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几种手性化合物的色谱分离方法研究 闫焕英 摘要：手性化合物的存在是自然界的一种普遍现象。随着科学和技术的发展， 人们对对映体的分离有了更加深入的认识，在生物化学、药物化学及有机化学中 的不对称合成和催化技术中，对映体的分离与分析显得越来越重要。因此对手性 对映体的拆分是很有必要的。目前，用于手性化合物拆分的主要色谱分离方法有 薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱和毛细管电泳法等。其中薄层色谱、高效液 相和毛细管电泳在目前手性化合物的分离中发挥着极其重要的作用。 本文首先利用毛细管电泳成功地对七种手性化合物进行了拆分，并考察了影 响分离的因素。另外，合成了三种纤维素的衍生物，把它们制成薄层板或将其涂 布在硅胶上，即可得到一类分离范围极广的手性固定相。通过实验条件的优化， 使被分离物质在纤维素衍生物薄层板上得到了很好的分离，并且探讨了纤维素衍 生物手性固定相的分离机理。 本论文研究主要分为四部分： 第一章内容；介绍了手性化合物对映体分离研究的背景、意义和手性化合物 对映体分离的方法。对p i r k l e 型手性c s p s ，纤维素衍生物类手性c s p s ，环糊精 型c s p s ，大环抗生素类c s p s 等进行了简要的评述。 第二章内容：本章以本实验室合成的h p b c d 作为毛细管电泳手性分离的手 性选择剂，采用正极进样，利用高效毛细管电泳对氧氟沙星、扑尔敏、苯丙氨酸 等七种手性化合物的分离进行了研究，获得较文献报道要好的分离结果。其中， 组氨酸在没有用荧光试剂对其进行柱前衍生化的情况下，使其达到基线分离。在 手性化合物的毛细管电泳分离过程中，关键的问题是最佳分离条件的选择，在实 际研究中需要大量的实验摸索，我们考察了背景电解质的p h 、手性选择剂浓度及 电解液种类和操作电压等对分离的影响。 第三章内容：以微晶纤维素为原料，苯甲酰氯、对氯苯甲酰氯和邻氯苯甲酰 氯为改性试剂，采用超声方法合成了3 种纤维素手性固定相。在合成三( 4 氯苯甲 酰基) 纤维素和三( 2 氯苯甲酰基) 纤维素反应中，优化工艺条件，加入催化剂 禾二甲基胺基吡啶，使反应产率大大提高。产物用核磁共振氢谱、红外光谱和元素 分析对它们进行了结构表征。分别将三种手性固定相与一定比例的微晶纤维素混 合制备手性薄层板，得到机械性能好、表面均匀光滑的手性薄层板，用来拆分了8 种手性化合物，通过色谱条件的优化使2 一( 9 一蒽基) 一2 一甲氧基乙酸、2 一( 9 一蒽基) 一2 一 羟基乙酸、苯丙氨酸和萘普生等8 种手性对映体达到了完全分离，并探讨了纤维 素衍生物手性固定相的分离机理。 第四章内容：合成了手性填料纤维素衍生物，并涂敷于氨丙基硅胶上，制备 成手性固定相。我们通过电子透射显微分析考察了不同涂敷方式( 沉积法和蒸发 法) 对涂敷型硅胶质量的影响。 最后，对整个论文做了总结。 关键词：手性固定相纤维素衍生物薄层色谱毛细管电泳手性拆分 玎 t h es t u d yo fc h i r a ls e p a r a t i o nm e t h o d so fs e v e r a lc h i r a l c o m p o u n d sb yc h r o m a t o g r a p h y y a nh u a n y i n g a b s t r a c t ：i ti sa nu n i v e r s a lp h e n o m e n o nt h a tc h i r a lc o m p o u n d se x i s ti nn a t u r e w i t ht h ed e v e l o p m e n to fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , p e o p l eh a v eh a dad e e pi n s i g h ti n t o t h ep h e n o m e n o no ft h ee n a n t i o s e p a r a t i o n t h e r e f o r e ，i ti sb e c o m i n gm o r ea n dm o r e i m p o r t a n tt oa n a l y z ea n ds e p a r a t e e h i r a ls u b s t a n c e si nb i o c h e m i s t r y , m e d i c i n a l c h e m i s t r y , a n do r g a n i cc h e m i s t r ya sw e l la sa s y m m e t r i cs y n t h e s i sa n dc a t a l y s i s s of a r ， t h e c h i l 褂s e p a r a t i o n sw i t hc h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d sa r em a i n l yp e r f o r m e db y t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) ，g a sc h r o m a t o g r a p h y ( g c ) ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n dh i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) ，e t c t l c h p l ca n dh p c ea r et h em o s tf r e q u e n t l yu s e dm e t h o d si ns e p a r a t i o n so fc h i r a l s u b s t a n c e s f i r s t l y , s e v e nc h i r a lc o m p o u n d sw e r eu s e da st a r g e t sf o rc h i r a ls e p a r a t i o nb yh i g l l p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si nt h i st h e s i s t h ei n f l u e n c eo f v a r i o u sf a c t o r sw a s s y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d s e c o n d l y , t h r e ek i n d so fc e l l u l o s et r i s ( b e n z o a t e ) sw e r e s y n t h e s i z e df r o mm i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e t h ec e l l u l o s ed e r i v a t i v e sw e r eu s e di n t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h ya n dw e r ea l s oc o a t e do n t os i l i c ag e lt op r e p a r ec s p t h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e da n do p t i m i z e da n dt h ec h i r a lr e c o g n i t i o n m e c h a n i s m so f t h e s ec s p sw e r ed i s c u s s e d t h ep r e s e n tp a p e rr e s e a r c hm a i n l yc o n s t i t u t e st h ef o l l o w i n gf o u rp a r t s ： t h ef i r s tc h a p t e r ：h it h i st h e s i s ，t h el i t e r a t u r e so nc h i r a is e p a r a t i o nw e r eb r i e f l y r e v i e w e d t h ek i n d so fc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e sw e r ei n t r o d u c e d ，e s p e c i a l l yp i r m et y p e c s p s ，c e l l u l o s cd e r i v a t i v e sc s p s ，c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v e s ( c d s ) c s p sa n dm a c r o c y c l i c g l y c o p e p t i d ec s p s t h e s e c o n dc h a p t e r ：i nt h i sp a r t ，s e v e n c h i r a lm o l e c u l e sw e r es u c c e s s f u l l y s e p a r a t e da n dg o o dr e s u l t sw e r eo b t a i n e db yh i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s u s i n gh p - 1 3 - c y c l o d e x t r i na sc h i r a is e l e c t o rw h e nt h e yw e r ei n j e c t e df r o mc a t h o d e t h e e f f e c t so f t h ep ho f t h eb u f f e r , t h ec o n c e n t r a t i o n so f t h ec dd e r i v a t i v e s ，t h et y p eo f t h e b a c k g r o u n de l e c t r o l y t ea n dt h ea p p l i e dv o l t a g eo nc h i r a is e p a r a t i o nw e r es y s t e m a t i c a l l y i n v e s t i g a t e d 、 t h et h i r d c h a p t e r ：t h r e e k i n d so fc h i r a ls t a t i o n a r y p h a s e s - c e l l u l o s e 1 1 1 t r i b e n z o y l ( c t b ) ， c e l l u l o s e t r i s ( p - c h l o r o b e n z o a t e ) ( c t p c b ) a n dc e l l u l o s e t r i s ( o e h l o r o b e n z o a t e ) ( c t o c b ) w e r eu l t r a s o n i c a l l yp r e p a r e db y t h er e a c t i o no f m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e w i t i l b e n z o y lc h l o r i d e p c h l o r o b e n z o y l c h l o r i d ea n d o - c h l o r o b e n z o y lc h l o r i d e t h e yw e r ec h a r a c t e r i z e db y1 n n m r , i rs p e c t r o m e t r ya n d e l e m e n t a l a n a l y s i s 1 1 1 ec h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e sw e r em i x e dw i t hm i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s ea n du s e di nt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h i cf o rt h es e p a r a t i o no fs o m ec h i r a l c o m p o u n d s e i g h tc h i r a lc o m p o u n d sw 9 1 ec o m p l e t e l ys e p a r a t e da f t e ro p t i m i z a t i o no f m o b i l ep h a s e s t h ec h i r a lr e c o g n i t i o nm e c h a n i s mo fc s p sw e r ea l s od i s c u s s e d t h el a s tc h a p t e r ：c e l l u l o s et r i s ( b e n z o a t e ) sw e r es y n t h e s i z e db yt h er e a c t i o no f m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s ew i t hb e n z o y lc h l o r i d e ac h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ew a sp r e p a r e d b yc o a t i n gc e l l u l o s et r i s ( b e n z o a t e ) so nt h es i l i c t h ei n f l u e n c eo nc h i r a ld i s c r i m i n a t i o n o ft h ec o a t e dl o a d i n g sw a yw a sp e r f o r m e d t h es u r f a c et o p o g r a p h i e so ft h ep a c k i n g m a t e r i a l sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e db yt h es c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e a tt h el a s t ，t h e r ei sas u m m a r ya b o u tt h ep r o g r e s s e so f t h ep a p e r k e yw o r d s ：c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，c e l l u l o s et r i s ( b e n z o a t e ) s ，t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，e n a n t i o s e p a r a t i o n 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：圈龌墓日期：2 翌2 ：苎：寥 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：! 塑壅基 第一章手性化合物分离的研究进展 1 1 引言 手性( 英文名为c h i r a l i t y , 源自希腊文e h e i r ) 是用来表达化合物分子结构不对 称性的术语，被认为是三维物体的一个基本属性。如果一个物体不能与其镜像重 合，就称其为手性物体。正如一个人的左手和右手在三维空间中可以对称，但是 不能重合，即左手不能与左手的镜像重合，彼此是实物和镜像的关系。这种关系 在化学中称为“对映关系”，具有对映关系的两个物体互为“对映体”。有很多化合物 分子，构成它们的元素完全相同，但原子排列方式不同，彼此如同镜子内外世界 的对应，也就是具有手性，它们就互称为“对映体”，统称光学异构体，对它们的识 别与区分，通过判别其光学特征进行，分别叫做右旋( d ) 、左旋( l ) 和外消旋( d l ) 。 在自然界中，手性现象无处不在。化合物分子含有某些不对称因素时，该化 合物被称为手性化合物。随着人类在生物工程和生命科学上的发展，科学家己经 认识到，手性化合物例如手性药物异构体尽管其物理和化学性质几乎完全相同， 只有旋光性不同，但他们在生物体内的生理活性和药理作用却存在很大的差别。 最经典的例子是t i l a l i d 锄i d e u l ，也叫反应停，曾在欧洲广泛使用，为孕妇减缓妊娠 反应用于临床。结果此后几年中，发现许多早期服用这种药物的孕妇，其婴儿有 严重的畸形现象。1 9 6 1 年被禁用。通过研究发现，其r 构型具有良好的镇静作用而 s 构型却导致胎儿畸形。还有像抗心率失常药物心得安( p r o p a n o l 0 1 ) 的l - ( 一) - 异构体药 理活性比d ( + ) 异构体大1 0 0 倍；又如熟知的外消旋的氯霉素的疗效仅为d - ( - ) 氯霉 素的一半；d 天门冬素是甜味，而l 坝是苦味1 2 1 ；( ) 美沙酮是强止痛剂而( + ) 美沙 酮则无效，这些研究唤醒了人们对异构体的重视。据统计1 3 4 ，目前所用的各种药 物中，5 2 3 种天然及半合成药中手性药有5 1 7 种，1 3 2 7 种全合成药中手性药有5 2 8 种。 而这些手性药物中的7 5 - 9 0 是以外消旋体的形式在市场上销售的i ”。在农药方 面，手性问题也受到广泛的关注。这主要是因为在外消旋体的农药中，其中一半 可能是没有活性的，如果用于洒播在农田，既造成资源浪费，又污染环境。在市 售的近6 5 0 种农药品种中，经证实有1 7 3 个有手性结构，市售的光学性农药只有几 十种。但随着对环境安全、高效、安全的要求，含单一对映体的手性农药将会不 断的发展。鉴于有机分子的构型与其生物活性的的特殊关系，有必要对手性化合 物的各个异构体分别进行考察，了解他们各自的生理活性，以便达到高效、安全、 无污染的用药目的。为此，许多国家都先后规定，在申报手性药物时，必须对不 同光学异构体的生理活性叙述清楚：在制药工业中，必须对有效成分的对映体进 行拆分，而不能将其作为单一药物出售。美国食品与药物管理局( f d a ) 在1 9 9 2 年颁 布了手性药物指导原则【6 】，要求所有在美国上市的外消旋新药，其生产者均需说明 药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。因此建立高专属性，高 灵敏度，高分离度的对映体拆分和测定方法具有重要的理论和实际意义，并且已 成为当今科学领域中的研究前沿。 1 2 手性化合物拆分的方法 手性化合物的拆分，就是将一个外消旋体的两个对映体分开，使之成为纯净的 状态 7 1 。外消旋体的拆分方法有很多种，早期用的大多是直接结晶拆分法：像机械 拆分法、手性溶剂结晶法、接种结晶拆分法；随后又出现了分级结晶法、化学拆 分、生物化学拆分、色谱拆分、萃取拆分以及手性膜拆分，他们都有各自的优点 和缺陷。 直接结晶法是应用最早的手性拆分技术，有多种体系已完成了工业化，但是， 其操作烦琐、流程过长、热量消耗大等缺陷直接制约了它的发展。 分级结晶法是手性化合物的经典拆分方法，即通过与一光学纯试剂反应，生 成非对映异构体，利用他们物理性质的差异达到分离的目的。但这种方法有很多 缺点：光学纯试剂较昂贵、操作费时、后处理麻烦、局限性较大。 化学拆分法是目前应用最广的拆分方法，从简单的化工原料到结构复杂的手 性药物都有化学拆分法的报道，但是由于化学拆分试剂的应用，不但使这种方法 成本高，对环境也有相当大的破坏作用，而且大部分化学拆分法过程冗长，产率 通常不高，对映体光学纯度不高，适用的化合物类型不多，所以化学拆分法的应 用范围在不断缩小滞j 。 生物化学拆分技术的优点是反应条件温和、收率高，并且一般不会造成环境 污染。但不足之处是可利用的酶制剂品种有限、酶易被破坏、容易失活等，限制 了生物化学拆分的推广1 9 j 。 随着现代科学技术特别是仪器分析技术的发展，科学家们已经把注意力集中 在手性化合物的色谱分离方法的研究上。不对称合成的发展也促进了手性色谱法 的建立以测定合成的起始物、中间体和最终产物。色谱技术已成为当前手性分离 的主要工具，手性分离也成为色谱科学的重要的研究对象。 目前，常用的有薄层色谱( t l c ) ，高效液相色谱( h p l c ) ，气相色谱( g c ) 以及最 新发展的高效毛细管电泳( h p c e ) ，h p c e 集分离与测定于一体，可实现复杂基质下 对映体的定性、定量及纯度的测定。其中，高效液相色谱( h p l c ) 手性分离研究开 展较早，其分析范围广，速度快，操作简单，几乎可以分析所有手性化合物，对 手性物质的分析及分离方面具有决定性优势，因此一直成为研究的热点。气相色 谱虽然也是e 1 前用于分析的主要手段，但是它限于挥发性组分的分析，限制了其 2 应用。这里重点介绍薄层色谱( t l c ) 拆分法、高效液相色谱( h p l c ) 拆分法和高效毛 细管电泳( h p c e ) 拆分法。 1 2 1 薄层色谱( t l c ) 拆分法 t l c 是最简便的色谱技术之一，其分离方式有手性试剂衍生化( c d r ) ，手性流 动相添加剂法( c m p a ) 和手性固定相法( c s p ) 等，用的较多的是c s p 法。薄层色谱具 有操作简便、设备简单、分析速度快、结果直观、能快速更换流动相系统等特点， 已在化学、化工、生化、医药卫生等各个领域广泛使用。董先明等利用薄层色谱 定性分析萘普生合成中的十种中间体监测反应程度的进行，分析效果较好 1 0 l 。 尽管手性固定相价格、紫外背景、显色剂等原因使的目前能用于t l c 的手性载 体和能被t l c 分离的手性化合物很少，但可以预见它将会成为手性拆分的重要手段 之一，在光学异构体的分离、分析及光学纯度的测定中发挥重要的作用。 手性固定相薄层板常用的有：( 1 ) 纤维素板及预涂纤维素的薄层板，可用于 拆分氨基酸及其衍生物，二肽等对映体。( 2 ) 浸渍手性选择剂的手性薄层板，主 要是浸渍有a 氨基酸烷基衍生物的铜( 1 1 ) 复合物的薄层板。( 3 ) 分子印迹法是 制各具有高选择性的合成高分子的方法。戎非【l l 】等分别以右旋扁桃酸、右旋邻氯 扁桃酸和右旋对氯扁桃酸为模板，丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯为功能单体 和交联剂合成分子印迹聚合物，并以此作为薄层色谱手性固定相。研究了模板分 子消旋体在手性固定相上的分离情况。( 4 ) 将手性选择剂化学键合到载体上，进 行对映体分离的化学键合手性薄层板主要有b 环糊精键合相薄层板、p r i c k l e 型薄 层板和萘乙基脲型薄层板，朱全红将p c d 键合相用苯基异氰酸及3 ，5 二硝基苯 甲酰氯进行衍生化，制备了衍生化的b c d 键合相薄层板，在反相色谱条件下分离 了氨基酸对映体及一些临床常用的手性药物对映体【坦1 3 1 。徐莉等用三一( 3 ，5 一二硝基 苯甲酰基) 纤维素薄层色谱分离了6 种手性对映体，取得了很好的分离效果1 1 4 j 。 1 2 2 毛细管电泳( c e ) 拆分法 c e 又叫高效毛细管电泳( h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e t r o p h o r e s i sh p l c ) ，是 近年来发展最快的分析方法之一l ”1 ，是8 0 年代经典电泳技术和现代微柱分离相结 合的产物。近年来，h p c e 已经发展成为可以与2 0 世纪5 0 年代末、6 0 年代初出现的 气相色谱( g c ) 以及2 0 世纪7 0 年代初出现的液相色谱( h p l c ) 相媲美的一种分离技 术，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究领域之一。其所以如此，主要 是因为h p c e 具有五个方面的突出特点： ( 1 ) 更适合分析大分子样品。h p c e 不仅能分析h p l c 胜任的中小型分子样品， 而且还能更快速、高效地分离分析h p l c 等技术不易分析的大分子样品( 如核酸、蛋 白质、多肽类药物等) 。 ( 2 ) 基本不存在柱污染的问题。h p c e 所采用的毛细管柱易于全面清洗，不需考 虑中药样品、生物样品和蛋白质样品对柱子造成的污染，只需进行简单的样品前 处理或不需进行样品前处理。 ( 3 ) 分析速度快、分离效率高。h p c e 的分析时间l e h p l c 短，而且柱效高，通 常理论塔板数在1 0 5 以上。 ( 4 ) 实验成本低，消耗少。h p c e 分离多在水介质中进行，消耗的大多为价格低 廉的无机盐类，毛细管长度仅为6 0 7 0 c m ，内径2 0 7 5i t m ，容积仅有几此，进样量 在“l 级或n g 级。 ( 5 ) 操作模式多。只需更换毛细管内溶液的种类、浓度、酸度或添加剂，就可 实现一台仪器多种分离模式。下面简单回顾一下h p c e 的发展历史，并总结了h p c e 的分离模式，综述了h p c e 在药物分析中的应用。 如果以毛细管区带电泳的出现为起点，毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 技术的起源可以追溯到2 0 世纪6 0 年代中期，瑞典科学家h e r t e n 首先提出毛细管 区带电泳的概念。我们今天所说的现代毛细管电泳是由j o r g e n s o n 和l u k a e s 临1 8 l 在1 9 8 1 年创立的。他们使用7 5 1 a m 内径的玻璃毛细管，用电迁移法窄带进样，以 荧光检测器进行在线检测，使丹酰化氨基酸得到了高效的分离，其理论塔板数超 过4 0 0 ，0 0 0 m ，这样高的柱效是以前的分离方法从未达到的。正是他们十分成功的 实验和异常出色的理论工作，使高效毛细管电泳技术跨入了飞速发展的黄金时期。 特别是1 9 8 4 年t e r a t ) e 1 1 9 1 开创了以胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 以来，在c e 中应 用环糊精( c y c l o d e x t r i n ，简称c d ) 分离手性异构体的研究日益增多。此后，毛细管 电泳技术得到飞速发展，在常规药物分析和其他药物研究中发挥着独特的作用， 如以治疗为目的的某一类药物的代谢物组学、药代动力学研究、药品质量控制、 生物制品、毒物及滥用药物的定性定量分析等。c e 具有高效、快速、微量、多模 式、经济、自动化及洁净等优点【2 0 l 。随着与之相关的一系列分析方法和检测联用 技术的不断改进，c e 在化学、生命科学、临床医学、药学等领域得到了广泛的应 用。按分离原理的不同，电泳可分为四种类型：区带电泳( z o n e ) 、移动界面电泳 ( m o v i n gb o u n d a r y ) 、等速电泳( i t p ，i s o t a c h o p h o r e s i s ) 和等电聚焦电泳( i n ， i s o e l e c t r i c ) 。对于它们的原理在此作一简单介绍： ( 1 ) 区带电泳是不同的溶质在均一的缓冲溶液系统中分离成独立的区带，如 果用光密度计扫描可以得出一个个互相分离的峰，与洗脱色谱的图形相似。电泳 的区带随时间延长和距离加大扩散严重，影响分辨率。 ( 2 ) 移界电泳，它只能起到部分分离的作用，迁移到毛细管最前面的成分有 部分是纯的，其他则互相重叠，各界面可用光学方法显示。 4 ( 3 ) 等速电泳原理是，样品离子置于前导和终末电解质之自j ，在电泳达到平 衡后，各迁移率不同的离子前后相随，以等速移动。它的区带没有重叠，是依次 排列。 ( 4 ) 等电聚焦电泳的原理是被分离的离子和两性电解质溶液混合装入毛细管， 在电场的作用下，不同等电点的两性载体电解质自动形成梯度，被分离离子各自 移至其等电点，形成很窄的区带，分辨率很高1 2 l j 。 毛细管电泳手性分离有两种基本策略，一是构建手性分离环境，二是手性消 除。手性消除反应需要昂贵的手性反应试剂，产物的手性不易恢复。构建手性环 境只需将手性物质引人至t j c e 分离通道中，样品通过手性相互作用来改变迁移速度， 最终获得分离，不触及样品本身，具有简便、快速、高效、发展空间大等特点， 已被普遍采用并迅速发展。较常用的有毛细管区带电泳法( c z e ) 。胶束电动色谱法 ( m e c c ) 和毛细管电色谱法( c e c ) 。 毛细管区带电泳法c z e 是c e 中最基本、最普遍的一种模式。各类手性试剂加 入到缓冲液中，实现多种手性异构体的分离：胶束电动色谱法( m e c c ) 涉及电渗电 泳和色谱分配过程，在缓冲液中加入表面活性剂形成胶束相，分离机理为分析物 在水相和胶束相中多次分配以达到分离目的。胶束体系可分为单一胶束、混合胶 束和微乳体系 2 2 1 。c e c 是将固定相填充于毛细管柱内或涂布、键合于其内壁，以 电渗流或电渗流结合压力流推动流动相、溶质，根据它们在固定相和流动相之间 的分配及自身电泳淌度的差异而得以分离。c e c 具备h p l c 高选择性，同时具备近 于h p c e 的高柱效。 随着毛细管电泳技术的发展，它除了在分析对象和应用广度上有很大的拓展， 还在分离理论、人工智能优化分离参数、毛细管电泳结合动力学和热力学等理论 研究方面有很大的发展1 2 3 1 。如t r a p p 利用动力学色谱和毛细管电泳技术测定了速率 常数，进而直接计算得到甲琉丙脯酸异构化的势垒刚；m u z i k a 等采用实验设计和 人工神经网( a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k ，a n n ) 相结合的方法，优化了三乙醇胺铬酸盐的 缓冲液，对高浓度氯离子的溶液中含有的硫酸盐进行了测定瞄j 。黄芳理论计算出 扑尔敏对映体与b 环糊精的结合常数，从理论上优化扑尔敏的最佳分离条件1 2 6 j 。 1 2 3 高效液相色谱( h p l c ) 高效液相色谱手性固定相分离测定对映体速度快、柱效高、适用范围广( 可以 用于对热稳定性差和极性农药的分析) 且分离能力强，h p l c 比g c 法更具有优越性 2 7 - 3 3 1 。于是也就成了手性药物分离的首选技术平台之一。高效液相色谱较气相色 谱和电泳技术应用广泛的原因，一是由于所有药物，当然包括手性药物，进入生 物体都是经由生物体的体液来运输而进一步产生作用而决定的，所以几乎所有手 5 性药物都能在高效液相色谱方法中找到适合于其本身特点的分离环境，从这一点 说高效液相色谱优于气相色谱；二是高效液相色谱更易实现生物样品的在线预处 理肩g 实现高度的自动化，现在已经发展成对映体分离比较迅速的领域之一。高效 液相色谱直接拆分法包括手性固定相法和手性流动相添加剂法：手性固定相法是 基于样品与键合到或涂敷于载体表面的手性选择剂间形成暂时的非对映体络合物 的能量差或稳定性不同而达到手性分离；手性固定相法具有很强的特征性，一个 固定相往往只能拆分一类或几类对映体。手性流动相添加剂法是通过对映体与添 加剂流动相中的手性物质形成一对非对映体络合物，由于非对映体络合物的稳定 性在流动相中溶剂化作用或络合物与固定相的键合等性质的差异而得到分离。 利用h p l c 拆分对映体的方法通常有3 种：一是利用手性试剂与被拆分物进行 柱外衍生化反应生成非对应异构体，从而可被传统的非手性h p l c 拆分：二是在流 动相中加入手性添加剂，其可产生非对映体离子对或络合物，便可在色谱上进行 分离；三是利用手性固定相( 简称c s p s ) 直接对对映体进行拆分。最简便和最有效 的方法是手性固定相法( c s p s h p l c ) 1 3 4 】。c s p s h p l c 法之所以能拆分对映体，是 因为在c s p s 与外消旋体相互作用时，其中一个对映体与c s p s 生成不稳定的对映体 复合物，造成在柱淋洗时保留时间不同，从而达到拆分的目的。目前，高效液相 色谱直接拆分手性化合物在药物工业，不对称合成和生物化学方面起着非常重要 的作用。具有不对称手性中心或手性识别能力的手性固定相的开发与研制，是手 性色谱研究的前沿。 目前，手性固定相法直接用于对映体的拆分，具有操作简单，对映体不用衍 生化、定量分析准确、手性色谱柱可长期使用等优点。但手性柱制备困难、实验 成本高；手性流动相添加剂法拆分光学对映异构体不需手性试剂衍生，也不需价 格昂贵的手性柱，而是将手性试剂添加到流动相中，用普通的正相或反相柱分离， 方法简单有效，但需价格不菲的手性添加剂。因此，开发能拆分范围广、价格能 被普遍接受的新型手性选择剂、或几种不同手性选择剂的联合使用、对分离机理 的研究以及新型、高灵敏度的检测方法和联用技术是这一领域研究的热点。可以 预见，随着h p l c 的不断完善，它必将成为色谱技术发展的一个新方向，手性分离 也将会进入一个新的发展阶段。 1 3 常见手性固定相和手性添加剂 手性固定相可由具有光学活性的小分子和聚合物来制备，将手性化合物通过 化学键合到或吸附到硅胶载体上而得至i j c s p 。在过去的2 0 3 0 年中，已开发出多种 类型的商效液相色谱手性固定相【35 1 。h p l c 手性固定相的分类，根据不同的目的， 有不同的分类方法，如被广泛采用的w a i n c r 分类方法，是按照手性固定相与溶质 6 之间的相互作用机理而分为五类。第一类为给体一受体c s p 3 ”，如p i r k l e 型c s p ， 被分析物与c s p 之间通过吸引排斥作用，主要是丌电子给体- 受体机理，形成短暂 的络合物。第二类为纤维素衍生物类c s p s 3 s - 3 9 1 被分析物是通过吸引作用被包容到 固定相的手性空腔中。第三类为主客体络合c s p s 4 ”，如环糊精c s p s 、冠醚类 c s p s ，形成的是包容络合物。第四类为手性配体交换色谱c s p s l 4 2 j ，溶质是所形成 的非对映异构金属络合物的一部分。它是将一个手性氨基酸接到苯乙烯一二乙烯 苯聚合物载体上，经吸附c u 2 + g j n i 2 + 之类的中心金属离子，来拆分氨基酸对映体。 另外还可以拆分一些药物。第五类为蛋白质类c s p s ，溶质与c s p s 通过疏水和极性作 用的结合形成化合物。a l l e n m a r k 等以牛血清蛋白( b s a ) 通过氨基同硅胶键合作为 h p l c 的c s p s l 4 3 1 ，可以分离一系列氨基酸对映体，在许多氨基酸对映体的拆分中 这类c s p 都显示了很好的对映体选择性和拆分效果。 下面仅就蛋白质型c s p s ，刷型( 又称p i r k l c 型) c s p s ，纤维素衍生物c s p s ，环 糊精型c s p s ，大环抗生素类c s p s ，以及其它类型的c s p s 4 4 1 作一简单介绍。 1 3 1 蛋白质型c s p s 许多小的手性分子与血清白蛋白、q 酸性糖蛋白等具有立体选择性的亲和力。 用化学的方法将蛋白质键合到硅胶或其它基质上，即可得到一类很有发展前景的 蛋白质手性固定相。在这一类手性固定相分离手性对映体时，其流动相在绝大多 数情况下是含有低浓度的有机溶剂的缓冲液。当蛋白质手性固定相的柱效很好时， 与蛋白质的亲和力差别很小的对映体都可以得到良好的分离。蛋白质手性固定相 色谱的另一优点是在键合蛋白质保持其原有的结合能力和流动相不影响其手性作 用时，通过色谱参数的测定可以推断蛋白质与药物相互作用的信息1 4 ”。 1 3 2p i r k l e 型c s p s 这类固定相的研究，主要贡献应归功于美国i l l i n o i s 大学的p i r k l ew h 研究组， 因此称为p i r k l c 型或多种作用手性固定相。而且，p i r k l c 还运用非对映异构体化合物 作用的分子模型和对同一系列的各种外消旋体物质的研究，阐明了这类c s p 的手性 识别机理，其立体识别基于三点作用原理。图1 1 给出了3 ，5 一二硝基苯酰基苯甘氨酸 离子( a ) 或共价( b ) 键合到氨丙基硅胶上的一种p i r k l c 型c s p 的结构。 在手性液相色谱领域，p i r l d e 型c s p s 是目前使用量大、适用面广、对手性识别 机理揭示较深的一类重要c s p s 。它们具有确定的化学结构，其共同结构特征是在 手性中心附近至少含有下列基团之一：n 酸或碱芳基：极性氢键给体一受体； 形成偶极相互作用的极性基团；大体积非极性基团，提供立体位阻、范德华力作 用或构型控制作用。在该类c s p s 上的对映体分离通常通过以下几种作用而发生： ( 1 ) 被分离溶质与c s p s 芳环的舡受体和舟授体之间的丌嘎作用；( 2 ) c s p s j 2 的仲胺、 7 羰基基团与溶质的酸性质子、羟基、氨基之间的氢键作用；( 3 ) 偶极一偶极作用；( 4 ) 大体积非极性基团靠近c s p s 手性中心而产生的空间立体效应。 删l 礼p p 。 心i 妒、p 。 1 3 3 纤维素衍生物类c s p s 1 3 3 1 纤维素乙酸酯衍生物手性固定相 纤维素和直链淀粉本身具有手性识别能力，d a l g l i e s h l 4 6 1 曾用纤维素作为手性 吸附剂直接分离氨基酸对映体。但不能作为实际适用的固定相，然而它们的衍生 物作为c s p s 具有较高的手性识别能力，能拆分大量的对映体。纤维素三醋酸酯 ( c t a ) 是第一个被研究的纤维素衍生物手性固定相，可由微晶纤维素的乙酰化得到。 尽管部分乙酰化的纤维素手性识别能力很低，但1 9 7 3 年，h e s s e 和h a g e l 4 7 - 4 9 发现非均相条件下制备的具有微晶结构的纤维素三乙酯( m c n 显示较高的手性识 别能力，对映体化合物可以结合到m c t 的空穴而达到手性分离。t r o g e r 7 s 碱在 这种手性固定相上得到了完全的分离，这种手性固定相特别适合于分离芳香手性化 合物1 4 ”。h e s s e 和h a g e l 认为c t a i 的微晶结构对于手性识别是必须的，但后 来发现，当m c t 溶于溶剂并吸着到硅胶上，或者将在均相条件下反应获得的c t a - i i 直接装柱，虽然手性选择性有所降低，但仍然对很多外消旋体表现出了不同于 m c t 原来的手性识别能力【5 2 - 5 3 1 。他们把这一改变归因于纤维素三乙酯的构象发生 改变。另外将c t 缸i 涂敷到硅胶上，x 射线晶体分析表明，涂敷在硅胶上的c t a 主要是无定形的i 州，这种涂敷型的c t a 由于传质阻力减小，柱效大大提高，也更 加耐用。这一结果清楚地表明，纤维素衍生物手性固定相光学拆分能力很大程度 上依赖于高度有序的结构。纤维素三乙酯的晶体结构与手性识别能力归结有如下 关系：( 一) m c t 手性识别能力随结晶度的增加而降低；( - - ) m c t 即使在均相条件 下制备也有手性识别能力；( 三) 通过涂敷于硅胶会产生高的柱效。 1 3 3 - 2 纤维素苯甲酸酯衍生物手性固定相 纤维素苯甲酸酯衍生物手性固定相是研究较多的纤维素类衍生物，结构如图 1 2 。在各种纤维素苯甲酸酯中，纤维素三苯甲酸酯和它们的衍生物被吸附在大孔 8 硅胶时，显示很好的手性识别能力【5 5 - 5 6 】，羰基是最重要的活性点，苯环上的取代 基可以改变羰基的极性。苯基上有给电子基( 如甲基) 时比吸电子基( 如氨基) 手性识 别能力高，因此增加羰基氧原子上电子云密度可能是重要的。这类c s p s 可以与有 羰基的消旋化合物通过偶极相互作用，与有氨基的化合物通过氢键相互作用而达 到拆分对映异构体。纤维素的3 或4 甲苯基甲酸酯也能拆分各类外消旋体。此外， 这类衍生物的手性识别能力还受到制备过程的影响。c h a n k v e t a d z e 等人1 57 j