（微生物学专业论文）动物源性食品中氯霉素快速检测的elisa方法研究.pdf

动物源性食品中氯霉素快速检测的e l i s a 方法研究摘要氯霉素( c a p ) 是一种高效的抗生素，它可以和大多数药物和饲料添加剂混用，在使用过程中稳定，药效不会降低。由于该药物的广泛使用，使其在动物源性食品中的检出率越来越高，许多发达国家相继禁止或严格限制使用氯霉素，但传统的氯霉素残留分析方法需要昂贵的仪器和专业技术人员，且周期长、成本高，不能满足现场和快速检测的要求，建立高效、灵敏、经济的氯霉素残留分析方法是很有必要的。因此，研究用于检测氯霉素的e l i s a 试剂盒用于食品安全检测，对于保护消费者利益，以及在国际贸易中有重要的意义。本研究对氯霉素人工抗原的合成、抗体的纯化以及e l i s a 检测方法的建立和优化等进行了研究。采用活性酯法和重氮化法，将半抗原氯霉素与小牛血清白蛋i 刍( b s a ) 和卵清白蛋白( o v a ) 偶联，经紫外光谱、红外光谱、s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定证明半抗原与载体蛋白偶联成功。运用合成的免疫原( h a p b s a ) 多次免疫动物，采集抗血清，制备出氯霉素多克隆抗体，经e l i s a 法测定抗体效价可达到1 ：10 0 0 0 0 0 。采用饱和硫酸铵分级沉淀法对采集的抗血清进行初级分离，后利用自制的免疫亲和层析柱对i g g 粗品进一步进行亲和层析纯化，可获得高纯度高特异性的兔抗氯霉素抗体。通过比较不同的酶标记方法，选用混合酸酐法合成酶标半抗原，并用e l i s a 法确定了偶联后h r p 的活性。通过对包被缓冲液、洗涤次数、包被温度、时间、减少非特异性吸附的方法等的筛选，优化了固相抗体酶标抗原直接竞争酶联免疫分析方法。确定以0 0 5 m o l lp h 9 6 的c b s 缓冲液作为包被酶标板的抗体稀释缓冲液，以0 0 1 m o l lp h 7 4p b s 溶液作为酶标抗原的稀释液，以1 0 o v a 的p b s 溶液作为封闭液，固相包被条件为3 7 2 h 最佳。利用优化后的分析条件和酶标半抗原采用直接竞争e l i s a 法进行抗体亲和性和特异性研究。通过方阵试验及筛选得到优化浓度组合为：抗体2 8 3 0 9 9 m l 、酶标半抗原5 3 6 肛g m l 。氯霉素在0 2 6 4 n g m l 浓度范围内，抑制率与浓度呈线性关系，回归方程为y = 一1 4 8 4 3 1 0 9 x + 5 6 6 9 2 ，r 2 = o 9 9 6 5 ，i c 5 0 = 2 8 2 n g m l ，i c l 0 = 0 4 5 1 n g m l 。与其他类抗生素无明显的交叉反应。华中农业大学专业学位硕十学位论文实验中确定了对鸡肉，牛奶和新鲜虾肉中氯霉素的提取方法，据此构建的e l i s a试剂盒可用于样品中氯霉素的快速检测。样品的添加回收率范围在7 2 6 1 1 3 6 之间，变异系数在4 2 6 1 7 7 5 之间。试剂盒性能测试结果表明，其准确性和重现性较好，储存期试验表明试剂盒在4 。c 下可保存4 个月。可用于虾肉，鸡肉，牛奶等样品中氯霉素残留的批量快速，廉价的检测。关键词：氯霉素；多克隆抗体；酶联免疫吸附分析；残留；试剂盒；酶标抗原n动物源性食品中氯霉素快速检测的e l i s a 方法研究a b s t r a c tc h l o r a m p h e n i c o l ( c a p ) i sab r o a d s p e c t r u ma n t i b i o t i ct og r a m - p o s i t i v ea n dn e g a t i v eb a c t e r i a l a n di t sp h a n n a c o d y n a m i ca c t i o ni ss t a b l ei nt h ea n i m a lf e e d sa n dd r u g s a sar e s u l to fa b u s i n gd r u g ，t h er e s i d u ep r o b l e ma p p e a r e ds e r i o u s l y c h l o r a m p h e n i c o lh a sb e e nf o r b i d d e nt oa p p l y i n gi na n i m a lf o o dp r o d u c t i o ni ns o m ed e v e l o p e dc o u n t r i e s a st r a d i t i o n a ld e t e c t i o n sa r eb a s e do nt h em e t h o d ss u c ha sb i o c h e m i s t r ya n di n s t r u m e n t a la n a l y t i c a lw h i c ha r ec o m p l i c a t e da n dt i m ec o n s u m i n g ，i ti sv e r yi m p o r t a n tt oe s t a b l i s har a p i d l ya n da c c u r a t em e t h o d t h e r e f o r e ，t h es t u d yo nc h l o r a m p h e n i c o le l i s ak i tp l a y sas i g n i f i c a n ts o c i a la n de c o n o m i cr o l ef o rp r o t e c t i n gc o n s u m e l s i n t e r e s t s ，f o o ds a f e t yt e s t i n ga sw e l la si n t e r n a t i o n a lt r a d e t h i ss t u d yf o c u s e do ns y n t h e s i z i n gt h ea r t i f i c i a la n t i g e n ，p u r i f y i n gi m m u n o g l o b u l i nga n de s t a b l i s h i n ge l i s am e t h o d t h ea c t i v ee s t e rr e a c t i o na n dd i a z o t i z a t i o nr e a c t i o nw e r eu s e dr e s p e c t i v e l yt oc o u p l et h eh a p t e nc h l o r a m p h e n i c o lw i t hc a r r i e rp r o t e i nb s aa n do v a t w oi m m u n o g e n sw e r eo b t a i n e da n dp r o v e db yu l t r a v i o l e ts c a n ，i n f r a r e ds p e c t r o g r a ms c a na n ds d s - p a g ee l e c t r o p h e r e s i s t h ea n t i c a pa n t i b o d yw a so b t a i n e db yi r n m u n i n gt h en e wz e a l a n dw h i t er a b b i t sw i t hh a p c a p t i t e ro fa bw a s1 。10 0 0 0 0 0b ye l i s a ap r i m a r yp u r i f i c a t i o nw a sc o n d u c t e da c c o r d i n gt ot h em e t h o do ft h ea m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n s u s i n gb i s ( 3 a m i n o p r o p g ) a m i n ea sas p a c e rb e t w e e nt h eg e la n dt h ec a pl i g a n d ，as e p a r a t i o nm a t e r i a lw a ss y n t h e s i z e df o ra f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yt op u n f yt h es p e c i f i ca n t i - c a pi g gt h er e s u l t ss h o w e dt h a th i g h l yp u r i f i e dr a b b i ta n t i c h l o r a m p h e n i c o la n t i b o d yc o u l db eo b t a i n e db yt h es e l f p r e p a r e di m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yc o l u m n c o m p a r e dw i t ht h ed i f f e r e n tm e t h o d so fc o u p l i n gh p r ，t h em o d i f i e dm e t h o do fm i x e da n h y d r i d ew a sp r o v e dt ob em o r ee f f e c t i v e l yt ot a gh r p , a n dt h ea c t i v i t yo ft h ec o n j u g a t ew a sp r o v e db ye l i s a t h ee f f e c t so fv a r i o u sf a c t o r s ，s u c ha sc o a t i n gb u f f e r ,w a s h i n gt i m e s ，c o a t i n gt e m p e r a t u r e ，c o a t i n gt i m e ，i o n i ci n t e n s i t ya n dn o n s p e c i f i c i t ya d s o r p t i o nw e r es t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o nw a sg i v e na sf o l l o w i n g ：c o a t e dw i t ht h ec o a t i n ga n t i b o d yi n0 0 5 m o l lp h 9 6c b s ，a n dt h e ni n c u b a t e da t37 cf o r2 h t h ep b sb u f f e rw i t h1 o o v ac o u l di m p r o v et h es e n s i t i v i t yo ft h ee l i s am e t h o d s a d o p t i n gt h eo p t i m i z e da n a l y t i cc o n d i t i o na n dh r pt a g g e da n t i g e n , t h ea f f i n i t ya n ds p e c i f i c i t yo fa bw e r ee v a l u a t e db yd i r e c tc o m p e t e d e l i s am e t h o d t h er e s u l t si n d i c a t e di i i华中农业大学专业学位硕士学位论文t h a ta bh a dh i g ha f f i n i t ya n ds p e c i f i c i t yt oc a p a n dt h er e s u l t so fs q u a r em a t r i xt i t r a t i o ns h o w e dt h a ta n t i c a pi g gw e r e2 8 3 0 t g m l ，h r pt a g g e da n t i g e nw e r e5 3 6 1 x g m 1 t h es e n s i t i v er a n g et od e t e c tc a pv a r i e df r o m0 2 n g m lt o6 4 n g m l t h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o nf r o mt h em e t h o dw a s3 1 = 一14 8 4 3 1 0 9 x + 5 6 6 9 2 ，r z = 0 9 9 6 5 ，w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i t ( i c l 0 ) 0 4 51 n g m l ，a n dt h es e n s i t i v i t yi c 5 0w a s2 8 2 n g m l t h ec r o s s r e a c t i v i t yw i t hr e l a t e da n a l y t e sw a sa l lb e l l o w0 01 t h ee l i s ak i tw a sp r e p a r e dt od e t e c tc a pi nd i f f e r e n tm a t r i c e s ，s u c ha sc h i c k e n ,m i l ka n ds h r i m p r e c o v e r yo fm e t h o d st od e t e c tc a pw a sr a n g e df r o m7 2 6 t o113 6 a n dt h ec o e f f i c i e n to fv a r i a t i o n sw a sr a n g e df r o m4 2 6 t o17 7 5 t h er e s u l t so fp e r f o r m a n c em e a s u r e m e n td e m o n s t r a t e dt h a tt h ee l i s at e s tk i ts h o w e dg o o dr e p e a t a b i l i t ya n da c c u r a c y , a n di t sp r e s e r v i n gd u r a t i o nc o u l db e4m o n t h sa tl e a s t t h ee l i s at e s tk i tc o u l db eu s e df o rt h es c r e e n i n ga n a l y s i so fc a pi nab a t c ho fs a m p l e ss u c ha ss h r i m p c h i c k e na n dm i l kw i t h i nas h o r tt i m ea tl o wc o s t k e yw o r d s ：c h l o r a m p h e n i c o l ，p o l y c l o n a la n t i b o d y , e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ,r e s i d u e ，r a p i dt e s tk i t ，e n z y m e t a g g e da n t i g e ni v动物源性食品中氯霉素快速检测的e l i s a 方法研究a ba gb s ac a pc b sc rd a d p ad c cd m fe d t ae l i s af c af i an h sh i 冲i c l oi c s oi g gd 翰p bp b sp b s ts d s p a g et e m e dt m b缩略词表a n t i b o d ya n t i g e nb o v i n es e r u ma l b u m i nc h l o r a m p h e n i c o lc a r b o n a t e b i c a r b o n a t es o l u t i o nc r o s s r e a c t i v i t yb i s 一( 3 一a m i n o p r o p y l ) 一a m i n ed i e y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d en n - d i m e t h y l f o m a m o d ee t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i de n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yf r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n tf r e u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n tn - h y d r o x y s u c c i n i m i d eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e1o c o n c e n t r a t i o no fi n h i b i t i o n5 0 c o n c e n t r a t i o no fi n h i b i t i o ni m m u n eg l o b u l i ngo v a l b u m i np h o s p h o r i ca c i db u f f e rp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n ep h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n ew i t ht w e e n 一2 0s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e g e le l e c t r o p h e r e s -i st e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e3 ，3 ，5 ，5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n ev抗体抗原牛血清白蛋白氯霉素碳酸盐缓冲液交叉反应率3 ，37 一二氨丙基亚胺n ，n 二环己基碳二亚胺n ，n 一二甲基甲酰胺乙二胺四乙酸酶联免疫吸附测定弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂n 一羟基琥珀酰亚胺辣根过氧化物酶1 0 抑制浓度5 0 抑制浓度免疫球蛋白卵清白蛋白磷酸缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲盐溶液十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳n n n n 四甲基乙二胺3 ，3 ，5 ，5 一四甲基联苯胺华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名即确翻时间：硼7 年舌月牛日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文) 在解密后适用于本授权书。学位论文作者签名：抑两翻导师签名：f 高砉纩签名日期：枷7 年易月牛日签名日期：砂口7 年6 月，日注：请将本表真接装订在学位论文的扉页和目录之闻动物源性食品中氯霉素快速检测的e l l s a 方法研究1 氯霉素简介1 1 氯霉素药物概况第一章前言弟一早刖西氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p ) 是1 9 4 7 年首次从链丝菌( s t r e p t o m y c e sv e n e z u e l a )的培养液中提取而得到的一种抗生素( b a r t zq r ，1 9 8 4 ) 。1 9 4 8 1 9 4 9 年确定其结构后，可通过化学合成方法大量合成。具有对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用的广谱抗菌谱性质，广泛用于沙门氏菌、嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、衣原体、支原体等感染的治疗( 戴自英，1 9 8 5 ) 。1 1 1 氯霉素的理化性质氯霉素，学名d 苏式1 对硝基苯基2 二氯乙酰胺基1 ，3 丙二醇，分子式为c 1 l h l 2 0 5n 2 c 1 2 ，分子量为3 2 2 0 1 ，化学结构式如图1 1 所示( 王桂枝等，1 9 9 9 ) 。氯霉素具有左旋光性，故又名左霉素( 1 a e v o m y c e t i n ) 。化学合成的氯霉素为等旋混合物，内含左、右旋异构体各半，其中左旋体即氯霉素，右旋体无抗菌活性。纯品氯霉素为中性的白色或微带黄绿色针状、长片状结晶或结晶性粉末，味极苦，熔点为1 4 9 1 5 1 ( 中国兽药典委员会，2 0 0 0 ) 。图1 1 氯霉素的结构式f i g 1 1t h em o l e c u l a rf o r m u l ao fc h l o r a m p e n i c o l氯霉素的化学性质极为稳定，在干燥状态下5 年以内仍具有抗菌活性。当p h在2 - 9 之间时对氯霉素水溶液的效价无影响，而当p h 大于1 0 时则失去活性( 张宇，2 0 0 7 ) 。氯霉素微溶于水，在水中的溶解度为0 2 5 m g m l ，但易溶于有机溶剂如甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、乙酸乙酯、丙二醇等，在乙醇中的溶解度可达4 0 0 m g m l ，稍溶于乙二醚，不溶于苯及石油醚。其水溶液稳定，可冷藏保存几个月。1 1 2 氯霉素作用机理氯霉素对于菌体的作用是通过抑制菌体蛋白合成而实现的。氯霉素主要通过作华中农业大学专业学位硕十学位论文用于细菌体内7 0 s 核糖体的5 0 s 亚基，达到特异性地阻止m r n a 与核糖体的结合的目的，同时又能抑制肽酞基转移酶的作用，使肽链的增长受阻，从而抑制菌体蛋白的合成( 阴天榜，2 0 0 4 ) 。1 1 3 氯霉素作用范围氯霉素在高浓度时具有很好的杀菌作用，低浓度时对多数细菌有抑制生长的作用，所以是在临床上被广泛使用的广谱抗生素之一。总体来说，衣原体、肺炎支原体、立克次体对于氯霉素都很敏感，并且革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌相比对于氯霉素更加敏感。革兰氏阳性细菌中如金葡菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、以及肠球菌等对本品多数敏感。白喉杆菌、李斯特菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、放线菌属、乳酸杆菌属等亦大多敏感。革兰氏阴性细菌对氯霉素敏感者有淋球菌、脑膜炎球菌、流感杆菌大肠杆菌、肺炎杆菌、沙门氏菌属、霍乱弧菌等，特别对流感杆菌、脑膜炎球菌，氯霉素在低浓度时即具有强大杀菌作用( 戴自英，1 9 9 2 ) 。由于氯霉素的大量使用，细菌耐药性的问题也随之出现，其耐药性的产生是由于基因的突变或耐药因子的转移。具有耐药因子的细菌可产生乙酞转移酶使氯霉素乙酰化而失效( 朱宝泉，2 0 0 3 ) 。1 2 氯霉素残留现状各种抗生素的大量使用使得许多动物源性食品存在一定的安全隐患，对人体的健康也存在一定的安全隐患。为了确保食品的产品质量，使消费者不受到抗生素残留的危害，各国纷纷采取相应的措施，颁布药物残留控制标准，对动物源性食品从源头开始进行严格控制管理( 柳林，2 0 0 4 ) 。在食品法典委员会( c a c ) 的倡导下，由f a o ( f o o da n d a g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o n )和w h o ( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ) 联合发起并组织成立的食品中兽药残留法典委员会( c c r v d f ) 制定了动物组织及产品中兽药残留的最高限量( m r l s ) 标准和休药期法规；欧共体( e e c ) 建立了兽药产品委员会( c v m p ) 配合兽药产品许可证程序的执行。各个国家还根据本国情况制定相应的药物最高残留限量。我国也于1 9 9 4年、1 9 9 7 年以及1 9 9 9 年先后发布动物性食品中兽药的最高残留量的通知，并由农业部于2 0 0 2 年1 2 月进行修订，对兽药使用和残留作出了明确规定，以此作为国内兽药管理监查工作的标准依据。因氯霉素残留而造成的危害比较严重，可以抑制人体骨髓造血功能从而引起再2动物源性食品中氯霉素快速检测的e l i s a 方法研究生性障碍性贫血症等。针对这一情况，许多国家严格禁止将氯霉素用于食品动物( 特别是蛋鸡，蜂蜜和奶牛) ，并规定其最大残留限量为o 一1 0 n g 。我国农业部也已禁止在食品源性动物中使用氯霉素，无论是内销还是出口的水产品、畜禽产品氯霉素都是必检项目。因此动物性食品中氯霉素的残留量分析，尤其是快速、准确、高灵敏度的检测方法，近年来得到国内外食品分析工作者的高度关注( 周正红，2 0 0 6 ) 。1 3 氯霉素检测方法现状近年来，随着药物残留研究的不断深入，残留检测方法日趋完善，并向简单、快速、灵敏、多通道、低成本的方向发展。在检测技术方面，目前国际上较多采用多残留检测技术和快速筛选检测技术。1 3 1 微生物法微生物检测在实际的应用中主要运用于氯霉素残留检测的初筛选工作，特点是简便、经济和快速。但是其灵敏度较低，特异性较差，时间较久，易受到其他抗生素的影响。所以微生物方法并不能作为最终的标准检测方法( 宋杰等，2 0 0 5 ) 。微生物检测方法主要有棉签法和杯碟法。棉签法，又称现场拭子法，是检测动物体内抗生素残留的现场试验方法。该方法用棉签( 拭子) 采取动物体内的组织液，然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基中保温过夜。根据棉签周围抑菌圈的有无及其大小判断抗生素残留( 李诚，1 9 9 3 ) 。棉签法检出限较高，易造成氯霉素残留漏检。杯碟法的主要原理是通过选择不同菌种，来观察抑菌圈的大小来判断氯霉素的含量。采用不同的试验菌种，可检测不同的抗生素，一般采用卵黄色八叠球菌检测氯霉素( 宋华宾，1 9 9 3 ) 。焦彦朝等( 焦彦朝等，2 0 0 2 ) 用此法研究了鲤鱼体内氯霉素残留。1 3 2 免疫法免疫分析是基于抗体与抗原的特异性结合的药物残留分析方法中常用的一类方法，具有很高的灵敏度和快速提供检测结果等优点。分析方法主要包括酶联免疫法和放射免疫法。3华中农业大学专业学位硕士学位论文1 3 2 1 酶联免疫法酶联免疫测定法是以酶学和免疫学为基础发展起来的一种新技术，该技术灵敏度高、特异性强、快速、经济，目前广泛应用于药物残留检测。v a nd ew a t e r 等( v a nd ew a t e r , 1 9 9 1 ) 采用竞争性酶联免疫法测定猪肌肉组织中氯霉素残留，检测限为2 5 i t g l 。同时建立了亲合素一生物素酶联免疫吸附测定法，用于快速大规模筛选猪肌肉组织和牛奶中的氯霉素残留，检测限达1 0 9 9 k g ( v a nd e w a t e r , 1 9 9 0 ) 。随着研究工作的深入发展，不少氯霉素检测试剂盒产品进入市场，如荷兰推出的氯霉素残留检测试剂盒q u i d c a r d ( 又称l ac a r t e t e s t 试剂盒) 。k e u k e n 等( k e u k e n ，1 9 9 2 ) 用l ac a r t et e s t 试剂盒检测肉中的残留氯霉素，最低检测限为2 9 9 k g 。关嵘( 关嵘，2 0 0 2 ) 对德国r - b i o p h a r m 公司生产的氯霉素酶联免疫检测试剂盒中的检测方法进行了改进，改进后的方法可适用于鸡肉、猪肉、虾仁和肠衣等动物源性食品中氯霉素残留检测，并比较了该方法与试剂盒中推荐的水产品提取方法，结果表明改进后的方法较推荐方法回收率高，重复性好。该方法的最低检测限为0 1 p g k g 。1 3 2 2 放射免疫法a r n o l d 等( a r n o l d ，1 9 8 5 ) 建立了放射免疫分析检测方法。该方法灵敏度高，最低检测限为0 2 9 9 k g ，适用于肉蛋奶中氯霉素的筛选。但该法具有同位素半衰期短、放射性污染及需要复杂仪器设备等缺点，应用范围受到限制( l o r r a i n e ，1 9 9 8 ) 。1 3 3 色谱法在氯霉素残留分析中色谱法是比较常用的方法，其中以高效液相色谱法、气相色谱法、气质联用法和液质联用法报道较多( 周正红等，2 0 0 6 ) 。1 3 3 1 高效液相色谱法液相色谱法可用于鸡、牛和猪肉中氯霉素残留检测。f r u n f e l d e r 将样品用蒸馏水提取，取一半滤液通过e x t r e l u t 柱，用二氯甲烷洗脱，浓缩后用水溶解，与甲苯分配，水相用于分析。采用c 1 8 柱，紫外检测器进行分析，检测波长为2 8 5 n m ，添加1 0 9 9 k g 氯霉素标样时，平均回收率为5 5 1 ，最低检测限为1 5 9 9 k g ( f r u n f e l d e rf t ，1 9 8 2 ) 。陈滔滔( 陈滔滔和赵红梅) 等用高效液相色谱法检测了牛乳中氯霉素的残留量。4动物源性食品中氯霉素快速检测的e l i s a 方法研究样品采用乙酸乙酯提取，固相萃取法净化，色谱柱为m i c r o s o r b m v1 0 0 5c l s 柱，固相萃取柱为s u p e l c oe n v i 一18 ( 5 0 0 r a g ，3 1 a m ) ，流动相为甲醇- 水( 4 0 ：6 0 ) 。该方法的回收率为6 5 6 8 0 7 ，变异系数为0 8 0 8 0 2 。1 3 3 2 气相色谱法气相色谱法( g c ) 是以气体为流动相的色谱过程，具有分离效率高、分析速度快、选择性较好、样品用量少、检测灵敏度高、操作简单等优点，是分析有机化合物不可缺少的一种手段，广泛应用于分离分析气体和易挥发或可转化为易挥发的液体及固体( 赵晓萌，2 0 0 4 ；黄雅丽，2 0 0 5 ) 。气相色谱法还可用于检测虾中的氯霉素残留( r o b e r tl ，1 9 9 4 ) 。样品中的氯霉素用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯旋转蒸干后，用4 氯化钠溶液溶解残余物，用正己烷去脂肪。再用乙酸乙酯将氯霉素从盐溶液提取出，将乙酸乙酯吹干后，用s y l o n h t p进行衍生，5 5 衍生4 0 m i n ，吹干多余的衍生化试剂，用甲苯溶解用配置e c d 检测器的气相色谱仪分析。r o b e r t 在文中报道了氯霉素残留分析的三个实验室间的比对结果。在虾肌肉中直接加标5 9 9 k g 水平的回收率，其回收率分别为1 0 2 ，1 0 4 ，1 0 8 。王建华和陈世山( 王建华和陈世山，2 0 0 1 ) 用毛细管气相色谱法同时测定鱼肉中氯霉素和甲枫霉素。将样品与无水硫酸钠研磨均匀，用乙酸乙酯提取，将乙酸乙酯旋转蒸干后，用水溶解残余物，正己烷去脂肪。将水相转入预先用3 m l 甲醇和3 m l水进行活化的c 1 8 小柱，用水淋洗，甲醇进行洗脱。洗脱液吹干后用s y l o nb f t 进行衍生，5 0 衍生2 0 m i n ，衍生后加入甲苯和水，取甲苯溶液上机分析。气相色谱仪配雹电子俘获检测器，采用外标定量法。当添加水平为5 - 2 0 1 x g k g 时，回收率为8 0 1 0 8 ，相对标准偏差为4 0 1 1 。1 3 3 3 气质联用法l a v a i lg i n k e l 等( l a v a i lg i n k e le ta 1 ，1 9 9 0 ) 根据欧盟确认标准开发了氯霉素残留的定量检测方法。该方法用g c m s 负离子化学源以3 7 c 1 2 为内标进行定量与确认。文中介绍了n c l 质谱定量的方法，在0 2 0 l x g k g 范围内线性良好。该方法还结合了放免、酶免筛选，对比了1 7 个样品的放免、酶免和g c m s 结果，1 7 个样品根据放免检测结果其氯霉素残留为o 0 1 1 0 g k g ，g c m s 除0 0 1 i t g l 的样品无法确证外，其余1 6 个样品均满足了阳性确证要求，而酶免仅能检测出其中5 个。方法的重5华中农业火学专业学位硕士学位论文复性与再现性良好，方法的检出限为o 1 “g k g 。n a g a t a ( n a g a t at o m o k oa n dh i s a oo k a 1 9 9 6 ) 等报道了g c m s 方法同时测定黄尾鱼肌肉中的氯霉素，氟氯霉素和甲砜霉素。用乙酸乙酯提取，正己烷去脂，乙酸乙酯蒸干后用乙醚溶解残余物，过f l o r i s i l 小柱，柱中氯霉素用3 ：7 的甲醇乙醚洗脱，洗脱液用氮气吹干后，用b s a 在5 0 。c 衍生化1 0 m i n 。衍生化试剂用氮气吹干后用乙酸乙酯定容后进行g c m s 分析。在加标水平为o 1 1 p , g k g 时，回收率高于6 5 ，检出限为1 p , g k g 。1 3 3 4 液质联用法r a m o s ( r a m o sme ta 1 2 0 0 3 ) 等报道了采用l c m s e s i 液质联用法测定虾体内的氯霉素残留。用p h 7 0 的磷酸缓冲液超声提取样品中的氯霉素，采用c 1 8 柱对样品进行净化。用3 0 的乙腈水洗脱氯霉素，用乙酸乙酯从沈脱液中提取氯霉素，提取液用氮气吹干后，用h p l c 流动相溶解后进行分析。流动相为乙腈水( 2 5 ：7 5 ) ，流速l m l m i n 。氯霉素的特征离子为m z3 2 3 ，3 2 1 ，2 5 7 和1 5 2 ，定量时选择m z1 5 2( c a p ) 和m z1 5 7 ( d s c a p ) 。分别添加0 2 ，0 5 ，1 0 ，5 0 和5 0 0 n g g 的标样时，回收率为1 0 1 1 1 0 ，r s d 7 1 ，方法的精密度为4 9 8 2 ：最低检测限为0 0 2 n g g 。a l e x ( a l e xge ta 1 2 0 0 3 ) 等分别采用l c m s m s 和g c m s 检测动物组织和尿中的氯霉素残留。样品中加入硫酸钠和二硫代苏糖醇，用乙酸乙酯提取样品中的氯霉素，将提取液在1 0 的条件下至少存放1 h 。提取液用氮气吹干后用4 的氯化钠溶解，正己烷去脂肪。将水溶液进行两步c 1 8 净化。样品洗脱液用氮气吹干，( 1 )向残余物中加入b s t f a ：1 0 t m c s 进行衍生，衍生后用e i 源的g c m s 在s i m 模式下进行分析，特征离子为m z2 2 5 ，2 0 8 ，2 4 2 ；( 2 ) 用流动相溶解残余物，用a p c i模式的l c m s m s 进行分析。流动相为乙腈0 0 2 5 m 醋酸胺+ o 3 甲酸，流速为l m l m i n 。特征离子为：m z3 2 1 ，1 5 2 ，2 5 7 和1 9 4 。文中比较了g c m s 和l c m s m s的灵敏度，g c m s 的最低检测限为2 p g k g ，而l c m s m s 的最低检测限为0 2 肛g k g 。1 3 4 各种检测方法的比较当今各检测机构广泛使用的是微生物法、色谱检测法和免疫分析法这三类检测方法。各个实验室和被检测单位根据不同的实验要求和实验目的，选用不同的检测方法。这三种方法都分别有不同的优缺点，因此在食品安全的检测中都有其应有的动物源性食品中氯霉素快速检测的e l i s a 方法研究价值。微生物检测法是传统的检测方法，对实验室设备要求低，检测成本也相对较低。但与其他方法相比较，该法需要的检测时间长，要进行菌种的活化，对结果判断容易产生误差，微量残留难以得到精确判断，同时对实验室有比较高的洁净要求。色谱检测法的检测灵敏度高，检测限低。我国政府部门选用高效液相色谱法来对出口产品进行验证。对氯霉素类抗生素可以进行定性、定量测定。该法比其他两种方法更精确、可靠，但是需要昂贵的仪器设备，而且前处理相当复杂，只能适用于单个样品的检测，检测的成本相当高，同时很难进行大通量的检测。免疫检测分析法，依靠抗原与抗体高度特异性的结合来达到检测物质的目的。由于抗体对抗原的高度特异性，因此具有了检测灵敏度较高的优点。同时由于抗原抗体发生反应的条件比较简单，所以样品前处理可以简化，使得整体操作简单，尤其是酶联免疫吸附法，通过酶显色，用酶标仪直接读数判定结果，速度快，能同时筛选大量的样品，且不需要昂贵的仪器设备，检测成本相对的降低。但总的来说，其灵敏度不如色谱法，在定性、定量方面还需要色谱法来做最终确定。综上所述，酶免疫测定法适合对残留初步筛选的需要，它能在几小时内检测几十到上百个试样，不需要复杂的仪器设备，并有特异性强、灵敏度高、试样预处理简单等优点，因此它在现场监控，简单基础实验室的检测，甚至大型实验室的初步筛选上有广范的应用前景。高效液相色谱法和气相色谱法具有精确可靠、灵敏度高、重复性好以及假阳性少等优点，但是首先要选择出合理的前处理条件和色谱条件，其次其单位时间能处理样品能力有限。在氯霉素残留定性定量检测中，g c m s 和l c m s m s 是首选的方法。现在，最通用的食品中氯霉素残留检测方法是使用e l i s a或者e i a 对样品进行初筛，再对阳性或样品用g c m s 或l c m s m s 进行进一步验证。2 小分子药物酶联免疫分析的研究方法农药、兽药等小分子化合物酶联免疫分析方法的建立，包括待测目标化合物的选择、半抗原的分子设计和合成、人工抗原的合成、抗体制备、测定方法的建立、样本前处理方法和方法评价等步骤。待测物、抗体和标记物是免疫分析中的三个基本要素，其中抗体是核心试剂，因此免疫分析又称以抗体为分析工具的分析技术。7华中农业大学专业学位硕士学位论文2 1 半抗原半抗原是指与目标分析物结构相同或类似、并具有反应活性基团( 女d - n h 2 、c o o h 、o h 和s h 等) 的小分子化合物。其设计与合成研究是小分子药物免疫分析技术的关键所在。通常药物分子本身不具有活性基团，需要通过反应引入活性基团以便与载体蛋白质上游离的羧基、氨基等以共价键相偶联。也有有些药物分子具有活性基团，但却位于分子的特异性部位，需要选择其他非特异部分进行改造，从而突出特异性部位。在半抗原的合成过程中，间隔臂( 或连接分子) 最好位于重要的特征性官能团的远端，以增加抗体与目标分子的识别和结合位点，利于诱导高选择性和高亲合性的抗体( a b a dae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。所以在半抗原合成中常采用保护、定向合成、立体选择性等手段。( f e r g u s o nbse ta 1 ，1 9 9 3 ) 。对于结构类似的一类化合物，间隔臂应最大限度的暴露分子的独特部位。间隔臂长度一般以3 - 6 碳为宜。太短，则载体的空间位阻将影响免疫系统对半抗原的识别，并可能由于载体局部的微化学环境使半抗原结构发生“形变”；过长，则可能因氢键( 某些极性间隔臂) 或疏水交互作用( 非极性间隔臂) 使半抗原发生“折叠”( q u e f f e l e c a l e ta 1 1 9 9 8 ) 。间隔臂尽可能不含较强的决定簇( 如芳环、共轭双键或杂原子等) ，通常以末端为活性基团的链烷为宣，以减少抗体对间隔臂的过度识别而降低对目标分子的识别能力。常见的间隔臂有( c h 2 ) n c o o h ，( c h 2 ) n - n h 2 等。半抗原最好是水溶性的，以利于下一步的偶联反应；半抗原要有一定的稳定性，以有效刺激机体产生对目标分析物具一定特异性和亲和力的抗体。故对于一种目标分子，有时需要合成多个半抗原以供筛选。半抗原设计和合成中亦考虑到有毒理学意义的代谢产物，以及测定对象是单一的药物或某一类药物，设计中需要相应地突出特定药物的结构或一类药物中共有的特征结构部分( a b a da ，1 9 9 8 ；l e ene ta l ，1 9 9 8 )2 2 人工抗原小分子半抗原只有偶联到载体蛋白上，才能诱导机体产生免疫应答反应。因此，在制备抗体前首先要合成半抗原载体蛋白偶联物，即人工抗原。在偶联物中载体蛋白不仅仅是增加半抗原的相对分子质量，也不是单纯的起运载作用，而是依靠本身的结构特异性，诱导体液抗体的产生继而诱导对半抗原分子的识别，这种现象称为8动物源性食品中氯霉素快速检测的e l i s a 方法研究载体效应( c a r r i e re f f e c t ) ( h a r r i s o nr0e ta l ，1 9 9 1 ) 。常用的载体蛋白有牛血清蛋白( b s a ) 、人血清蛋白( h s a ) 、卵清蛋白( o v a ) 和钥孔血蓝蛋白( k l h ) 等。对于同一种目标化合物，包被原和免疫原通常不用同一种蛋白偶联，目的是减少抗体对包被原的非特异性结合，提高分析的特异性和灵敏性。也有文章认为免疫原和包被原所用载体蛋白的结构和分子量差异越大，非特异性结合反应越弱，分析灵敏度越高( j u n gfe ta l ，1 9 9 8 ) 。2 2 1 偶联方式的选择一般可根据半抗原所含活性基团的不同，选择不同的方式与蛋白质进行偶联。如半抗原含