（植物学专业论文）猕猴桃愈伤组织的诱导及植株再生研究.pdf

摘要 本文以中华猕猴桃( a c t i n i d i ac h i n e n s i sp l a n c h ) 为材料， 对其体细胞愈伤组织的诱导、芽的分化、芽的增殖以及芽苗生根 的一些基本规建进行了研究，以期为中华猕猴桃的快速繁殖提供 一些基础资料。 弋实验结果表明： 、。 诱导愈伤组织以去皮层茎段作为外植体，以m s + z t l 0 - 2 0 r a g ，l 1 + n a a 0 1 0 2 m g l 1 和m s + z t 0 5 2 0 m g l - i + i b a 0 2 0 ，5 m g l 。作为培养基效果最好。 芽分化最佳培养丛配方为m s + z t i - o - 2 o m g 一+ n a a 0 l 鼎搿锱粼搂辫糌糌酱粼龉z t 畸叛a i 诱弓的茎霞恧伤组织萌芽芬死话况比其它来源的愈伤组 织要好。 芽的增殖的最佳培养配方为m s + z t i 0 m g l 。+ 6 b a 2 0 m g l + g a 3 1 0 m g l 4 试管苗的生根培养基配方为i 2 m s + i b a i 0 m g l 。厂 关键词：中华猕猴桃；愈伤组织；植株再生 s t u d e i so nc a l l u si n d u c t i o na n d r e g e n e r a t i o no f c h i n e s eg o o s e b e r r y x i e z h i b i n g ( d e p a r t m e n to f f r u i t & f o r e s t r y ，x i a o g a nt e a c h e r sc o l l e g e ，4 3 2 1 0 0 ) a b s t r a c t a c l i n i d i ac h i n e l i s t sp l a n c hw a su s e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s r e s e a r c h e sw e r ed o n eo ns o m eb a s i cl a w so fi t sc a l l u si n d u c t i o no f s o m a t i ct i s s u e s ，s h o o ti n d u c f i o na n dp r o l i f e r a t i o na n dr o o t i n g ，w h i c h p r o v i d e ds e v e r a lr e f e r e n c e sf o ri t sr a p i dp r o p a g a t i o n t h ef o l l o w i n g a r et h er e s u l t s ： t h eb e s tr e s u l t so fi n d u c e dc a l l u sw e r eo b t a i n e df r o m s t e m s e g m e n t s o fp e e l i n ge p i d e m i c sa s e x p l a n t s a n do nm s + z t l o 一 2 0 m g l - i + n a a 0 1 0 2 m g l o rm s + z t 0 5 - 2 0 m g l “+ i b a 0 2 - 0 5 m g l 。a sm e d i u m ； t h eb e s tc o m b i n a t i o n so fs h o o ti n d u c t i o nw a sm s z t l o - 2 0 m g l - z + n a a 0 1 0 2m g l 一+ c h 6 0 0 m g l - i a n d t h e o p t i m u m c o n c e n t r a t i o n s o fs u c r o s ew e r e 2 0 3 0 9 l ，t h ec o n d i t i o no f s h o o ti n d u c t i o ni ns t e ms e g m e n t si n d u c e do nz t + n a ai sm u c hb e t t e r ； t h eb e s tc o m b i n a t i o n so fs h o o t p r o l i f e r a t i o n v c a s m s + z t l 0 m 2 l “+ 6 一b a 2 o m g l 1 + g a l l o m g l 1 t h eb e s tc o m b i n a t i o n so f r o o t i n gw a sl 2 m s + i b a1 0 m g l k e yw o r d s ：a c t i n i d i a p l a n t l e t c h i n e n s i s ； c a l l u s ； r e g e n e r a t i o n 前言 中华猕猴桃( a c t i n i d i ac h i n e n s i s p l a n c h ) 为猕猴桃科 ( a c t i n i d f _ a c e a e ) 猕猴桃属( a c t i n i d i a ) 的落叶藤本植物，原产于 我国。猕猴桃属植物全世界分布有6 3 个种，其中中华猕猴桃和美 味猕猴桃( a c t i n i d i a d e l i c i o s ac f l i a n g ) 是最具有商品价值的 两个种f jj 。中华猕猴桃简称猕猴桃，本草纲目载有“其形如 梨，其色如桃，而猕猴喜食，故有诸名| 2 】。即为得名之由。猕猴 桃又名阳桃、羊桃、毛桃、阳梨、毛梨、藤梨、红藤梨；我省叫 毛桃、毛梨、刺梨、猴桃；英国称为c h i n e s eg o o e s b e r r y 即“中 国鹅莓”或“中国鹅梨”；新西兰称为k i w i f r u i t 或k i v 。i 即“基 维果”：日本称“猕猴梨”j 。 猕猴桃是一种古老的植物，在广西田东发现有中新世早期的 猕猴桃叶片化石。猕猴桃在我国有悠久的历史记载，早在公元前 两千五百多年前的春秋时代，就被书载于我国最早的诗歌总集一 一诗经中1 4 j ：尔雅( 公元前2 0 6 5 5 年) 有食用此食品 的记载p 】。唐代诗人岑参在一首诗中写有“中庭井栏上，一架猕 猴桃”，可以肯定至少在1 2 0 0 多年前就已经人工栽培猕猴桃了 1 6 。其后 本草拾遗、 开宝本草、 植物名实图考、 国药提要、 只用本草等不少文献对其医疗效用和其它多 种用途，均有较详细的记载，可见猕猴桃在我国早就被人们所利 用【5 一”。 尽管猕猴桃原产我国，发现和利用有着悠久的历史，并且不 论是种类、数量、分布面积、还是总蕴藏量上，我国均居世界首 位。但是，我国的猕猴桃早期主要还是处于野生状态，直到5 0 年代，一些省市有关单位才开始进行资源调查和引种工作。到7 0 年代后期，我国逐渐开始了大规模的资源调查和单株选优工作。 7 0 年代末至8 0 年代初各地才丌始建园，将猕猴桃作为果树进行 系统研究和规模化商品栽培。 1 猕猴桃的营养价值、医疗保健作用和经济价值 猕猴桃是一种营养价值非常高的珍贵水果。它所含营养成分 非常丰富，对人类健康十分有益，人称“水果之王”被誉为“聪 明果”、“仙果”。猕猴佻果实酸甜可口，风味独特，具甜瓜、 草莓和柑桔的混合风味。特别是果实中维生素c 含量十分丰富， 据国家轻工部测定，每1 0 0 克鲜果中含维生素c 3 0 1 4 0 0 毫克， 居一切水果之冠，比柑桔类高五至十倍，比苹果高二十至八十倍， 比梨、葡萄等也高十几到几十倍，胜过号称富含维生素c 的柚子 五至十倍，超过了以前认为维生紊c 含量最高的醋梨，是维生素 c 植物的新资源，享有“维生素果”之称【4 - ”。除维生素c 之外， 果实中还含有大量的可溶眭糖分、有机酸、维生素d 、维生素b 、 维生素p 、蛋白质朊酶、多种必需氨基酸、脂肪以及钙、磷、铁、 钾等多种人体必需的矿物质。 ” 猕猴桃的鲜果除可生吃外，还可以加工制成各种各样的食 品，如猕猴桃果酱、果干、果粉、果汁、浓缩果汁、果脯、果晶、 糖浆、糖水罐头和猕猴桃酒等，它们是需要高营养物质的高空、 潜海、矿井、高山、高原等特种工作人员以及炼铁工人、林业工 人及老弱、妇婴、伤病人员等特需的滋补营养佳品。可贵的是， 加工后的果品仍保持其原来的豇l 昧，营养成份也很少损失。 猕猴桃果实有很好的医疗保健作用，对一些常见的疾病有较 好的疗效。可促进手术后病人的康复和产妇复原，并可作高血压、 肝炎、癌症、动咏硬化、冠心病、尿道结石、大面积烧伤等辅助 治疗药物。北京医学院研究结果表明：猕猴桃汁是阻断致癌物质 亚硝基吗啉在人体内合成最有效的阻断剂，其阻断率高达 9 8 5 i 趴。具有很好的防癌治癌效果。这主要归功于猕猴桃含有丰 富的维生素c 和其它能阻断硝酸胺合成的活性物质。维生素c 还 可增强心肌和血管壁的弹眭和韧性并能促进胆固醇加速转化为胆 酸，降低血中胆固醇及甘油三脂的水平，因而对高血压、动咏硬 化、冠心病等具有很好的防治效果。猕猴桃还具有通便、祛风利 湿、清热解毒、降低辐射为害、提高智力、美容、延年益寿等功 效。 除果实之外，猕猴桃的其它部分对人类也有广泛的用途，叶 片大而肥厚，营养丰富，含淀粉1 1 8 、蛋白质8 2 、维生素 c 7 5 毫克1 0 0 克，还含有各种矿质营养，是很好的饲料，也可供 药罔。花是上等蜜源植物，丌花时香气浓郁，花中芳香浊含量丰 富，是浸提芳香油较好的工业原料。种子含油量高达3 5 6 ，其 油为干性油，种子含蛋白质1 5 左右，为优质的食用原料。猕猴 桃藤蔓中台有大量的纤维素、半纤维素和木质素，细长坚韧，是 制宣纸的上等原料。蔓中含有丰富的胶液，粘性很强，抗姒化性 能良好，是工程建筑的好原料。根中含有丰富的药用物质，能消 热利尿、止渴调中、下气解烦、除热骨节风痛，能压丹石、散淤 止血、通淋疗痔，对痢疾、胃癌、麻风病也有很好的疗效。【4 1 1 9 l 猕猴桃除具有较高的营养价值和医疗保健作用外，还具有较 高的经济价值，被誉为“绿色金矿”。在国内市场上，标准果一 般售价为1 5 2 0 元公斤。在广州、深圳、上海、北京等地一个 1 0 0 克左右的猕猴桃售价为5 6 元。一亩猕猴桃园投产后，可产 鲜果1 5 0 0 公斤以上，亩产值1 5 0 0 0 元左右，这正是猕猴桃成为投 资热点的重要原因i i l 。 猕猴桃还可作为一种观赏植物，由于猕猴桃的叶片正绿反 白，花由乳白而变鲜黄，中庭井栏栽上一株，任其樊缘于树木房 舍之间，相映成趣，是庭园观赏的优良树种【1 “。 2 国内外猕猴桃栽培及研究现状 全世界栽培猕猴桃的国家有新西兰、意大利、智利、日本、 美国、法国、澳大利亚、希腊、西班牙、以色列和南非等3 0 多个 国家面积约5 万公顷，产量约8 0 万盹。其中新西兰和意大利占 世界总产量的近7 0 ，前8 国占世界总产的9 8 。国外猕猴桃都 是直接或间接地从我国引种，几个主要猕猴桃生产国家基本上是 从2 0 世纪初开始正式栽培的，早在1 8 4 7 年英国皇家园艺学会从 我国收集了不少猕猴桃标本。其后，e h w i l l i s o n 于1 8 9 9 年受丘 植物园( k e wg a r d e n ) 的委托，到我国湖北西部各地采集了包 括猕猴桃在内的大量标本。 英国、美国又先后于1 9 0 0 年和1 9 0 4 年从我国引种栽培。特 别是新西兰于1 9 0 6 年从我国引种后，培育出了a b b o l t 、a l l i s o n 、 b r u n o 、h a y w a r d 及m o n t y 等优良品种并进行商品性生产后，其 果实行销世界各地。 新西兰是世界上公认的发展猕猴桃最成功的国家，其生产和 科研在国际上处于领先位置，代表着国际上猕猴桃生产和科研的 发展趋势。自3 0 年代开始靓范化商品以来，直到7 0 年代中期， 发展直处于缓慢阶段，此后由于出口效益特别好，其它行业的 农民也纷纷改种猕猴桃，从7 0 年代中期到8 0 年代，生产得到了 飞速发展，进入9 0 年代，在基本上不增加面积的情况下，重点抓 单产、品质和销售。目前栽培面积为1 0 1 6 l 公顷，年产量2 0 余万 吨。年出口创汇达2 亿美元，新西兰园艺中第一大出口创汇产业 ( 园艺业为新西兰第六大出口汇产业) ，在其国民经济中占有举 足轻重的地位。新西兰不仅对发展猕猴桃生产非常重视，而且对 其科研工作也很重视，对猕猴桃的开花习性，结果习性、病虫防 治、杂交育种授粉受精和贮藏性能等方面的研究都取得了一定成 就。新西兰猕猴桃业的巨大成功，是科学技术是第一生产力的具 体生动体现。意大利是继新西兰之后的又一大猕猴桃生产大国， 也是北半球主要的生产国。目前，其产量和栽培面积均己超出新 西兰，栽培面积已达1 6 万公顷，年产量突破2 5 万吨，近一半出 口。在国际影响上已接近甚至超过新西兰i ij 。 我国是猕猴桃的故乡，但长期以来，并未受到很大重视，各 种科研工作开展较迟，大多数猕猴桃还处在野生状态。新中国成 立以后，我国科学工作者对猕猴桃资源及其分布地区进行了调 查。同时，各地植物园和科研单位先后进行了引种驯化栽培和观 察试验。到7 0 年代后期，我国逐渐开始了大规模的资源调查和单 株选优工作，7 0 年代束至8 0 年代初各地才开始建园，将猕猴桃 作为果树进行系统研究和规模化商品栽培，同时猕猴桃的生产利 用及科研得到了国家的高度重视，1 9 7 8 年中国农业科院主持召开 了全国关于猕猴桃的科研座谈会，讨论制定了当前科研计划和长 远打算，要求迅速开展全国性的猕猴桃资源调查、品种选优和培 育、育苗繁殖。栽培管理及贮藏加工等一系列技术措施研究。这 次会议对我国开发猕猴桃资源和发展其生产起了重要的推动作 用。1 9 9 8 年9 月在武汉召开了中国猕猴桃国际学术会议l i “，会上 进行了学术交流，内容涉及资源调查、品种选育、贮藏加工、抗 癌研究等方面大会回顾了近年来在猕猴桃科研方面的研究成果和 进展，认真分析了生产科研中还存在的问题，并提出了相应的解 决途径。目前在栽培技术研究方面，已成功掌握了一套有效的栽 培模式，在品种选育方面，也成功地选育出批具有国际水平的 新品种。如湖北的“鄂猕猴1 号”、欧西的“秦美”湖南的“米 良l 号”等，前述三个品种与新西兰王牌品种h a y w a r d ( 海沃德) 被国家指定为优先发展品种。在栽培面积及产量上也已初具规 模。据1 9 9 4 年1 2 月“中华猕猴桃开发联合体”统计，全国栽培 面积为1 6 5 万公顷，其中挂果面积为4 0 0 0 公顷，总产量为1 5 5 万吨，目前，所产的猕猴桃以内销为主，出口尚处于试销和起步 阶段。湖北省农科院果茶所选育的猕猴桃品种“鄂猕猴桃1 号” 在1 9 9 3 年第7 4 届秋季广交会上，有数家来自世界各地的外商要 求订货。显示出我国猕猴桃产业的巨大潜力。 3 国内外猕猴桃组织培养概况 从本世纪初德国植物学家o g h a b e r l a n d t 提出植物细胞组织 培养的设想2 ”j 到现在，通过长期的科学研究，植物细胞的全能 性和器管分化、体细胞胚胎发生的激素调节得到了证实。植物组 织培养技术也有了迅速发展，组培技术在生产中也得到了广泛的 应用。组培技术在猕猴桃上的应用起步较晚，直到7 0 年代后期才 开始对猕猴桃进行组织培养研究，其研究主要侧重快速繁殖。对 猕猴桃进行快繁有其内在的原因，猕猴挑雌雄异株，长期自然杂 交，单株性状差异很大，单果重从3 0 克到2 0 0 克，果肉有绿、黄、 红三种，果味各异，每1 0 0 克果肉中维生素c 含量最高可达4 0 0 毫克，而最低的仅有3 0 毫克，两者相差l o 倍以上。成熟期也存 在较大差异。如果把选育出来的优良品种或优良株系采用实生种 子繁殖，将会出现以下问题：一、后代性状不一，不能保持良种 特性，营养期长，结果迟；二、实生苗难以生根；三、雄株出现 的比例高。如采用扦插繁殖有些品种又难以生根 1 4 】。所以这些常 规育种方法均不能满足生产上的需求，使良种株系推广受到了很 大限制，为了加速良种的繁殖，国内外有关科技工作者都很重视 猕猴桃离体培养和快速繁殖技术研究旧” 。 自7 0 年代后期以来，猕猴桃组织培养工作主要包括以下内 容： 1 利用猕猴桃的茎段或叶片进行组织培养以诱导植株再 生，通过这种方式进行快速繁殖 1 9 7 5 年h h a r a d a 首先报道了中华猕猴桃的离体器官培养， 用根和茎的切块诱导成芽、根和球形胚。并首次提出了玉米素对 诱导猕猴桃离体茎段再生植株有着良好的效果，同时也指出猕猴 桃这一材料对玉米素及其类似物质需要的特异性。这一结论也基 本上得到了公谢”j 。1 9 7 9 年桂耀林【1 9 1 用离体茎段诱导再生植株 获得成功，他认为以m s 为基本培养基补加1 0m g l 。玉米素的 效果为最显著。并对中华猕猴桃、美味猕猴桃的出愈率和诱苗率 进行了比较，对雌株和雄株的情况也进行了探讨；a s t a n d a r d i 于1 9 8 2 年和1 9 8 4 年口“1 也进行了快繁试验，并利用茎尖育成小 苗。黄贞光等口? 】于1 9 8 3 年诱导愈伤组织成功。并诱导芽、根的 发生，且移栽成功。8 0 年代至9 0 年代猕猴挑组培研究迅速发展， 林国辉等( 1 9 8 5 ) 2 3 j 、会韵琴( 1 9 8 6 ) 2 a l 、万萌等( 1 9 8 7 ) 2 5 1 、 王际轩等( 1 9 8 2 ) 2 6 1 、余师珍( 1 9 8 5 ) p “、李风云( 1 9 8 6 ) 2 8 1 、 林贵荚等( 1 9 8 8 ) p 、杨增海( 1 9 8 5 ) 3 0 l 、江洪如等( 1 9 8 8 ) l j “、 张春喜等( 1 9 9 0 ) 【j “、朱德瑶等( 1 9 9 3 ) 3 3 1 、林庆良等( 1 9 9 4 ) ”、欧风光等( 1 9 9 4 ) 【j “、朱道圩( 1 9 9 7 ) 3 6 1 、丁士林等( 1 9 9 7 ) 3 7 j 在猕猴桃离体器官培养中获得了成功，他们在试村上采有中华 猕猴桃，美味猕猴桃、软枣猕猴桃( 一a r g u t ap l a n c h ) 、狗枣猕猴 桃( 爿幻l o m i k t am a x i m ) 等，外植体采用茎段、叶片、茎尖、腋 芽，从离体繁殖、增殖倍数、提高生根率和移栽成活率等备个方 面分别进行了试验。同期，猕猴桃商品化离体快繁也见诸报端， 1 9 8 1 年g i l b e r t o 等i j 习报道了猕猴桃的商品化离体快繁。1 9 8 8 年意 大利用离体快繁技术生产大批猕猴桃根砧和品种自根砧苗木，表 明微繁技术走向规模化生产【3 ”。目前，在意大利9 5 的猕猴桃苗 是通过组织培养快繁的l 荷兰、巴西、智利也有规模化快繁的报 道【1 ”。1 9 9 3 年刘根林、韩杰峰 3 9 1 对中华猕猴桃无性系繁殖试管 苗的工厂化生产技术进行了探索，找出了不同生长期所需要的最 佳继代生长培养基，并提供了中华猕猴桃工厂化组培育苗的最佳 培养程序。 2 利用胚乳进行组织培养，以期获得三涪体植株 1 9 8 2 年，桂耀林p 吣对猕猴桃胚乳进行培养长成了完整植株， 他认为猕猴桃胚乳培养要求有较高浓度的玉米素( 3 0m g l 。) 及一定量2 4 一d ( o 5 1 om g l 。) 的配合，只有这种配合，才能 诱导胚乳形成愈伤组织和促使胚状体发生，在产生愈伤组织之 后，2 , 4 - d 对分化有抑制作用，故胚乳培养采用诱导与分化两步 分开的实验程序。1 9 8 2 年黄贞光等i 4 】j 出从胚乳培养三倍体猕猴桃 植株。实验出分或诱导和分化两个步骡，通过实验表明，接种于 附加有n a a 的培养基上的胚乳都经由愈伤组织形成不定芽的分 化途径，再由不定芽长或二倍体完整植株，恧接种于加有2 、4 d 的培养基上的呸y l 贝p j 经由愈伤组织形成胚状体的分化途径，进而 发育成三倍体完整植株。 关于猕猴挑的组织培养研究还有毋锡金等( 1 9 9 0 ) 吲对胚的 培养，柱耀林( 1 9 8 2 ) 、匡安秀等“1 ( 1 9 8 3 ，1 9 8 4 ) 对组培 中形态发生的组织学和垣织化学研究马有会h 6 1 进行了通过叶片 作为外植体诱导胚性愈伤组织，并形成分化胚状体及幼株的研 究，余师珍口4 1 对组培中生化特 生进行了研究，a m h i r s c h 4 i “j 也对猕猴组培中生化特性进行了研究。对猕猴桃原生质体的培 养工作在9 0 年代开展起来，张远记等( 1 9 9 5 ) 4 9 1 、蔡起贵等( 1 9 9 2 ) 5 0 1 肖尊文等( 1 9 9 2 ) 川、 1 m o l “e i r a f l 9 9 i ) 吲 对毛花猕桃( 一盯i a n t h ab e n t h ) 、美味猕猴桃、中华猕猴桃的 原生质体培养再生植株的研究。 猕猴桃生产在我国正处在迅猛发展的阶段，而且，猕猴桃的 发展在我国有很多优势：一是有十分丰富的猕撰挑种质资源，并 选出了批具有国际水平的新品种；二是有羊富多样的生态坏 境，适宜和比较适宜栽培的地区很多；三是我国为1 2 亿人口大 国，这是一个十分巨大的潜在市场，随着经济的发展和人民生活 水平的提高，对优质水果的需求量大大增加；四是与我国毗邻的 国家栽培猕猴桃较少，我国生产的鲜果除满足国内市场外，还可 以向这些国家和地区出口。综上所述，我国发展猕猴桃尚具有巨 大潜力。同时我国猕猴桃生产还存在很多问题，其中个主要问 题是优劣品种并存，大大影响了猕猴桃质量，所以大力推广优良 品种已成为了猕猴桃生产中一个迫在眉睫的任务。通过组织培养 进行快速繁殖己成为国际大趋势，但在我国真正已成规模的猕猴 桃商品化快速繁殖还没有口，而在猕猴桃的基础性组培研究中， 又有很多不致的结论。有鉴于此，本文以中华猕猴桃为试材， 以茎段，叶片等为外植体，对愈伤组织的诱导、器官分化、增殖 以及生根过程中不同条件的影响进行了系统的研究。以期为大规 模商品化快速繁殖作一些基础性的理论研究。 材料与方法 1 实验材料 供试材料为中华猕猴桃( a e t i n i d i a c h i n e n s i sp l ，) 的幼嫩茎 及叶片，品种为武植2 号雌株。材料采自中科院武汉植物研究所 猕猴桃园，树龄为十年左右，栽培管理状况良好，幼茎采用当年 生枝的第3 5 节，叶片采用当年生枝从顶芽往下第3 叶。材料取 回后，当天进行处理。 2 实验方法 2 1 愈伤组织的诱导 取猕猴挑幼嫩茎和叶片，经表面清毒，把嫩茎横切成3 - 5 r a m 左右小段，然后纵切成4 瓣；叶片则在主脉附近切取边长3 - 5 m m 的小方块，接种于附加有各种激素的m s 培养基上，每日光照 1 0 1 2 小时，光强为1 0 0 0 1 u x 左右，温度为2 5 摄氏度左右。二局 后统计各培养基中愈伤组织的诱导率( 愈伤组织的诱导率= 愈伤 组织的块数接种外檀体块数x1 0 0 ) ，并观察愈伤组织的生长情 况。 2 2 愈伤组织的芽的分化 愈伤组织的芽的分化实验方法分为二种，一是在愈伤组织的 诱导培养基上继续让其生长，观察其芽分化率( 芽分化率= 有芽 点或苗分化的愈伤组织块数愈伤组织块总数1 0 0 ) ，芽平均 数( 芽平均数= 芽总数7 愈伤组织块总数) 和芽平均高度。一是选 择生长较好的愈伤组织转接到不同的分化培养基上，然后观察芽 分化率，芽平均数和芽平均高。 2 3 芽的增殖 选择生长较好的带芽的愈伤组织，切下较大的芽( o 5 c m 以 上) ，余下的小芽连同愈伤组织切成小块后，转入各种增殖培养 基，观察其生长情况。 2 4 芽苗诱导生根 将1 2 c m 长的小苗沿基部切下，采用浸泡法( 将芽苗浸泡在 含生长素的溶液中一段时问，然后转入不含激素i 2 m s 培养基 中，促进生长，或转入附加一定量的生长素的1 2 m s 培养基中， 观察其生根率( 生根率= 有根出现的苗数转入培养基的茁数x 1 0 0 ) 、根的数量及长度。 结果与分析 1 猕猴桃愈伤组织的诱导 1 1 植物生长调节物质对猕猴桃愈伤组织的诱导效应 1 1 1 单独使用植物生长调节物质对猕猴桃愈伤组织的诱导效应 本实验在前人研究的基础上选取了z t 、6 - b a 、f i t 、n a a 、 2 , 4 一d ，i b a 六种植物生长调节物质附加在m s 培养基中，用幼嫩 茎段作为外值体接种，观察不同植物生长调节物质分别在不同浓 度下对猕猴桃愈伤组织的诱导效应，结果如下( 二周后观察) ： 1 ，1 1 1 z t 的效应 z t 对愈伤组织诱导的效应见表l 表1 ：z t 对愈伤组织诱导的效应 t a b l e1 ：e f f e c to fz to i lc a l l u si n d u c t i o n ， z t 浓度( m g 一) 0 0 10 , 20 5t 02 05 0 诱导率( )6 31 6 72 355 0 48 7 57 1 34 0 ，l 生k 势 +上+ + 上+ + 注：一无；+ 差：+ 一股；+ + 较好：+ 卅旺盛( 本文中备表均同) 从表l 可以看出，猕猴桃茎段的愈伤组织诱导是比较容易， 在z t 各个浓度梯度中以1 o 一2 0 m g l “范围内最好。此范围诱导 出的愈伤组织为淡绿色，致密平滑，生长较好，从接种到愈伤组 织能被肉跟清晰的看见大约为一周对削。 1 1 1 26 一b a 的效应 6 - b a 对愈伤藩筋组织诱导的效应见表2 表2 ：6 一b a 对愈伤组织诱导的效应 t a b l e2 ：e f i e c to f 6 一b ao i lc a l l u si n d u c t i o n ， i ：! 垒盟达鏖! 里g ： ! q ! ：! ：；! ：i! ：q 2 ：! i ：! 诱导率( )6 31 5 04 38 6 1 8 7 504 031 2 , 5 尘丝垫= ：二 从表2 可以看出，6 - b a 的各个浓度梯度内都能获得愈伤组 织，最佳浓度范围为0 5 1 0 m g l - i , 但相较z t 而言，诱导率要稍 低一些，长势明显比附加z t 的一但要差，最佳浓度范围内的愈 伤组织颜色呈淡绿色，生长势一般，质地致密平滑。从接种到愈 伤组织能被肉眼看见大约为一周左右的时吲： 1 i 1 3k t 的效应 k t 对愈伤组织的诱导的效应见表3 表3 ：k t 对愈伤组织诱导的效应 t a b l e3 ：e f f e c to fk to n c a l l u si n d u c t i o n 诱导率( )6 31 0 42 551 9 81 5 03 29 1 生睦势 + +一 从表3 可以看出，k t 对愈伤组织的诱导效果非常差，相对 而言，0 2 0 5 m g l 。浓度时的诱导率要高一些，最高只有2 55 ， 在上述三种细胞分裂素中，k t 明显是诱导效果最差的一组，经 k t 诱导的愈伤组织无色，致密平滑，生长缓慢。从接种到能肉 艮看见大约为一周左右的时间。 1 i 1 4n a a 的效应 n a a 对愈伤组织诱导的效应见表4 表4 ：n a a 对愈伤组织诱导的效应 t a b l e4 ：e f i e c to fn a ao nc a l l u si n d u c t i o n 诱导率( )6 31 0 34 4 42 50 1 0 5 5 37 4 生k 势 t 十一一+十+ 从表4 可以看出，n a - a 对猕猴桃愈伤组织的诱导效果也不显 著，诱导率不高，最高彳信e4 4 4 ，而且生长缓慢，长势很差， 经n a a 诱导的愈伤组织质地致密平滑，颜色呈淡黄绿色。 1 1 1 52 4 一d 的效应 2 4 d 对愈伤组织诱导的效应见表5 表5 ：2 4 一d 对愈伤组织诱导的效应 t a b l e5 ：e f f e c to f2 , 4 一do rc a l l u si n d u c t i o n ；：q 盟鲨鏖! 堕g ：! ：! ! q! ：! ：! ：i! ：!：! ：q 诱导率( )635 007 5 01 0 0 8 8 9 7 226 3 生长势 十+ +十十+ + + + + t 。斗+ 一 从表5 可以看出，2 4 d 对猕猴桃愈伤组织的诱导效果极其显 著，2 4 d 在o 1 5 0 m g l 1 范围内均能较多获得愈伤组织，其中 以浓度在o 5 一1 0 m g l 1 范圈内为最佳，最高诱导率可达1 0 0 ， 此时生长极其旺盛，经2 4 d 诱导的愈伤组织质地疏松呈小瘤 状，颜色呈自色。但不久愈伤组织出现褐化现象，愈伤组织呈泡 沫状坍塌。 1 1 1 6 i b a 的效应 1 b a 对愈伤组织诱导的效应见表6 0 表6 ：i b a 对愈伤组织诱导的效应 t a b l e6 ：e f f e c to fi b ao i lc a l l u si n d u c t i o n 从表6 可以看出，i b a 对猕猴桃愈伤组织的诱导效果并不甓 显，诱导率最高才到2 5 o ，并且生长势很差，生长缓慢，经i b a 诱导的愈伤组织致密平滑，颜色呈淡黄绿色。 1 1 2 细胞分裂素和生长素配合使用对猕猴桃愈伤组织的诱导效 应。 本实验选取细胞分裂素中对愈伤组织诱导效应较好的z t 为 固定细胞分裂素，再与生长素中的n a a 和i b a 配合而形成的植 物生长调节剂组合来诱导愈伤组织。外植体选用幼嫩茎段，接译 二周后观察诱导率及生长势，结果如下： i 1 2 1z t 和n a a 组合的效应 z t 和n a a 组合对愈伤组织的诱导效应见表7 表7 ：z t 和n a a 组合对愈伤组织的诱导效应 t a b l e7 ：e f 凫c to fz ta n dn a ao i 1c a l l u si n d u c t i o n z t 的浓鹱 趟垒垒曲垫壁! 盟g ：l ：12 ( m g l “) 0 0 10 20 51 02 05 0 注：表中数据为箨组合的怠 j j 缌织诱导奉( ) 观察结果表明：z t 和n a a 的各种浓度组合都对愈伤组织的 诱导有着显著的作用：当z t 浓度固定时，n a a 的作= 用用曲线来 表示，呈一钟形，有其最适作用点，n a a 的最适浓度在0 1 o 5 m g l “的范围内：当z t 浓度为0 或较低对，n a a 的最适浓 度都为o 2 m g l ；当z t 处于较高浓度时，随z t 浓度的增加。 n a a 的最适浓度随之向高浓度推移。当n a a 浓度固定时，z t 的作用曲线基本上也呈钟形，有最适作用点，z t 的最适浓度集中 在1 0 m g l 一。从表7 可以看出，z t n a a 比例较大较比例较小 更易诱导愈伤组织的产生，z t 瓜a a 比例在1 0 左右时，诱导率都 较高，诱导率最高达9 6 4 。在所有组台中以z t l 0 - 2 ，0 m g l 、+ n a a 0 1 - o 2 m g ，l 4 的诱导效果最好，诱导率高而且愈伤组织生 长旺盛，颜色呈淡绿色，质地致密光滑。 1 1 2 2z t 和i b a 组合的效应 z t 和i b a 组合对愈伤组织的诱导效应见表8 表8 ：z t 和l b a 组合对愈伤组织的诱导效应 t a b l e8 ：e f f e c to fz ta n di b a0 1 1c a l l u si n d u c t i o n 注：表中数据为备组台的愈伤缉织诱导辜( ) 从表8 可以看出，z t 和i b a 各种浓度的组合都能起至i 促进 愈伤组织产生的作用。z t 对愈伤组织的诱导效应明显大于1 b a 的诱导效应z t 在这个组合中处于主导地位，但与i b a 的不同 配合诱导效应差异也有很大。当z t 为0 时，i b a 的最适浓度为 2 0 m g l “恒诱导率候低，只有2 5 o ：当z t 浓度固定时，i b a 的诱导作用曲线为一钟形曲线，有其最适作用点，而且随着z 丁 浓度的增加，i b a 的最适作用点非常明显地后移，当z t 浓鏖为 0 1 m g ，l - i i b a 的最适怍用点为0 1 m g l ，当z t 浓度为5 0 m g l 。 时，i b a 的最适作用点后移到了1 0 m g l ，这说明z t 1 b a 的浓 度比例必需在一定范围内才能有较理想的诱导率。从表8 可以看 出，z t 1 b a 的比例在2 - 5 的范围内诱导率比较理想，在z t 和i b a 各种浓度的组合中，以z t 0 5 - 2 0 m g + l + i b a 0 ，2 0 5 m g l 。的 浓度组合诱导效果最好，生长较好，此时的愈伤组织质地紧密， 呈白色或淡绿色。 1 2 不同外植体的愈伤组织的诱导 本实验选用猕猴桃幼嫩枝条上的叶片，叶柄以及茎段作为外 植体进行愈伤组织的诱导。茎段分两种处理，一种剥去皮层，另 一种不剥去皮层，把这几类外植体分别接种于附加z t l 0 m g l “ 和n a a 0 i n a g l “的m s 培养基上，二周后观察愈伤组织的诱导 情况：统计愈伤组织的诱导率、生长势以及获得愈伤组织的最早 时间、愈伤组织的形态，结果见表9 。 表9 ：不同外植体的愈伤组织诱导效应 t a b l e9 ：e f f e c to fd i f i e r e n t e x p l a n t s o nc a l l u si n d u c t i o n 从表9 可以看出，以茎段作为外植体进行愈伤组织诱导的效 果非常显著地高于以叶片和叶柄为外植体的诱导效果。茎段的诱 导率都在9 5 以上，并且生长旺盛，在茎段中又以去皮层茎段的 诱导率略高于带皮层茎段的诱导度。叶柄的愈伤组织诱导率比叶 片耍f 氐_ 些，并且生长势很差，生长缓慢，颜色呈白包。从实验 中，我们还发现，各类外植体的初愈时间( 即从接种开始到肉眼 能看见明显的愈伤组织的一段时问) 亦相差很大，去皮导茎段的 初愈时间为4 天，带皮层茎段的初愈时问为5 天，叶片的初愈时 间为1 0 天，叶柄的初愈时间为1 2 天，初愈时间的长短从另一方 面证实了各类外植体的愈伤组织的生长情况不尽相同。 1 3 水解酪蛋白( c h ) 的愈伤组织诱导效应 有机氮对很多植物组织的生长有着良好的促进作用，m s 培 养基中只甘氨酸作为有机氮源，在前人所作的猕猴桃组织培养 中，有使用c h 作有机氮源附加在m s 培养基中的方法，但没有 对c h 的最适浓度以及使用效果作正式的研究。本实验在附加 z t l 0 m g l “和n a a 0 1 m g l “培养基中再分别补充c h 0 ，2 0 0 ， 4 0 0 ，6 0 0 ，8 0 0 ，1 0 0 0 m g l 以幼嫩茎段为外植体接种于以上各培 养基，二周后观察愈伤组织的诱导情况。结果见表1 0 表1 0 ：c h 对愈伤组织的诱导效应 t a b l el0 ：e f f e c to fc h0 i 2c a l l u si n d u c t i o n c h 的浓度( m g l “)诱导率( ) 生| 乏势颜色质嚣 09 5 8h +绿致密光滑 2 0 0964+绿致密光滑 4 0 09 6 5 + + + + 绿致密光滑 6 0 0950+绿致密光滑 8 0 09 0 3 * + 绿致密光滑 1 0 0 0 974+ 绿致密光滑 观察结果可知，附加各种浓度的c h 的培养基诱导愈伤组织 与不添加c h 的培养基比较起来并没有明显的差异，这说明c h 对 诱导愈伤组织并没有明显的效果。 2 猕猴桃愈伤组织的芽分化 2 1 植物生长调节物质对猕猴桃愈伤组织的芽分化诱导效应 以前述单独使用植物生长调节物质和配合使用两种植物生长 调节物质( 细胞分裂素和生长素) 诱导出的愈伤组织为对象，让其 继续生长在原诱导愈伤组织的培养基上，观察其芽分化情况，然 后统计其芽分化率。 2 1 1单种植物生长调节物质对愈伤组织的芽分化诱导效应 单种植物生长调节物质对愈伤组织的芽分化诱导效应见表11 表11 ：植物生长调物质对愈伤组织的芽分化诱导效应 t a b l e11 ：e f f e c to fp l a n tg r o w t h r e g u l a t o r s o ns h o o ti n d u c t i o n 植物生氏 盗窒! 翌g ：l ：12 调节物质0010 20 51 02 05 0 z t07 51 2 72 8 94 2 53 5 03 3 3 2 0 o 0 0 o o 2 5 3 o o o 0 7 8 0 o o o 4 注：表内数据为芽分比率( ) l 0 0 o 0 3 o 0 o 0 名o 0 o o o o 0 o 0拳裟叭 从表1 l 可以看出，只有附加z t 和6 - b a 的培养基才出现芽 的分化，而k t 、n a a 、2 , 4 d 、1 b a 均没有出现芽。在含有z t 的培养基上芽的分化情况又要好于含6 - b a 的培养基。最高的分 化率为4 2 5 ，是在z t 浓度为1 0 m g l 。时出现的，过低的z t 浓度促进芽分化的效果不显著，当z t 浓度超过1 0 m g l 。时随 着浓度的增加，分化率呈缓慢下降的趋势。6 b a 对芽分化效应也 有最适作用点，浓度在2 0 m g l “左右。 2 1 2 细胞分裂素和生长素组合对愈伤组织的芽分化诱导效应 2 1 2 1 z t 和n a a 组合愈伤组织的芽分化诱导效应见表1 2 表12 ：z t 和n 从组合对愈伤组织的芽分化诱导效应 t a b l e1 2 ：e f f e c to fz ta n dn a ao ns h o o ti n d u c t i o n 注：表内数据为各浓度组合下的芽分化率( ) 从表1 2 可以看出，各种浓度组合的芽分化率相差很大，最高 达8 4 1 2 ，而有些浓度组合则完全没有芽的分化，从z t 的各浓 度的芽分化率来看，有较强的规律性，高浓度的z t 对愈伤组织 的芽分化的诱导效应显著高于低浓度的z t 。其中又以 z t l 0 m g l “和2 0 m g l 。表现最好，z t 5 0m g ，l “要珞低一些。 在各浓度z t 的基础上如果再附加n a a ，芽分化率又有很大的变 化，添加n a a 0 1 m g l “的芽分化率比与之相对应没有添加n a a 的芽分化率有了极显著的提高，但随n a a 浓度的增加，相对应 的芽分化率开始缓慢降低。n a a 的最适作用点浓度较低的0 1 o 2 m g l 。的范围内。从表中还可明显的看出z t n a a 比例较高 的芽分化率极显著的高于z t n a a 比例较低的芽分化率，可见芽 的分化对z t 肘a a 的比例有一定要求。综上所述，芽的分化既要 求有较高浓度的z t ，又需要一定浓度的n a a 的配合，对z t n a a 的比例也有一定的要求。 2 + 1 2 2z t 和i b a 组合的效应 z t 和i b a 组合对愈伤组织的芽分化诱导效应见表1 3 。 表1 3 ：z t 和i b a 组合对愈合组织的芽分化诱导效应 t a b l e13 ：e f 凫c to fz ta n di b ao ns h o o ti n d u c t i o n z t 的浓度1 b a 的浓度( m g l “) (mgl-1)0 0 10 20 51 02 05 0 0 1 o 2 o 5 1 0 2 0 5 0 注：表中数据为各浓度组合下的芽分化率( ) 观察结果可知：各种浓度组合的芽分化率有显著的差异。总 体而言，z t 和i b a 给合的芽分化率要低于z t 和n a a 组合的芽 分化率。同z t 和n a a 组合的芽分化诱导效应类似：在各浓度 z t 中添加i b a 能显著提高芽分化率，但过高浓度的i b a 对芽分 化反而有抑制作用；z t i b a 比例高的芽分化率要高于z t i b a 比 例低的芽分化率；在各浓度组合中芽分化率最高的是z t l 0 2 0 m g l “+ i b a0 5 m g l - i 其芽分化率在6 0 以上。 2 2 不同基本培养基对芽分化的效应 本实给以使用i v l s + z t l 0 m g l - z + n a a 0 1 m g l 。培养出的 茎段愈伤组织为材料，在植物生长调节物质种类浓度均相同 ( z t i o m g l - 1 + n a a o 1 m g l 。) 的不同基本培养基中进行培养， 一个半月后统计芽分化率、平均芽数以及平均芽高，结果见表1 4 6 4 7 o 6 3 0 i t t i & ，-1 l ； n 争3 石 o ，3 7 9 ，j，一，一 4 5 o 石王王王。=5 4 ，3 4 ，- j-)-，