（微生物学专业论文）利用基因组改组技术对灰黄霉素产生菌荨麻青霉进行改良的研究.pdf

论文使用授权声明 福建师范大学学位论文使用授权声明 本人( 姓名)星剑学号 2 q q 量窆曼垄专业丝生物堂 所呈交的论文( 论文题目：利用基因组改组技术对灰黄霉素产生菌一荨麻 青霉进行改良的研究) 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师范大学有 关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交的学位论文并允 许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容；学校可以 采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名蔓囱 指导教师签名 签名日期 谚。多口乡 摘要 摘要 基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育新技术。 灰黄霉素( g r i s e o f u l v i n ，g f ) 高产菌株荨麻青霉( p e n i c i l l i u mu r t i c a eb a i n i e r ) 发酵周期较 长，增加了生产成本和生产周期。本研究拟通过基因组改组技术，以筛选出发酵周 期较短或效价较高的荨麻青霉菌株。 本研究的主要结果如下： ( 1 ) 探索了荨麻青霉原生质体的高效制备以及再生方法：采用0 6m o l ln a c l 作为渗透压稳定剂，菌龄为2 8 0 c 培养2 0 小时，0 。0 1m o l ld t r 预处理0 5 小时，0 7 纤维素酶+ 0 7 蜗牛酶+ 0 5 溶菌酶2 8 0 c 酶解3 5h ，p d a 高渗双层培养基平板分 离。结果表明原生质体的产量达到2 0 9 x 1 0 6 个m ! ，再生率达到2 1 2 ： ( 2 ) 通过对诱变条件的探讨确定了最佳诱变方案，对原始出发菌株的诱变采用 u v 与n t g 复合诱变处理的方法，先用2 5 4n m 波长紫外线诱变处理1 5 0 秒，再用l 毫克 毫升的n t g 溶液诱变处理3 5 分钟。结果获得了形态与原始菌株不同的诱变株，经平 板抑菌试验筛选出抑菌效果比出发菌株更好的3 株诱变菌株，基本达到了预期的效 果； ( 3 ) 使用3 0 的p e g4 0 0 0 做助融剂，在3 0 0 c 下作用5 分钟，通过两轮递推式 原生质体融合，对融合菌株进行挑选，获得了发酵效价得到提高的3 株菌株，效价 提高了约1 5 。r a p d 分析表明，改组菌株的遗传组成与原始菌株相比存在差异。 初步实现了选育目的。 关键词：荨麻青霉，灰黄霉素，基因组改组，原生质体融合，育种 a b s t r a c t a b s t r a c t g e n o m es h u f f l i n gi san e wb r e e d i n gt e c h n o l o g yw h i c hb u i l d so nt h ep r o t o p l a s t f u s i o nt e c h n o l o g y p e n i c i l l i u mu r t i c a eb a i n i e r ，t h eg r i s e o f u l v i nh i 曲p r o d u c t i o ns t r a i n ，a s i t si n c u b a t i o np e r i o di sl o n g ，i n c r e a s e dt h ep r o d u c t i o nc o s ta n dp r o l o n g e dt h ep r o d u c t i o n p e r i o d a c c o r d i n g l y , t h i sr e s e a r c hp l a n sm e a n st oo b t a i ns h o r t e rf e r m e n t a t i o np e r i o do r h i g h e rt i t e rp e n i c i l l i u m gu r t i c a eb a i n i e rs t r a i nb yg e n o m es h u f f l i n g t h em a i nr e s u l t so ft h i sr e s e a r c ha r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h i sr e s e a r c h h a s e x p l o r e dt h eh i g l l l y e f f e c t i v ep r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n d r e g e n e r a t i o nm e t h o do fp e n i c i l l i u mu r t i c a eb a i n i e r ：t h eo p t i m u mo s m o t i cp r e s s u r es t a b i l i z e r i s0 6m o l ln a c l ，t h eo p t i m u ma g eo ft h es t r a i ni s2 0h o u r sc u l t i v a t e di nt h et e m p e r a t u r e 2 8 ，p u r t i c a eb a i n i e rh y p h ap r e t r e a t e d0 5h o u r sb yd t f ，e n z y m e d3 5h o u r sb yo 7 c e l l u l a s e + 0 7 s n a i l a s e + 0 5 l y s o n z y m ei nt h et e m p e r a t u r e2 8 ，a n ds e p a r a t e do nt h e d o u b l e d e c k e dh i g l li n f i l t r a t ep d ac u l t u r em e d i u mp l a t e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e p r o t o p l a s ty i e l dr e a c h e s2 0 9 x 1 0 6 m l ，a n dt h er e g e n e r a t i o nr a t eo fp r o t o p l a s tr e a c h e s 2 1 2 ： ( 2 ) t h r o u g ht h er e s e a r c ho fm u t a g e n e s i sc o n d i t i o n s ，h a s c h o s e nt h eo p t i m a l m u t a f a c i e n ts c h e m e ，t h eo r i g i n a ls t r a i nm u t a g e n i z e db yt h ec o m p l e xm u t a g e no fu va n d n t g ，u s i n g2 5 4n n lw a v e l e n g t hu vm u t a t e d1 5 0s e c o n d s ，a n dt h e nl m g m ln t g s o l u t i o nm u t a t e d3 5m i n u t e s a m o n gt h em u t a t e ds t r a i n s ，o b t a i n e d3s h a p e d i f f e r e n t m u t a n ta n dh i g h v i t a l i t ye f f e c t i v es t r a i n sb yt h ea n t i m i c r o b i a ls c r e e n i n ge x p e r i m e n t ，h a s a c h i e v e dt h ed e s i r e dr e s u l tb a s i c a l l y ； ( 3 ) t h em u t a n ts t r a i n sa n do r i g i n a ls t r a i n sf u s e d5m i n u t e sb y3 0 p e g 4 0 0 0i n3 0 。c ， a f t e rt w or o u n d so fr e c u r s i v e p r o t o p l a s tf u s i o n ，w eh a v eo b t a i n e dt h r e eh i g hf e r m e n t a t i o n v i t a l i t ys t r a i n s ，t h e i r st i t e ri n c r e a s e db ya b o u t1 5 a n a l y s i sb yr a p di n d i c a t e dt h a tt h e e x i s t e n c eo fg e n e t i cd i f f e r e n c e sb e t w e e nt h em u t a n to rs h u f f l e ds t r a i n sa n dt h eo r i g i n a l s t r a i n ，a c h i e v e dt h eb r e e d i n gp u r p o s eo nt h ew h o l e k e y w o r d s ：p e n i c i l l i u mu r t i c a eb a i n i e r ，g r i s e o f u l v i n ，g e n o m es h u f f l i n g ，p r o t o p l a s t f u s i o n ，b r e e d i n g i i i 中文文摘 中文文摘 基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育新技术， 它首先运用诱变育种的方法，以获得目的性状得到改进的正向突变菌株的基因组库， 以此作为首轮多亲本融合的直接亲株，然后通过原生质体递推式融合使这些正向突 变的若干个菌株进行基因组重组，从中筛选出符合育种要求的重组子，从而在短时 间内获得性状得到大幅度提高的菌株。实践表明基因组改组技术可以明显增大菌株 的进化几率，扩大变异范围，增加获得高产菌株的机会，大幅度地缩短菌种选育周 期，快速和高效地筛选出优良菌株，使得目的菌株更快地投产、产生效益。 灰黄霉素( g r i s e o f u l v i n ，g f ) 是一种非多烯类抗真菌抗生素，被广泛地用于人体各 种体表真菌感染的治疗。其耐前体灰黄霉素高产菌株荨麻青霉( p e n i c i l l i u mu r “c a e b a i n i e r ) 具有高发酵效价、耐前体氯离子，高糖低p h 低氮发酵及耐泡敌等优良的发 酵特性，但发酵周期较长，增加了生产成本和生产周期。本研究拟通过基因组改组 技术，以筛选出发酵周期较短或效价较高的荨麻青霉菌株。 本课题的主要研究结果如下： ( 1 ) 从水解酶的种类和浓度配比、菌龄的选择、酶解作用的时间和温度、预处 理剂、渗透压稳定剂、再生培养基的组成等方面，对荨麻青霉原生质体的高效制备 以及再生方法进行了一系列探索和优化，结果发现最佳制备方法组合为：菌龄为2 8 0 c 培养2 0 小时，0 6m o l ln a c i 作为渗透压稳定剂，0 0 1 m o l l d t i 预处理0 5 小时， 0 7 纤维素酶+ 0 7 蜗牛酶+ 0 5 溶菌酶2 8 0 c 酶解3 5h ，p d a 高渗双层培养基平 板分离。该组合制备原生质体产量达到2 0 9 x 1 0 6 个m l ，其再生率达到2 1 2 ； ( 2 ) 通过对诱变条件的探讨确定了最佳诱变方案，对原始出发菌株的诱变采用 u v 与n t g 复合诱变处理的方法，确定紫外线致死率为8 0 9 0 、n t g 诱变致死率在 9 5 左右为最佳作用时间，先用2 5 4n m 波长紫外线诱变处理1 5 0 秒，再用1 毫克毫升 的n t g 溶液诱变处理3 5 分钟。诱变后稀释涂皿，获得约8 0 0 个菌株，经过平板抑菌试 验以及形态指标筛选出抑菌效果比出发菌株要好的4 株诱变菌株。基本达到了预期的 诱变效果； v 福建师范大学罗锏硕士学位论文 ( 3 ) 使用3 0 的p e g4 0 0 0 做助融剂，在3 0 0 c 下作用5 分钟，对诱变所获得的三 株诱变株h 2 2 3 、h 2 3 1 、h 2 7 2 与具有不同遗传背景的荨麻青霉菌株h 0 6 、h d 、h s h 共六株进行第一轮原生质体融合，通过黑曲霉平板抑菌试验挑选抑菌圈较大、并结 合挑选孢子颜色浅白的菌株，共获得约2 0 株。选其中的a 2 、a 1 0 、a 1 6 、b 2 、c 6 、 d 5 作为第二轮多亲本融合的出发菌株。第二轮多亲本融合后经过初筛获得e 3 、e 6 、 b 1 、b 3 0 、b 3 2 、f 4 等1 3 个菌株。经形态特征和平板抑菌试验初筛、摇瓶发酵复筛， 获得了发酵效价得到提高的三株菌株，它们的效价提高了约1 5 。r a p d 分析表明， 诱变株和改组菌株的遗传组成与原始菌株相比存在差异。初步实现了选育目的。 v i 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 微生物遗传育种技术的发展及历史地位 微生物菌种改良，是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进 行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方 法，使我们获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。其目的是改良菌种的特性，使 其符合工业生产的要求。当前菌种选育的基本内容是根据菌种自然变异而进行的自 然选育，以及用人工方法引起菌种变异，再按照工业生产的要求进行筛选来获得新 的变种。工业微生物遗传育种的主要方法有经典的自然选育和诱变育种技术，使菌 种发生突变，存优去劣，这是目前普遍采用的方法，容易施行，易见成效；另一条 途径是研究目的物的基因结构及基因调控、表达的方式，进行基因重组、转殖，使 之高效表达。工业微生物菌种的选育，不仅可提高目的物的产量，使目的物产量成 百上千倍的提高，大大降低生产成本，提高经济效益，而且通过微生物菌种的选育， 可简化工艺，减少副产品，提高产品质量，改变有效成分组成，甚至获得活性更高 的新成分。 工业微生物菌种选育在发酵工业历史有着重要地位，是决定发酵产品能否具有 工业化价值及发酵过程成败与否的关键。菌种选育技术的广泛应用为我们提供了各 种类型的突变菌株，使得在食品工业、医药、农业、环境保护、化工能源、矿产开 发等领域产生众多新的产品，促使传统产业的技术改造和新型产业的产生，同时使 诸如抗生素、有机酸、维生素、色素、生物碱、激素以及其它生物活性物质等产品 的产量成倍甚至成千万倍地增长，并且产品的质量也不断的提高。如青霉素是于1 9 2 9 年英国f l e m i n g 发现的，当时的利用表面培养只能获得1 - 2 u m l 青霉素，经过数十载 的诱变育种使其产量提高到目前的9 0 0 0 0 u m l ，以及由最初的纯度2 0 和得率3 5 提高到纯度9 9 9 和得率9 0 船3 ，如此同时链霉素、土霉素、金霉素和氯霉素等抗 生素也大规模的生产起来；在代谢控制育种的推动下使得产氨基酸、核苷酸、有机 酸等次生代谢产物的高产菌株大批投入生产；由基因工程构建的工程菌株使得微生 物次生代谢产物生产能力迅速提高，而且生产出微生物本生不能生产的外源蛋白质， 如胰岛素、生长激素、单克隆抗体和细胞因子等等。由此可见工业微生物遗传育种 福建师范大学罗剑硕士学位论文 技术是工业发酵工程的核心技术，在其作用下人们获得了许多的高产优质菌株，为 生产实践发展起了强大的推动作用。 1 2 基因组改组技术在菌种选育中的应用 1 2 1 基因组改组技术的产生和原理 如前所述，各种育种方法各有优势，然而也有其不足之处。比如，对人类有用 的微生物产物大多是次级代谢产物。对这些次级代谢产物而言，其合成一般是由微 生物细胞内的多酶体系催化完成的，多酶体系中的各个酶由分散或连锁的结构基因 编码，至今人们仍不能清楚了解大多数次级代谢产物合成基因的性质，因此目前对 次级代谢产物产生菌的基因改造，绝大多数仍难于采用定向育种的方法完成。由此， 研究开发高效定向的微生物菌种选育方法，一直是微生物科学工作者们所面临的重 要课题。 1 9 9 4 年，s t e m m e r 首先提出了在体外定向进化分子的方法d n as h u f f l i n g 技 术3 。其方法是，将同源的d n a 用d n a a s ei 进行消化成片段，然后将得到的随机片段 无引物p c r ，使之重新随机装配，从而获得了多种排列组合的突变基因库，最后利用 设计好的引物p c r ，得到预期的重组体。这种方法已被广泛应用于酶的改性、蛋白的 改良、疫苗的优化等方面，获得了较大的成功。 基于相似的原理，1 9 9 8 年，s t e m m e r 等又提出了g e n o m es h u f f li n g ( 全基因组改 组) h 1 ，该种方法首先选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得多个表型 得到提高的菌株，构建突变候选株文库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融 合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融 合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，依此类 推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株。 从基因组改组技术的产生过程来看，可以认为，g e n o m es h u f f l i n g 技术是分子 定向进化d n as h u f f li n g 技术在全基因水平的延伸。它将重组的对象从单个基因 扩展到整个基因组，因此，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组 合。 第1 章绪论 1 2 2 基因组改组技术的方法和特点 1 2 2 1g e n o m es h u f f l i n g 技术的具体方法 从基因组改组技术的原理来看，进行基因组改组，首先要运用诱变育种的方法， 以获得目的性状得到改进的正向突变菌株的基因组库，并作为首轮多亲株融合的直 接亲株。诱变育种的具体操作要根据不同菌种的特性而异。然后进行多亲株的递推 式融合( r e c u r s i v ef u s i o n ) 。( 见图1 - 1 ) a s e x u a ls e x u a l 协 o c = l l p a r e n t r e c u r s i v em u t a g e n e s i s m u t a t emu t a t e - 。i ；i 测d 鳅i s c a 佣r d 岛- i 謦 牟畦 匡、e r e c u r s i v er e c o m b i n a t i o n m u t a t e ： i 二 皇ir-x广 广一 i i i l l -i i s e l e c ta n ds h u f f l ep o p u l a t i o n o fl m p r o v e dp r o g e n y c y c l e s e v o l u t i o n a r yt i m e ) 图1 1 诱变育种与基因组改组育种方法比较示意图 f i g 1 - 1a s e x u a lm u t a g e n e s i sv e r s u ss e x u a lr e c o m b i n a t i o n ( 说明：该图中纵横轴无坐标单位，不具有精确的度量意义，只示意性状或产量的提升和改组 操作进程) 递推式融合的操作方法与原生质体融合技术基本相同，首先要进行原生质体制 备，随后是原生质体融合、再生、鉴定和挑选等。 1 2 2 2g e n o m es h u f f l i n g 的特点 传统诱变通常是将每一轮产生的突变体库中筛选出的最优的一株作为下一轮诱 变的出发株，其正向突变率很低，仅为1 0 叫左右，筛选一株优良的生产菌株需要大量 福建师范大学罗剑硕十学位论文 的时间和工作量。此外菌种在经过多次诱变后自身抗性增强，会出现对诱变剂的“钝 化 反应，即所谓“饱和现象”嵋1 。一些无关的或对菌株的生产性能造成负面影响 的突变随之积累，会导致诱变效率下降。杂交育种可以消除长期诱变处理造成的菌 种活力衰退和产量下降的现象，但不同微生物种之间通常难以形成稳定的重组体。 代谢控制育种的前提是充分了解微生物的代谢路线图及其代谢调控机制，对大多数 微生物而言，仍不能很好地运用此法来提高代谢产物产量。基因工程育种必须建立 在对微生物基因的结构和功能较为详细了解的基础之上，技术难度较大。 g e n o m es h u f f lin g 只需在进行首轮s h u f f lin g 之前，通过诱变获得初始突变体 库，然后将包含若干正性突变株的突变体库作为第一轮原生质体融合的出发菌株， 此后经过递推式的多轮融合，最终使引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株 中。同经典的诱变方法相比，通过基因组改组技术可以更为快速和高效地筛选出优 良菌株，而且这些菌株往往剔除了负突变而集多种正突变于一体，因此在很大程度 上弥补了经典诱变方法的缺陷。从理论上而言，基因组改组技术是整个基因组的循 环重组，可以同时在整个基因组的不同位点重组，将亲株的多个优良表型通过多轮 的随机重组集中于同一株菌株，与代谢控制育种相比，其突出优点是不必了解整个 基因组的序列数据和代谢网的信息h 6 1 。 1 2 2 3g e n o m es h u f f l i n g 育种优势的验证 在y i n g - x i nz h a n g 等人的研究中，以四株营养缺陷型的泰乐菌素的生产菌，弗 氏链霉菌( s t r e p t o m y c e sf r a d i a e ) 为模型进行重组进行了一系列实验。以四株营 养缺陷型的弗氏链霉菌为模型进行链霉菌之间的重组，实验表明采用的原生质体融 合是实现基因组重组的十分有效的办法，重组有效率超过2 0 。检测四株经多营养缺 陷型的链霉菌的原生质体重组的后代发现，重组中含有两个标记的重组后代为3 ， 含有三个标记的为0 0 4 ，四个标记为0 0 0 0 0 5 。四轮无选择性条件的原生质体融合 再生结果表明，后代中带有多重正向进化标记重组子出现的几率是采用原始诱变育 种方法的4 0 - 1 0 5 倍h 1 。证明了多轮递推原生质体融合可以有效地将多个亲本株的优良 基因整合在同一个细胞株中，这一结果为多基因重组提供了有效依据，使得我们可 以通过d n a 改组，增加多基因重组的几率，获得含有多个亲本遗传信息的更有意义 的子代。 另外，他们还从同一菌株s f l 出发，比较了g e n o m es h u f f l i n g 与诱变育种对 第1 章绪论 s f r a d i a e 生产能力提升的效率。试验中所用菌株s f l 是从自然界中分离到的野生型 稳定单克隆；s f 2 1 是s f l 经过2 0 轮常规诱变得到的泰乐菌素高效生产菌株，m a x g e n 公司将野生型菌株s f l 先进行了一轮常规诱变，然后通过两轮基因组改组，得到两个 高产的菌株g s l 、g s 2 。经分析g s l 、g s 2 的泰乐菌素产量是s f l 的9 倍多，e l s f 2 1 还要 高，从统计学上分析与s f 2 1 差异不大( 图1 - 2 ) ；但从生理学角度上看，g s l 、g s 2 跟 s f 2 1 相比有明显的差异，s f 2 1 成的是粗糙的小的单克隆，而g s l 和g s 2 与野生型s f l 菌落形态相似，这一现象显示g s l 、g s 2 是 l s f 2 1 更加性状优良的菌株。从上面的结 果我们可以看到弗氏链霉菌通过两轮基因组改组得到了普通诱变剂需要2 0 轮诱变才 能得到的结果。从理论上讲，这是传统诱变过程与基因组改组之间的差异。而对于 研究者而言，2 4 ，0 0 0 次实验与1 ，0 0 0 ，0 0 0 实验之间的区别，也就是一年的努力与2 0 年工作的差异( 见图1 - 2 ) 。 回臣亘至习 t 。 t g s t n t g ，+ 。土上 基因组改 u v ，! 重咎种 翥_ 焉。 a n ( h ；2 0 6 篆， 2 4 t , - j ：1 o yo o i kt 株 g s 诱变；1 0 6 株 一一” 处理童 t 。 t n 1 g t l s fl i 图1 - 2 诱变育种与基因组改组选育效果比较 f i g 1 - 2c o m p a r e so fb r e e d i n gm o t h o db e t w e e ng e n o m es h u f f l i n ga n dc l a s s i cm u t a g e n s i s 由此可见，基因组改组技术可以大幅度地缩短菌株选育周期，同时基因组改组 技术采用的递推式重组技术在挑选种群中明显地增大了菌株的进化几率，扩大了变 异范围，增加了获得高产突变菌株的机会，可使得目的菌株更快地投产，产生效益。 1 2 3 基因组改组技术的应用 g e n o m e s h u f f li n g 技术诞生以来，短短几年时间里，在工业生产菌种改进及开 福建师范大学罗剑硕士学位论文 发方面就获得了成功的应用，受到了学术界极大的关注。 1 2 3 1 用于改进微生物代谢产物产量 在提高微生物代谢产物产量的研究上，徐波等人以稀有放线菌替考游动放线菌 为研究对象，以产量抗性物质标记菌株，探索稀有放线菌次级代谢产物产生菌的基 因组重排育种的基本规律，在1 年内对替考游动放线菌进行了三轮基因组重排育种， 共筛选了6 4 8 株，结果其替考拉宁产量从原始株的1 8 2 5 u m l 提高至u 3 0 1 6 u m l ，增长 6 5 3 ，而传统的诱变育种方法达到此目标，通常需耗时3 4 年筛选2 5 0 0 0 3 0 0 0 0 株 菌才能实现口1 。柠檬酸作为一种食品添加剂被广泛地用于食品和饮料中，h c a ( 羟基 柠檬酸) 在柠檬酸的第二个碳原子上有一个羟基，具有四种立体异构体以及它们的 内酯形式。其中，( 2 s ，3 r ) - h c a 能抑制胰腺q 一淀粉酶和肠q 一葡萄糖苷酶，降低糖类 的代谢和血液中胰岛素的水平，可用于糖尿病的治疗。传统方法选育( 2 s ，3 r ) 一h c a 的高产菌株一直不太理想。日本学者h i r o y u k ih i d a 等人用n t g 诱变处理链霉菌 ( s t r e p t o m y c e ss p ) u 1 2 1 的孢子，获得突变菌株的基因组库，然后通过三轮的基 因组改组，获得的菌株产h c a 能力比原始出发菌株产量高5 倍以上，三角瓶培养显示 细胞生长速度也获得了大幅提高陋1 。李立风等人利用一株分离、纯化的酱油曲霉， 制备其分生孢子的原生质体，将分生孢子的原生质体进行紫外诱变，得到7 株酶活提 高幅度较大的紫外诱变株，以此作为候选株文库，采用基因组改组，进行了两轮多 亲株灭活电融合，获得9 株酶活大幅度提高的菌株嘲。 1 2 3 2 用于改进微生物多基因调控表型的进化和对环境的适应性 在菌株次级代谢产物合成和代谢途径调节机制并不清楚的情况下，通过多轮循 环的基因组改组，可以迅速将决定某一理想表型的多个甚至数十个突变基因组合在 一起而达到菌种改进的目的。例如，微生物耐酸性的调节机制是非常复杂的，乳酸 生产菌l a c t o c o c c u sl a c t i s x e i k 乇p h 值的耐受性与散布在基因组上的1 8 个插入突变点 有关，并涉及到低p h 值环境下的多种生长保护机制，对乳杆菌的蛋白质组比较分析 也表明，在酸性生长环境下有6 3 种不同的蛋白质被协同诱导表达n 们。因此，通过d n a 重组技术或诱变的方法来提高微生物的耐酸性是非常困难的。2 0 0 2 年，r a n j a n p a t n a i k 等将基因组改组应用于乳酸生产菌l a c t ob a c i l l u s 的低p h 耐受性的改良， 通过5 轮基因组改组得到在p h 3 8 的酸性环境下生长良好的菌株。经过9 6 孔培养板、 l o m l 试管、2 5 0 m l - - - 角瓶以及1l 发酵罐 f l 氐p h 发酵培养验证，乳酸收率均比出发菌株 第1 章绪论 提高了2 3 倍n 引。王玉华等研究人员用紫外线与亚硝基胍两种传统微生物诱变方法 对干酪乳杆菌( 1 a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 进行诱变，经低p h 平板、碳酸钙平板和摇瓶 试验获得了5 株耐酸性提高的突变菌株，以此为出发菌株，用灭活双亲原生质体融合 后致死损伤得到互补获得活性融合子的方法，对其进行基因组改组。改组菌株能够 在原始菌株无法生存的p h 条件( p h3 4 ) 下生长，在p h3 8 的条件下，改组菌株产酸量 为原始菌株的2 4 倍1 。相类似的成功例子还有应用基因组改组提高微生物对有毒物 质的耐受性和降解能力。p c p ( 五氯苯酚) 是一种不易降解的高毒性杀虫剂，在含有p c p 的土壤中分离到的s p h i n g o b i u mc h l o r o p h e n o l i c u m 可将其完全降解，但是该菌对于 p c p 的降解速度很低且耐受力较差。m i n g h u ad a i 等通过三轮g e n o m es h u f f l i n g 获得 了7 株p c p 降解菌株，所获得菌株对剧毒杀虫剂五氯苯酚的耐受浓度提高了1 0 倍以上， 并可将培养基中所含的3m m o l lp c p 完全降解n 羽。随后的分析表明，基因组改组将 多种有益的突变组合在了一起，其中包括菌体生长速率的提高、五氯苯酚降解酶的 组成型表达和对五氯苯酚耐受性的提高。 1 2 3 3 用于提高微生物菌株的遗传多样性 目前对真核微生物运用基因组改组成功的例子还鲜见报道，但也取得令人鼓舞 的成就。施巧琴、林峻等运用基因组改组技术对碱性脂肪酶产生菌扩展青霉 ( p e n i c i l l i u me x p a n s u m ) f s 8 4 8 6 菌株进行了选育，经过两轮递推式原生质体融合， 最后获得的菌株b 一9 l 与原来出发菌株相比，耐热性提高了7 ，产量提高了三倍以 上n 引。他们还使用r a p d 随机引物对出发菌株和改组菌株进行多态性分析，通过计算 机软件计算供试菌间的遗传距离并构建聚类图，尝试在分子水平分析亲代和改组子 代在实验室定向进化过程中的遗传关系。结果表明：子代菌株b 9 1 与亲本f s 8 4 8 6 遗 传关系最近( 遗传距离0 2 9 1 2 ) ，子代菌株b - 8 8 8 则与亲本f s - 1 3 2 聚成一个类群 ( 遗传距离0 4 2 8 5 ) 。表明在基因组改组中，由于d n a 重组的随机性，使得子代菌 株与亲本间的遗传关系不一致，但均有一“主效亲本现象。结果还表明，经基因 组改组的两供试子代菌株间的遗传距离( o 6 5 9 3 ) 高于两亲本间的遗传距离( o 5 4 4 ) ， 说明基因组改组可有效提高子代菌株的遗传多样性n 3 1 ，这为进步改良菌株提供了 丰富的资源，这也是基因组改组技术比传统育种技术更具有生命力的重要原因，对 保护重要的工业微生物资源也具有重大意义。 福建师范大学罗剑硕士学位论文 1 2 3 4 与其他生物技术相结合大幅改进微生物性状 尤其值得一提的是，目前，科研工作者已经开始将g e n o m es h u f f l i n g 技术与d n a 重组技术和代谢工程相结合起来。例如，陈涛等科研工作者综合应用基因组改组和 d n a 重组技术改进了核黄素生产菌b s u b t i l i s 的性状，首先在b s u b t i l i s 菌株的染色 体上整合和扩增了多个核黄素操纵子拷贝，并经过两轮的基因组改组后筛选所得的 菌株b s u b t i l i s3 3 p m x 4 5 与原始菌株b s u b t i l i s2 4 p m x 4 5 相比，核黄素的产量增 加了1 倍，并具有快速同化利用葡萄糖、生长迅速、可形成感受态和进行基因整合、 扩增等优良性状n4 1 。由于菌株b s u b t i l i s3 3 p m x 4 5 具有一系列优良的性状，可以作 为新一轮基因组改组的基因组库的一个新基因组。 1 2 3 5 基因组改组技术应用面临的难点 g e n o m es h u f f li n g 技术有两个重要部分：其一是正突变基因组文库的筛选，这 是进行有效的基因组改组的前提。另一个是筛选模型的构建，此项工作艰巨而重要， 需要寻求育种目的与相应表型的直接或间接关系，这也是决定基因组改组能否广泛 应用的一个重要限制因素。此过程中，除了首先要对原生质体的制备、融合和再生 的最佳条件进行探索外，对融合子的挑选应根据菌种的特点设计筛选模型畸1 ，常用 方法有利用营养缺陷型标记、抗药性等，但是由于这些方法固有的缺点，在多亲本 融合中都难以实行。目前，对产酶菌株的筛选尚有一些相对可行的方法，如采用琼 脂板法、水解圈法、灿烂绿法等结合进行n 引，初筛获得的少数优良菌株再分批进行 复筛，最后分离出综合双亲优势的重组体。而筛选对象产物为次级代谢产物的话则 困难得多。在笔者所进行的荨麻青霉( p e n i c i l l i u mu r t i c a eb a i n i e r ) 基因组改组中， 采用的是琼脂板抑菌圈的方法并结合形态指标进行初筛，复筛则直接比较产物合成 及发酵水平。然而由于其代谢产物灰黄霉素( g r i s e o f u l v i n ) 为胞内次级代谢产物， 生产周期长，这种常规方法依然显得工作量过大、筛选效果不太显著。 相比而言，在d n a 改组中，目前已开发了一些集计算机控制、自动化操作、高灵 敏度检测、数据自动采集和处理于一体的高通量筛选方法，可以实现快速、微量、 灵敏和大规模的筛选，其中一类比较重要的是荧光激活细胞分类法( f l u o r e s c e n c e a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g ，f a c s ) ，例如：a r n o l d 等n 钉利用山葵过氧化物酶( h r p ) 可 以将苯酚或儿茶酚等具有羟基的芳香族化合物连接成可发出荧光的二聚体的原理而 开发了一种高通量的荧光数字成像筛选方法，这种方法可以快速从d n a 改组后得到的 第1 章绪论 大量产物中筛选出活性得到提高的加氧酶( 该酶催化芳香族化合物的羟基化反应) 。 此外，凝胶微滴技术( g e lm i c r o d r o pt e c h n o l o g y ) 、细胞指示剂法( c e l l - c e l l i n d i c a t o ra s s a y ) 等也在高通量筛选中有着成功的应用，但总的来说，由于高通量 筛选方法都具有较强的专一性，仍然亟需开发和完善针对各种生物加工产品的高通 量筛选方法来促进d n a 改组和基因组改组在代谢工程中的应用。 对基因组改组而言，能否构建一个融合子及高效菌株的高效率筛选模型，将直 接影响到基因组改组技术的应用。 1 2 4 基因组改组技术的展望 由于g e n o m es h u f f l i n g 技术为一些经过多年诱变、对理化诱变因素己不太敏感 以及不便于利用d n a 重组等技术改进的菌株提供了新的改良方法，因此早在该技术 诞生之初，就有学者认为，该技术的出现是“细胞改良中的一个重要里程碑”n 羽，该 技术的建立与成熟“将引起传统微生物育种及发酵生产的一场革命“。实践表明 该技术能优化大多数工业微生物的代谢途径和表型，操作直接和比较简便，缩短了 育种周期。此外，重组得到的菌株与基因修饰的有机体不同，可以直接用于食品工 业1 。因此，该技术的出现已经成为菌种选育的巨大推动力。 1 2 4 1 基因组改组技术与基因工程技术手段相结合的展望 目前，基因组改组研究已经开始与基因工程技术手段相结合并已取得初步成果。 其基本思路是，利用重组d n a 技术对细胞的多种不同基因进行定点改造和修饰，可以 得到各种改造后的细胞组成多样性的基因组库，然后通过循环的基因组改组筛选集 多个改造基因于一体的细胞，这样可以极大地加快工程菌株的构建进程，减少对菌 种进行多基因改造和组合的困难，并明确改组优化的原因或本质。 1 2 4 2 基因组改组技术应用于代谢工程的展望 基因组改组不仅用于菌种表型的改进，还可以对不同的优良性状进行组合，进 而对代谢途径进行优化，因此在代谢工程中显示出了极大的应用潜力n 引，它还为代 谢工程、基因组学、蛋白质组学等学科提供了大量的素材和研究方法。虽然基因组 改组可以快速改进工业生产菌种或优化代谢途径，但是仅仅通过基因组改组很难使 人们了解发生改进或优化的原因。这促使科研工作者将g e n o m es h u f f l i n g 技术与代 谢工程的各种分析方法相结合，以期望阐明表型或代谢途径得到优化的分子机制， 福建师范大学罗剑硕士学位论文 甚至发现代谢网络中一些未知的调节机制，包括基因组测序、基因一表型作图、 t r a n s c r i p t i o n a lp r o f i l i n g 、p r o t e i ne x p r e s s i o n p r o f i l i n g 、m e t a b o l i t e p r o f i l i n g 等在内的各种高通量的分析方法将在促进两者结合的过程中起着重要作 用，例如：最近g i l l 等n 刀提出的一种高通量的并行基因表型作图法( p a r a l l e l g e n e t r a i t m a p p i n g ，p g t m ) 就可以用于改组后产生的大量嵌合基因组的比较分析， 从而快速确定基因和表型的相关性。 可以预见，g e n o m es h u f f l i n g 技术的进一步应用发展，以及与重组d n a 技术、 代谢工程及其分析方法等其它生物技术相结合，将会在功能基因组学的研究、揭示 基因型和表型的关系以及工业微生物菌种的改进等方面发挥越来越重要的作用。 1 3 本课题的研究内容及目的意义 抗生素在人们生活中应用越来越广泛，在维护人类健康、防治各种感染性疾病 方面做出了巨大贡献。灰黄霉素( g r i s e o f u l v i n ，是1 9 3 9 年从灰黄青霉 ( p e n i c i l l i u mg r i s e o f u l v i n ) 培养液中得到的一种含氯代谢产物，1 9 5 8 年开始用于 临床。1 9 6 0 年中国医学科学院抗生素研究所从我国土壤中得到灰黄霉素的生产菌， 并研究试制成功灰黄霉素n 踟。灰黄霉素是非多烯类抗真菌抗生素，已被广泛地用于 人体真菌感染的治疗n 引，临床用于头癣、迭瓦癣、皮肤癣及手足甲癣等体表真菌感 染，特别对头癣的疗效显著，国内治愈率在9 0 以上n 刖。苹果中有一种念珠菌病，是由 一种叫做苹果核盘菌引起的疾病，在花授粉期间感染，使苹果的中心腐烂，灰黄霉素 对这种感染有特效呦2 。 我国是世界上灰黄霉素最大的出口国，由我院选育的耐前体灰黄霉素高产菌株 荨麻青霉( p e n i c i l l i u mu r t i c a eb a i n i e r ) 已投入生产。该菌株具有高发酵效价，耐前体氯 离子，具有产淀粉酶活性，能直接利用大米粉原料做碳源，高糖低p h 低氮发酵及 耐泡敌等优良的发酵特性，达到国际领先水平。由于该菌株所需的发酵周期较长， 一般需要8 1 2 天，增加了生产成本和生产周期。因此，本实验拟通过基因组改组 技术，以筛选出发酵周期较短或效价较高的灰黄霉素菌株，以便降低生产成本，最 终大规模应用于森林、牧场的大面积灭菌以及农业真菌的防治等领域。 第2 章荨麻青霉原生质体的制各与再生 第2 章荨麻青霉原生质体的制备与再生 2 1 材料和方法 2 1 1 菌株 荨麻青霉( p e n i c i l l i u mu r t i c a eb a i n i e r ) 菌株h 0 6 ，由福建师范大学生命科 学学院施巧琴教授提供。 2 1 2 培养基 ( 1 ) 菌种斜面培养基： 蔗糖3 0 f e s 0 40 0 0 1 p h 自然 ( 2 ) 查氏液体培养基： 蔗糖3 0 f e s 0 40 0 0 1 ( 3 ) h m m 培养基 葡萄糖4 o f e s 0 4 0 0 0 1 ( 4 ) p m a 培养基： 葡萄糖4 o f e s 0 40 0 0 1 酵母膏0 2 ( 5 ) p d a 高渗培养基： 查氏培养基添加麸皮 k h 。p 0 40 1 m g s 0 4 0 0 5 k h 。p 0 40 1 m g s 0 4 0 0 5 k h 。p 0 40 1 m g s 0 4 0 0 5 k h z p o 。0 1 m g s 0 4 0 0 5 p h 6 0 n a n 0 30 2 琼脂2 o k c l0 0 5 麸皮3 0 n a n 0 3 0 2 k c l0 0 5 p h 自