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植物源草酸氧化酶筛选、性质及初步纯化 摘要 草酸氧化酶( o x a l a t eo x i d a s e ，o x o ，e c1 2 3 4 ) 能够专一性地催化 草酸降解为h 2 0 2 和c 0 2 ，在草酸积累相关疾病的诊断、体内草酸的清除 等方面具有很大的应用潜力。为扩大o x o 酶源及研究酶的性质以探讨酶 的应用，本试验以4 5 科8 8 种植物叶片为材料，对材料在两个不同时期 的o x o 活性进行比较，发现o x o 在不同科属的植物中广泛存在，不同 植物间其活性表达存在着较大的差异；在同种植物中，不同季节和不同 的生长发育时期o x o 的活性表达也有明显的差异性。 对其中1 0 种植物的o x o 性质进行研究发现，红丝线中o x o 的最适 温度为5 5 c ，最适p n 为3 0 ，在3 0 6 0 。c 、p h2 0 - - 4 0 范围内活性相对 稳定；南板蓝中o x o 的最适温度为5 0 ，最适p h 为3 5 ，在3 0 6 0 、 p h2 0 - 2 5 范围内活性相对稳定；紫金牛中o x o 的最适温度为4 5 。c ，最 适p h 为3 0 ，在4 5 - 6 0 。c 、p h2 0 - 一2 5 范围内活性相对稳定；大叶落地生 根中o x o 的最适温度为4 5 。c ，最适p h 为3 5 ，在3 0 - 一4 5 。c 、p h2 0 - 2 5 范围内活性相对稳定；柳叶白前中o x o 的最适温度为5 0 。c ，最适p h 为 3 5 ，在4 0 - - 6 5 、p h2 0 - 2 5 范围内活性相对稳定；草珊瑚中o x o 的最 适温度为4 5 。c ，最适p h 为3 0 ，在3 0 - 。8 0 。c 、p h2 0 - 2 5 范围内活性相 对稳定；白鹤灵芝中o x o 的最适温度为3 5 。c ，最适p h 为3 0 ，在3 0 5 5 。c 、 p h2 5 - 3 0 范围内活性相对稳定；甘草中o x o 的最适温度为3 5 c ，最适 p h 为3 0 ，在3 0 - - 6 5 c 、p h2 0 - - 4 0 范围内活性相对稳定；白花败酱中 o x o 的最适温度为3 5 。c ，最适p h 为4 0 ，在4 5 6 0 。c 、p h3 5 4 5 范围 i 内活性相对稳定；松果菊中o x o 的最适温度为4 0 。c ，最适p h 为3 0 ， 在3 0 8 0 c 、p h2 0 - 3 0 范围内活性相对稳定。各种材料中o x o 经8 0 保温处理1 0 m i n 后，均能保持各自最高活性的2 7 以上。除草珊瑚外的 九种材料中o x o 的活性均没有受到10 m m o l l 的c l 。的明显抑制。除南板 蓝、柳叶白前、草珊瑚和甘草外，紫金牛、大叶落地生根、红丝线、白 鹤灵芝、白花败酱和松果菊中的o x o 活性不因胃蛋白酶的作用而受到抑 制。紫金牛、草珊瑚和白鹤灵芝中o x o 的活性因受到s d s 的作用而发 生显著的降低，红丝线、南板蓝、大叶落地生根、柳叶白前、甘草、白 花败酱和松果菊中o x o 的活性不受s d s 的影响。 o x o 初步纯化的结果表明：通过简单的硫酸铵盐析和热处理可以将 红丝线和草珊瑚中o x o 分别纯化2 2 9 和5 5 9 倍，但s e p h a c r y ls - 2 0 0h i g h r e s o l u t i o n 层析柱和d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换与凝胶柱对红丝 线中o x o 纯化没有明显效果；d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换与凝 胶柱对草珊瑚中o x o 纯化没有明显效果；以松果菊为材料，经热处理、 硫酸铵盐析和d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 柱层析三步纯化得到纯化倍数 为1 2 3 2 、最终活性为0 7 6 4 u m gp r o t e i n 的o x o 。 关键词：草酸氧化酶筛选性质纯化 s c r e e n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o na n dp r e l i m i n a r yp u r i f i c a t i o no fo x a l a t e o x i d a s ef r o mp l a n t s w a n gy o n g f e n g ( c o l l e g eo f a g r i c u l t u r e ，g u a n g x iu n i v e r s i t y , n a n n i n g5 3 0 0 0 4 ，c h i n a ) a b s t r a c t o x a l a t eo x i d a s e ( o x o ，e c1 2 3 4 ) ，w h i c hc a t a l y z i n gt h ed e c o m p o s i t i o n o fo x a l a t et oh y d r o g e np e r o x i d ea n dc a r b o nd i o x i d e ，i sp o t e n t a i lt oq u a n t i f y a n ds c a v e n g eo x a l a t ei na n i m a lb o d yt h u st oa m e l i o r a t et h er e l a t e dd i s e a s e s w i t ht h ea i mt oe n l a r g et h er e s o u r c eo fo x o ，a n dt os t u d yt h ec h a r a c t e r i s t i c s o fo x oa sr e l a t e dt om e d i c a lu s a g e ，8 8p l a n ts p e c i e sf r o m4 5f a m i l i e sw e r e u s e da sr a wm a t e r i a lt os c r e e no x a l a t eo x i d a s e ( o x o ) t h er e s u l ts h o w e dt h a t o x ow a sw i d e l ye x i s t e di np l a n t s ，b u tt h e i ra c t i v i t i e sd if f e r e da m o n gp l a n t s p e c i e s ，a n dv a r i e di nd i f f e r e n ts e a s o n so ra td i f f e r e n tg r o w t hs t a g e se v e ni n s a m es p e c i e s t e np l a n ts p e c i e sw e r ec h o s e na sc a n d i d a t e st os t u d yt h e i rc h a r a c t e r i s t i c s t h eo x of r o ml y c i a n t h e sb i f l o r a ( l o u r ) b i t ts h o w e do p t i m a lt e m p e r a t u r ea t 5 5 。ca n dp ha t3 0 ，a n dw a ss t a b l ea tt e m p e r a t u r er a n g e3 0 - 6 0 。ca n dp h r a n g e2 o 4 o ；t h eo x of r o mb a p h i c a n t h u sc u s i a ( n e e s ) b r e m e ks h o w e d o p t i m a lt e m p e r a t u r ea t5 0 。ca n dp ha t3 5 ，a n dw a ss t a b l ea tt e m p e r a t u r e r a n g e3 0 - 6 0 。ca n dp hr a n g e2 0 - 一2 5 ；t h eo x of r o ma r d i s i aj a p o n i c a ( t h u n b ) b l u n es h o w e do p t i m a lt e m p e r a t u r ea t4 5 * ca n dp ha t3 0 ，a n dw a s s t a b l ea tt e m p e r a t u r er a n g e4 5 - - 6 0 ca n dp hr a n g e2 0 - - 2 5 ；t h eo x of r o m k a k a n c h o ed i a g r e m o n t i a n ah a m e te tp e r r i ls h o w e do p t i m a lt e m p e r a t u r ea t 4 5 ca n dp ha t3 5 ，a n dw a ss t a b l ea tt e m p e r a t u r er a n g e3 0 一4 5 。ca n dp h r a n g e2 o 2 5 ；t h eo x of r o mc y n a n c h u ms t a u n t o n h ( d e c n e ) s c h l t r e xl e v i s h o w e do p t i m a lt e m p e r a t u r ea t5 0 ca n dp ha t3 5 ，a n dw a ss t a b l ea t t e m p e r a t u r er a n g e4 0 6 5 ca n dp hr a n g e2 0 - - 2 5 ；t h eo x o f r o ms a r c a n d r a g l a b r a ( t h u n b ) n a k a is h o w e do p t i m a lt e m p e r a t u r ea t4 5 。c a n dp ha t3 0 ， a n dw a ss t a b l ea tt e m p e r a t u r er a n g e3 0 - 8 0 * ca n dp hr a n g e2 0 - - 2 5 ；t h e o x of r o mr h i n a c a n t h u sn a s u t u s ( l i m a ) k u r zs h o w e d o p t i m a lt e m p e r a t u r ea t 3 5 * ca n dp ha t3 0 ，a n dw a ss t a b l ea tt e m p e r a t u r er a n g e3 0 - - 5 5 ca n dp h r a n g e2 5 - 3 o ；t h eo x o f r o mg l y c y r r i z au r a l e n s i sf i s c h g g l a b r als h o w e d o p t i m a lt e m p e r a t u r ea t 35 ca n dp ha t3 0 ，a n dw a ss t a b l ea tt e m p e r a t u r e r a n g e 3 0 6 5 。ca n dp hr a n g e2 o 4 o ；t h eo x of r o mp a t r i n i av i l l o s a ( t h u n b ) j u s ss h o w e do p t i m a lt e m p e r a t u r ea t3 5 ca n dp ha t4 0 ，a n dw a s s t a b l ea tt e m p e r a t u r er a n g e4 5 - 6 0 。ca n dp hr a n g e3 5 - 4 5 ；t h eo x of r o m e c h i n a c e ap u r p u r e am o e n c hs h o w e do p t i m a lt e m p e r a t u r ea t4 0 * ca n dp ha t 3 0 ，a n dw a ss t a b l ea tt e m p e r a t u r er a n g e3 0 8 0 。ca n dp hr a n g e2 0 - - 3 0 t h e o x o sa l lr e t a i n e dm o r et h a n2 7 o ft h e i rm a x i m a la c t i v i t i e sw h e nh e a t e da t 8 0 f o r10m i n t h eo x o sw e r en o ti n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l yb yc 1 。 ( 1o m m o l l ) e x c e p tt h a tf r o ms a r c a n d r ag l a b r a ( t h u n b ) n a k a i ，a n dn o t h y d r o l y s i s e db yp e p s i ne x c e p t t h o s ef r o mb a p h i c a n t h u sc u s i a ( n e e s ) b r e m e k ，c y n a n c h u ms t a u n t o n h ( d e c n e ) s c h l t r e xl e v i ，s a r c a n d r ag l a b r a i v ( t h u n b ) n a k a ia n dg l y c y r i z au r a l e n s i sf i s c h g l a b r al t h eo x o sf r o m a r d i s i aj a p o n i c a ( t h u n b ) b l u n e ，r h i n a c a n t h u sn a s u t u sl i n na n ds a r c a n d r a g l a b r a ( t h u n b ) n a k a iw e r ei n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l yb ys d s ，w h i l et h o s ef r o m l y c i a n t h e sb i f l o r a ( l o u r ) b i t t ，b a p h i c a n t h u sc u s i a ( n e e s ) b r e m e k , k a k a n c h o ed i a g r e m o n t i a n ah a m e te tp e r r i l ，c y n a n c h u ms t a u n t o n i i ( d e c n e ) s c h l t r e xl e v i ，e c h i n a c e ap u r p u r e am o e n c h ，p a t r i n i av i l l o s a ( t h u n b ) j u s s a n dg l y c y r i z au r a l e n s 括f i s c h g l a b r alw e r en o ta f f e c t e db ys d s t h ep r e l i m i n a r yp u r i f i c a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h ea c t i v i t i e so fo x of r o m l y c i a n t h e sb i f l o r a ( l o u t ) b i t ta n ds a r c a n d r ag l a b r a ( t h u n b ) n a k a iw e r e i n c r e a s e d b y 2 2 9a n d5 5 9 f o l d ，r e s p e c t i v e l y , b ya m m o n i u m s u l f a t e f r a c t i o n a t i o na n dt h e r m a lt r e a t m e n t s e p h a c r y ls - 2 0 0 h i g h r e s o l u t i o n c h r o m a t o g r a p h ya n dd e a e s e p h a r o s ef a s t f l o wc h r o m a t o g r a p h yh a dn o e f f e c to np u r i f i c a t i o no ft h eo x of r o ml y c i a n t h e sb i f l o r a ( l o u t ) b i t t ，a n d d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wc h r o m a t o g r a p h yh a d n oe f f e c to np u r i f i c a t i o no f t h eo x of r o ms a r c a n d r ag l a b r a ( t h u n b ) n a k a i t h r o u g ha m m o n i u ms u l f a t e f r a c t i o n a t i o n ，t h e r m a l t r e a t m e n ta n d d e a e s e p h a r o s e f a s tf l o w c h r o m a t o g r a p h y , o x of r o me c h i n a c e ap u r p u r e am o e n c hw a sp u r i f i e dt o 1 2 3 2f o l dt oaf i n a la c t i v i t yo f0 7 6 4u m gp r o t e i n k e y w o r d s ：o x a l a t eo x i d a s es c r e e n i n gc h a r a c t e r i s t i cp u r i f i c a t i o n v 承诺书 广西大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下完成的，研究工作所取 得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已 经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究 工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：互辱砺 日期： 2 。邵年参月衫日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不 以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论 文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索 与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢 利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。 口不保密。 学位论文全文电子版提交后： 口同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 作者签名 导师签名： 日期：渺翳硐矽留 广西大掌硕士砻啊盘论文植物源蕈酸氧化硝 筛选、性质及初步纯化 1 前言 o x o 是一种热稳定性较好、在酸性条件下作用的糖蛋白酶，能够催化草酸和0 2 发生反应生成h 2 0 2 和c 0 2 ( s c h w e i z e r 等，1 9 9 9 ) 。由于o x o 能够用于测试尿液和血 浆中的草酸水平并可以用来治疗高草酸尿而具有较高的医学应用价值( h o n o w 等， 1 9 9 7 ) ，另外由于o x o 能够降解草酸产生h 2 0 2 同时引起c a 2 + 的释放而对植物的发育、 胁迫反应和防卫病原菌的入侵有着重要的作用。 1 1o x o 的分布、命名与种类 o x o 最早被z a l e s l 【i 和r e i n h a r d 在对面粉的研究报告中提及，随后在苔藓( d a t t a 等，1 9 5 5 ) 、菌类( t m c h a n t 等，1 9 9 6 ；k o y 锄a ，1 9 8 8 ；a g u i l a r 等，1 9 9 9 ：v m s e y 等，1 9 6 1 ) 和大麦( c l l i 抽o g a ，1 9 6 3 ；s u p r a 等，1 9 7 9 ；k o t s i r a 等，1 9 9 7 ) 、小麦 ( g r z e l c z a k 和l a n e ，1 9 8 4 ：刘娥娥和郭振飞，2 0 0 4 a ，2 0 0 4 b ) 、玉米( v u l e t i e 和 s u k a l o v i c ，2 0 0 0 ) 、刺苋( p u n d k 和c h a u l l m ，1 9 9 6 ：p u i l d i r 等，1 9 9 9 ) 和高粱( p u l l d i r ， 1 9 9 1 ；p u n d i r 和s a 锣a p a l ，1 9 9 8 ) 及其它多种植物( b e q 等，1 9 7 2 ；o b s a n z k y 和 砌c h a r d s o n ，1 9 8 3 ；s m v 邪t a _ v a 和硒s h n a n ，1 9 6 2 ：n a g a l l i s a 和h a r o f i ，1 9 “；r a g h a v 锄 和d e s v 嬲a g a y 锄，1 9 8 5 ) 的组织都有发现。但相比之下对小麦和大麦的o x o 研究比 较多，对苔藓、菌类和其它植物中的o x o 研究较少。 小麦g e 衄i n 是l a l l e 等在1 9 8 0 年在研究萌芽专性蛋白质过程中新发现的一种蛋 白( t h o m s o n 和l a n e ，1 9 8 0 ) 。g e 肌i n 及其m r n a 在未成熟的麦胚或未萌发的成熟 麦胚中都不存在。只有在种子完成吸涨作用后的5 1 0 小时才开始有g e n n i nm r n a 和 蛋白的出现，之后特异性地转录出大量的g e m i nm r n a ，然后翻译出大量的g e 肋i 1 1 。 当初由g e 肌i ne d n a 推断出来的氨基酸序列不能反映任何己知蛋白质的同源性，也 反映不出这一蛋白质的准确的功能，因此便采用了g e r m 的名字( l a n e ，1 9 9 1 ) 。 到1 9 9 3 年两个独立实验详细地研究了小麦g e 肌i n 同工酶和大麦o x o 的序列同 源性和累积模式图，结果表明小麦萌芽过程中的g e n l l i i l 就是一种o x o ( l a n e 和 d m w e l l ，1 9 9 3 ；d u i l l 弱等，1 9 9 3 ) 。另外试验结果也表明萌发素在大麦和小麦的萌发 植物源草酸氧化酶筛选，性质及初步纯化 过程中都有表达，于是将大麦和小麦中的o x o 称为萌发素类o x o 。虽然已经在多种 物种中发现有o x o 的表达，但是只有大麦、小麦、燕麦、黑麦、水稻、玉米和松树 中的o x o 属于萌发素类o x o ( d u n w e l l 等，2 0 0 0 ；l a n e ，2 0 0 0 ) ，其它物种中的o x o 则被成为非萌发素类o x o 。o b z a n s k y 等( o b z a n s k y 和r i c h a r d s o n ，1 9 8 3 ) 和p u n d i r 等( p u n d i r 和s a t y a p a l ，1 9 9 3 ) 分别发现双子叶植物园林甜菜( b e t av u l g a r i sl i n n ) 茎中的o x o 具有萌发素的稳定性但不能与萌发素抗体反应，高粱( h y b r i dc s h 5 ) 叶片中的o x o 缺乏萌发素的稳定性。 1 2o x o 的结构、活性中心及分子量 o x o 是种非常有研究价值的糖蛋白酶，包括多种在不同植物的不同发育阶段 和病理反应中产生的具有o x o 活性的蛋白质。在对o x o 的活性和结构进行研究时 发现，它们都具有较好的热稳定性和抗s d s 的性质( m o s i n g c r 等，1 9 9 8 ) ，至少有一 端带有多糖基团，它们的多肽部分具有高度的保守性( s w a r t 等，1 9 9 4 ) ，不同之处不 仅在于多糖部分的不同，而且不同来源的o x o 的基本结构也不同。大麦和小麦中的 o x o ( s v e d r u 艺i 6 等，2 0 0 5 ) 是m n 2 + 螯合蛋白失去m n 2 + 就会造成酶活性的丧失；刺苋 ( p u n d i r 和c h a u h a n ，1 9 9 6 ：p u n d i r 等，1 9 9 9 ) 中的o x o 是一种简单的二聚体蛋白； 苔藓和真菌的o x o 是一种黄素蛋白。在利用x 光衍射法对它们进行晶体分析时发现 它们都有1 3 折叠形成的保守的桶状结构而被划分到一个被指定为c u p i n s ( 来自拉丁语 c u p a ，小木桶的意思) 的功能蛋白超家族中( d u n w e l l ，1 9 9 8 ) 。这些c u p i n s 蛋白以两 种形式存在( w o o 等，1 9 9 8 ) ，一种似1 0 0 2 0 0 a a s ) 只有一个单一的结构域( 如：o x o 、 磷酸甘露糖异构酶和聚酮合成酶) ，另一种( c 4 0 0 5 0 0 a a s ) 有两个结构域( 如：草 酸脱羧酶、蔗糖结合蛋白和贮藏蛋白) 。在对小麦萌发素和从大麦中提取到的与它关 系很近的o x o 进行蛋白质序列分析时得到一个长2 0 0a a ( 包含一个指导向细胞壁分 泌的靶序列) 和分子量为2 1 2k d a 的无糖基化的肽段。这两种蛋白都是多聚体，并 且它们的酶活性都只与聚合的蛋白有关，而与形成聚合体的单体无关( l a n o 等， 1 9 9 3 ) 。另外经过胰岛素、胰凝乳蛋白酶和金黄色酿脓葡萄球菌蛋白酶在2 7 m m o l l 的s d s 环境下处理，酶的低聚体能够存留下来，而单体则被消化( m c c u b b i n ，1 9 8 7 ) 。 最初的研究表明大麦的o x o 是由分子量为7 5 k d 的亚单位组成的二聚体 ( m c c u b b i n ，1 9 8 7 ) ，后来曾被报道为四聚体或五聚体( m o s i n g e r 等，1 9 9 8 ) 。在不 2 广西大掌硕士学位论文植物源革酸氧化酶筛选、性质及初步纯化 少文章中曾报道小麦萌发素拥有一个同形五聚体结构，分子量为1 2 5 k d ( l a n e 等， 1 9 9 3 ) 。他们采用的研究方法不同，得到的结果有很大的差异。g a n e 等( g a n e 和 d u n w e l l ，1 9 9 8 ) 根据g e h n i n 与豌豆球蛋白氨基酸序列上的相似性，对g e n n i n 蛋白 单体做了3 d 模型预测( 图1 1 ) 。模型表明，在保守的p 折叠桶结构中有3 个组氨酸残 基，可能构成潜在的o x o 活性位点。 ajl b 图卜1g e r n l i n 蛋白的模型图 f i g 1 1m o d e l i n go ft 1 1 eg e 咖i np r o t e i n 为了清楚的了解o x o 的低聚物结构，w o o 等( w o o 等，2 0 0 0 ，1 9 9 8 ) 利用x 光衍射法对纯化的大麦o x o ( 由s i g m a 公司提供) 晶体进行了结构分析。结果显示： o x o 为寡聚糖蛋白6 聚体，其结构与种子贮存蛋白相似，由两个三聚体形成两个结 构域，每个单体含1 分子m n ( h ) ，金属离子与3 分子h i s 、1 分子g l u 、2 分子h 2 0 相连。每个单体含有1 个n 末端d 折叠和3 个0 【螺旋组成的结构域，活性中心位点 通过2 个g l u 、1 个a s p 的通道与b 折叠相连，中性条件下，阻止草酸接近活性中一f l , 。 其活性中心分子模型如图2 ，证实了g a n e 等的预测。 r e q u e n a 和b o m e m a n ( r e q u e n a 和b o m e m a n ，19 9 9 ) 研究表明大麦o x o 对草酸 的催化机制可能是：草酸先接近活性中心，然后与m n ( h ) 结合进行电子传递，再由催 化基团( 图1 2 ) g l u 9 5 完成催化降解。由于草酸是有机强酸，只有在适合的p h 条件 广西大掌硕士学位论文植物源草酸氧化酶筛选、性质及初步纯化 下当g l u 5 8 、a s p 6 0 和g l u 6 3 等氨基酸残基的基团的质子化程度发生改变的时候，草 酸才能通过由g l u 5 8 、a s p 6 0 和g l u 6 3 等氨基酸残基组成的通道与活性中心接近。大 麦中o x o 的活性与其内部所形成的二硫键有着十分密切的关系( k o t s i r a 等，1 9 9 7 ) ， 可能与二硫键可以维持o x o 的寡聚结构有关。另外有研究结果显示o x o 的六个亚 基在p h 4 8 8 5 之间并不解聚，说明o x o 在高p h 条件下活性丧失不是由亚基解离引 起的构象变化引起的，可能是由于各种与酶活相关的基团和辅基发生变化引起的。 a g u 一9 5 图1 2o x o 活性位点的分子结构模型 f i g 1 - 2m o d e l i n go fa c t i v es i t eo fo x o k o t s i r a 和c l o n i s ( k o t s i m 和c l o n i s ，1 9 9 8 ) 用化学修饰法证明了l y s 为大麦根 o x o 的必需氨基酸。在p h 为9 0 的5 0 m m o l l 的硼酸缓冲液中，用o 0 1 5 1 0 m m o l l 的t n b s 标记l y s ，随t n b s 的浓度增大o x o 相对残存活性降低，相对残存活性也 随修饰反应的时间增加而与l y s 的被修饰度成正比下降，因此推测首先被修饰的l y s 为酶的必需基团。胡一鸿( 2 0 0 6 ) 根据t n b s 对小麦o x o 的抑制动力学和底物对酶 的保护作用两方面的实验证据对小麦中o x o 也作出了相同的推测。另外胡一鸿等也 通过化学修饰的方法证明了a r g 、s e r 、t h r 和t r p 不是小麦中o x o 的必需基团。 通过现有的报道可以发现，用不同的方法研究不同来源的o x o 的分子量所得到 结果也是不一样的。胡一鸿( 2 0 0 6 ) 通过等凝胶过滤法测定小麦o x o 全酶分子量为 4 植物源草酸氧化酶筛选、性质及初步纯化 1 7 2 k d ；p u n d i r 等( 1 9 9 9 ) 将刺苋中o x o 过s e p h a d e xg - 2 0 0 凝胶柱测得其分子量为 1 3 0 k d ，另外通过凝胶过滤法( p u n d i r 和s a t y a p a l ，1 9 9 3 ) 测得高粱h y b r i dc s h - 5 叶 片中o x o 的分子量为1 2 0 2 k d ；k o t s i r a 和c l o n i s 等( 1 9 9 7 ) 用高效液相色谱测定大 麦根o x o 的全酶分子量为1 2 5 k d 。 1 3o x o 的酶学特性 1 3 1o x o 的最适p h 和p h 稳定性 从不同的材料中得到的o x o 的最适p h 值是不同的，小麦萌发的胚中o x o ( 刘 娥娥和郭振飞，2 0 0 4 a ) 的最适p h 为3 5 ，大麦幼苗( s u g u i r a 等，1 9 7 9 ) o x o 的最 适p h 为3 2 ，大麦根的o x o 的最适p h 为3 8 ；玉米根细胞壁( v u l e t i e 和s u k a l o v i e ， 2 0 0 0 ) o x o 的最适p h 为3 2 ，刺苋叶片( p u n d i r 等，1 9 9 9 ) 的o x o 的最适p h 为 3 5 ，甜菜的叶子( b e r r y 等，1 9 7 2 ) 中的o x o 的最适p h 为4 0 ，假单胞杆菌p s e u d o m o n a s s p o x - 5 3 的o x o ( k o y a m a ，1 9 8 8 ) 的最适p h 为4 8 ，苔藓中的o x o ( d a t t a 等，1 9 5 5 ) 最适p h 为4 o ，高粱中o x o 的最适p h 为5 0 ( t h a k u r 等，2 0 0 0 ) 。o x o 均在酸性 条件下达到最适p h 与o x o 的催化活性中心存在着大量的组氨酸的咪唑基团( g a n e 和d u n w e l l ，1 9 9 8 ) 和催化活性中心的基团结构有关。另外这也与o x o 的底物草酸 阴离子的影响有着分不开的关系。 研究p h 对大麦根部o x o 活性的影响时发现，在不同的温度条件下，酶在p h 5 0 时均比p h 3 8 时稳定( k o t s i r a 等，1 9 9 7 ) 。 1 3 2o x o 的最适温度和热稳定性 多数o x o 的最适反应温度都在4 0 左右，p s e u d o m o n a ss p o x 5 3 ( k o y a m a , 1 9 8 8 ) 和九重葛( s h r i v a s t a v a 和k r i s h n a n ，1 9 6 2 ) 叶片中o x o 的最适温度为3 7 c ， 大麦幼苗( s u g u i r a 等，1 9 7 9 ) o x o 的最适温度为3 5 c ，高梁h y b r i dc s h - 5 叶片中 o x o 的最适温度4 0 ( p u n d i t 和s a t y a p a l ，1 9 9 3 ) 。 不同来源的o x o 有着共同的热稳定性，尽管它们之间热稳定性不同，但与其它 酶类相比较，热稳定性还是很强的。刺苋( p u n d i r 等，1 9 9 9 ) 中o x o 在8 0 c 力n 热5 r a i n 仍保留2 7 的活性。高粱叶片中o x o 在8 0 c 下加热3 m i n 仍保留1 0 的活性。假单 植物源草酸氧化酶筛选、性质及初步纯化 胞菌中o x o 在6 5 ( 2 下加热l o m i n 仍保留9 的活性。甜菜茎中的o x o 在6 0 c 下 1 0 m i n 仍保留3 0 1 拘活性，但是在超过6 0 c 后就失去了活性( o b s a n z k y 和r i c h a r d s o n ， 1 9 8 3 ) 。大麦根( k o t s i r a 等，1 9 9 7 ) 中o x o ，在8 0 c 下加热5 m i n 仍保留6 0 的活性。 胡一鸿等( 2 0 0 6 ) 研究发现小麦幼苗中o x o 在8 0 下加热2 0 m i n 仍保留7 4 的活性。 1 3 3o x o 的底物抑制及k m 值 在最适p h 的情况下，不同来源的o x o 受底物抑制的草酸浓度不同。小麦g 和 y g 受0 2 m m o l l 的草酸的抑制( 刘娥娥和郭振飞，2 0 0 4 a ) 。高粱叶中o x o 的活性 在草酸浓度大于0 4 m m o l l 时，表现出底物抑制( p u n d i r 和s a t y a p a l ，1 9 9 3 ) ；担子菌 c e r i p o d o p s i ss u b v e r m i s p o r a 菌丝体提取液中的o x o 在草酸浓度大于2 5 m m o l l 时才 表现出底物抑制( a g u i l a r 等，1 9 9 9 ) ；大麦根o x o 在草酸浓度大于4 m m o l l 时，表 现出底物抑制( k o t s i r a 等，1 9 9 7 ) ，而刺苋中的o x o 在草酸浓度高达8 m m o l l 时仍 未出现底物抑制现象。小麦幼苗中o x o ( 胡一鸿，2 0 0 6 ) 的k m 为。0 2 0 7 2m m o l l ； 小麦幼苗根( 刘娥娥和郭振飞，2 0 0 4 a ) 中g 的k m 为0 0 8 4 m m o l l ，与高粱叶片中 o x o 的k m ( 0 0 7 8m m o l l ) 比较接近( p u n d i r 和s a t y a p a l ，1 9 9 3 ) ，玉米根细胞壁中 o x o 的k m 为2 5 4 m m o l l 或1 3 1m m o l l ( v u l e t i c 和s u k a l o v i c ，2 0 0 0 ) ；担子菌类 c e d p o r i o p s i ss u b v c r m i s p o r a 的菌丝体提取液中o x o 的k m 值为o 1m m o l l 。 1 3 4 一些化合物和金属离子对o x o 活性的影响 至于一些化合物和金属离子对o x o 活性的影响，不同的人在研究不同的材料得 到的结果是不尽相同的。k o t s i r a 和c l o n i s ( 1 9 9 7 ) 研究表明1m m o l l 的n 矿、k - 、 m 矿、m n 2 + 、n 0 3 和s 0 4 2 + 对大麦根o x o 活性没有影响，c l 。仅在1m m o l l 时表现 出轻微的抑制。刘娥娥( 2 0 0 4 ) 的研究表明：o 1m m o l l 的n a + 、k + 、m g + 、m n ? 、 c l 对g 和、i ，g 的活性没有影响，只有n 0 3 和s 0 4 2 有抑制作用，o 1m m o l l 的c u 2 + 、 c 0 2 + 、z n 2 + 、f d + 和砧3 + 皆可抑制g 和、i ，g 的活性，但是在e d t a 存在时，抑制作用 被降低，推测这些阳离子可能是和草酸形成难溶的化合物，降低了底物对o x o 的有 效浓度。k o t s i r a 和c l o n i s ( 1 9 9 7 ) 认为v d + 和f e 3 + 还可作为酶的抑制剂，因为高浓度 的草酸不能完全恢复其对o x o 的抑制作用。c h i t i b o g a 报道说黄素对o x o 的活性有 刺激作用，能提高酶活。而k o t s i r a 和c l o n i s ( 1 9 9 7 ) 报告f a d 和核黄素对大麦o x o 6 植物源草酸氧化酶筛选，性质及初步纯化 的活性没有影响；刘娥娥和郭振飞( 2 0 0 4 a ) 报道f a d 、核黄素和f m n 皆可抑制v g 的活性，而其中的f a d 和f m n 对g 的活性却没有影响，核黄素则可抑制g 的活性。 g o y a l 等( 1 9 9 9 ) 在对刺苋中o x o 进行研究时发现除了p b 2 + 和n i 2 + 外的的金属阳离 子均对o x o 活性没有影响；在浓度为0 0 1 m m o l l 时除了h c 0 3 。对酶活性有轻微影响 外，c l 、f 、n 0 3 。、b r - 和c 0 3 2 - 对酶活性都没有影响；f a d 、核黄素和f m n 皆对酶 活性没有影响。 1 4o x o 的生理功能 1 4 1 草酸对植物的危害 草酸是多种致病茵类入侵植物的毒素，可以引起细胞内酸度增加及水分失调，导 致细胞膜脂质过氧化水平升高，细胞结构受损，细胞膜透性增加。草酸对植物的致病 机理大致如下：1 ) 草酸降低了寄主细胞的p h 值。p h 值的降低有利于多种植物细胞壁 降解酶活性的提高，如多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶( m a r c i a n o 等，1 9 8 3 ) 和半纤维 素酶等。2 ) 草酸抑制了抗性相关的酶和光合作用酶的活性。在p h 5 6 的条件下，草酸 能够抑制多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性；3 ) 草酸具有很强的离子鳌合能力，它 可夺取植物细胞壁果胶钙中的钙离子，形成草酸钙晶体破坏细胞壁，使得多聚半乳糖 醛酸酶更易水解果胶层，加速细胞的降解，另外还可以辅助空气进入木质部导致木质 部阻塞甚至萎蔫；4 ) 草酸对寄主细胞有直接毒