（植物学专业论文）三角褐指藻的收集及从中提取甘油三酯的方法研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 生物柴油是清洁的可再生能源，是优质的石油柴油代用品，但原料供给的不足 和生产成本的高昂始终是制约生物柴油产业发展的重要因素。三角褐指藻是硅藻的 模式种类之一，是一种极有开发潜力的优质经济藻种。目前关于该藻的研究很多， 主要集中在对影响其生长、繁殖、藻体生化组成及多不饱和脂肪酸( p 切随) 积累 的影响因子方面，但有关利用它进行生物柴油的研究还很少。据研究报道，三角褐 指藻在生长至对数期后可自身积累甘油三酯，提取甘油三酯后经甲酯化即可转化为 生物柴油，因此是生物柴油潜在的优势原料之一。然而，如何简单、快速且低成本 的进行大规模收集藻细胞是首要解决的问题，同样对所含甘油三酯的提取也是其中 关键的研究之一，这两方面的工作是其最重要的研究内容，也是研究的难点。 本研究的内容和结果如下： 1 本文对三角褐指藻的生长情况及甘油三酯含量受温度的影响进行了研究，结 果表明2 0 c 培养时细胞生长速度最快，而甘油三酯含量受温度影响变化不明显。 2 在综述目前常用的微藻收集方法的基础上，对三角褐指藻的大规模收集方法 进行探究，找到了一种快速、简单、低廉的方法，即采用絮凝法收集藻细胞。本文 着重研究了硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁、氯化铁和有机高分子阴离子型絮凝剂聚丙烯 酰胺( a g e f l o cw t 6 5 2 ) 等几种絮凝剂对藻细胞的絮凝效率，最终优化了使用氯 化铁和a g e f l o cw t 6 5 2 相结合对其进行高效絮凝采收的方法，为大规模养殖三角 褐指藻的细胞收集工作提供了有益借鉴。 3 在对文献进行综合分析研究及本研究室所能提供的实验条件基础上，采用索 式提取和超声波辅助提取这两种方法提取了三角褐指藻细胞内的甘油三酯。结果表 明超声波辅助提取方法较优，提取效率可达细胞干重的2 7 。 关键词：三角褐指藻；收集；甘油三酯：生物柴油：絮凝 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t b i o d i e s e li sc l e a nr e n e w a b l ee n e r g ya n dg o o ds u b s t i t u t e sf o rp e t r o l e u md i e s e l ，b u t t h er a wm a t e r i a l ss u p p l ya n dc o s tc o n s 仃a i n t sa 陀a l w a y si m p o r t a n tf a c t o r si nt h e d e v e l o p m e n to fb i o d i e s e li n d u s t r y a so n em o d e lo fd i a t o ma n do n et y p eo fe x c e l l e n t e c o n o m ym i c r o a l g a e ，p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u mh a sg r e a te x p l o i t a t i o na n du t i l i z i n g p o t e n t i a l t h e r ea r eal o to fr e s e a r c h e sa b o mt h ef a c t o r sw h i c ha f f e c tt h ec e l lg r o w t h , p r o p a g a t i o n , t h eb i o c h e m i c a lc o m p o s i t i o n , p u f aa c c u m u l a t i o na n ds oo n b u tt h e s t u d i e st h a tu s i i 培p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u mt op r o d u c eb i o d i e s e li sf e w i tc a l l a c c u m u l a t et r i g l y c e r i d e si nt h el o g a r i t h m i cp h a s eg r o w t h , s ot h a ti tc a np r o v i d er a w m a t e r i a l sf o rb i o d i e s e ls y n t h e s i s h o wt of i n do n em e t h o do fc o l l e c t i n ga l g a lc e l l sw h i c h i ss i m p l e ，f a s ta n dl o w - c o s ta n d c a nb eu s e di nl a r g e s c a l ei st h em o s ti m p o r t a n tp r o b l e m , a n dt h ee x t r a c t i o no ft h et r i g l y c e r i d ec o n t a i n e di sa l s ot h ek e yo ft h es t u d y t h e s et w o a s p e c t sa r ev e r yi m p o r t a n tp a r to ft h es t u d ya n da r ea l s ov e r yd i f f i c u l ts t u d i e s 皿ec o n t e n ta n dr e s u l to ft h ep a p e ra r ea sf o l l o w i nt h i st h e s i s ，p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u mg r o w t ha n dt r i g l y c e r i d ec o n t e n ta f f e c t e d b yt e m p e r a t u r ew e r es t u d i e dt od e t e r m i n et h eo p t i m a lc u l t u r et e m p e r a t u r e t h er e s u l t s h o w st h a t2 0 ci st h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e ，w h i l et h ec o n t e n to ft r i g l y c e r i d ei sn o t a f f e c t e d o nt h eb a s i so fs u m m a r i z i n gt h em e t h o do fh a r v e s t i n gm i c r o a l g a ec u r r e n t c o m m o n l yu s e d , w ee x p l o r e d t h em e t h o dt oh a r v e s tp h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m c o s m i c a l l y ，a n df o u n daf a s t , e a s y ，c h e a pm e t h o d , w h i c ha d o p t st h em e t h o do f f l o c c u l a t i n ga l g a lc e l l s w ef o c u s e do ns e v e r a lf l o c c u l a n t so nt h ef l o c c u l a t i o ne f f i c i e n c y o fa l g a lc e l l s ，a n du l t i m a t e l yo p t i m i z e dt h em e t h o do fu s i n go ff e r r i cc h l o r i d ea n do r g a n i c p o l y m e ra n i o n i cp o l y a c r y l a m i d ef l o e c u l a n t sa g e f l o cw t 6 5 2c o m b i n e d i ti ss u i t a b l e f o rl a r g e - s c a l ea p p l i c a t i o n s ，s oi tp r o v i d e sat h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rp h a e o d a c t y l u m t r i c o r n u t u mh a r v e s t i n go fl a r g e - s c a l ef a r m i n g f u r t h e r m o r e ，w ec o m b i n e dt h ec o m p r e h e n s i v ea n a l y s i so ft h el i t e r a t u r er e s e a r c ha n d t h er e s e a r c hc o n d i t i o n so ft h el a b o r a t o r yc a l lp r o v i d e ，w eu s e ds o x h l e xe x t r a c t i o na n d u l t r a s o n i c - a s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o d st oe x t r a c tt r i g l y c e r i d ec o n t a i n e di np h a e o d a c t y l u m t r i c o r n u t u mc e l l s 1 1 1 er e s u l t ss h o w st h a tt h em e t h o do fu l t r a s o u n d a s s i s t e de x t r a c t i o ni s b e t t e ra n dt h ee x t r a c t i o ne f f i c i e n c yc a na c h i e v e2 7 o fc e l ld r yw e i g h t k e yw o r d s ：p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ：h a r v e s t ；t f i g l y c e f i d e ；b i o d i e s e l ； f l o e e u l a t i o n 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：传春步缸 日期：徊7 年月厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作者签名： 话弃括 日期：例9 年月日 导师签名：删( 扒) 喊吵莎月二日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。园童迨塞握变后进厦! 堕兰生；旦= 生；旦三玺蕉查! 作者签名： 储存物 日期：筇。罗年月日 导师签名：彦爻却( 川) 魄7 年歹 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 生物柴油概述 1 文献综述 生物柴油( b i o d i e s e l ) ，是指含油植物或动物油脂与低分子量醇类( 主要包括甲醇 及乙醇) 进行酯交换反应制成的甲酯或乙酯，是一种洁净的生物燃料，其合成反应 方程式如图1 1 ( c h i s t i 。2 0 0 7 ) 所示。主要以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和 黄连木等油料林木果实、工程微藻等油料水生植物以及动物油脂、废餐饮油等 为原料制成，是优质的石油柴油代用品。按化学成份分析，生物柴油一般由1 4 至1 8 个碳原子的高级脂肪酸单酯组成，与石化柴油非常相似( a n j a n as r i v a s t a v ae ta l ， 2 0 0 0 ) ，它具有可再生、易于生物降解、排放的污染物低、基本无温室效应等优点， 属环境友好型绿色燃料，具有深远的经济效益与社会效益。目前在全球大范围得到 了迅速发展，欧盟、美国、日本、巴西、包括印度都在积极推动这项产业的发展( 姜 楠，张正，2 0 0 5 ) 。在我国，大力发展生物柴油对经济可持续发展、推进能源替代、 减轻环境压力、控制城市大气污染等也具有重要的战略意义。 c h 2 i l i 伽 i l i c h 2 o o 0 r t r 2 r 3 o 0 c h 3 o c - & o 0 + 3 c h 3 j o h _ + c h 3 o c r 2 ( c a 协l y s t ) t r ig ：删d e m e t h a n o l ( p a r e n to i l ) ( a l c o h 0 1 ) o n c h 2 - 0 h i + c h 0 h f c h 2 o h c h 3 o c l t 3 m i x t u r eo f f a t t ye s t e l 晦 g l y c e r o l ( b i o d i e s e l ) 图1 1 甘油三酯经转酯反应合成生物柴油示意图( c h i s t i ，2 0 0 7 ) f i g 1 - lt r i g l y c e r i d es y n t h e s i z ei n t ob i o d i e s e lb yt r a n s e s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o n o c o i c o c 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 1 生物柴油的特点 与石化柴油相比，生物柴油具有以下无法比拟的优良性能( c v e n g r o s ， c v e n g r o u s o v a , 1 9 9 4 ；p a l l i g a r n a ie ta l ，2 0 0 8 ) ：良好的生物降解性；生物柴油直链碳 一端有两个氧原子的简单化学结构，极易为微生物分解利用，而普通石化柴油可能 含有双键、多环、支链等复杂结构，除较为特殊的微生物外，被普通微生物分解较 困难。一般生物柴油2 8 天降解率可达7 7 8 9 ，而普通柴油只有1 8 。可再生性 能；可通过农业和生物科学家的努力，利用可再生的植物资源生产生物柴油，可供 应量不会枯竭，大大降低对石油的依赖。环保特性；主要表现在生物柴油中硫含 量低，二氧化硫和硫化物的排放减少，芳香族烷烃的含量也低，废气对人体损害低 于柴油。而且与普通柴油相比，生物柴油的十六烷值较高，燃烧充分，可降低9 0 的未完全燃烧碳氢化合物和7 5 9 0 的多元芳香环烃的排放。另外，生物柴油生产 过程中使用的植物还可将二氧化碳转化为有机物固化在土壤中，从而减少大气中的 温室气体浓度。较好的发动机低温启动性能：无添加剂时冷凝点达2 0 。较好 的润滑性能；可降低喷油泵、发动机缸和连杆的磨损率，延长使用寿命。较好的 安全性能；闪点高，不属于危险品。简便性；无须改装柴油机，可直接添加使用， 同时无需另添设加油设备、储存设备及人员的特殊技术训练。生物柴油以一定比 例与矿物柴油调和使用，可以降低油耗、提高动力性，并降低尾气污染。 总之，生物柴油无毒性，系可再生能源，而且生化分解性良好，健康环保性能 良好，也无须改动柴油机，可直接添加使用，而且用途极为广泛，除了供公交车、 卡车等柴油机的替代燃料外，又可供为海洋运输、水域动力设备、地底矿业设备、 燃油发电厂等非道路用柴油机之替代燃料。 1 1 2 生物柴油的国内外生产现状 1 1 2 1 国外现状 欧盟是全世界生物柴油发展最快的地区，2 0 0 5 年生产生物柴油3 1 8 万吨，2 0 0 6 年产量大幅增长至4 0 0 万吨。欧盟各国通过采取原料种植补贴、生物柴油差别税收 等刺激政策，使生物柴油在价格上能与石化柴油相竞争，还要求各国降低生物柴油 税率，并且将从2 0 0 9 年开始强制性将生物燃料调配入车用燃料中，调和量最少为l ，欧共体还计划在2 0 2 0 年使生物柴油的市场占有率达到1 2 ( 秦洪万，2 0 0 1 ) 。 除此之外，欧盟政府还通过与农民签定合同，种植生物柴油专用油菜等措施来保障 生物柴油原料的供应，这些措施的实施有力地促进了生物柴油的商业进程化。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 美国政策支持生物柴油在美国的商业应用始于2 0 世纪9 0 年代初，是最早研究 生物柴油的国家( 谭天伟等，2 0 0 2 ) ，但直到最近两年才逐渐形成规模，并已成为 该国发展最快的替代燃油。为了便于推广使用，美国材料实验协会( a s 刑) 相继 在1 9 9 6 年和2 0 0 0 年发布标准，完善生物柴油的产业化条件，并且美国能源部及许 多州政府立法加速、强化推广使用生物柴油，同时实行积极鼓励的方式，在生物柴 油的价格上给于一定的补贴，规定在标准柴油燃料中每混入1 的生物柴油，燃油 消费税就可降低1 ，混合量最高可达总量的2 0 。 日本在1 9 9 5 年开始研究生物柴油，在1 9 9 9 年建立了以煎炸油为原料生产生物柴 油的工业示范装置，2 0 0 2 年，日本的生物柴油生产量约为4 0 万吨( 朱建良，2 0 0 4 ) 。 泰国发展生物柴油的计划已于2 0 0 1 年7 月发布，泰国石油公司承诺每年收购7 万吨棕 榈油和2 万吨椰子油用于生产生物柴油，并实施税收减免，第一套生物柴油装置已 经投入运行。加拿大b i o x 公司投资2 4 0 0 万美元修建5 万吨年生物柴油厂，2 0 0 5 年投 产。巴西已建成大型生物柴油生产装置，计划2 0 0 5 年使生物柴油在石油柴油中的掺 比达到5 ，n 2 0 2 0 年达到2 0 ( 杨尧，2 0 0 7 ) 。韩国引进了德国生产技术，以进口 菜籽油为原料于2 0 0 2 年建成1 0 万吨年的生物柴油生产装置，目前己扩建为2 0 万吨 年。 1 1 2 2 国内现状 我国对生物柴油的系统研究始于中国科学院的“八五 重点科研项目“燃料 油植物的研究与应用技术 ，已成功研制出利用菜籽油、光皮树油、麻疯树油、大 豆油、米糠油脚料、工业猪油、牛油等作为原料，与甲醇通过酯交换反应生产的生 物柴油，它们不仅可以作为代用燃料直接使用，而且还可以作为矿物柴油的添加剂 使用( 张红云等，2 0 0 7 ) 。近几年来，有一批企业已投入到生产和应用行列，所用 原料主要集中在地沟油和植物废旧油等，如海南正和、四川古杉油脂、福建卓越能 源等公司相继建成了超过1 2 万吨年的生产装置，产品已达到国外同类产品的质量 标准。除此之外，规划建设的生物柴油厂也有许多国外公司开始进入，这些公司来 自德国、英国、美国、奥地利、意大利等。中国大型石化公司、粮油公司对生物柴 油也很重视，都已有计划( l i nje t a i ，2 0 0 4 ) 。目前，我国规划建设的生物柴油厂总 生产能力可能超过3 0 0 万吨年。 1 1 3 生物柴油的原科来源 成本过高一直是发展生物柴油的瓶颈问题，原料在生物柴油生产总成本中，所 占比重最大，达到7 0 一8 0 。因此，获得充足量的生物油脂，寻求含油率高、再生 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 周期短、能够稳定供给的原料成为当前生物柴油研究的重中之重。 1 1 3 1 国外生产生物柴油的主要原料 世界上已经确认的油料作物有3 5 0 多种，由于自然条件和农业政策不同，各国 都选择有自身优势的原料来发展生物柴油( 谭天伟等，2 0 0 2 ) 。在欧盟，油菜籽是 普遍的农作物，适宜作为制造生物柴油的原料。美国为世界的大豆王国，生产生物 柴油的原料主要是转基因大豆油，巴西的主要原料是蓖麻油和转基因大豆油，菲律 宾的主要原料是椰子，泰国则以麻疯树为主要原料，印度以棉籽为主要原料，马来 西亚和印度尼西亚则以其盛产的棕榈油来发展生物柴油。 1 1 3 2 我国生产生物柴油的主要原料 我国是油脂生产大国，但由于人口多、油脂食用消费数量巨大，国内油料作物 生产远远不能满足人们的食用消费，每年还需要进口约1 0 0 0 万吨的植物油来满足 国内消费需要。因此对于我国来说，生物柴油的原料不能像欧美等国家那样通过专 门种植油料作物提供，而必须采用其他多元化途径来满足生物柴油的原料供应。 a 利用废弃油脂 中国是食用油消费大国，随着城市餐饮业的发展，各种废弃的动植物油数量巨 大，如2 0 0 7 年食用油的消费总量约为2 2 0 0 万吨，若按消费总量的1 0 计算，则产 生2 2 0 万吨的废油脂。同时，中国也是世界上的制油大国，而且有几千家食用油及 肉类、皮革、骨粉、骨胶、明胶等骨产品加工企业，每年可排放动植物油脂下脚料 几百万吨。这些废油脂和动植物油下脚料若直接排放，不仅造成环境和水质污染， 而且也是严重的资源浪费。因此，在大中城市规模回收这些废弃油脂作为生物柴油 生产原料，可以减少污染、变废为宝，利国利民。 b 种植木本油料植物 木本油料植物都适于在山地和丘陵地区生长，可在荒山、荒地栽培，不与粮棉 争地，而且是一次栽种多年收获。我国有荒山荒地0 5 5 亿h m 2 ，以及边远性和废弃 土地资源1 亿h m 2 ( 黄文捷，2 0 0 8 ) ，结合产业调整政策以及我国西部退耕还林生 态工程，利用这些土地种植一些具有强抗逆性、耐旱、耐贫瘠的乔灌木油料作物， 如麻疯树、黄连木、文冠果、绿玉树等，可以作为制备生物柴油的又种廉价原料。 c 发展微生物油脂和工程微藻 微生物油脂是由酵母、霉菌、细菌等微生物在一定条件下利用碳源在菌体内产 生的大量油脂。与传统油脂生产工艺相比较，具有产量高、周期短、成本低等优点， 而且所需原料来源丰富且便宜，可利用农副产品、食品加工及造纸业的废弃物为培 养基原料，非常有利于废物再利用和环境保护。美国国家能源部可再生能源实验室 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s ( n i 违l ) 的报告特别指出，微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重 要研究方向( t y s o ne ta l ，2 0 0 4 ) 。 微藻是一种最低等的、自养的放氧水生植物，种类繁多、分布极其广泛。其不 但油脂含量可观，而且提取得到的油脂成分与植物油相似，可以作为生物柴油替代 石油直接应用于工业上。“工程微藻 是通过基因工程技术建构的微藻，在实验室 条件下可使脂质含量达到6 0 以上，在户外也可达到4 0 以上，而且生产能力高， 生产油脂比陆生植物单产可高出3 0 倍( 柏杰，2 0 0 2 ) ，它可以海水作为培养基进行 大量繁殖，不与其他农业争地，也可以通过污水处理池来养殖工程微藻。因此，养 殖工程微藻不仅可以生产生物柴油原料，还可以净化污水，大大降低污水处理的成 本。 1 1 4 我国发展生物柴油的意义 从生物柴油的各项品质性能可以看出，作为一种环保型的可再生绿色能源，研 究生物柴油对解决当今世界面临的能源短缺和环境污染两大问题具有十分重要的 意义。发展生物柴油在我国具有巨大潜力，将对缓解能源危机、保障石油安全、保 护环境生态、促进农业和制造业发展、提高农民收入产生相当重要的作用( 黄文捷， 2 0 0 8 ) 。 1 1 4 1 有利于缓解我国的能源供应危机 近年来，随着我国逐步走上新型工业化道路和汽车工业的快速发展，能源消耗 大幅增长，2 0 0 3 年我国已成为仅次于美国的全球第二大石油消费国。同时，我国是 一个化石能源资源十分短缺的国家，已探明的原油、天然气储量仅占世界储量的 2 4 和1 2 。2 0 0 6 年石油净进口量约1 6 亿吨，对外依存度已达4 7 。预计2 0 2 0 年石油进口的依存度将达7 0 ，能源问题正在成为困扰中国经济发展的一大难题。 尤其是近年来国际油价大幅飙升，对中国经济的影响越来越大，中国油气供需矛盾 突出。因此，寻找新的石油替代能源，制备可再生的生物柴油，可以有效的缓解我 国的能源供应危机。 1 1 4 2 有利于保障我国的石油安全 目前，我国能源形势十分紧迫，柴油是石油消费的重要组成部分，从1 9 9 5 年至 2 0 0 0 年，我国的柴油消费已从4 2 6 0 万吨增加到6 7 0 0 万吨。2 0 0 5 年，我国柴油产量达 n 8 0 5 0 万吨，仍有6 0 万 - 2 4 0 万吨的缺口。预计至i j 2 0 1 0 年，柴油的需求量将突破l 亿 吨，3 0 2 0 1 5 年市场需求量将达n 1 3 亿吨左右( 钱伯章，2 0 0 3 ) ，这将严重威胁国家 的石油安全。立足于发展本国的生物柴油可在一定程度上满足或部分缓解我国柴油 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 供应紧张的状况，是保障我国石油安全的重要战略措施之一。 1 1 4 3 有利于生态环境的保护 使用生物柴油可以减少对化石燃料的开采和消耗，从而大大减少对环境的污 染。生物柴油硫含量低，其大量的生产和使用不会形成酸雨，造成环境灾害，而碳 循环基本上是动态平衡，燃烧所排出的有害气体比石油柴油减少7 0 左右，生物柴 油中也不含对环境造成污染的芳香化合物，因而废气对人体损害也低于柴油。另外， 在保证生物柴油的原料供应同时，种植油料作物还将增加对陆地的植被覆盖，从而 对减少水土流失、调节环境气候等多方面具有生态调节功能。 1 1 4 4 有利于促进我国农村的经济和产业发展 生物柴油生产是以动、植物油脂为主要原料的，因此，可在适合油料作物生长 地区大量种植油料作物，同时通过农业结构调整将退耕还林和木本油料植物发展结 合起来，建立生物柴油原料基地。通过提高土地资源使用效率，增加生物能源供应 量，可以形成一个大产业，并通过建设能源工厂等相关产业，可以增加农民收入， 创造新的就业机会，带动农村地区特别是山区经济的发展。 因此，有效地发展生物柴油对调整农业结构、增加社会有效供给、改善生态环 境、缓解能源危机、增加就业机会、促进中国社会、经济发展、增强中国石油安全 保障具有重要的战略意义。 1 2 微藻概述 微藻是遍布全球水体的单细胞藻类，是地球上最早的生物物种，无论是海洋、 淡水湖泊等水域，或是潮湿的土壤、树干等处，几乎在有光和潮湿的任何地方都能 生存。它们是地球上的最初级生产力，有了它们才有了大气中的氧气，才有了海洋 和陆地上的其他生物，也才有了人类。每年由微藻光合作用固定的二氧化碳占全球 二氧化碳固定量的4 0 以上，微藻在能量转化和碳元素循环中起着举足轻重的作 用。 微藻是一类单细胞生物，与陆地微生物相比，微藻具有如下特点( 王长海， 2 0 0 4 ) ： a 微藻具有叶绿体等光合器官，能有效地利用太阳能通过光合作用将h 2 0 、 c 0 2 和无机盐转化为有机物，并通过固定和利用c 0 2 可以减少温室效应； b 微藻一般以简单的分裂式繁殖，细胞周期较短，易于进行大规模培养，由 于微藻通常无复杂的生殖器官，使整体生物量容易采收和利用； c 微藻可以用海水、咸水或半咸水培养，因此是淡水短缺、土地贫瘠地区获 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 得有效生物资源的重要途径； d 微藻富含蛋白质、脂肪和碳水化合物，某些种类还富含油料、微量元素和 矿物质，是人类未来重要的食品及油料的来源； e 微藻，尤其是海洋微藻，因其独特的生存环境使其能合成许多结构和生理 功能独特的生物活性物质。特别是经过一定的诱导手段微藻可以高浓度的合成这些 具有商业化生产价值的化合物，是人类未来医药品、保健品和化工原料的重要资源。 1 2 1 三角褐指藻简介 三角褐指藻( p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ) 属于硅藻门( b a c i l l a r i o p h y t a ) 、羽纹藻 纲( p e n n a t a e ) 、褐指藻目( p h a e o d a c t y l a l e s ) 、褐指藻科( p h a e o d a e t y l a c e a e ) 、褐指藻属 ( p h a e o d a c t y l u r f l ) ，单细胞，营海岸生、浮生及底生，属于低温品种，具有梭形、 卵形和三出放射形三种不同形态( 陈峰，姜悦，1 9 9 9 ) ，这三种形态在不同的 环境条件下可以相互转变。梭形细胞长2 0 t m ，两臂末端较钝；卵形细胞长8 1 a m ， 宽3 岬，有一个硅质壳面；三出放射形细胞长度约为1 0 1 8 “m ( 两臂间垂直距 离) ，有3 个“臂”。一般通过平行分裂成为2 个形态相同的细胞。因细胞无硅 质壳，在裂殖时与一般硅藻不一样，藻体不会缩小，梭形细胞主要行纵裂繁殖。 该藻对盐度的适应范围很广，在9 9 2 的盐度范围内都能生活，最适盐度为 2 5 3 2 。适温范围为5 2 5 ，最适温度为1 0 2 0 ，即使是在o 条件下仍稍有繁 殖。对酸碱度的适应范围也很广，在p h 7 1 0 的环境下均能生长、繁殖，最适范 围为p h 7 5 - 8 5 之间。 三角褐指藻不仅是近海初级生产力的主要贡献者，而且长期以来一直被人们作 为一种人工育苗的常规优良基础饵料，它富含蛋白、多糖、多不饱和脂肪酸等多 种高价值活性物质，尤其因为富含二十碳五烯酸( e p a ) 而备受重视，也有报道称 国外己用三角褐指藻生产抗氧化剂( 岩藻黄素) ( 张继红等，1 9 9 8 ) ，因此它是水产养 殖饵料生产和高价值活性产物开发利用的优质经济微藻，具有非常好的开发利 用前景( j i a n g ，g a o ，2 0 0 4 ) 。关于它的培养研究工作国内外有许多，如美国、 日本和以色列等曾率先采用户外开放大池培养三角褐指藻以生产多不饱和脂肪酸 ( p u f a ) ，国内学者对影响其生长、繁殖、藻体生化组成及p u f a 积累的影响因子进 行了探讨，如对温度( 李文权等，2 0 0 3 ；万新祥等，1 9 9 6 ；蒋汉明等，2 0 0 4 ) 、光强 ( 林霞等，2 0 0 3 ) 、时间( 万新祥等，1 9 9 8 ) 、营养盐( 李文权等，1 9 9 4 ；梁英等， 2 0 0 1 ；朱艺峰等，2 0 0 1 ：廖启斌等，2 0 0 0 ) 及微量元素( 朱明远等，2 0 0 0 ) 等进行了 探讨。另外，海洋微藻在受到环境胁迫后，如氮限制( n a t a l i ae ta l ，2 0 0 5 ；i r m ae ta l ， 7 2 0 0 2 ) 、超声波、紫外光等对微藻的化学组成也产生了很大的影响( 陈峰等1 9 9 9 ； j i a a g 等，2 0 0 4z 危蔚，2 0 0 5 ) 。 硅燕富含油脂( 占细胞干1 4 0 0 r 5 0 ) ( s h e e h a a e t a l ，1 螂) ，且短链脂肪酸( c 1 4 和c 1 6 ) 占细胞中总脂肪酸的6 7 - 7 0 2 e 右西m s i a n n a l ，1 9 9 4 ；j i a n g h ，o a ok ，2 0 0 4 ) 。 三角褐指藻作为硅藻研究的模式种类之一，如上所述关于它的研究很多，但关于生 产生物柴油的研究较少，它的细胞壁含硅较少，利于破碎，是优质的生物柴油生产 原料。而且具有以下特点：首先，该藻生长至对数期后开始积累油脂( 如图1 - 2 所示) ， 在缺氮等条件下，油脂产量更高，含油量可高达4 0 5 0 n ；其次，个体小、培养周 期短、生长速度快、单位面积的产量高，已在世界许多地方实现了大规模养殖 ( l c b e a u ，2 0 0 3 ) ；再次，三角褐指藻对温度、盐度、光强、酸碱度的要求都不高， 生长范围广，在世界许多地区都可以养殖。 i 日_ 图1 之a ：显徽镜观察下的三角揭指藻b ：尼罗红染色后的三角褐指藻 f 嘻1 - 2 a ：p h a e o d a c t y l u m t r t c o r n u t t o n u n d e r t h * m i c n ：e c o p e b ：p h a e o d a c t y l u m t r i c o r n u t u ms t a i n e d w i t h n i l e r e d 1 2 2 鬣藻的开发研究进展 微藻作为鱼、虾、贝类幼体或成体的直接或间接的活饵料，很早就受到人们的 重视。近几十年来，人们越来越多地注重微藻生物活性物质的研究和开发。人们已 了解微藻中存在着丰富的、结构独特的生物活性物质，其中有许多具有药理活性， 是十分丰富的高价值化学品及药品的来源。在医药和保健品的开发应用方面具有巨 大的潜力。当前，微藻及微藻产品在医药工业中的应用正逐步受到人们的重视，藻 类生物技术的研究开发遍及世界各地，藻类生产公司大量涌现。从微藻中提取色素、 錾一 矿 。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 微藻多糖、多不饱和脂肪酸、毒素、抗生素、甜菜碱、酶、甾醇等活性物质在当前 都有研究，并取得了一定的成果( 齐沛沛，2 0 0 8 ) 。 色素从微藻中提取的色素主要有b 一胡萝卜素、虾青素和藻蓝素。b 一胡萝卜素 是v a 的前体，有抗氧化、抗突变、抗衰老、预防癌症、增加免疫力等作用。虾青素 具有很强的抗氧化功能，能清除体内自由基，对紫外线引发的皮肤癌有很好的治疗 效果，还能显著促进机体抗体的产生。藻蓝素亦称藻蓝蛋白，是一种安全无毒的色 素蛋白，能促进血细胞再生，是一种理想的光敏剂，国外已用于癌症的光动态治疗。 多糖微藻多糖是广泛存在于微藻体内的一种天然大分子物质，具有抗肿瘤、 抗病毒、抗辐射损伤、抗突变、抗衰老、抗凝血、降血脂及调节机体免疫能力等广 泛的生理功能。 多不饱和脂肪酸当前研究较多的多不饱和脂肪酸( p u f a ) 是二十碳五烯酸 ( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) ，它们具有独特的生理功效，有预防和治疗心血管疾 病、癌症，调节中枢神经、视觉系统的功能，可提高人体的免疫机能调节能力，防 止记忆力减退。 徼藻油脂美国国家能源部可再生能源实验室( n r e l ) 通过现代生物技术建 成“工程微藻 ，即硅藻类的一种“工程小球藻，其利用“工程微藻”生产生物柴 油，为生物柴油生产开辟了一条新的技术途径。在实验室条件下可使“工程微藻” 中脂质含量增加到6 0 以上，户外生产也可增加到4 0 以上，而一般自然状态下微 藻的脂质含量仅为5 2 0 。 1 2 3 微藻生产生物柴油的现状 1 2 3 1 研究进展 以发展生物柴油产业为目的进行微藻产油的研究始于上世纪7 0 年代末。美国 能源部1 9 7 8 年立项利用微藻制备生物柴油的研发工作，研究人员从海洋和湖泊中 分离到了3 0 0 0 多种微藻，从中筛选出3 0 0 多种生长快、含油量高的硅藻、绿藻和 蓝藻等藻种。进入2 l 世纪后，微藻生物柴油技术的研究得到了快速发展。2 0 0 7 年 l o 月，国际能源公司宣布开发以微藻为原料生产生物燃料的新技术；1 2 月，s h e l l 公司宣布与美国从事生物燃料业务的h r b i o p e t r o l e u m 公司组建c e l l e n a 合资公司， 投资7 0 亿美元开展微藻生物柴油技术的研究。荷兰a l g a e l i n k 公司也于2 0 0 7 年1 0 月宣布开发成功新型微藻光生物反应器系统，开始向全球销售其反应器，并提供相 关技术支持。其他如s o l a z y m e 、v a l c e n t 、v e r t i g r o 、c e h m m 等多家公司都在积极 开展相关技术研发。 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s s 随着生物柴油开发的兴起，我国一些科研机构及企业也开始关注产油微藻的研 究和开发。有人利用异养生长( 利用外加的葡萄糖生长) 的产油小球藻进行了密闭 培养、提油和生物柴油加工研究，在技术上证明是可行的。在产油微藻的研究方面， 目前已有水生生物所、武汉植物园、过程工程研究所、南海海洋所、青岛海洋所等 单位开展了选种、育种、大量培养、收集和提油等研究，并积极开展与我国大型石 油化工企业的合作，试图开辟适合我国国情的微藻生物柴油产业化道路。 1 2 3 2 微藻生产生物柴油的优势 微藻种类多，含油量高；许多微藻的含油量都可达2 0 5 0 ，部分微藻的含 油量甚至可以超过微藻干重的8 0 ( c h i s t i ，2 0 0 8 ) ，如表1 1 ( s p o l a o r ee ta l ，2 0 0 6 ) 所示，而高等植物种子的油脂含量仅为干重的1 5 2 0 。不同种类的微藻会产生不 同种类的油脂和其他复杂的油类( g u s c h i n a ，2 0 0 6 ) ，但从微藻中提取的油脂组成 与一般油料植物相似，都以c 1 6 、c 1 8 系脂肪酸为主，通过转酯化后可转变为脂肪 酸甲酯即生物柴油。生长繁殖快，产量高：从生产速度上看，一般高等植物生长需 要好几个月甚至几年才完成一代，藻类繁殖一代的时间仅为2 5d 。经过驯化，一般 微藻在2 4h 内就可以使生物量加倍，对数生长期内生物量的倍增时间缩短为3 5h ( c h i s t i ，2 0 0 7 ) ，其中一些藻类的光合生产率已经达到5 0g m - 2 d - 1 。而且由于微藻 具有环境适应能力强、不占用耕地、可大规模自动化培养等优势，因此，开发利用 微藻生产生物柴油具有极为广阔的前景，是未来生物柴油发展的趋势之一。 表1 1 部分含油微藻的含油量 t a b l el - lo i lc o n t e n to fs o m em i c r o a l g a e 微藻 含油质量分数慌 b o t r y o c o c c u sb r a u n i i 2 5 7 5 c y l i n d r o t h e c as p 1 6 - - , 3 7 i s o c h r y s i ss p 2 5 0 3 m o n a l l a n t h l a ss a l i n a 2 0 n a n n o c h l o r i ss p 2 m 0 5 n e o c h l o r i so l e o a b u n d a n s3 5 6 4 n i t z s c h i as p 4 5 4 7 p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m 2 m 0 0 s c h i z o c h y t r i u ms p 5 0 7 7 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 3 3 微藻生产生物柴油存在的不足 利用高等植物和微藻生产生物柴油，其能量都来自于太阳光。地球上单位面积、 单位时间内接收到的太阳光能是一定的，微藻在单位面积上的高能量密度产出是相 对于高等植物产油的关键优势。但是，以目前的技术水平，微藻培养也存在单位面 积生产能耗大、投入成本高的问题，微藻生物柴油要真正成为一种替代能源，降低 微藻的生产能耗和成本至关重要。目前实现微藻规模培养的方式有两种( 宋东辉等， 2 0 0 8 ) ：开放式户外大池光自养培养和封闭式光生物反应器( 发酵罐) 自养或异养培 养。前者结构和运转比较简单，生产成本低，但存在藻类生长所达到的细胞密度较 低、易污染、水蒸发量大、生产不稳定、占地面积大等缺点，因此其发展受到很大 限制；后者操作简单，培养条件、参数易控制，可达到较高的藻细胞密度，不易被 杂藻侵染，水蒸发量小，可实现全年无菌纯种培养，但反应器造价和运转成本较高， 因而需要发展出能够集二者优点而避免其缺点的新型培养方式。另外，微藻培养液 中细胞只占很小一部分，绝大部分是水，需要发展出低能耗的收集细胞并循环使用 培养液的技术。 1 3 微藻的收集方法 1 3 1 离心法 离心法即利用高速离心机对微藻细胞进行离心浓缩，是实验室普遍采用的收集 微藻的方法，但其能源消耗大，操作繁琐，且离心过程中易导致细胞破碎，造成损 失。 1 3 2 超滤法 超滤是一项新型的膜分离技术，它是以膜两侧的压力差为推动力，使被处理料 液流经表面具有微小孔径的不对称结构超滤膜时，实现不同分子量物质的物理分离 过程( 陆九芳等，1 9 9 3 ) 。已广泛用于微粒的脱除，包括细菌、病毒、热源