作为最终电子受 体起作用。即s r b 利用硫酸根离子作为最终电子受体，将有机物作为细胞合成 的碳源和电子供体，同时将硫酸盐还原为硫化物。 4 1 引言 胞外 碳源 s 0 4 2 + h 2 0 喜霪等土j 型趔墼堕一严册 高能电子王_ 叶上 c 0 2 + h 2 0 + c h 3 c o s 2 + o h 。 分解代谢电子传递生物氧化 图l - 2s r b 代谢过程 f i g 1 2m e t a b o l i cp r o c e s so fs r b 目前关于s r b 代谢机理研究还不很成熟，硫酸盐还原的可能途径如图1 3 。 s 0 4 2 。s 0 4 2 + a t p a p s + p p i 2 p i 胞内 s 2 _ 一 2 e s 2 0 3 2 。一 2 e 图1 - 3 异化硫酸盐还原的可能途径 f i g 1 - 3t h ep o s i b l ep a t h w a y e so fd i s s i m i l a t es u l p h a t er e d u c t i o n 硫酸盐首先在细胞外积累后进入细胞。在细胞内，第一步反应是s 0 4 2 - 的活 化，即8 0 4 2 与a t p 反应生成腺苷酰硫酸( a p s ) 和焦磷酸( p p i ) 。p p i 迅速被分解为 无机磷酸( p i ) 推动反应不断进行；而a p s 继续分解为亚硫酸盐( s 0 3 2 。) 和磷酸腺苷 ( a m p ) 。亚硫酸盐脱水后变成偏亚硫酸盐( $ 2 0 5 2 - ) ，$ 2 0 5 2 - 极不稳定，迅速转化为 中间产物连二亚硫酸盐( s 2 0 4 2 ) ，8 2 0 4 2 又很快转化为8 3 0 6 2 。，s 3 0 6 2 - 分解为硫代硫 酸盐( s 2 0 3 2 ) 和亚硫酸盐( s 0 3 2 。) ，$ 2 0 3 2 - 又经自身氧还原作用，变成s 0 3 2 和最终代 谢产物磷s 二，s 2 被排出体外，完成了整个分解代谢过程【3 7 4 1 1 。 1 2 3 影响硫酸盐还原菌生长的因素 s r b 还原硫酸盐的作用主要受以下几个因素的影响： pma 小 铲 s s 皆；i如；i吵；驴 内蒙古师范大学硕士学位论文 ( 1 ) 温度 s r b 的硫酸盐还原作用主要受温度的影响。根据s r b 的最适温度将其分为 中温菌和嗜热菌两类。已知的大多数s r b 最适温度在3 0 左右，属中温性菌。 在2 8 - - - , 3 8 。c 时s r b 生长最好，高于4 5 。c 时难以生存【4 2 】。m a r e e 和s t r y d o m 认为 s r b 的最佳生长温度是3 0 。5 ，当温度高于3 8 时，会抑制s r b 生长。当温度 高于5 0 。c 时可在几分钟内杀死中温斟4 3 1 。s t r v j o 也认为还原硫酸盐的最适温度为 3 1 c ，最高温度不能大于5 0 c t 4 4 1 。有研究表明，虽然s r b 的纯培养最佳生长温 度是3 0 。c 左右，但一般在3 5 时，其硫酸盐还原速率最大。这是因为含硫酸盐 废水体系非常复杂，由各种菌混合共生形成。环境的温度不是唯一影响s r b 的 硫酸盐还原速率的因素，还要受其竞争的影响。所以硫酸盐还原速率最大的温度 一般为3 5 。 高温s r b 的生长温度在5 4 - , - , 7 0 。c 间，有些嗜热s r b 的最适温度为5 6 。 r i n t a l a 分离得到最适温度是5 5 c 和7 0 。c 的两种菌。当温度小于4 0 c 时，这两种 s r b 菌的生长受到抑制【2 l 】。 ( 2 ) p h p h 是影响s r b 活力的主要因素之一。早期的研究者认为s r b 生长的p h 范 围在中性左右，p h 6 0 时s r b 一般无法生长【4 3 4 卯。当p h 值在6 。o 8 0 间时硫 酸盐还原效果比较好，而p h 值为6 6 时硫酸盐还原率最大。z e b e l l 和p f e n n i g 等 人认为，s r b 更适于在p h 为7 o 7 8 的弱碱性条件下生长。s r b 能承受的p h 范围在5 5 - 9 0 之间【4 5 】。后来有研究报道，有些s r b 在p h 4 0 的强酸环境下也 能生长，而能承受的最大p h 值为p h 9 0 t 2 0 1 。 ( 3 ) 硫化物 硫酸盐还原形成h 2 s 和硫化物。许多细菌的生长都受h 2 s 和s 厶，特别是h z s 的抑制作用。r e n z e 和m a r e e 研究发现当p h 7 0 时，h 2 s 和h s 的相对比例为 1 ：1 ( 2 5 。c 时h 2 s 的p k a = 7 o ) ，s r b 可适应的总硫化物水平为9 0 0 m g s l ，此时游 离h 2 s 对s r b 的毒性水平为4 5 0 m g s l 【4 4 1 。早期的研究已表明，当h 2 s 的浓度 在4 0 - 5 0 m g l 时，s r b 的生长完全受到抑制。h 2 s 对s r b 的抑制不是由不可利 用的离子所引起的，由此硫酸盐还原过程中产生的h 2 s 对s r b 的毒性作用是可 逆的、直接的。虽然硫化氢从受抑制的菌种上脱落后能恢复其活性，但h 2 s 的浓 度大于4 0 - - 一5 0 m g l 时，3 “h 后s r b 菌种不可逆地丧失其活性。这种急剧的毒 性作用大于高浓度的游离h z s 引起的可逆的抑制作用。所以s r b 对h 2 s 的毒性 6 1 引言 影响相当敏感【1 9 加4 7 1 。 r e n z e 和a l m e l d a 等提出了h 2 s 对s r b 抑制作用的数学模式【4 8 1 。s r b 的生长 曲线通常是线性，而不是指数形式。经非竞争性抑制作用模式得出h 2 s 的抑制浓 度 h 2 s 】蝴x 为5 4 7 m g l ，与其他研究者们所得到的结果基本吻合。他们认为h 2 s 对s r b 的抑制作用是由生长系统作用受到h 2 s 直接毒性作用所引起，或是由于 f e 2 + 变为难溶的f e s 时所产生的间接毒性作用。因此，控制游离的h 2 s ，防止硫 化物的毒性抑制硫酸盐还原过程尤为重要。p h 值为碱性时，大部分硫化物以h s 、 s 2 。游离形式存在，对生物活性的影响不大；因此增加反应器中的p h 值是目前采 取的控制h 2 s 浓度的最主要措施【4 8 ，4 9 】。降低消化液中溶解态s 2 。的浓度，可通过 加入重金属形成金属硫化物沉淀而实现。f e 、c 。、n i 、c u 、z n 等微量元素也可 以与s 2 形成硫化物沉淀。在p h 值低时从反应器中吹脱去除h 2 s 气体。m a r e e 和s t r y d o m 认为采用回流可以在上向流填充床反应器中的硫化物去除掉，这可能 是生物膜层和水流层间的扩散率因为回流而增加使p h 梯度尽可能降低，高度集 中的硫化氢浓度可更快地扩散的缘故。目前，许多研究者采用惰性气体，尤其是 n 2 ，以逆流通过反应器吹脱h 2 s 气体。如g e r h a r d 在实验中使用3 - 3 0 l h 的n 2 吹脱h 2 s 气体；m a r e e 、h u l s e 等人在实验中使用6 l h 速率的n 2 连续通入介质来 。吹脱h 2 s 气体；m a r e e 和h i n 在密闭系统中以n 2 和c 0 2 气体吹脱h 2 s t 5 0 1 。 ( 4 ) 氧气 s r b 属于严格厌氧菌，氧气是s r b 最有效的抑制因子。任何s r b 均不能以 0 2 作为电子受体生长，0 2 总是抑制s r b 生长，s r b 生长的氧化还原电位( e h ) 必 须低于1 0 0 m y l 3 1 , 3 3 , 3 7 , 4 3 , 5 1 】。 ， 1 2 4 硫酸盐还原菌的应用 硫酸盐还原菌( s r b ) 在硫的循环体系中具有重要的地位和作用t 2 1 , 5 2 ，主要应 用于以下几个方面。 ( 1 ) 烟气生物脱硫 烟气中的s 0 2 通过水膜除尘器或吸收塔溶解于水并转化为亚硫酸盐、硫酸 盐；在厌氧环境及有外加碳源的条件下，硫酸盐还原菌( s r b ) 将亚硫酸盐、硫酸 盐还原成硫化物；然后在好氧条件下通过好氧微生物( 无色硫杆菌) 的作用将硫化 物转化为单质硫，再经过浓缩、分离，从而将硫元素从系统中去除【5 3 】。近年来， 烟气生物脱硫技术已经成为工业烟气脱硫的重要方法。 ( 2 ) 处理硫酸盐废水 7 内蒙古师范大学硕士学位论文 处理硫酸盐废水时，采用物理、化学方法，因出水电解质浓度较高，只能排 放；使用电渗析、反渗透或离子交换等技术，因预处理要求严格，管理和维护技 术要求高，而运行费用大；采用微生物法处理硫酸盐废水，即利用自然界广泛存 在的硫酸盐还原菌( s r b ) 的作用将硫酸盐转化为硫化物而除去。微生物法处理硫 酸盐废水可实现工艺优良、处理效果好、达到出水水质的要求，并实现了废水的 资源化利用2 0 , 5 4 , 5 5 而成为处理硫酸盐废水最主要的方法。 ( 3 ) 处理工业重金属废水 重金属离子与有机物不同，在环境中不能被生物分解，因而一旦进入环境后 就会在环境中不断地积累，造成环境的长期污染。目前对重金属废水的处理方法 主要有沉淀法( 形成氢氧化物、碳酸盐、硫化物等) 、离子交换法、电渗析和反渗 透等方法，这些处理方法成本都较高。硫酸盐还原菌( s r b ) 法处理工业重金属废 水的成本低，处理效率高又可以回收贵重金属等多项优点，而受到工业上的青睐。 其原理是s r b 把硫酸盐还原成硫化氢后重金属与硫化氢反应，生成溶解度非常 低的金属硫化物沉淀，从而使溶解态的重金属离子被除去【5 6 1 。 ( 4 ) 处理含硫酸盐的酸性矿山废水 含硫酸盐的酸性矿山废水的污染是全球性环境问题之一，目前研究高浓度硫 酸盐废水的处理成为一个热点。硫酸盐废水涉及面广，利用s r b 处理酸性矿山 废水具有费用低、适用性强、无二次污染、可回收短缺原料单质硫等优点，成为 最具潜力的处理硫酸盐酸性矿山废水的处理方法【5 n 。 ( 5 ) 微生物炼油 将硫酸盐还原菌加入到油井中，可以提高油产量。在石油的二次回收过程中， 脱硫弧菌产生的粘液是一种胞外多糖，起着表面活性剂的作用，有助于从石油砂 层中提取石油【5 s ,