（植物学专业论文）废次烟叶中茄尼醇的提取、分离技术研究.pdf

废次烟叶中茄尼醇的提取、分离技术研究 摘要 我国是产烟大国之一，其种植面积和产量均居世界首位，种植面积约1 3 0 万公顷 每年产量4 5 0 - - 5 0 0 万吨，其中约有近2 5 的烟叶、烟末等下脚料被废弃。烟叶中的茄 尼醇是一种重要的医药中间体。从天然材料中分离纯化茄尼醇较难，高纯度茄尼醇的生 产工艺技术长期被日本所垄断。我国大部分厂家只能生产附加值很低、纯度在2 0 以 下、不能直接作为药用原料的茄尼醇租品。因此，从废次烟叶中提取、分离获得高纯茄 尼醇技术，倍受人们关注。本文对从废次烟叶中提取、分离高纯茄尼醇技术进行了较深 入全面的研究，获得了如下结果： 1 建立了茄尼醇的薄层色谱检测方法( t l c ) 和液相色谱检测方法( ，l c ) 。t l c 测定茄尼醇的条件是：以石油醚：乙酸乙酯( 4 ：1 , v v ) 为展开剂，香草醛硫酸乙醇溶液 为显色剂，1 0 0 ( 2 下显色5 r a i n ，采用反射法单波长锯齿扫描，测定波长6 2 0 n m ，狭缝1 2 5 x 1 2 5 ，线性化系数s x = 3 。h p l c 测定茄尼醇的条件是：以甲醇：乙醇( 1 ：l , v v ) 为流动 相，色谱柱为k r o m a s i l o d s c l 8 5 止，2 5 0 46 r a m ；检测波长2 1 5 n m ；柱温3 0 1 2 。t l c 法检测成本低、快速、操作简便适于定性和在线检测；h p l c 法适于精确的含量测定。 2 比较了不同夹带剂对超i 缶界c 0 2 提取废次烟叶茄尼醇的影响，结果夹带剂为p a 时最佳，并采用正交试验优化了工艺参数：加入量按固液比5 ：1 ( m v ) ，萃取釜压力 2 0 m p a ，萃取釜温度5 5 ( 2 ，分离釜i 压力7 m p a ，分离釜i 温度3 5 c ，分离釜i i 压力 4 m p a ，分离釜i i 温度3 0 c ，c 0 2 的流量2 0 l h ，萃取时间3 h 。按此优化条件一步提取 茄尼醇得率为5 ，1 5 ，含量为1 0 9 5 。 3 比较研究了提取溶剂和提取方法，结果发现提取溶剂p a 和回流提取法较好。 之后采用正交试验考察了温度、时间、固液比3 因素，对回流提取工艺进行了优化，结 果表明：提取时间3 h 、提取温度4 0 ( 2 、料液比为l ：8 时最好，提取率高、稳定性好、 便于操作。 4 优化了茄尼醇皂化工艺条件。以皂化介质、温度、时间和n a o h 的加入量为因 素进行了正交实验，结果显示：y h 试剂为皂化介质、温度5 0 1 2 、时间3 h 、n a o h 量为 原料的1 4 0 时为最优。此条件下，皂化后茄尼醇的量增加了0 7 2 倍。 5 确定了茄尼醇的柱层析优化条件。通过对吸附剂、洗脱剂、上样方式和树脂活 性级数等进行比较研究，结果表明以活性级数i i 的硅胶为吸附剂、以乙醇为洗脱剂、采 用干法上柱为最优条件，以此方法分离茄尼醇，纯度和收率都较高，纯度达到5 97 ， 收率为7 35 。 6 采用结晶、重结晶方法进一步对茄尼醇粗品进行纯化。对茄尼醇的结晶试剂和 结晶条件进行了优化研究，结果y h l 为茄尼醇的最佳结晶试剂，其最优结晶条件为： 用1 2 倍量y h l 溶解茄尼醇粗品，在2 条件下放置5 小时，过滤、重结晶一次、干燥 得到茄尼醇产品，平均纯度为9 7 0 0 , 4 ，最高纯度为9 82 ，提取率达到了8 37 。用此 方法纯化茄尼醇，工艺简单、周期短、成本低、便于操作，提取率和纯度都较高。 关键词：烟叶；茄尼醇；提取；超临界c o ：萃取；纯化 s t u d y o nt h ee x t r a c t i o na n d s e p a r a t i o no fs o l a n e s o l f r o mi n f e r i o ra n dw a s t et o b a c c ol e a v e s a b s t r a c t i nc h i n a ，t o b a c c o y i e l da n dp l a n t e da r e a , w h i c hh a v er e a c h e d4 5 0 0 ，0 0 0 5 0 0 0 ，0 0 0t o na n d1 3 0 0 ，0 0 0h e k t a r e ，a r et h em o s tg r e a ti nt h ew o r l d n e a r l y2 5 o fi tw a sw a s t e d s o l a n e s o li nt o b a c c ol e a v e si s a l l i m p o r t a n ti n t e r m e d i a t e m a t e r i a lo f m e d i c i n e i ti sd i f f i c u l tt os e p a r a t ea n d p u r i f ys o l a n e s o lf r o mn a t u r a l m a t e r i a l s ，a n dt h et e c h n o l o g yt op u r i f y i n gs o l a n e s o lw a sm o n o p o l i z e db y j a p a nf o ral o n gp e r i o d ，m o s te n t e r p r i s e si nc h i n ac o u l do n l ym a n u f a c t u r ec r u d e s o l a n e s o ip r o d u c tw i t hl o wa d d e dv a l u e ，w h i c hc o n t e n to fs o l a n e s o lw a s b e l o w 2 0 t h e r e f o r e ，m a n yr e s e a r c h e r sh a v ef o c u s e do nt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f y i n g t e c h n o l o g yo fs o l a n e s o lf r o mi n f e r i o ra n dw a s t et o b a c c ol e a v e si nr e c e n t y e a r s i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，e x t r a c t i o na n dp u r i f y i n gt e c h n o l o g yo fs o l a n e s o l f r o mi n f e r i o ra n dw a s t et o b a c c ol e a v e sw a ss t u d i e dt h o r o u g h l y , a n dt h er e s u l t s w e r eo b t a i n e da sb e l o w 1 t h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d so ft l ca n dh p l cw e r ee s t a b l i s h e d t h e d e v e l o p i n g s o l v e n tw a sp e t r o l e u m e t h e r - e t h y la c e t a t e ( 4 ：1 v v ) i nt l c a c e t a l d o ls u l p h u r i ca c i de t h a n o ls o l u t i o nw a sc o l o ra g e n t ，d e v e l o p e dc o l o ra t 1 0 0 。cf o r5 m i n ，w a v e l e n g t hw a s6 2 0 n m ，s l i ts i z ew a s 1 2 5 x 1 2 5 ，l i n e a r i z a t i o n c o e f f i c i e n ts x = 3 t h em o b i l ep h a s ew a sm e t h a n o l - e t h a n o l ( 1 ：1 ，v v ) i nh p l c ， c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nw a sk r o m a s i lo d sc 1 8 ，5 皿，2 5 0 4 6 m m ； w a v e l e n g t hw a s2 1 5 n m ；c o l u m nt e m p e r a t u r ew a s3 0 c 。t h em e t h o do f t l ci s l o w - c o s t ，q u i c k ，e a s y - o p e r a t ea n ds u i t a b l ef o ro n - l i n ea n a l y s i s ，w h e r e a st h e m e t h o do fh p l ci sm o r ea c c u r a t e 2 p aw a st h eb e s t b yc o m p a r i n g e f f e c to fd i f f e r e n te n t r a i n e r s d u r i n gt h ee x t r a c t i o no fs f c o p t i m i z e dp a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e dt h r o u g h o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，r a t i oo fs o l i d ：l i q u i sw a s5 ：1 ( m v ) ，e x t r a c t i o nv e s s e l p r e s s u r ew a s2 0 m p a ，e x t r a c t i o nv e s s e lt e m p e r a t u r ew a s3 0 ( 2 ，s e p a r a t i o n v e s s e lip r e s s u r ew a s7 m p a ，s e p a r a t i o nv e s s e lit e m p e r a t u r ew a s3 5 。c ， s e p a r a t i o nv e s s e li ip r e s s u r ew a s4 m p a ，s e p a r a t i o nv e s s e li it e m p e r a t u r ew a s 3 0 。c ，f l u xo fc 0 2w a s2 0 l h ，e x t r a c t i o nt i m ew a s3 h t h ey i e l da n dp u r i t yo f s o l a n e s o lw a s5 1 5 a n d1 0 9 5 u n d e rt h i sc o n d i t i o n s ， 3 t h ee x t r a c t i o ns o l v e n ta n de x t r a c t i o nm e t h o d sw e r es t u d i e d i tw a s b e t t e r b y c i r c u m f l u e n c ee x t r a c t i o nw i t hs o l v e n tp a t h r o u g h o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t ，o p t i m i z e dp a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e d ：t h ee x t r a c t i o nt i m ew a s3 h , t h ee x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 0 c ，a n dt h em a t e r i a l ：s o l v e n tw a s1 ：8 u n d e r t h u sc o n d i t i o n s ，t h ey i e l dw a sh i g h ，t h es t a b i l i t yw a sg o o d ，a n di tc o u l db e o p e r a t e de a s i l y 4 s a p o n i f i c a t i o np r o c e s s c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e db y o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t t a k es o l v e n ty ha ss a p o n i f i c a t i o nm e d i a ，t h et e m p e r a t u r ew a s 5 0 。c ，t h et i m ew a s3 h , t h ea m o u n to fn a o hw a s1 4 0o ft h em a t e r i a l t h e i v a m o u n to fs o l a n e s o la f t e rs a p o n i f i c a t i o ni n c r e a s e db y0 7 2t i m e su n d e rt h u s c o n d i t i o n s ， 5 c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n so fs o l a n e s o lw e r eo p t i m i z e db y o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h es o r b e n tw a ss i l i c ag e la ta c t i v i t yg r a d e2 ，e t h a n o l w a se l u a n t ，a n df i l l e di nc o l u m nb yd r ym e t h o d u n d e rt h o s ec o n d i t i o n s ，t h e p u r i t ya n dr e c o v e r ya l eh i g ha n dr e s p e c t i v e l yr e a c h5 9 7 a n d7 3 5 6 c r u d es o l a n e s ow a sp u r i f i e db yr e - c r y s t a l l i z a t i o n ，t h es o l v e n ta n d c r y s t a lc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d r e s u l t ss h o w e dt h a ty h lw a st h eb e s tc r y s t a l s o l v e n t ，a n dt h ec r y s t a lp r o c e s sw e r ea sb e l o w ：y h l b y1 2t i m e sa m o u n t d i s s o l v et h ec r u d e s o l a n e s o ，s t a n d i n g f o r5ha t 一2 c ，f i l t r a t e d ，t h e n r e c r y s t a l l i z a t i o n t h ea v e r a g ep u r i t yw a s9 7 0 ，t h em a xp u r i t yw a s9 8 2 ，t h e r e c o v e r yr e a c h e d 叩t o8 3 7 t h i sp r o c e s sw a ss i m p l e ，s h o r t t e r m ，l o w c o s t ， e a s y o p e r a t e ，a n dh i g hp u r i t ya n dr e c o v e r y , i ti sab e t t e rm e t h o da tp r e s e n t k e y w o r d s ：t o b a c c ol e a v e s ； s o l a n e s o ； e x t r a c t i o n ；c 0 2 s c f e ； p u r i f i c a t i o n v a r c p h p l c 缩略词表 分析纯 化学纯 高效液相色谱 r p - - h p l c反相高效液相色谱 t l c g c u v s c f e s f e c 0 2 s c - c 0 2 p a h s l s 薄层色谱 气相色谱 紫外分光光谱 超临界流体萃取 超临界c 0 2 流体萃取 超临界c 0 2 多核芳烃 类茄尼醇物质 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 髋蜷各了炒帅钆咽 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同 方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 研绥吕 i 对l - j ：7 以年l z 月l 歹日 导师虢镪辱 帆朋缉吲肌 第一章文献综述 烟草( n i c o t i a n at o b a c u ml ) 为茄科烟草属一年生或多年生植物，单叶互生，常有 粘质柔毛，原产南美洲“。我国引种烟草很早，与其他国家一样种植的烟草主要用 作卷烟。目前我国是世界产烟大国之一，其种植面积和产量均居世界首位，种植面 积约1 3 0 万公顷，每年产量有4 5 0 5 0 0 万吨，其中约有近2 5 的烟叶、烟末等下 脚料被废弃，不能用于卷烟生产”。 我国的湖南、河南、云南、贵州、福建等省都有大面积的烟田、众多的卷烟厂 和复烤烟叶厂，每年产生大量的废烟叶、烟灰、烟杆。这些下脚料由于没有很好的 利用而被烧掉，既浪费资源，又造成环境污染。如何将这些烟草废弃物加以合理的 综合利用，是摆在人们面前一个迫切的课题”1 。 烟叶中含有3 0 0 0 多种化合物，包括生物碱、蛋白质、氨基酸、甙类( 芸香甙、r 谷甾醇) 、糖类、有机酸等物质“”1 。它们中许多都是重要的生化医药原料，如烟碱、 茄尼醇、v e 等，都具有广泛的用途和较高的经济价值。我们对其可以采用一系列的 化学方法，对这些活性物质进行提取、分离，作为原料或产品应用于医药、化工等 行业，其重要活性物质茄尼醇因其广泛的医学用途而倍受人们关注”1 。 人们对茄尼醇的研究起初集中在烟草燃烧过程中产生的烟气中茄尼醇所发生的 变化以及对生物体的影响。1 ，最初是基于其对烟气香味的影响。尽管没有足够的证 据表明类茄尼醇物质的含量对烟叶的质量产生影响，但通过对茄尼醇的裂解反应进 行研究，发现烟气中的二异戊二烯部分是由茄尼醇分解而来的，并且二异戊二烯是 影响烟气香味的主要成分，因此可以说茄尼醇间接影响着烟气的香味。此外，茄尼 醇还是烟气中多核芳烃( p a h ) 的前体，而p a h 具有强烈的致癌作用。后来进一步的 研究发现茄尼醇本身具有抗溃疡作用，为此很多专利报道了多种茄尼醇衍生物的合 成，以探索合成新药的可能性。此后对茄尼醇的研究就主要集中在其药用价值上。 目前，茄尼醇已主要应用于合成维生素k 2 和辅酶q l o ，其中辅酶q l o 的合成最具有 应用和商业价值。 辅酶q i o 是1 9 5 7 年从牛心肌的线粒体中发现的，具有改善心肌代谢障碍的作用， 是细胞内产生能量所必不可少的辅酶。辅酶q l o 作为人体细胞呼吸和代谢的激活剂 以及机体的免疫增强剂，用于治疗急慢性肝炎、亚急性肝坏死、心脑血管等疾病。 辅酶q l o 是日本销量最大的第五种药物，作为医疗保健品在欧洲各国被广泛应用。 近年来我国也进口辅酶q l o 原药，在国内加工成片剂和针剂，市场销售良好。最近 更有研究表明，感染h i v 的病人用辅酶q i o 辅助疗法，可防止受h i v 病毒感染，并 由此防止了感染进展到艾滋病相关综合症，这方面的应用目前处于i i 期临床阶段“。 目前日本药物级辅酶q l o 的生产量占世界总量的9 0 以上，成为世界上最大的 辅酶q l o 生产国家。全球产量最高的两家公司分别为日清制粉公司和协和发酵株式 会社1 含辅酶q l o 的营养保健品与其他天然保健品一样，可在美国的超市、食品 连锁店和药店里自由出售。由于效果确切，故很受西方消费者欢迎。2 0 0 1 年，消耗 辅酶q l o 原料最多的国家( 地区) 分别为美国、日本、西欧与澳大利亚。由于辅酶 q 1 0 具有药用和保健功能，目前在国际市场上供不应求，而对作为辅酶q l o 合成的主 要原料茄尼醇的需求量也越来越大。烟草工业属于夕阳工业，目前世界上禁烟呼声 日益强烈，但鉴于其在国民生产中的重要地位，这就决定了必须另辟溪径，对其进 行综合利用，深度开发其下游产品。茄尼醇由于其广泛的用途而成为当前各烟草种 植和加工企业的研究重点，正是基于这样的背景，我们开展了废次烟叶中茄尼醇的 提取和分离研究工作。 1 茄尼醇的理化性质 茄尼醇英文名称为s o l a n e s o l ，化学名称“九聚异戊二烯伯醇”，是一种不饱和的 聚异戊二烯醇“，是由9 个异戊二烯单元组成的一种非环萜烯醇，属于四倍体萜醇， 分子式为c 4 5 h 7 4 0 ，相对分子量为6 3 1 0 7 9 ，熔点为3 1 3 2 。c “”，结构式“”见图1 - 1 ： 饵 口毛 图1 - 1茄尼醇的分子结构式 f i g 1 - 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f s o l a n e s o l 高纯度的茄尼醇为白色或浅黄色固体粉末，通常因含有少量杂质而呈淡黄色， 弱极性，易溶于正己烷、乙醚、丙酮及汽油等有机溶剂，难溶于水，其对紫外光呈 非选择性吸收，无光学活性“”。 茄尼醇有顺式和反式两种构象，反式又有a 和b 两种构型，它们的结晶有不同的 熔点和光学性质，x 一射线衍射研究发现型是平面型的，而b 型则是立体结构“”。 茄尼醇同时含有异戊二烯单元和醇轻基，其化学性质比较活泼、稳定性较差， 能发生多种反应。不仅接触酸碱容易发生化学变化，而且在某些情况下，室温下就 e 一 ， 喁 瞳 徂 1 7 的褐色膏状物的产品，另一种是茄尼醇含量7 5 8 色或淡黄色粉末状产品。含量在 9 8 以上的高纯茄尼醇，目前多为美国、日本的公司生产。由于提取工艺复杂、生 产成本高，其售价已达到1 2 0 0 元2 5 m g ，产量也非常有限，仅作为实验室分析用标 样。 高纯度茄尼醇的生产工艺技术长期被日本所垄断，因茄尼醇分离较难，以至我 国大部分厂家只能生产附加值很低的含量2 0 以下的粗品茄尼醇。粗品茄尼醇不能 直接作为药用原料，因此我国粗品茄尼醇出口到日美等国家后，被精制成精品茄尼 醇( 含量9 0 以上) 及辅酶q 1 0 后再返销国内。虽然国内外多家公司、研究机构也 在进行烟叶茄尼醇的提取纯化等研究，除日本、美国外尚无稳定成熟的大规模商业 化生产茄尼醇的技术报道。国内以孙心齐等“”为主率先对烟叶中的茄尼醇进行提取 研究，但是都以溶剂提纯为主，工艺流程复杂、成本昂贵、难控制而未能进行工业 化生产。有少数采用超临界流体技术提取茄尼醇，但仍然处于实验室阶段，未能进 行中试并将之产业化。 国外从烟叶中提取茄尼醇的技术中，工艺较为成熟的是日本的两项专利“ 2 ”， 均以优质的黄种烟叶为原料，用高纯度的正己烷作为提取溶剂，加热搅拌抽提2 3 次，经过滤，滤液浓缩得茄尼醇粗品，再经皂化( k o h m e o h ) 、离心液液层析 ( 正己烷为固定相，1 0 乙醇为流动相) 及h p l c 制备色谱精制，最终得到高纯度 的茄尼醇，该技术存在原料来源困难、成本高、周期长和三废排放严重等问题。 针对上述技术存在的问题，我国学者张德玉啪1 发明了用霉烟或碎烟末制备茄尼 醇的新工艺，采用低纯度的工业正己烷作抽提溶剂，解决了原料来源困难问题，也 在一定程度上降低了成本。另外，姚文等”1 提出采用s o t 溶液体系萃取烟渣中的茄 尼醇，岑波等o ”研究了用价格远比正己烷便宜的p e 溶液提取废次烟叶中的茄尼醇。 但都未见成功生产的报道。 5 茄尼醇的提取方法 文献报道的茄尼醇提取方法较多，主要有以下几种方法： 5 1 茄尼醇的溶剂提取方法 茄尼醇生产原料主要为废次烟叶及下脚料。2 0 世纪9 0 年代我国就开始了废次 烟叶中茄尼醇回收利用的研究。传统的正己烷溶剂提取工艺多为国外早期生产工艺 的改进，起步水准较低，其生产工艺技术类似于日本的工艺流程。“2 ”。 生产过程主要由原料粉碎、浸提、过滤、滤液浓缩和溶剂回收等主要工艺单元 组成。工艺流程见图卜2 。 烟叶( 或废次烟叶) 寸粉碎一溶剂浸提寸浓缩斗粗提取物专皂化寸 皂化物寸真空干燥斗茄尼醇粗品 图1 - 2茄尼醇的生产工艺流程图 f i g 1 - 2 p r o c e s so fm a n u f a c t u r i n gs o l a n e s o l 目前茄尼醇的溶剂提取工艺存在着提取率低、产品纯度低、生产成本高、周期 长、不易操作和控制、存在易燃易爆的危险和严重造成环境污染等问题而无市场竞 4 争力。为了解决茄尼醇有机溶剂提取工艺存在的问题，一些学者对提取溶剂进行了 改进研究，如：采用s o t 溶剂体系、p e 溶剂、混合溶剂( 乙醇、丙酮和氯仿) 等 有一定极性的溶剂替代传统的茄尼醇萃取剂。这些改进研究虽然在一定程度上完善 了传统工艺，但没有从根本上解决有机溶剂萃取操作温度高、溶剂消耗大、产品纯 度低等问题。 5 2 茄尼醇的超临界c 0 。萃取分离法 超临界c 0 2 流体萃取( s f e c 0 2 ) 技术是近2 0 年来国际上迅速发展起来的一种较 新的提取分离技术，它己广泛应用于食品、香料、医药工业等领域。”。国际上有 较多专利报道利用超临界c 0 2 萃取技术从烟叶提取烟碱。”州，对于从烟叶中提取茄 尼醇的报道却较少。r a d o s a v p a l i e 等研究了超临界c 0 2 萃取优质烟叶中的化合物( 包 括茄尼醇) 和抗菌性物质“”。国内对烟叶中茄尼醇的超临界流体萃取工艺主要有几 项专利报道，王振锟“发明了超临界多元流体萃取精馏烟草的工艺及装置，主要是 在装有脱除尼古丁烟草的高压萃取槽内，先在循环的超临界c 0 2 或n 2 0 流体中添加 2 2 0 重量的精制无水乙醇脱水脱溶。后通入压力1 6 3 2 m p a ，温度5 3 5 的 c 0 2 或丙烷。每小时c 0 2 或丙烷的循环量为烟草原料重量的2 6 倍。在循环流动的 c 0 2 或丙烷流体进入萃取槽前，均匀混入占循环c 0 2 或丙烷流体重量为5 2 5 的 乙醚、丙酮、丁烷、己烷、戊烷或庚烷，萃取富含茄尼醇的烟草有效成分。萃取时 间为2 0 1 2 0 m i n ，分离压力3 9 m p a ，分离温度1 5 9 0 1 2 ，在设置有精馏柱的分 离器内获得富含茄尼醇的乙醚、丙酮或c l c 3 脂肪烷烃，再按传统工艺分离提纯后 进行重结晶精制，获取得9 0 0 以上纯度的茄尼醇。杨群力等“2 1 发明了一种茄尼醇的 提取工艺，其工艺是采用超l 临界流体萃取技术，将粉碎好的烟叶装入萃取器中，储 罐中的c 0 2 液体加压到1 0 o 3 0 0 m p a ，送到换热器，将其加热至3 0 8 0 后送入 萃取器完成萃取过程。负载溶质的c 0 2 流体进入分离器中，分离器中压力为8 0m p a 以下，温度在1 0 c 以上，c 0 2 流体溶解度降低，使萃取物得以分离。分离萃取物后， c 0 2 流体再经换热器液化，回到储罐中循环使用。每批原料连续萃取时间为2 4 h ， 产品从分离器下方出口放出，此产品为粗品。粗品加5 1 0 倍量甲醇，加热搅拌， 过滤，滤液冷冻后析出沉淀，过滤沉淀干燥后得精品。另外李烈等“”采用超临界c 0 2 萃取烟叶中茄尼醇，以7 5 的乙醇为夹带剂，在萃取压力为2 5 m p a ，萃取温度为4 0 ( 2 ， 解析压力为6 m p a , 解析温度为4 0 c ，c 0 2 流量为1 5 k g h 萃取3 h 。该方法提取的粗提 物色泽淡黄，不粘稠，有利于茄尼醇的进一步重结晶或上柱纯化。张海波等”研究 了超f 临界c 0 2 萃取茄尼醇，得到了提取工艺参数，提取率达到了7 9 ，但茄尼醇的纯 度不清楚。后来康锋“”也研究了茄尼醇的超l 临界c 0 2 流体萃取，从超临界c 0 2 萃 取实验的结果可以看出，在压力3 0 m p a ，温度5 5 c ，时问2 h ，c 0 2 流量1 5 9 m i n ， 夹带剂流量2 9 m i n 的萃取操作条件下，萃取的收率达到o 7 5 6 1 。但未对提取产 品的纯度作出结论。 从以上可以看出用超临界方法萃取烟叶中的茄尼醇，虽然提取周期短、污染少， 萃取率较高，但设备投资大、生产费用较高、产量小，离工业化生产有一定的差距。 5 3 分子蒸馏法提取茄尼醇 分子蒸镏暨短径蒸馏技术，是一种新型的物理法分离技术，它克服了传统蒸馏技 术的缺点、避免了化学法的污染，是精细化学品分离和提纯的理想方法，原理是利 用液体分子受热时会从液面逸出，不同种类分子逸出后的运动平均自由程度不同而 实现物质的分离“”。孔宁川等m 1 采用分子蒸镏技术发明了“一种烟草浸膏深加工制 烟草净油及富含集茄尼醇的方法”的专利，该专利采用烟草浸膏为原料，在0 1 l o o p a 帕真空度，8 0 2 2 0 c 蒸发温度条件下，通过真空度和蒸发温度的控制，对烟草浸膏 进行分段处理。在0 1 l o o p a 真空度；在8 0 1 8 0 蒸发温度的条件下，得到高真空 烟草净油的前段。将分离出净油前段的剩余物在0 1 l o p a 真空度，蒸发度1 8 0 2 2 0 条件下得到高真空烟草净油后段。分子蒸馏残渣为黑色的茄尼醇富集段。蒸馏 过程中不仅有茄尼醇蒸出，其他沸点相近的成分也会同时蒸出。要得到高纯度的茄 尼醇，还需要进一步的精制处理。同时因提取温度高，茄尼醇损失较大，产率低的 缺点。 5 4 柱层析法分离茄尼醇 9 0 的茄尼醇则需要通过柱层析法分离得到，其主要难点在于洗脱液的选择， 据国外的报道一般都要采用三元以上的混合溶剂经多级洗脱后才能得到较纯的茄尼 醇。陶云海等“7 1 选择了活性级数为级的硅胶为固定相，以苯：1 ，2 一二氯已烷：丙 酮= 9 ：9 ：o 7 ( v v ) y g 洗脱剂。得到纯度为9 0 的茄尼醇，收率达到了为7 9 2 。夏薇 等“”也对柱层析进行了研究，取得了较好结果，但存在着层析通量低、成本高、产 率低的不足。 5 5 其他的提取纯化方法 除了以上介绍的方法外，国内还有几项专利报道了用其他的方法提取纯化茄尼 醇。比如，张伟和等人“”提出了在连续抽提、过滤后增加两次沉降过程和尾气吸收 处理过程，提高了产品的质量，也提高了生产的机械化程度，同时减少了环境污染 及安全危害，使得生产过程更符合工业化的生产要求。胥克亮等脚1 报道了一种提纯 6 茄尼醇的方法，包括经皂化结晶析出后纯度不低于7 0 的茄尼醇提取物，用正己烷 溶剂溶解后，以正己烷、l ，2 二氯乙烷和丙酮的混合配液为洗脱液，以丙酮为返洗剂， 采用吸附色谱法，将与茄尼醇极性不同的杂质去掉，浓缩后制得茄尼醇粗品。张德 玉等。”发明了一种茄尼醇不皂化物的制备方法，其中主要过程是将霉烟或碎烟末作 为原料，加入溶剂和催化剂一次性完成皂化反应，然后依次完成过滤、混合、分离、 超滤、浓缩等工艺过程，制得茄尼醇不皂化物。其特点是生产成本低，工艺流程短， 消耗费用少，产品纯度和收率高。另外，祖元刚等“”也发明了一种从烟叶中提取纯 化茄尼醇的方法，其工艺流程是：将烟叶与溶剂按比例混合，并用打浆机打浆，滤 饼再用乙醇空化萃取，过滤，滤液与前述打浆液的滤液合并浓缩、皂化。皂化液用 正己烷萃取，正己烷萃取液用水洗至中性，加入吸附剂吸附一定时间后过滤，滤液 用乙醇萃取，浓缩正己烷相并冷冻析晶。过滤晶体，晶体用热的乙腈溶解、低温析 晶两次，可得到9 5 以上的茄尼醇精品。 6 茄尼醇的检测方法 茄尼醇的测定方法较多，国内外均有大量的报道，主要有柱色谱分离重量法、 薄层扫描法、薄层分离一库仑滴定法、气相色谱法以及高压液相色谱法等。 6 1 薄层分离一库仑滴定法 郑奎玲旧1 用薄层分离一库仑滴定法对茄尼醇浸膏纯化并进行了含量的测定，确 定了层析板为硅胶板，乙酸乙酯：甲醇= 3 ：1 的混合溶剂为展开剂，碘显色的分离体 系，得到最适合的滴定介质为冰醋酸( 7 2 ) ：甲醇( 8 ) ：水( 2 0 ) ，在2 0 3 0 1 2 范围内 测定茄尼醇较准确。刘快之嘲“1 以l m o l l k b r 的1 8 ( v v ) 醋酸溶液为介质，以5 m a 恒电流为电解电流对茄尼醇进行库仑滴定，用双铂电极电流法指示滴定终点，得到 了满意的结果；后来l i uk z 1 对此方法加以改进以2 m o l l k b r c h 3 c o o h ( 2 2 ：7 8 ， v ) 为介质，得到了更满意的效果。 茄尼醇提取纯化过程中有许多样品需快速测定而不需精确定量的，库仑滴定法 方法简单，精密度较高，可以满足其要求，该方法不需要标准溶剂，不需要昂贵的 仪器，容易实现。 6 2 薄层扫描测定法 薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法，是草药化学成分鉴定、探索柱 层分离条件的常规方法。姚文等人。”用硅胶g 板，以1 , 2 一- 氯乙烷苯丙酮 ( 9 ：9 ：l ，v v ) 为展开剂，1 2 5 磷钼酸乙醇液为显色剂，在1 1 0 c 下显色5 r a i n ，茄尼 醇的r f 值为0 5 2 。郑奎玲等“”用乙酸乙酯：甲醇( 3 ：l ，v v ) 为洗脱剂，洗脱最完全。刘 快之等呻3 用硅胶g f 2 5 4 薄层板及上行法展开，对3 种不同组成及配比的展开剂进行了 实验比较，其中以正己烷：二氯乙烷：丙酮( 1 ：2 ：l , v v ) 效果最好。 薄层层析法是常用的物质定性分析方法，采用薄层层析检测茄尼醇，可以为茄 尼醇的定量分析节省时间。该方法不需要昂贵的仪器，可为烟叶中茄尼醇的质量分 析和控制提供依据。 6 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法是以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方 法，发展而成的分离分析方法。具有分离性能高、分析速度快、检测灵敏度高、流 动相选择范围广和应用范围广等特点。高效液相色谱特别适合分析高沸点、大分子、 强极性、热不稳定化合物和各种离子型化合物。因此被广泛应用于生物碱、黄酮、 有机酸、萜类化合物、维生素、农药等的分离和分析。 赵瑾等呻1 选用z o r b a x s l l ( 2 5 0 m m x 4 6 m m i d ) 色谱柱，以正己烷：异丙醚：乙酸乙 酯( 6 ：3 ：1 ) 混合溶剂作流动相，用示差折光检测器测定了烟叶提取物中茄尼醇的含量， 结果表明所用方法具有良好的分离效果和回收率，可用于烟叶或茄尼醇产品中茄尼 醇含量的测定。成功测定的关键是流动相脱气和正己烷的提纯。李烈等“”报道高效 液相色谱一蒸发光散射检测法可以用于烟叶中茄尼醇的质量控制。张明时等“”采用 正相硅胶色谱柱，以正己烷：异丙醇( 体积比为9 8 ：2 ) 混合液为流动相，在波长2 1 5 n m 处对烟叶中茄尼醇的含量进行了测定。 7 本论文研究的目的、意义及主要内容 我国是烟草大国，每年有约有近1 1 0 1 2 0 万吨的废次烟叶、烟末等下脚料被废 弃，不能用于卷烟生产。随着卷烟市场向高、中档发展，废次烟叶将会大量增加，这 些原料一旦利用起来，将产生很大的经济效益。做好烟叶中茄尼醇等重要的医药有 效成分的提取和综合利用，必将对我国的烟草行业的发展产生推动作用，将会愈来 愈受到烟草企业的关注。 虽现有不少企业在生产茄尼醇，但因生产技术落后，工艺陈旧，产品质量不稳 定，生产成本高，经济效益低而无市场竞争力。这些低含量的的茄尼醇不能直接作 为药用原料，导致我国粗品茄尼醇出口到日美等国家后，被精制加工成含量9 0 以 上精品茄尼醇( 5 0 0 万元吨) 或合成辅酶q l o 后再返销国内。本文研究废次烟叶中 茄尼醇的提取纯化新工艺，改进传统的提取技术，获取高收率和高质量的茄尼醇产 品，使之符合现代医药生产和产品的要求。力求在提高茄尼醇产品质量、降低生产 成本、充分利用资源等方面有所改进或突破。 8 本论文研究的主要内容： 茄尼醇的薄层和液相色谱测定方法的建立以及茄尼醇的稳定性研究。 选择茄尼醇提取溶剂和提取方法。 茄尼醇的提取工艺条件研究，优化和确定茄尼醇的提取参数。 进行皂化、萃取和结晶等纯化过程条件的优化，建立茄尼醇粗产品的柱层析 纯化方法。 建立茄尼醇租产品的结晶重结晶方法。 系统地对上述过程进行研究，从而确立简单、可行的高纯茄尼醇提取分离工艺 及工艺参数。 9 第二章烟叶中的茄尼醇分析方法建立 及稳定性研究 茄尼醇的测定方法较多，国内外均有较多的报道，主要有柱色谱分离重量法、 薄层扫描法、薄层分离一库仑滴定法、气相色谱法以及高效液相色谱法等，但是国 内少见有反相高效液相测定茄尼醇含量的报道，为了测定大量样品和研究生产中在 线监控的方便以及为茄尼醇的质量分析提供可靠的检测手段，本部分试图建立茄尼 醇的薄层扫描测定方法和反相高效液相测定法，考虑到在后期的提取分离过程中温 度、光照等对茄尼醇的影响，本部分还对茄尼醇的稳定性进行了实验。 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 实验材料 废次烟叶于2 0 0 4 年1 0 月购于张家界市沅沽坪镇、慈利县高峰镇。 1 1 2 实验试剂 茄尼醇对照品( 含量为9 7 2 1 ) 购于山东潍纺。 丙酮、苯、三氯甲烷、乙酸乙酯、l ，2 二氯乙烷、乙酸、硫酸、甲醇、乙醇、 正己烷、石油醚为国产分析纯，羧甲基纤维素钠、香草醛为国产化学纯。 薄层层析硅胶g ( 青岛海洋化工厂) 。 液相用甲醇、乙醇为国产色谱纯。 1 1 3 实验仪器 薄层扫描仪：c s 9 0 0 0 ，日本岛津公司；高效液相色谱仪：l c 9 a 、日本岛津公 司；小型样品粉碎机：w t - 1 5 0 ，中国江苏；万分之一分析天平：a e g 2 2 0 ，日本岛 津公司；定量毛细管点样器：d r u m m o n d2 p l 、5 p l ，美国；薄膜旋转蒸发仪：r e 5 4 0 ， 日本大和公司；红外水份测定仪：f d 2 3 0 ，日本大和公司；十万分之一天平： a e l 一4 0 s m ，日本岛津公司。 1 2 实验方法 1 2 1 薄层扫描测定茄尼醇的方法 1 2 1 1 展开剂的摸索 首先采用层析滤纸做预备实验，初步确定层析展开剂，然后利用此展开条件在 1 0 硅胶g 板上展开。具体做法为：取硅胶g 板，于1 0 5 1 2 活化o 5 h 后点样，置于展开 剂中直立上行展开1 5 1 7 c m 时取出，6 0 c 烘干，喷洒显色剂显色。 1 2 1 2 显色剂的选择” 我们选择帖类化合物的几种显色剂体系作为茄尼醇显色剂的筛选对象：1 2 5 磷钼酸乙醇液；香草醛浓硫酸溶液；香草醛- 硫酸乙醇液。 1 2 1 3 薄层测定条件 扫描方式：反射法单波长锯齿扫描，测定波长：6 2 0 n m ，狭缝：1 2 5 1 2 5 ，线 性化系数s x = 3 ，背景校正：o n 。 1 2 1 4 标准曲线绘制 、 准确称取o 0 3 7 4 9 茄尼醇对照品置于2 5 m l 的棕色容量瓶中，用正己烷溶解并定 容至2 5 m l ，配制成1 4 9 6 m g m l 的溶液。从中分别吸取1 、2 、3 、4 、5 m l 置入5 m l 容量瓶中分别用正己烷定容至1 0 m l ，在同一薄层板上分别点系列浓度标准品溶液， 按上述方法展开、扫描测定。以茄尼醇浓度为横坐标，斑点峰面积积分值为纵坐标 绘制标准曲线。 1 2 1 5t l c 检测茄尼醇的精密度测定 取同一样品点于同一薄层板上，按上述方法层析展开、扫描测定，根据面积计 算相对偏差，确定精密度。 1 2 1 6t l c 检测茄尼醇的回收率测定 取一已测样品( 纯茄尼醇量为b ) 与同体积标样( 纯茄尼醇量为d ) 混合点于 同一薄层板上，按上述方法层析展开、扫描，并计算出混合样中纯茄尼醇量a ，减 去已知样品的纯茄尼醇量b ，则剩余纯茄尼醇量a b ( 即测得的标样中纯茄尼醇量) ， 其回收率为( a b