（植物学专业论文）扇脉杓兰cypripedium+japonicum+thunb菌根显微结构与内生真菌多样性.pdf

独创性声明 熙幽 学位论文题目扇丛拉兰( 纽! 亚曼垡丝也卫丝丝! 塾坚望坠：! 菌褪 一显微结捡生囟生真菌垒搓性 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标 注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了 明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者： 签字日期：b 11 年月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保 密期限至年月止) 学位论文作者签名：番式 l 导师签名： 签字日期：趵1 1 年6 月毽日 签字日期：年月 日 p 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论。1 1 1 兰科植物概况1 1 2 兰科菌根的特点1 1 3 菌根真菌对兰科植物生长发育的影响2 1 4 兰科植物菌根真菌的分类鉴定3 1 5 兰科菌根的应用前景5 1 6 研究对象、研究目的及技术路线6 第2 章扇脉杓兰菌根显微结构观察9 2 1 材料与方法9 2 1 1 材料来源9 2 1 2 研究方法9 2 2 结果与分析。1 0 2 2 1 茵根显微结构1 0 2 2 2 内生真菌的侵染1 0 2 3 讨论1l 第3 章扇脉杓兰内生真菌的分离与鉴定1 7 3 1 材料与方法1 7 3 1 1 材料来源1 7 3 1 2 培养基配制1 7 3 1 3 内生真菌的分离纯化1 7 3 1 4 内生真菌的形态鉴定。1 7 3 1 5 内生真菌的分子鉴定。1 7 3 2 结果与分析1 9 3 2 1 内生真菌的分离1 9 3 2 2 真菌的形态学特征2 0 3 2 3 总d n a 提取和p c r 扩增结果2 8 3 2 4 真菌i t s 序列分析2 8 3 2 5 基于i t s 的系统发育分析。3 1 3 3 讨论一3 3 第4 章结论与展望3 5 4 1 结论。3 5 4 2 展望。3 5 参考文献3 7 致谢4 2 在读期间发表论文4 3 、 _ 西南大学硕士学位论文摘要 扇脉杓_ 兰( c y p r i p e d i u mj a p o n i c u mt h u n b ) 菌根 显微结构与内生真菌多样性 植物学专业硕士研究生乔元宝 指导教师何平教授 摘要 兰科植物是被子植物中最大的科之一，具有极高的观赏价值和药用价值，由于过度采挖和生 境的迅速丧失，兰科植物的种类和数量急剧减少，处于濒临灭绝、亟待保护的境地。在自然界中， 几乎所有兰科植物都与真菌共生形成菌根，必须部分或全部依靠菌根提供营养才能完成其生活史。 对兰科菌根的深入研究，有助于进一步探索兰科植物的适应机制，加强对野生兰花资源的有效保 护。本文以扇脉杓兰( o 霉啦砌翮配姗t h u n b ) 野生植株的新鲜营养根为实验材料，研究菌根 的显微结构、菌根真菌的侵染方式以及胞内菌丝团的特点，并对其内生真菌进行分离鉴定，旨在 揭示扇脉杓兰菌根的形成机制以及内生真菌的物种多样性，从而为扇脉杓兰与菌根真菌的共生关 系研究和有益菌株的筛选奠定基础，同时，丰富我国菌根真菌资源的种类，为兰科植物就地保护 和迁地保护中涉及的生境评估提供参考。 通过石蜡切片法和苯胺蓝染色压片，借助光学显微镜对扇脉杓兰菌根进行观察，结果表明： 扇脉杓兰的根部结构由根被、皮层和中柱三部分组成，根被组织由一层细胞组成，皮层占根横切 面的大部分，皮层细胞分布有大量的淀粉粒，通常集中于细胞核周围，有时可见针状晶柬。初生 木质部六原型，与初生韧皮部相对的内皮层细胞呈明显的马蹄形增厚。扇脉杓兰菌根具有兰科菌 根的典型特征，真菌在皮层细胞形成大量的胞内菌丝团，菌丝具横隔，细胞间隙只有少量菌丝， 内皮层、中柱和根尖细胞无真菌分布。菌丝团之间通过贯穿细胞壁的菌丝相互连通，形成一个连 续的整体。真菌的入侵主要通过破坏扇脉杓兰的根被组织，进而侵染皮层细胞或者在有活力的根 被细胞内形成菌丝异常膨大的菌丝团。在根被细胞内有时也会形成泡囊结构，通过较细的菌丝相 互连通。在泡囊结构存在的区域，根被细胞中不形成膨大的菌丝团。 采集扇脉杓兰的新鲜营养根进行内生真菌分离，依据形态特征归并后得到1 3 个菌株纯培养。 通过r d n a i t s 序列分析结合形态学特征将其中l o 个菌株鉴定到8 个种，分别是f u s a r i u ms o l a n i ， n e o n e c t r i a r a d i c i c o l a ，c h a e t o m i u mg l o b o s u m ，a l t e r n a r i aa l t e r n a t e ，p h i a l o s i m p l e xc a n i n u 墨，c e r i p o r i a l a c e r a t e ，t r i c h o d e r m aa s p e r e l l u m ，d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i ；其余3 个菌株，1 个鉴定为鬼伞属 西南大学硕士学位论文摘要 ( c o p r i n e l l u ss p ) ，2 个鉴定为口蘑秋t r i c h o l o m a t a c e a e ) 和发菌科( t r i c h o c o m a c e a e ) 。系统分类学分 析显示，这些菌株隶属于3 亚门、5 纲、8 目、1 0 科、1 0 余属。其中，子囊菌亚门3 纲、4 目、4 科、和5 属，担子菌亚门l 纲、2 目、3 科、3 属，半知菌亚门l 纲、2 目、3 科、3 属，表明扇脉 杓兰能与多种真菌类群建立共生关系，在一定程度上反映出其内生真菌的物种多样性，与其广布 种的特征是相一致的。 、关键词：扇脉杓兰：兰科菌根：菌根显微结构：分子鉴定：内生真菌多样性 即 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t m y c o r r h i z a l m i c r o s t r u c t u r ea n d f u n g a l e n d o p h y t ed i v e r s i t y o fc y p r i p e d i u m a p o n i c l l m t h u n b r c a n d i d a t e ：q i a oy u a n b a o t u t o r ：p r o f d r h ep i n g m a j o r ：b o t a n y f i e l d ：p l a n tc o n s e r v a t i o nb i o l o g y a bs t r a c t mo r c h i d a c e a ei so n eo ft h el a r g e s ta n dm o s td i v e r s ef a m i l i e so fa n g i o s p e r m s d u et ot l l e i rh i g h o r n a m e n t a la n dm e d i c a lv a l u e s ，ag r e a tn u m b e ro fo r c h i & h a v eb e e no v e r - c o l l e c t e df r o mn a t u r a lh a b i t a t s , w h i c h , i na d d i t i o nt or a p i dl o s so fh a b i t a t s ，r e s u l t e di nc o n s i d e r a b l er e d u c t i o ni ns p e c i e sa n di n d i v i d u a l n u m b e r , t h u sb r o u g h tt h e mt ot h ev e r g eo fe x t i n c t i o na n dd e s i r i n gc o n s e r v a t i o n i nn a t u r e , o r c h i & a r e w e l lk n o w nt of o r mm y c o r r h i z a la s s o c i a t i o n sw i t hf u n g ia n ds h o ws t r o n gd e p e n d e n c e0 1 1t h es y m b i o s i s f o rt h e i rs u r v i v a lt h r o u g h o u tl i f e t i m e t h e r e f o r ea p r o f o u n dk n o w l e d g e o fo r c h i dm y c o r r h i z aw o u l d h e l p t oe x p l o r et h em e c h a n i s mo f a d a p t a t i o nt ot h ee n v i r o n m e n ts oa s t oc o n s c l w et h e s eo r c h i d se f f e c t i v e l y i n t h i sp a p e r , f r e s hm y c o r r h i z a lr o o t so fc y p r i p e d i u mj a p o n i c w nt h u n b w e r ec o l l e c t e df r o mn a t u r a l h a b i t a t sf o rs m l e m r a lo b s e r v a t i o na n df u n g a li s o l a t i o n t h e nt h em y c o r r h i z a lm i c r o s t r u c t u r e , t h ew a y s m y c o r r h i z a lf u n g ii n f e c t i o na n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fp e l o t o n sw e r l gi n v e s t i g a t e d , 缸t h e $ a n l et i m e , m y c o r r h i z a lf u n g iw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e d 1 r t 圯o b j e c t i v e so ft h i sw o r kw e r et oe x p l a i nt h e m e c h a n i s mb yw h i c ht h em y c o r r h i z a eo fc j a p o n i c u mf o r m e da sw e l la st oe x a m i n et h es p e c i f i c i t ya n d d i v e r s i t yo fm y c o r r h i z a lf u n # c o m p a t i b l ew i t ht h i so r c h i d c o n s e q u e n t l yf u r t h e rr e s e a r c hi nt h e m y c o r r h i z a la s s o c i a t i o mb e l 、】i ，僦t h eo r c h i da n df u n g a li s o l a t e sc o u l db ec a r r i e do u t , b yw h i c h b e n e f i c i a ls t r a i n sc o u l db es c r e e n e do u t i na d d i t i o n , t h i sw o r kc o u l de n r i c ht h es p e c i e so fm y c o r r h i z a l f u n g ir e s o u r c 懿i nc h i n aa n dp r o v i d er e f e r e n c ef o rh a b i t a t a le v a l u a t i o nd u r i n gi ns i t ua n d 麟s i t u c o n s e r v a t i o no f o r c h i d s m y c o r r h i z a lm i c r o 蜘w e r eo b s e r v e dt h r o u g hp a r a f f i ns e c t i o n sa n da n i l i n eb l u es t a i n i n g t a b l e t t i n gu n d e rt h em i c r o s c o p e ，1 1 l er e s u l ts h o w e dt h a tt h er o o to fcj a p o n i c u mc o n s i s t e do fv e l a m e n , c o r t e xa n ds t e l e 1 1 圮v e l a r n e nw a sf o r m e db yal a y e ro fc e l l , a n dt h ec o r t e xc o v e r e dm o s to ft h er o o t c r o s s - s e c t i o n al a r g en u m b e ro fs t a r c hg r a i n s ，w h i c hu s u a l l yc o n c e n t r a t e da r o u n dt h en u c l e u s , e x i s t e di n t h ec o r t i c a lc e l l s a c i c u l a rc r y s t a l se x i s t e di ns e v e r a lo u t e rc o r t i c a lc e l l s 1 1 1 ep r i m a r yx y l e mw e r e h e x a r c h , a n dt h ee n d o d e r r n i sc e l l sa d j a c e n tt ot h ep h l o e ms h o w e dh o r s e s h o e s h a p e dt h i c k e n i n g a st h e t y p i c a lf e a t u r e so fo r c h i dm y c o r r h i z a e , m y c o r r h i z a lf u n g if o r m e dp e l o t o n si nt h ec o r t i c a lc e l l so fc 、 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t j a p o n i c u m t h ep e l o t o n sw e r ec o n n e c t e dt h r o u g ht h eh y p h a ep e n e l r a t e dc e l lw a l la n df o r m e da n e t w o r k w i t h i nt h er o o t i n f e c t i o na n dp e l o t o n sf o r m a t i o nw e r en o t i c e di nt h ec o r t i c a lc e l l s ，e s p e c i a l l yi nt h eo u t e r c o r t i c a lc e l l s ，h o w e v e rh y p h a eh a dn e v e rb es e e ni n t h ee n d o d e r r n i s ，s t e l eo rr o o tt i pc e l l s e n t r yo ft h e f u n g u si n t ot h ec o r t e xw a sa l w a y st h r o u g hd a m a g i n gt h ev e l a m e mt h eh y p h a es p r e a di n t ot h ec o r t e x i n t r a c 詹l l u l a r l y , o rf o r m e dp e l o t o n sw i t ht h i c kh y p h a ei ns e v e r a ll i v ec e l l so ft h ev e l a m e n v e s i c l e sc o u l d b en o t i c e di ns o m ev e l a m e nc e l l s ，w h i c hw e r ec o n n e c t e dw i t he a c ho t h e rb yt h i nh y p h a e w ef o u n dt h a t e i t h e rv e s i c l e so rp e l o t o mf o r m e dw i t he x t r e m e l yn l i c kh y p h a ee x i s t e di nt h ev e l a m e nc e l l s a l lt h ei s o l a t e sf r o mf r e s hm y c o r r h i z a lr o o t so fe j a p o n i c u mw e r ei n i t i a l l yc l a s s i f i e db a s e do n m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n sa n d13f i n a ls t r a i n sw e r eo b t a i n e d w es e q u e n c e dt h ei n t e r n a lt r a n s c r i b e d s p a c e r ( i t s ) r e g i o no f n u c l e a rr i b o s o m a ld n a f r o m1 3i s o l a t e sa n di d e n t i f i e d1 0s t r a i n sa s8 s p e c i e s ，i e f u s a r i u ms o l a n i , n e o n e c t r i ar a d i c i c o l a ，c h a e t o m i u mg l o b o s u m ，a l t e r n a r i aa l t e r n a t e , p h i a l o s i m p l e x c a n i n u s , c e r i p o r i al a c e r a t e , t r i c h o d e r m aa s p e r e l l u m ，d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i f u r t h e r m o r e , a n o t h e r s t r a i nc o u l db ei d e n t i f i e dt og e n u sc o p r i n e l l u s ，a n dt w os t r a i n si d e n t i f i e dt of a m i l i e st r i c h o l o m a t a c e a e o rt r i c h o c o m a c e a e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e s em y e o r r h i z a li s o l a t e sb e l o n g e dt om o r et h a n 1 0g e n e r a , 1 0f a m i l i e s ，8o r d e r s ，5c l a s s e s ，a n d3s u b p h y l a , c o n t a i n i n g3c l a s s e s ，4o r d e r s ，4f a m i l i e s ，4 5 g e n e r ao fa s c o m y c o t a , 3g e n e r a , 2f a m i l i e s ，1o r d e r , 1c l a s so fb a s i d i o m y c o t aa n d3g e n e r a , 2f a m i l i e s , 1 o r d e r , 1c l a s so fd e u t e r o m y e o t i n a t h er e s u l t si n d i c a t e da 、i d er a n g eo ff u n g im i g h tf o r mm y c o r r h i z a l a s s o c i a t i o n sw i t hc j a p o n i c u r aa n dah i 【g hd i v e r s i t yo fm y c o r r h i z a lf u n g i 。w h i c hc o n s i s t e dw i t ht h e s t a t u sa sa w i d e l yd i s p e r s e ds p e c i e s k e yw o r d s ：o r c h i dm y c o r r h i z a ；m y c o r r h i z a lm i c r o s t r u c t u r e ；f u n g a le n d o p h y t e d i v e r s i t y ；m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ；c y p r i p e d i u m j a p o n i c u m i v 两南大学硕士学位论文第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 兰科植物概况 兰科( o r c h i d a c e a e ) 是被子植物中所含属、种数目仅次于菊科的第二大科【l 】，全世 界约有8 0 0 属2 5 0 0 0 种【2 】，广泛分布于全球热带、亚热带和温带地区，特别是热带地 区的兰科植物具有极高的多样性【3 一。中国约有兰科植物1 9 4 属1 3 8 8 种【5 1 ，并且由于 地跨热带、亚热带和温带3 个气候带且地理环境复杂，使得我国不仅具有各个气候带 的兰科植物区系和生态类型，还保留着许多原始类群【6 】。 兰科植物的花部器官高度特化，在系统演化上属于最进化、最高等的类群之一【刀， 依据生长习性的不同可以分为地生兰、附生兰和腐生兰三种类型。大多数兰科植物株 形美观、花部特征丰富多样，具有极高的观赏价值，如兰属( c y m b i d i u m ) 、兜兰属 ( p a p h i o p e d i l u m ) 、杓兰属( c y p r i p e d i u m ) 、石斛属( d e n d r o b i u m ) 、万带兰属( v a n d a ) ；许 多兼具重要的药用价值，如石斛( d e n d r o b i u mn o b i l e ) 、天麻( g a s t r o d i ae l a t a ) 、白及 ( b l e t i l l as t r i a t a ) 、金线兰( a n o e c t o c h i l u sr o x b u r g h i o 等均是重要的中药。由于过度采挖， 加之生境的迅速丧失，野生兰花的种类和数量都在急剧减少，几乎所有的兰科植物都 处于濒临灭绝、亟待保护的境地。1 9 7 3 年由i u c n 建议各国政府联合制定的野生动 植物濒危物种国际贸易公约( 简称c i t e s ) 中，我国被列入的重点保护植物有1 3 0 0 多 种，其中兰科植物1 2 0 0 多种，达9 0 以上嗍。 1 2 兰科菌根的特点 菌根是自然界中普遍存在的一种共生现象，是植物与真菌在长期的进化过程中形 成的一种共生体。根据形态学和解剖学特征，可将菌根分为内生菌根、外生茵根和内 外生菌根三种类型，其中内生菌根主要包括丛枝菌根( a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a e ) 、兰科菌 根( o r c h i dm y c o r r h i z a e ) 和杜鹃类菌根( e r i c o i dm y c o r r h i z a e ) 。 兰科茵根只在营养根上形成，在气生根或贮藏根上没有菌根真菌的侵染。菌根的 外部形态与一般营养根没有根本差异，没有菌套，只有松散的根外茵丝，菌丝一般分 隔，根皮层内无哈蒂氏网，但皮层细胞内具有呈结状或螺旋状的胞内菌丝团【9 】。由于 贮藏根中会产生兰酚，抑制了菌根真菌的侵染，因而贮藏根不形成菌根结构【1 0 1 。 兰科菌根的形成过程可分为两个阶段：种子萌发时的初次侵染和生长新根时的再 次侵染【9 】。兰科植物种子吸水后膨胀，种皮破裂生出胚根，真菌菌丝体穿过胚根的细 胞壁，侵入根细胞腔内生长【1 1 1 。在多年生兰科植物中，每个生长季节的开始都需要形 成新的营养根及新的菌根，为植物提供营养【1 2 】。真菌菌丝通过外皮层通道细胞或破坏 西南大学硕十学位论文 第1 章绪论 根被组织和外皮层细胞侵入皮层，并在皮层细胞中形成菌丝团【l3 1 。在真菌侵染过程中， 被侵染的皮层细胞的细胞壁严重扭曲变形，菌丝在皮层细胞形成菌丝结，菌丝结常位 于细胞核附近或包围细胞核【1 4 1 。 菌根结构的研究表明，菌根真菌主要分布于根皮层细胞，根据各部分功能的不同 可将皮层细胞分为三层：真菌寄主细胞层，消化真菌的细胞层，贮藏营养层【1 2 1 。菌根 真菌侵入兰科植物的营养根后，在皮层细胞内形成螺旋状的菌丝圈，或者与宿主的根 细胞形成不规则的菌丝附着物，这种结构称为胞内菌丝团( p e i o t o n s ) ，菌丝团的出现是 兰科菌根形成的标志之一。胞内菌丝团的寿命不长，几天之内就会被宿主根细胞消解， 消解的菌丝残体逐渐被根细胞溶解和吸收，最后消失【1 5 】。胞内菌丝团对兰科植物的生 长发育具有相当重要的意义，植株积累的营养物质被真菌利用形成菌丝团，最后又以 菌丝团消解的形式返还供给植株生长。菌根真菌通过形成菌丝团、消解菌丝团，为兰 科植物提供营养物质【1 6 】，这一过程被称为真菌营养( m y c o t r o p h y ) 。真菌营养可以作为 一部分的能量来源补充甚至代替光合营养【l 7 1 。兰科植物菌根细胞消化真菌的方式有两 种，一是真菌以菌丝结的形式被同化，即侵入根或根茎细胞中的菌丝形态发生变化， 相互扭曲盘绕成菌丝结被消化掉；二是胞质逸出，即真菌的原生质体注入根的吸收细 胞被利用，这种过程是由进行胞质逸出的特殊菌丝来完成的【1 8 】。 范黎等【l9 】研究了天麻种子萌发过程中与其共生真菌间的相互作用，较详细地阐述 了兰科菌根真菌的入侵机制。菌丝首先侵入柄状细胞，但不形成菌丝团，在外皮层中 形成菌丝团，而在内皮层中的菌丝被消化。菌丝以不同形态存在于原球茎的柄状细胞、 外皮层细胞和内皮层细胞。胚细胞中出现菌丝团是兰花和真菌共生体形成的最初标 志，此时种子开始萌发。 王瑞苓等幽】对黄花杓兰一个生长周期内不同物候期的根进行显微观察，发现真菌 营养一般在光合营养不能满足植株生长时出现，而在光合作用旺盛，光合产物完全可 以使植株正常发育甚至有剩余时，无菌丝团出现。一年中，会有两次菌丝团的出现， 也有两次无菌丝团时期。每次菌丝团出现之前，植株都有相当大的物质能量积累。 1 3 菌根真菌对兰科植物生长发育的影响 兰科菌根真菌对兰科植物的生长发育与生物多样性具有重要影响，在自然条件 下，几乎所有的兰科植物都能与相应的菌根真菌建立共生关系，并且必须依赖于这种 共生关系才能完成其生活史【1 4 2 1 , 2 2 】。大量研究表明，内生真菌多样性会影响兰科植物 的竞争力与适应性，进而影响兰科植物的分布【2 3 。2 5 】。 兰科植物无论是种子萌发还是萌发后的生长发育过程中都必须依赖与之共生的 2 西南大学硕士学位论文第1 章绪论 菌根真菌，从真菌中获得所需的营养物质。大多数兰花的种子没有子叶，也不具胚乳， 只是一团未分化的胚细胞，种胚具胚柄或胚柄退化仅留残迹 2 6 - 2 引，在自然条件下，只 有被适合的真菌侵染后才能萌发【2 9 】。与共生真菌泛化的兰花相比，真菌专一性程度越 高的兰花种子在散播后被特定真菌侵染的概率要低得多，因而，也就更易步向濒危【3 0 】。 内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中 二者形成了稳定的生态关系，一方面内生真菌可从宿主中吸收营养供自己生长需要， 另一方面内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起着重要的作用，可以通过自 身的代谢产物或借助于信号转导作用对宿主植物产生影响【3 1 , 3 2 】。 兰科植物的菌根真菌多数是快速生长的腐生茵，它们可将复杂的碳源多聚物，如 淀粉、果胶、纤维素、木质素分解成可溶性的糖，为兰科植物提供可溶性糖、n 源、 矿质营养及各种生长因子【3 3 3 5 】。有些兰科菌根茵同时是其它植物的外生真菌，此类菌 可以将环境中其它植物的营养运输给兰科植物【3 6 】。 菌根真菌作为诱导子，能够增强兰科植物的抗性。兰科菌根形成后，茵根真菌成 为有益的优势菌群，释放拮抗物质，可以有效地阻止其它病原菌侵入兰根，大大减轻 了兰根遭受病害的危险，从而间接提高幼苗的成活率，促进植株的生长。兰科植物也 可产生某些次生代谢产物，抑制其它真菌的生长和繁殖，为菌根真菌创造更优越的共 生环境，使它更好的发挥作用。 b u 唱e 停3 7 j 指出兰花与真菌间没有严格的专一性，但某种菌根真菌同哪种兰科植物 更能有效地共生却有明显的倾向。w a r c u p 3 8 】认为至少在属的水平上，兰科植物与其菌 根真菌之间存在着专一性。m a s u h a r a t ”】提出生态专一性( e c o l o g i c a ls p e c i f i c i t y ) 和潜在专 一性( p o t e n t i a ls p e c i f i c i t y ) 两个概念，将自然环境和实验室条件下可与特定兰花种形成 茵根的真菌范围加以区别。兰科植物与菌根真菌共生关系的专一性应该是指在自然环 境条件下，两者之间能否形成相对稳定的共生关系的可能性m 】。研究表明，兰科植物 与菌根真菌之间的共生关系不是高度专一的，这种共生关系是有条件的，环境的改变 可能会导致这种平衡关系发生变化。在相同生境下的不同兰花有着相似的菌根真菌， 不同生境下同一兰花种会有不同的菌根真菌【4 l 】。 1 4 兰科植物菌根真菌的分类鉴定 大多数兰科菌根真菌可以在人工培养基上生长并实现纯培养。1 9 2 9 年，c a t o n i 4 e l 成功地将一种从兰科植物上分离到的真菌，在培养基上诱导形成子实体，大大推动了 兰科菌根真菌的分离和鉴定。1 9 9 2 年，c u r r a h 和z e l m e r 4 3 】首次列出了已发现的兰科 菌根真菌1 5 属2 9 种2 个腐生类群最基本的检索表，并附有主要的培养特征和形态特 3 西南大学硕：t 学位论文第1 章绪论 征描述，为兰科菌根真菌的分类研究提供了可靠的依据和有效手段。 目前已知的兰科菌根真菌种类以担子茵0 3 a s i d i o m y c o t i n a ) 和半知茵 ( d e u t e r o m y c o t i n a ) 为主，部分为子囊菌( a s c o m y c o t i n a ) 4 0 。已知能够感染兰花根部并与 之共生的真菌有：伏革茵属( c o n 耙i u m ) 、干菌属( x e m t u s ) 、皮伞菌属( m a r a s m i u s ) 、密 环菌属( a r m i l l a r i a ) 、杯菌属( c l i t o c y b e ) 、层孔茵属( f o r m s ) 、蜡壳菌属( s e b a c i n a ) 、刺壳 菌属( h y m e n o c h a e r e ) 、角担菌属( c e r a t o b a s i d i u m ) 、欧立菌属( o l i v e o n i a ) 、亡革菌属 ( t h a n a t e p h o r u s ) 、胶膜菌属( t u l a s n e l l a ) 以及半知菌亚门无孢目中的丝核茵属 ( r h i z o c t o n i a ) 等1 4 4 1 。 一 传统的真菌分类是根据菌株的形态特征、生理生化特性、生态学特性等进行的， 尤其以有性生殖阶段的形态特征为主要依据。然而，真菌的形态复杂多变、培养特征 不稳定，可用的分类特征相对较少，加之菌根真菌与一般腐生真菌不同，通常难以诱 导形成子实体，单从形态学方面很难准确地完成鉴定。随着生物化学、遗传学和分子 生物学等相关学科的发展与相互渗透，以及科研技术设备的不断改进，真菌的分类鉴 定方法日趋多样化，传统的形态学分类方法也得以进一步完善。尤其电镜技术和分子 生物学技术的广泛应用，使真菌分类学研究进入了一个全新的阶段。 2 0 世纪3 0 年代，德国人e r u s k a 发明了电子显微镜，使得观察真菌的细微和超微 结构成为可能。通过电镜，人们发现真菌游动孢子鞭毛的“9 + 2 ”结构、担子菌的桶装 隔膜、无性和有性孢子的纹饰等，对真菌的认识更加科学，极大地推动了真菌分类鉴 定和系统进化的发展【4 5 】。 真菌的分子鉴定具有操作简便，特异性高和准确可靠等优点，可以从遗传进化的 角度对真菌的种类、系统地位以及相互问的亲缘关系等做出判定，有效地提高了真菌 鉴定的科学性和准确性。另外，采用分子生物学方法可以从菌根样品中直接提取d n a ， 然后通过特异性扩增和序列分析实现内生真菌的菌种鉴定及多样性分析，对于一些难 以实现分离的茵根真菌尤其适用。真菌r d n a 的i t s 区域与其他区域相比进化速度更 快，具有较高的变异性，i t s 序列分析能够如实地反映出真菌种间、种内群体间的碱 基差异，因此广泛应用于菌根真菌的分类鉴定中。 i t s ( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e ) 耳p 内转录间隔区，包括位于1 8 s 和5 8 sr d n a 之间 的i t s l 以及5 8 s 和2 8 sr d n a 之间的i t s 2 ，5 8 sr d n a 通常也被包括在内。i t s i 和 i t s 2 是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这 特点使得i t s 区段不仅适合于属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关 系分析，而且非常适合于真菌物种的分子鉴定m 。同时，r d n a 上的l g s 、5 8 s 和2 8 s 4 西南大学硕十学位论文第l 章绪论 r d n a 序列具有极大的保守性，即存在着广泛的异种同源性，可以根据这些基因上的 高度保守区段设计出与之序列互补的通用引物，借助p c r 技术将i t s 序列扩增出来。 此外，真菌的i t s 序列长度一般在6 5 0 - 7 5 0 b p 之间，区段较小，序列分析易于完成。 w h i t e 等( 1 9 9 0 ) 最早为真菌r d n ai t s 区段的扩增设计了5 条通用引物，通过不同 的引物组合可以选择性地将i t s l 、i t s 2 或者全部i t s 扩增出来【4 7 】。i t s l 和i t s 2 用 于扩增1 8 sr d n a 和5 8 sr d n a 之间的转录间隔区i t s l ，i t s 3 和i t s 4 用于扩增5 8s r d n a 和2 8sr d n a 之间的转录间隔区i t s 2 ，而i t s l 和i t s 4 则可以有效地将包括5 8 s r d n a 在内的全部i t s 区扩增出来，该组合被大多数的实验室用来扩增真菌i t s 的全 序列。然而，i t s l 和i t s 4 也能扩增一些植物的i t s 区段，所以不适用于植物真菌混 合d n a 样品的分析。为此，g a r d e s 和b r u n s ( 1 9 9 3 ) 设计出一对引物i t s l f 和i t s 4 b ， 能够特异性扩增担子菌r d n a 的i t s ，在菌根研究中得到了广泛应用【4 8 】。 i t s 3 一 - i t s 2 - i t s 4 图1 - 1r d n a 结构与p c r 扩增引物结合位点示意图( 参照k o r a b e c n a m 绘制) 。i t s ：内转录间隔区： e t s ：外转录间隔区。 f i g 1 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fr d n ar e g i o nw i t hp r i m e r si o o a ii z a t i o n a c c o r d i n gt o k o r a b e c n a t 柏 it s ：in t e r n alt r a n s c rib e ds p a c e r ：e t s ：e x t e r n alt r a n s c rib e ds p a c e r 1 5 兰科菌根的应用前景 在自然界中，几乎所有兰科植物都与真菌共生形成菌根，在其生活史中必须部分 或全部依靠菌根提供营养方可生存。对兰科菌根的深入研究，有助于进一步探索兰科 植物的适应机制，加强对野生兰花资源的有效保护；另一方面，分离并筛选出优良的 内生真菌资源，应用于兰花的人工栽培与快速繁殖，能够加快兰花生产的产业化发展。 对于能产生与宿主相同或相似的生理活性物质的菌株筛选，也是天然药物开发和生产 的一条重要途径，具有广阔的应用前景。 兰科菌根是菌根真菌与兰科植物形成的共生体，真菌的菌丝可以侵入兰花的种子、 原球茎和营养根内，形成螺旋状扭曲的菌丝团，这些菌丝团不断消解与形成，为兰科 植物种子的萌发以及萌发后的生长发育提供营养物质；同时菌根真菌能够产生某些次 生代谢产物，增强兰科植物的抗性，提高幼苗的成活率。研究兰科植物与共生真菌的 关系，以及利用共生真菌来促进种子萌发和幼苗生长，已经成为兰科植物繁殖生物学 研究的重要方1 6 1 。 5 西南大学硕士学位论文第1 章绪论 在全球气候变化和人类活动的影响下，许多兰科植物所处的生境已被严重破坏， 在这种情况下，对物种的保护已不能单纯地通过建立自然保护区来实现，把植物迁移 到气候适宜的新地点进行保护意味着一种新的挑战m 1 。兰科植物的生长和繁衍需要特 定的环境条件，对生境的要求较其它科属的植物更为苛亥u t 7 1 。因此，在确立迁地保护 地点时，必须对新生境中土壤微生物多样性做出