（微生物学专业论文）产脂肪酶菌的筛选及随机突变改善酶热稳定性.pdf

摘要 摘要 脂肪酶 e c 3 1 1 3 】即三酰甘油酰基水解酶，作为一种催化介质，在洗涤、皮革、 食品、生物化工、造纸、医药、环保等行业中被广泛应用。而耐热脂肪酶因有较好 的工业应用要求，越来越受到人们的重视。从极端环境中筛选耐热脂肪酶产生菌和 通过分子改性技术改造现有中温脂肪酶是获得耐热脂肪酶的主要方法。本文正是通 过这两个方面分别进行了耐热脂肪酶产生菌的筛选及随机突变改善扩展青霉脂肪酶 ( p e l ) 热稳定性的研究。 1 耐热脂肪酶产生菌菌种的筛选 通过固体平板法从福州温泉水样中筛选出6 株产碱性耐热脂肪酶菌种，其中， f l 1 2 可产生和分泌碱性耐热脂肪酶。对该菌株进行产酶条件的初步摸索得出其摇 瓶发酵条件为2 糊精，3 酵母膏，m g s 0 4 7 d d h 2 00 1 、k 2 h p 0 40 1 、c a c l 2 0 1 、 三丁酸甘油酯乳化液0 1 ，起始p h 7 0 ，通气量为5 0 m l 2 5 0 m l 摇瓶，2 5 0 r m i n ， 发酵温度为3 5 ，发酵周期为2 2 h 。酶学性质表明，此酶最适作用温度为4 5 ，最 适作用p h 为1 0 0 ，在p h5 0 - - 1 1 0 范围内稳定，在6 0 下温浴3 0 m i n 仍保留7 7 的活性；0 0 1 的s d s 明显抑制该酶的活性，0 0 5 的e d t a 对该酶几乎没有影响， o 0 1 的t r i t o n x 1 0 0 和t w e e n 8 0 对该酶有促进作用；1 0 m m 的各种金属离子对该酶 的实验结果表明k + 有激活作用，p b ”、b a 2 + 等对此酶有抑制作用。为了鉴定该菌 株，克隆并测序了其1 6 sr d n a 基因序列，系统进化树分析表明，该菌株与 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 具有最紧密的亲缘关系。 2 随机突变对扩展青霉脂肪酶( p e l ) 热稳定性的改善 利用易错p c r ( e r r o r - p r o n ep c r ) 和交错延伸p c r ( s t a g g e r e de x t e n s i o np r o c e s s ( s t e p ) ) 相结合的方法对扩展青霉脂肪酶p e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s e ( p e l ) 进行 随机突变。将p c r 产物经双酶切后连接到同样双酶切的酵母穿梭质粒p p i c 3 5 k 中， 构建含有随机突变基因的重组质粒p p i c 3 5 k 1 i p m u t a n t s ，将重组质粒经s a li 酶切线 性化后，电转化引入毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) g s l1 5 中进行异源表达；平板透明圈 法高通量筛选和摇瓶复筛得到表达产物脂肪酶p e l s e l g s ，p e l s e 2 g s ；1 5 的 s d s p a g e 结果分析表明突变体脂肪酶分子量与野生型的一致，约为2 8 k d a 。其热 稳定性研究表明，野生型脂肪酶( p e l ) 的t m 值为3 8 6 8 ，随机突变酶p e l s e l g s 、 p e l s e 2 g s 的t m 值分别为4 1 7 7 、3 9 7 6 * ( 2 ，其t m 值分别比野生型p e l g s 提 高了3 0 9 、1 0 8 。基因测序结果表明突变酶p e l s e i g s 第6 8 位的亮氨酸变为 福建师范人学占月长沽硕+ 学位论文 了脯氨酸，第2 2 9 的赖氨酸变为了丙氨酸，p e l s e 2 g s 第2 7 0 位的丙氨酸变为了苏 氨酸。 关键词：脂肪酶，筛选，随机突变，热稳定性 中文文摘 中文文摘 脂肪酶( e c 3 1 1 3 ) 即- - 酰甘油酰基水解酶，广泛存在于植物、动物和微生物中， 它是一种酯键水解酶，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油 及游离脂肪酸。在洗涤、制革、食品、生物化工、造纸、医药、环保等行业被广泛 应用。目前工业上应用的脂肪酶大多是对热比较敏感的中温酶，不适宜在高温环境 下发挥作用，保存期短，应用推广受到限制。而热稳定性高的脂肪酶保存期长，运 输方便，使用效率高，因此获得作用温度高，热稳定性好的耐高温脂肪酶越来越受 到人们的重视。目前，获得热稳定性高的脂肪酶的方式主要包括：( 1 ) 从自然界高 温环境中筛选耐高温脂肪酶产生菌，这些菌产生的脂肪酶往往具有比较好的耐热性。 ( 2 ) 升化传统微生物诱变育种改造现有中温脂肪酶的稳定性方法，利用定点突变、 随机突变、d n as h u f f l i n g 等分子突变技术来改善脂肪酶的热稳定性。 本研究从福州温泉水体中筛选出6 株脂肪酶产生菌。其中一株产碱性耐热脂肪 酶菌株并命名为f l 一1 2 ，其所产脂肪酶命名为s a l l 。对其产酶条件进行了初步摸索， 获得了较为适宜的发酵产酶条件。对其发酵液进行了初步纯化获得了纯化的脂肪酶。 通过琼脂板透明圈法和分光光度法测定其最适作用温度为4 5 。c ，最适作用p h 为 1 0 0 ，具有较高的耐热性：6 0 下温浴3 0 m i n 残余酶活达7 7 。 本研究还利用分子育种技术随机突变方法对扩展青霉碱性脂肪酶 p e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s e ( p e l ) 进行了分子改造，分别获得了热稳定性有所提高 的突变体p e l s e l g s ，p e l s e 2 g s 。 1 脂肪酶菌种的筛选、鉴定及部分酶学性质的研究 本研究从福州温泉水体中取样温度约为8 0 的，菌体用0 2 2 t x m 的滤膜过滤截 留，浓缩1 0 0 0 倍的水样涂布含三丁酸甘油酯为底物的y p g 平板，通过划线分离单 菌落，同时获得6 株在能分解三丁酸甘油酯的菌株( 在平板上) 。对以上6 株菌在 l b 平板上培养分别形成乳白色或黄色菌落，显微镜下分别呈球形，细长杆状形和短 杆具芽孢状形，菌体大小在0 5 - 一2 9 m 之间。对其中三株菌落形态不同的菌株进行 基因组提取，以其为模版，并利用细菌1 6 sr d n a 通用引物( 2 7 f ，1 5 1 2 r ) ，通过p c r 分别扩增出约1 5 0 0 b p 左右的目的条带，经过克隆到p s k 载体上，验证并送交上海 生工测序，g e n e b a n k 上比对及分子进化树分析，初步鉴定这三株分别为巨大芽孢 杆菌( f g 2 ) 、鞘氨醇单胞菌( f l 3 ) 和金黄色葡萄球菌( f l 一1 2 ) 。其中f l 1 2 在l b 平板 上形成黄色菌落，圆形致密，边缘整齐，显微镜下菌体成葡萄球状，其发酵液可在 v 福建师范人学胡长沽硕十学位论文 三丁酸甘油酯琼脂检验板上形成较大透明圈，但是另外2 株f l 3 和f g 2 所形成的 透明圈较小，在高温下检测几乎没有透明圈。因此，本论文重点进行了金黄色葡萄 球菌( f l 1 2 ) 研究。 对f l 1 2 产酶条件的初步优化获得如下摇瓶发酵条件：2 糊精，3 酵母膏， 起始p h 7 0 ，通气量为5 0 m l 2 5 0 m l 摇瓶，发酵温度为3 5 。c ，发酵周期为2 2 h 。其次 将f l 1 2 接种至上述培养基中并在上述条件下大量发酵，发酵液离心去菌体，上清 经( n h 3 ) 2 s 0 4 沉淀，然后用 i r i s h c i 缓冲液溶解，并转移到透析袋中于4 c 条件下透 析。透析液经离心用d e a e s e p h a r o s ep f 凝胶分离样品，n a c l 溶液梯度洗脱，n 2 超 滤浓缩、除盐制得粗酶。 对该酶s a l l 进行了酶学性质的初步研究表明，该酶最适作用温度和p h 分别为 4 5 ，l o o ；在6 0 * ( 2 下温浴3 0 m i n 仍可保留7 7 的活性，在p h5 o 1 1 o 范围内稳 定；0 0 5 的e d t a 对该酶几乎没有影响，0 0 1 的s d s 明显抑制该酶的活性，0 0 1 的t r i t o n x 1 0 0 和t w e e n 8 0 对该酶有促进作用；1 0 m m 的各种金属离子对该酶的实验 结果表明k + 有激活作用，a 1 3 + 、p b 2 + 等对此酶有抑制作用；底物特异性研究表明该 酶可水解长链的油脂( c = 1 8 ：o ) ，但偏爱水解中短链的油脂( c s l 2 ：o ) 。 2 随机突变对扩展青霉脂肪酶( p e l ) 热稳定性的改善 本研究还利用了分子育种技术随机突变方法对扩展青霉碱性脂肪酶 p e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s e ( p e l ) 进行了改造。 利用e r r o r - p r o n ep c r 和s t a g g e r e de x t e n s i o np r o c e s s ( s t e p ) 相结合的方法对扩展 青霉脂肪酶p e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s e ( p e l ) 进行定向进化。将p c r 产物经s n a b i e c o r l 双酶切后连接到同样双酶切的酵母穿梭质粒p p i c 3 5 k 中，转化e c o l it o p l 0 f 感受态细胞中构建含有随机突变基因的重组质粒p p i c 3 5 k 1 i p m u t a n t x ，将所有转化 子用灭菌的涂布棒刮到1 0 0 m l 的l b 中培养供抽提质粒。将重组质粒经s a l i 酶切线 性化后，用b i o r a d 电穿孔仪电转化引入毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) g s l l 5 中进行异源 表达。y p o m 平板透明圈法高通量筛选和摇瓶复筛得到突变体脂肪酶p e l s e l 一g s ， p e l s e 2 g s 。 重组子经摇瓶发酵，甲醇诱导表达1 2 0 h ，发酵液经橄榄油检验板、1 5 的 s d s p a g e 分析表明突变体能在检验板上形成水解圈，其分子量与野生型的一致，约 为2 8 k d a ，表明突变基因在毕赤酵母中得到了正确的表达和修饰。经测定，随机突 变体p e l s e l g s ，p e l s e 2 g s 的最适作用温度分别为3 5 、4 5 。c ，分别比野生型 v i 中文文摘 脂肪酶( p e l ) 降低和提高了5 。t m 值分别为4 1 7 7 、3 9 7 6 ，分别比野生型 p e l g s 的3 8 6 8 提高了3 0 9 、1 0 8 。突变体p e l s e 2 g s 的发酵酶活明显高 于野生型( p e l s e l g s 、p e l s e 2 g s 酶活分别为4 1 4 u m l 、8 0 8 u m l ) 。基因测序 结果表明突变酶p e l s e l g s 第6 8 位的亮氨酸变为了脯氨酸，第2 2 9 位的赖氨酸变 为了丙氨酸，p e l s e 2 g s 第2 7 0 位的丙氨酸变为了苏氨酸。 总之，通过本论文研究获得了一株产碱性耐热脂肪酶菌株f l 1 2 ，其所产 脂肪酶s a l l 的最适作用温度为4 5 ，最适作用p h 为1 0 o ，具有较高的耐热性： 在6 0 下温浴3 0 m i n 残余酶活达7 7 。本研究还利用了分子育种技术对扩展青霉碱 性脂肪酶p e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s e ( p e l ) 进行了改造，获得了随机突变体 p e l s e l g s 和p e l s e 2 g s 。其最适作用温度分别为3 5 、4 5 ，分别比野生型 脂肪酶( p e l ) 的最适作用温度降低和提高了5 。t m 值分别为4 1 7 7 、3 9 7 6 ， 分别比野生型p e l g s 的3 8 6 8 提高了3 0 9 、1 0 8 。基因测序结果表明突变酶 p e l s e l g s 第6 8 位的亮氨酸变为了脯氨酸，第2 2 9 位的赖氨酸变为了丙氨酸， p e l s e 2 g s 第2 7 0 位的丙氨酸变为了苏氨酸。 v i i a b s t r a c t a b s t r a c t l i p a s e e c 3 1 1 3 】i sw i d e l yu s e di nw a s h i n g 、l e a t h e r 、f o o d 、b i o c h e m i c a l 、 p a p e r m a k i n g 、m e d i c i n e 、e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o ne t c t h ec h a r a c t e ro ft h et h e r m o s t a b l e o fl i p a s ei sv e r yi m p o r t a n ti ni n d u s t r i a la p p l i c a t i o n sa n dh a sa t t r a c t e dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o n s c r e e n i n go fl i p a s ep r o d u c i n gs t r a i n sf r o me x t r e m e l ye n v i r o n m e n t sa n d a r t i f i c i a le v o l u t i o nb ym o l e c u l a rm o d i f i c a t i n ga r et h e m a i n l ym e t h o d s t oo b t a i n t h e r m o s t a b l el i p a s e s i xl i p a s ep r o d u c i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mah o ts p r i n ga n dt h e c h a r a c t e r so fal i p a s ew e r es t u d i e d i na d d i t i o n ，t w ol i p a s em u t a n t sw e r ec r e a t e db y r a n d o mm u t a g e n e s i sa n ds h o wh i g h e rt h e r m o s t a b i l i t yt h a nt h eo r i g i n a le n z y m e 1 s c r e e n i n go ft h e r m o s t a b l el i p a s ef r o mh o ts p r i n g b a c t e r i u mf l - 12w h i c hc a np r o d u c el i p a s e ，w a si s o l a t e df r o mah o ts p r i n gi n f u z h o u ，t h eo p t i m u mc u l t u r a la n ds e c r e t i o nc o n d i t i o no ft h el i p a s ew a so p t i m i z e da s f o l l o w i n g2 d e x t r i n e ，3 y e a s te x t r a c t ，m g s 0 4 7 d d h 2 0o 1 ，k 2 h p 0 4o 1 ，c a c l 2 o 1 ，t r i b u t y r y l g l y c e r o l se m u l s i o no 1 ，p h 7 0 ，5 0 m l 2 5 0 m lf l a s ka n dg r o wa t3 5 * ( 2f o r 2 2 h t h e16 sr d n as e q u e n c i n go ft h eb a c t e r i u ms h o w s h i g hh o m o l o g yw i t h s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s l i p a s ef r o mf l 一1 2n a m e ds a l lw a sp u r i f i e da n ds h o w sh i g h e s t c a t a l y t i ca c t i v i t ya tp h10 0a n d4 5 c t h ee n z y m es t a b l e sa taw i d e l yp hr a n g eo f5 o 11 0a n ds h o w sh i g ht h e r m o s t a b i l i t yw i t h7 7 a c t i v i t yr e t a i n e dw h e ni n c u b a t e da t6 0 c f o r30 m i n t h ee n z y m ec a nc a t a l y z et h eh y d r o l y s i so fg l y c e r i d ew i t hf o u rt oe i g h t e e n c a r b o na n dp r e f e rt h eg l y c e r i d ew i t hs h o r tc a r b o n t h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ew a s i m p r o v e db y0 01 t r i t o n x 10 0a n dk + b u ti n h i b i t e db yp b 2 + ，b a 2 + ，0 01 s d sa n d 0 0 5 e d t a 2 i m p r o v e m e n to ft h et h e r m o s t a b i l i t yo fp e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s eb yr a n d o m m u t a g e n e s i s p e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s e ( p e l ) i so n eo fa l k a l i n el i p a s e sw h i c he d n ah a s a l r e a d yf u n c t i o n a le x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i sg s115 p e lp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n i n d u s t r yf o ri t sc a t a l y t i cc h a r a c t e r s ，b u ti t st h e r m o s t a b i l i t yi sp o o r i no r d e rt oi m p r o v et h et h e r m o s t a b i l i t yo fp e l ，e r r o r - p c ra n ds t e pt e c h n i q u ew e r e u s e d t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 3 5 k l i p m u t a n t xc o n t a i n i n gr a n d o mm u t a t i o ng e n e s w e r ei n t r o d u c e di n t op i c h i ap a s t o r 括g s115 t h o u s a n d so fc l o n i e sw e r es c r e e n e db yh i g h i i i 福建师范大学胡k 沽硕十学位论文 t h r o u g h - p u ta g a rp l a t e n i n es t r a i n s w e r ec o n f i r m e dt oh a v el i p a s ea c t i v i t y t h e t h e r m o s t a b i l i t ys t u d i e ss h o w e dt h mt h et mo ft h er a n d o mm u t a n t sp e l - s e 1 g sa n d p e l s e 2 一g sa r e3 0 9 。c 、1 0 8 。ch i g h e rt h a nt h a to ft h ew i l dt y p ep e l t h es e q u e n c i n g r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e r ea r et w os u b s t i t u t i o n so fl e u 6 8 p r oa n dl y s 2 2 9 a l ao c c u r e di n p e l s e l 一g sa n do n es u b s t i t u t i o no f t h rt oa l aa tp o s i t i o n2 7 0i np e l - s e 2 一g s k e yw o r d ：l i p a s e ，s c r e e n i n g ，r a n d o mm u t a g e n e s i s ，t h e r m o s t a b i l i t y i v 福建师范大学胡k 沽硕士学位论文 福建师范大学学位论文使用授权声明 本人( 姓名) 胡长浩学号2 0 0 6 0 9 6 5专业邀生物生丝皇公王生 物堂所呈交的论文( 论文题目：产脂肪酶菌的筛选及随机突变改善酶热 稳定性) 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师范大学有关保留、使用 学位论文的规定，即：学校有权保留送交的学位论文并允许论文被查阅 和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容；学校可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名鎏乌壁指导教师签名枷避 签名日期童! 立、堡：望签名日期d 翌、 口 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题背景 脂肪酶( 1 i p a s e ，t r i a c y l g l y c e r o la c y l h y d r o l a s e s ，e c3 1 1 3 ) 即三酰基甘油酰基水解 酶，是工业酶制剂中最重要的酶类之一，能够在油水界面催化天然底物油脂水解， 生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，同时脂肪酶还能催化酯交换、转酯、酯合成、 醇解、酸解、氨解等多种化学反应【1 ，2 ，3 1 ，且催化效率高，催化条件简单，因此，它 被广泛应用于如洗涤剂、皮革、食品、油脂加工、化妆品、废纸脱墨、日化等工业 中【4 ，5 ，6 1 。此外，随着医药领域研究的迅猛发展以及能源日益短缺的今天，脂肪酶在 催化手性药物拆分和生物柴油合成方面均有良好的应用前景，并引起了人们的极大 关注f 7 ，8 】。 目前工业上应用的脂肪酶多是中温酶，大多由微生物产生，且基本上为胞外酶， 酶的最适反应温度一般在3 7 _ 4 0 左右【9 1 ，因此在高温下其反应受到限制，而热稳 定好的脂肪酶在较高温度下，可抗蛋白质变性，仍表现较高的活性，有利于催化反 应在较高温度下进行。利用热稳定性好的脂肪酶作为生物催化剂具有如下优点：( 1 ) 制备酶的成本降低，由于酶的稳定性高，因而可在室温下分离提纯和包装运输、并 能长久地保持活性；( 2 ) 对反应器冷却系统等的要求标准降低，减少了能耗，由于热 稳定酶有耐高温的特性，所以生产中可不需要复杂的冷却装置。( 3 ) 加快了动力学反 应，随反应温度的提高，酶分子运动速度加快，催化能力加强，因而使用效率得到 了提高；即节省了开支，又降低了冷却过程中对环境所造成的污染；( 4 ) 提高了产物 的纯度。在热稳定酶的催化反应条件下，一般很少有杂菌存活，从而减少了细菌代 谢物对产物的污染【1 0 , i i 】。 热稳定性高的脂肪酶的获得，主要有以下几种方式：( 1 ) 从自然界的高温环境 中筛选可以产生脂肪酶的微生物，这些微生物产生的脂肪酶往往具有比较好的耐热 性。( 2 ) 利用微生物的诱变育种技术使脂肪酶产生菌发生基因突变，从大量的突变 体中筛选出稳定性高的脂肪酶突变体。( 3 ) 运用p c r 介导的基因定点突变技术，通 过三维结构的计算机模拟理性设计来改变脂肪酶的某些碱基，从而使编码该脂肪酶 的蛋白质序列发生改变，导致蛋白质空间结构更加稳定，从而使酶的热稳定性增强。 ( 4 ) 利用蛋白质体外分子的定向进化技术，通过基因的随机突变、同源或异源脂肪 酶基因的杂交、d n a 重排等手段来改变编码脂肪酶基因的序列，通过高通量筛选从 而获得耐热性较高的突变体脂肪酶。 福建师范人学胡长沽硕十学位论文 脂肪酶的热稳定性问题一直是脂肪酶研究及生产和应用的瓶颈问题。目前国外 对脂肪酶的研究主要集中于脂肪酶基因的克隆与表达、蛋白质改造、结构与功能、 空间构象、作用机理、动力学等方面，并取得了一些重要进展，国内的研究还主要 集中在菌种选育、酶学特性、发酵特性等的研究上，分子生物学水平上也有研究所， 但相对较少1 1 2 】。本研究小组致力于从耐高温菌种筛选、分子突变、结构修饰等方面 研究和解决该问题。从自然界筛选耐高温脂肪酶菌种，获得相应的基因，不但菌种 本身将来有可能成为耐高温脂肪酶的生产菌种，同时其基因可能成为分子改造和分 子重组的重要基因来源。 近年来，本课题组已完成了扩展青霉脂肪酶( p e l ) 基因的克隆和序列分析， 并实现了该基因在大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母中的表达【1 3 , 1 4 , 1 5 】，在此基础上， 本课题组采用蛋白质工程的方法对p e l 进行了定点突变的研究，初步获得了最适作 用温度和热稳定性有所改善的突变体。袁彩【1 6 】通过蛋白质工程的定点突变技术，使 p e l 的最适作用温度下降了1 5 。c 。蔡少丽【1 2 7 】利用叠加突变的方法改造p e l ，使其 叠加突变体酶热稳定性的比野生型p e l 的t m 值提高了3 5 。 脂肪酶被广泛应用于各个领域，但每个领域所对脂肪酶的要求不同，如在洗涤 剂中要添加能够在较低温度下发挥较好作用的脂肪酶，造纸脱胶和废纸脱墨工艺中 却要采用耐高温的脂肪酶。就目前脂肪酶的研究现状来看，仅通过蛋白质工程来改 善脂肪酶特性，是远不能解决各个领域对脂肪酶的要求的。因此，寻找发现具有新 特性、耐热、高活力、符合现代生物工程要求的脂肪酶是一项非常有意义的工作。 基于以上条件，本文进行了以下研究： 1 于福州温泉水体中筛选耐热脂肪酶产生菌，并对其进行了菌种鉴定和脂肪酶酶学 性质的研究。 2 通过易错p c r ( e r r o r - p r o n ep c r ) 和交错延伸p c r ( s t a g g e r e de x t e n s i o np r o c e s s ( s t e p ) ) 相结合的方法对扩展青霉脂肪酶( p e l ) 进行随机突变，以期获得最适作 用温度和热稳定性有所改善的突变体脂肪酶。 第1 章绪论 1 2 微生物脂肪酶 脂肪酶广泛存在于植物、动物和微生物中【1 8 】。其已有一百多年的研究历史，是 最早研究的酶类之一。其1 8 3 4 年第一次报道了兔胰脂肪酶，1 8 5 8 年报道了胃脂肪酶， 18 7 1 年报道了植物种子脂肪酶，而微生物脂肪酶直到2 0 世纪初才发现，且脂肪酶在 微生物界中分布广泛。据估计，细菌有2 8 个属、放线菌4 个属、酵母菌1 0 个属、其它 真菌的2 3 个属共计达6 5 个属的微生物可以产脂肪酶【1 9 】。实际上，脂肪酶在微生物界 中的分布远超过于此，主要是研究还不广泛，且多半局限于经济意义的属中。动植 物虽然能产生脂肪酶，但原材料生长周期长，提取也比较困难，而微生物产脂肪酶 较动植物有更大的优势，具体如下：( 1 ) 微生物种类较繁多，可根据特定的作用p h 、 作用温度及作用底物特的异性等方面进行定向筛选；( 2 ) 生产成本低、原料来源广、 较易获得高产优良的突变株。( 3 ) 可以不受气候、季节等环境因素的影响，便于进行 连续的工业化生产；( 4 ) 产酶周期短、发酵产物比较单纯，易于获得高纯度制剂；( 5 ) 作用温度及p h i l 动植物脂肪酶广泛，有机溶剂中稳定性好、异构体选择性、底物专 一性、高度位置选择性和催化活性，便于工业化生产和获得较高纯度的酶f 2 0 川。 目前，微生物脂肪酶在研究和应用上发展非常迅速，其在工业上应用的主要有 如下表【2 2 3 2 1 。 表1 微生物脂肪酶在工i k 生产中的j 蓝用 t a b l e 1i n d u s t r i a la p p l i c a t i o n so f m i c r o b i a ll i p a s e s 工业 反应产品或应用 去污剂业 制酪业 饮料业 脂肪和油 化学业 制药业 化妆品业 皮革业 造纸业 洗涤剂业 水解脂肪 水解乳脂 植物芳香改良 转酯 合成、对映异构体选择 转酯作用 合成作用 水解作用 水解作用 水解作用 从纤维中除油 诱发牛奶、奶酪中的芳香 饮料 可可脂、人造奶油 化学制品 脂制药品、助消化药物 保湿品、乳液 皮革生产 提高纸制品质量 除脂 福建师范人学胡长沿硕十学位论文 1 3 嗜热微生物 一般将在5 56 c 以上环境中能够生长的微生物称作嗜热微生物( t h e r m o p h i l e s ) ，其 中生长温度上限在5 5 7 5 之间的叫中度嗜热微生物，生长温度在7 5 * ( 2 以上的微生 物称为极端嗜热微生物( e x t r e m et h e r m o p h i l e s ) ，生长温度在9 0 。c 以上的微生物称为超 嗜热微生物( h y p e t h e 肌o p h i l e s ) 【3 3 1 。嗜热微生物多分布于草堆、煤堆、火山地、厩肥、 温泉、海底火山附近、地热区土壤、工厂高温废水排放区等处。斯坦福大学科学家 发现的古细菌，最适生长温度为1 0 0 ，德国的斯梯特( k s t e t t e r ) 研究组在意大利 海底发现的一族古细菌，可以生活在1 1 0 以上高温中，美国的j a b a r o s s 发现一些 从火山口中分离出的细菌能生活在2 5 0 的环境中。 ( h t t p ：k c z y z j u t e d u c n m i c r o b i o l o g y ) 。自从美国人t h o m a sb r o c k 于1 9 6 9 年首次从水温 在6 0 8 0 c 的美国黄石国家公园中分离筛选出第一个严格意义上的水生栖热菌 ( t h e r m u sa q u a t i c u s ) 以来，到目前为止，约有9 0 种嗜热菌从世界不同的高温陆地和海 洋环境中被筛选出来，从系统发育和生理属性上可划分为3 4 个属，1 0 个目，约有4 0 0 株高温菌被分离和描述【3 4 3 7 1 。近年来筛选到的一些嗜热微生物情况如下表3 3 。3 7 】。 表1 2 部分嗜热微生物 t a b l e1 2p a r t so ft h e r m o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m s o r g a n i s m g cc o n t e n t ( ) t o p t ( )s o u r c eg e n o m es e q u e n c e ds i z eo f g e n o m e ( m b ) t h e r m o p h i l i ca r c h a e a p a b y s s i 4 49 6s e a2 0 0 11 7 7 p f u r i o s u s 4110 0m a r i n es e d i m e n t s2 0 0 21 91 zk o d a k a r a e n s i s 5 2 8 5m a r i n e2 0 0 72 0 9 s o l f a t a r i c u s 3 68 5 h o t s p r i n g 2 0 0 72 9 9 ph o r i k o s h i i4 29 8s e a - w a t e r2 0 011 7 4 rl e t t i n g a e 3 9 6 5 s u l f a t e r e d u c i n g 2 0 0 72 14 t h e r m o t o g as p r q 2 4 68 2m a r i n e2 0 0 81 8 8 z p e t r o p h i l a 4 78 0k u b i k io i lr e s e r v o i r2 0 0 71 8 2 c a s a c c h a r o l y t i c u s 3 57 0 h o t - s p r i n g 2 0 0 72 9 7 ct h e r m o c e l l u m 3 9 6 0c o t t o nb a l e2 0 0 73 8 4 丁m a r i t i m a4 68 0m a r i n e1 9 9 9 1 8 6 4 第1 章绪论 从热的岩石、沉积物、泥土、土壤和水的好氧和厌氧环境中采集样品，分离筛 选嗜热微生物，因硫化氢的存在大多数热环境是厌氧的，所以样品应立即快速冷却 或降低氧含量- 以避免失活。可以使用固体培养基，通过富集培养物柬获得单菌落。 嗜热细菌并非单一的菌属或菌群而是广泛分布于各种不同的菌群中的。现在 通用的分类方法是比较1 6 s 1 8 sr r n a 序列的系统发育进化树。通过系统进化树将牛 物世界分成三界：细菌( b a c t e r i a ) 或真细菌( e u b a e 证r i a ) 、古生莳( a r e h a e a ) 或 古细菌( a r e h a e b a c t e r i a ) 和真核生物( e u k a r y a o r e u k a r y o t e s ) 。日前柬看，对于分 类的识别及描述，基于1 6 s 1 8 sr r n a 序列的分类系统是必不可少的1 3 4 3 5 i 。另外传 统的分类特征如d n a 的g c 百分含量、形态、d n a 的同源性、生理学特征等，可以 用束在进化系统中做进一步的分类。嗜热微生物的分类在生命进化中的地位如图1 ， 其中红线部分代表嗜热菌1 3 6 1 。 幽】- i 基t r n a 的进化树，红线代嗜热苗 f i g l 一】p 时l o g e n e t i e t r e e b a s e do n r n a r e d l i e sr e p r e s e n t h t 福建师范大学胡长浩硕士学位论文 1 3 1 嗜热微生物的嗜热机制 由于嗜热微生物细胞大小是在微米范围的，任何独立对抗热环境的保护剂都是 不可能有效的。因此，所有细胞成分都必须是抗热性的。目前对嗜热菌的嗜热机制 研究，认为有以下几个方面的原因。 一、细胞膜的组分及其嗜热机制：嗜热微生物的膜脂分为两大类型，一类是真 细菌型膜脂，另一类是古细菌型膜脂。真细菌型膜脂是通过脂肪酸和甘油酯键结合 形成的脂肪酸甘油酯，一般是甘油脂肪酰二酯。随温度升高，复合脂类中的烷基链 相互间隔扩大，但是极性部分作为膜的双层结构却保持液晶的整齐状态。膜通过自 动调节脂成分来维持膜的液晶态从而获得更高的熔点。古细菌型膜脂是通过甘油和 异戊基醇( c 2 0 和c 4 0 植烷醇) 的醚键结合衍生出的两类基本醚，植烷醇甘油二醚及四 醚，它们的非极性链差不多都固定在c 2 0 和c 4 0 上。醚可以形成大小和脂双分子层相 同的单层膜脂，因而避免了双层膜在高温下易变性分开的状况。在嗜热古细菌的膜 中还存在着环己烷型脂肪酸，在高温下这种脂肪酸链的环化能促进二醚磷脂向四醚 磷脂的转变，从而提高了耐热性1 3 3 j 。 二、d n a 结构的稳定性：d n a 是通过配对碱基之问的氢键及相邻碱基之间的堆 积力来维持它的稳定性的。实验研究发现嗜热菌能够生存的最高温度与( g + c ) 之 间的关系是正向的。嗜热栖热菌d n a 中含有6 0 - - - 7 0 的( g + c ) ，d n a 的构型一 般为a 型，而相邻碱基重叠的偏差大，这有利于形成较多的氢键来维持稳定性 3 9 1 。 至今，已知的嗜热微生物都具有逆促旋酶( r e v e r s eg y r a s e ) ，它是一种独特的i 型d n a 拓扑异构酶，可以引起正超螺旋的形成，其反应依赖于a 1 1 p ，在a t p 和m 矿+ 存在条 件下，其逆促最高温度可达9 0 ( 2 ，逆促旋酶正是通过正超螺旋来抵消高温对d n a 结 构的影响郾4 0 , 4 1 1 。另外，一些产烷嗜热菌细胞质中存在着大量的环化的2 ，3 钾铋 磷甘油，它能保护d n a 不受化学物质的降解 4 2 1 。此外，核小体与组蛋白能在高温下 聚合成四聚体甚至八聚体，能保了护裸露的d n a 免受高温降解，增加了稳定性f 3 8 4 3 。 三、t r n a 的热稳定性：嗜热菌的t r n a 周转速度大于中温菌，且g c 含量高，因 此嗜热菌的代谢快，保护了热不稳定的代谢物，使一些重要代谢产物能够迅速再合 成【3 3 1 。最近发现修饰后的核苷酸茎环上碱基之间的相互作用以及d 环堆积核心氢键 及离子对的产生与极端嗜热菌t r n a 的热稳定性有关。嗜热微生物核糖体的稳定性是 嗜热微生物生长上限温度的决定性因子。非w a ts o n c r i c k 碱基对的增加，也能间接 导致r n a 一- - 级结构中氢键数目的增加。此外，r n a 螺旋侧面突起的碱基和近端酯键 第1 章绪论 之间的配对也能避免r n a 结构上的不稳定性j 。 四、钨元素的稳定作用：在生物生命系统中钨是一种非常罕见的元素，然而在 p y r o c o c c u s f u r i o s u s ( 激烈热球菌) 等古生菌的生长和代谢中却起着十分重要的作用。 迄今，已有4 种含钨的结合酶被纯化和分离出来，它们氧化不同种类的醛，并在糖类 和氨基酸代谢中起着重要的角色，其中w o r 4 是一个二聚体，每个亚基含有1 个w 原 子、3 个f e 原子、3 4 个酸不稳定的s 原子、一个c a 原子，w o r 4 不能氧化脂肪和羟基 酸【4 5 1 。 五、蛋白质和酶的稳定性：嗜热菌之所以能够耐受高温环境，其决定性的原因 是细胞内的蛋白质和酶类的热稳定性比较好。嗜热菌产生的蛋白质和酶几乎都是热 稳定的。中度嗜热菌产生的蛋白其变性温度一般为7 0 ；而从超嗜热菌中分离的蛋 白其变性温度在8 5 9 5 c 之间，有的甚至超过了1 0 0 * c t 3 3 1 ，例如：激烈热球菌 ( p y f o c o c c u s f u r i o s u s ) 的蛋白水解酶在9 5 。c 的条件下其半衰期超过6 0 h ，其乙醇脱 氢酶在8 5 条件下的半衰期可达1 6 0 h 4 6 l ；硫化叶菌( 鼬物l o b u ss o d m r i c u s ) 的2 一 酮3 脱氧醛缩酶在1 0 0 。c 的条件下半衰期达2 5 h 【4 7 1 。金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) 的果糖醛缩酶在9 7 c 条件下的半衰期为1 ，6 h 【4 8 1 。 酶的热稳定性研究表明，蛋白质在氨基酸顺序排列成一级结构的基础上，通过 氢键、盐桥、疏水作用、离子键等次级键的作用，折叠成对活性和耐热性起关键作 用的二、三、四级结构。蛋白质在空间结构上的微小差异以及其他因素的影响使嗜 热酶蛋白表现出比常温酶更强的耐热性，更利于在高温条件下发挥其活性。 1 3 2 嗜热酶 1 3 2 1 嗜热酶 嗜热酶是指那些最佳温度在6 0 - - 8 5 发挥催化功能的酶，最佳活性温度在8 0 以上的酶称为超级嗜热酶【4 9 1 。嗜热酶具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率 高和作用温度及p h 广泛等特点，且嗜热酶在高温下的稳定性也较好。因而它能克服 中温酶( 2 0 * c - - , 5 5 。c ) 及低温酶( 2 c 2 0 ) 在应用过程中出现的生物学性质不稳 定的现象，可以取代传统的中温酶催化及化学催化，能够为优化工艺流程开辟一条 新的途径，特别是在1 0 0 以上仍能够稳定性的酶，从而可以使很多高温化学反应过 程得以实现，这将极大地促进我国生物技术产业的发展，带动我国生