（有机化学专业论文）一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用.pdf

摘要 毛细管液相色谱整体柱具有制备方法简单、易于改性、柱效较高、渗透性好、 可进行快速分离等优点，已经得到越来越多的应用。 本文首先以甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 为主要单体，乙叉二甲基丙烯 酸酯( e d m a ) 为交联剂，偶氮二异丁腈( 舢b n ) 为引发剂，十二醇和坏己醇 为致孔剂，通过原位聚合制备了一种毛细管液相色谱整体柱。实验考察了聚合混 合物组成、反应时间、反应温度等参数对整体柱连续床孔隙结构、耐压性、通透 性的影响，从而确定了整体柱的最佳制备条件。 然后，在酸性条件下，使甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧环打开，生成二醇， 增加了整体固定相的极性，从而增强了固定相的亲水性。 最后，通过优化流动相p h 、离子强度等条件，利用该亲水毛细管整柱在液 相色谱模式下先后基线分离了几种极性组分和几种离子型组分。探讨极性组分和 离子型组分在该固定相上的保留机理。实验结果表明，在高乙腈浓度下，对于极 性组分，亲水作用起主要作用，对于离子型组分的保留主要表现为亲水作用，而 静电作用较弱。 关键词： 毛细管液相色谱；毛细管整体柱；亲水作用 a b s t r a c t c a p i l l a r yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym o n o l i t h i cc o l u m nh a sr e c e i v e dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o nb e c a u s eo fi t sg o o df e a t u r e si n c l u d i n gs i m p l ep r e p a r a t i o n ，e a s yd e r i v a t i o n ， h i g he f f i c i e n c y , g o o dp e r m e a b i l i t ya n dr a p i ds e p a r a t i o n i nt h i sw o r k ，ac a p i l l a r yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym o n o l i t h i cc o l u m nw a sf i r s t l y , p r e p a r e db yi n - s i t uf r e er a d i c a lp o l y m e r i z a t i o no fg l y c i d y lm e t h a c r y l a t e ( g m a ) w i t h e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) i nt h ep r e s e n c eo ft h ei n i t i a t o r ( a i b n ) a n da m i x t u r eo fp o r o g e n s i n c l u d i n gd o d e c a n o l a n dc y c l o h e x a n 0 1 t h ee f f e c t so f c o m p o s i t i o n o f p o l y m e r i z a t o nm i x t u r e s ，p o l y m e r i z a t i o n t i m ea n dr e a c t i o n t e m p e r a t u r e so nc o n t i n u o u s b e dm o r p h o l o g ya n dp e r m e a b i l i t yw e r ee x p e r i m e n t a l l y e x a m i n e d ，a n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rp r e p a r i n gt h ec o l u m n sw e r ee s t a b l i s h e d s e c o n d l y , i no r d e rt oe n h a n c et h ep o l a r i t ya n dc o n s e q u e n t l ys t r e n g t h e nt h e h y d r o p h i l i c i t yo ft h es t a t i o n a r yp h a s e ，t h ep r e p a r e dm o n o l i t hw a sm o d i f i e db y h y d r o l y z i n gt h ee p o x yg r o u p so nt h es u r f a c eo ft h es t a t i o n a r yp h a s et od i o lg r o u p s w i t hh y d r o c h l o r i ca c i d f i n a l l y , s e v e r a lp o l a rs p e c i e sa n di o n i cs p e c i e sw e r eb a s e - l i n es e p a r a t e d r e s p e c t i v e l yo nt h em o d i f i e dm o n o l i t h i cc o l u m na f t e rp ha n di o n i cs t r e n g t ho fm o b i l e p h a s ew e r eo p t i m i z e d t h er e t e n t i o nm e c h a n i s mo ft h es e v e r a ls p e c i e so nt h e s t a t i o n a r yp h a s ew a se x a m i n e d i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a th y d r o p h i l i ci n t e r a c t i o nw a s r e s p o n s i b l ef o rt h es e p a r a t i o ni nh i g ha c nc o n t e n to fm o b i l ep h a s ef o rt h ep o l a r s p e c i e sw h i l eh y d r o p h i l i ca n dw e a ke l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nf o ri o n i cs p e c i e s k e y w o r d s ：- h p l c ；c a p i l l a r ym o n o l i t h i cc o l u m n ；h y d r o p h i l i ci n t e r a c t i o n 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特 别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示 谢意。 学位论文作者签名：垄苣垂崔2 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：塑歪拉指导教师签名： 签名日期： o 年毛只午r 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 第一章毛细管液相色谱概论 毛细管液相色谱( c a p i l l a r yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , 一h p l c ) 是在对常 规液相色谱柱进行微型化的基础上，伴随精密加工以及微加工制造技术的进步和新材料 的出现而发展起来的一种色谱微分离技术1 1 j 。它能大幅度提高分离柱效，大大减少了样 品、流动相和固定相的消耗，对于较为难得的试样极为有利，而且由于降低了溶质柱上 稀释比，所以检测灵敏度优于传统的h p l c 。它还很容易与其它检测器( 如质谱) 在线 联用，使用h p l c ) ，不仅提高了分离效率，而且减少了与质谱联用时的样品稀释。正 是这些独特的优点促进了毛细管液相色谱近年来的迅猛发展，并以惊人的速度广泛应用 于生化分析、手性分离、神经科学、蛋白质和多肽研究、医药等领域。特别在近两年蛋 白组学的研究中广泛使用肛h p l c m s 联用，更是促进了这相技术的进一步发展。 1 1 毛细管液相色谱的进展 毛细管液相色谱近年来得到了迅猛发展，大致经历了三个发展阶段。 1 9 6 7 年，h o r v e i t h 及其同事【2 l 首次提出微柱液相色谱h p l c ) ，他们用内壁涂有一 层液膜的内径0 5 1 0m m ，长度1m 的不锈钢柱分离了核苷酸，奠定了微柱液相色谱发 展的基础。 1 9 7 3 年，i s h i i 等【3 j 用湿法填装聚四氟乙烯柱管的微填充柱，在自制的微柱液相系统 上成功地分离了多环芳烃化合物。1 9 7 6 年，s c o t t 和k u e r c a 等【4 】用改装的紫外检测器( 检 测池为2 4 肛l ) ，在1 0i n 1 0m mi d 的色谱柱上分离了一系列烷基苯。同年，日本 j a s c o 公司推出了第一台商品微柱液相色谱系统，这些标志着微柱液相色谱进入了一 个新的发展时期。在接下来的近十年的时间里，以i s h i i ，n o v o t o n y ，y a n g 和s c o t t 为代 表的科研小组在微柱液相色谱领域的研究十分活跃。在1 9 8 4 到1 9 8 5 年间，出版了三本 专著【5 7 l 并且发表了大量综述性文章【8 - 1 0 1 。1 9 9 0 年9 月在日本神户召开了第十二届国际毛 细管色谱会议，详细讨论了常规液相转换为微柱液相所涉及的技术问题。 9 0 年代以来，随着分离科学与技术的发展，特别是电子工业和微制造业的进步，为 分析仪器微型化注入了新的生命力。微型分析仪器能减少仪器的重量、体积、物耗与能 耗，提高稳定性和响应速度，降低了制造成本。微制造技术于7 0 年代术渗透入微型气 相色谱仪器研究领域，于8 0 年代中期在气相色谱微型化方面取得成功，这种理念和技 术又迅速扩展到色谱仪器的其他方面和整个分析仪器领域。近年来，微型液相色谱的研 究也得到迅速发展【1 1 。毛细管色谱柱是微分离分析的核心，也是毛细管分析技术的瓶颈。 作为分离的场所和工具，色谱柱性能的优劣，从根本上决定了分离效果的好坏。因此， 有人将色谱柱誉为色谱仪的心脏，应是当之无愧的。发生在色谱柱中的分离过程，受热 力学因素和动力学因素的控制。为了获得满意的分离效果，首先必须考虑固定相的性质 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 及其与溶质相互作用的强弱，这主要体现在色谱柱填料的设计、合成及选择上。为了使 分离的谱带展宽尽可能的小，就需要对柱子进行优化设计并将填料填充成性能优良的柱 子。总之色谱柱填料和色谱柱技术是色谱发展的核心和关键技术。在h p l c 的发展过程 中，始终伴随着色谱柱和色谱填料的不断改进和发展。研究新型色谱柱和色谱填料，揭 示其分离机理一直是h p l c 领域的研究重点和热点。 1 2 毛细管色谱固定相发展概况 毛细管色谱柱可根据固定相在柱内的存在方式分为以下三种：开管毛细管色谱柱 ( o p e nt u b u l a rc a p i l l a r yc o l u m n s ) 、填充毛细管色谱柱( p a c k e dc a p i l l a r yc o l u m n s ) 、整体 毛细管色谱柱( m o n o l i t h i cc a p i l l a r yc o l u m n s ) 。 1 2 1 开管柱 在开管柱无封口问题，有更好的渗透性和更高的柱效，但其柱效与柱内径成反比， 相比小、样品容量极低、柱选择性差、仪器要求苛刻，限制了其发展。 1 2 2 填充柱 现代液相色谱的发展是与色谱柱技术的突破分不开的。它是色谱仪的最主要的部件 之一，是色谱仪的“心脏 ，赖以实现色谱分离。高效液相色谱柱的获得，不仅取决于 柱填料的性质，也与柱床的结构密切相关，而柱床结构直接受填充技术的影响。柱填充 的根本目的，是要得到一个均匀，紧密的床层，不均匀的床层产生较大的涡流扩散，使 峰明显展宽。不仅如此，在达到相同分离效率的前提下，填充不好的色谱柱比填充良好 的色谱柱需要更多的分析时间。因此，柱填充质量对柱性能有重大的影响。目前，填充 毛细管液相色谱柱的填充方法主要有两种：干法和湿法。填充柱具有的缺点是，该法填 充技术性强，但稳定性和重复性难以保证。 1 2 2 1 干法 在制备常规液相色谱柱( 4 6m mi d ) 时j 通常认为，当固定相填料的粒度如 嫠 o 8 0 7 681 01 21 41 6 压力( m p a ) 图2 5 压力与流速关系图 注：流速的测定方法为记录在卜i u j 的压力下，水流过长1 0c m ，内径为2 5 0u m 白色聚p u 氟乙烯管所需要的时间，从 m 算 l ；流速。整体柱长度为1 5c m 。 1 9 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 2 2 2 9 最佳条件 综合以上各方面的考察，最终我们选择最佳反应条件为：聚合物配比为单体：致孔 剂( 2 ：3 ) 。m a a ：d a m a ：g m a ：e d m a ( 1 ：1 ：4 ：4 ) ；反应温度：6 0 ；反应时间：4h 。 2 3 偶联柱的制备 从最初的颗粒填充毛细管液相色谱柱到目前广泛使用的毛细管液相色谱整体柱，人 们在简化液相色谱柱制备过程和改进柱性能等方面进行了大量的尝试。但是毛细管液相 色谱柱在检测窗口位置易断的问题一直尚未得到很好地解决。偶联柱可通过更换检测窗 口来解决液相色谱柱在检测窗口处易断的问题。本文介绍了制备了一种实用、简便、廉 价的零死体积毛细管偶联柱，增加了其实用性。 2 3 1 零死体积偶联柱的制备 偶联柱的制备可分为两个步骤，一是制备平整末端毛细管；二是毛细管的连接。其 中第一步是第二步成功的必要条件。 一、平整末端毛细管的制备 在大多数毛细管电色谱实验室内，毛细管的切割是通过商品化的毛细管切割器实现 的，但通过该方法获得的毛细管末端在显微镜下观察发现并不平整，尚不能满足偶联柱 对毛细管末端平整性的要求。本实验采用自制的简易辅助设备，在2 0 0 0 目的砂纸上研 磨，所获得的毛细管的末端如图2 6a 所示。如果在没有任何实验器械的帮助下直接手 持毛细管在砂纸上研磨则很难实现，因为在研磨过程中很难保证毛细管的轴向与砂纸平 面垂直，往往得到如图2 - 6b 所示的情形，这样偶联柱在接口部位的死体积过大。本文 设计了如图2 7 所示的装置：首先在小的圆柱体轴承中心钻一个d , - 孑l ，将一小段内径为 2 5 0 z m 的聚四氟乙烯管插入其中，使两端平整；其次在大的圆柱体轴承的两面分别贴 上3 0 0 0 目和1 0 0 0 目的砂纸；最后将毛细管插入聚四氟乙烯管中，分别垂直在3 0 0 0 目 和1 0 0 0 目的砂纸上湿研磨( 在研磨的过程中，柱子一端和高压泵连接，处于通水状态) ， 避免或减缓研磨时的碎屑进入毛细管中造成堵塞现象，直到在显微镜下观察到毛细管切 割面平整为止( 大约只需2m i n 左右) 。这样，就获得了具有平整末端的毛细管。 2 0 一种亲水，陆毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 图2 - 6 毛细管示意图 图2 7 毛细管末端研磨辅助装置 二、零死体积毛细管的连接 在得到了末端平整的毛细管后，需将分离柱与作为检测窗口的毛细管连接在一起， 为了保证两根毛细管的紧密连接，且具有一定的耐压性，本文采用内径( 2 5 0 m ) 小于毛 细管外径( 3 6 5 m ) 的聚四氟乙烯管实现的，且方法简单、有效。具体操作过程如图2 8 ： 首先取长度约为1 5c m 的聚四氟乙烯管( 图2 8a ) ，用特制针头将聚四氟乙烯管的一端稍 稍扩展，并使该部分聚四氟乙烯管的内径稍大于毛细管的外径，然后将毛细管从这一端 插入聚四氟乙烯管中( 图2 - 8b ) 。开始时，由于聚四氟乙烯管的内径小于毛细管的外径， 所以会产生碎屑，但随着毛细管逐渐穿透聚四氟乙烯管，产生的碎屑会被完全推出，此 时继续移动毛细管，直至毛细管的另一端移至聚四氟乙烯管的中间位置；取另一根毛细 管，仍然从扩展端插入聚四氟乙烯管中，用力将第二根毛细管推入聚四氟乙烯管中，直 到两根毛细管紧密连接( 图2 8c ) ，最后割除聚四氟乙烯管的扩展端( 图2 8d ) ，这样就 得到了零死体积的偶联柱。 b c d ： i ； 瓷：i 莎： = = = 警三! = ；= ；：鼍 蚕：_ ； 一z ；t _ f 图2 - 8 偶联柱的制各 2 1 2 3 2 结果与讨论 2 3 2 1 接口耐压性测试 为了考察该接口的耐压性，将偶联柱 与高效液相色谱泵连接，在压力高达1 2 0 0 p s i 时，未发生任何泄漏现象，说明采用该 方法制成的偶联柱具有较高的抗压能力， 从而为色谱柱的稳定运行奠定了良好的 基础。 3三 一；l；l；弘b 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 2 3 2 2 偶联的优缺点 采用实用、简便、廉价的零死体积毛细管偶联柱，很好的解决了毛细管电色谱柱在 检测窗口位置易断的问题；另外，大部分毛细管液相色谱聚合物整体柱都通过部分填充 的方式来制备检测窗口，这就要求在制备整体柱时，注入毛细管内的聚合混合物的位置 要严格控制，这对于初学者来说，有一定的难度，而采用偶联柱，则在制备毛细管整体 柱时可方便地将毛细管充满反应液，反应结束后截取所需长度即可，大大降低了实验难 度，且采用部分填充毛细管整体柱，通常会发现在固定相的末端即检测窗口前的位置固 定相不均匀，将对柱子的性能产生负面影响，而在制备偶联柱时，可将该结构不均匀部 分切除，从而消除其对柱子性能的负面影响。 2 4 小结 本章选用g m a 为主要单体，通过优化致孔剂含量、反应温度、时间等参数制备通 透性较好的毛细管液相色谱整体柱，并对g m a 的环氧环进行酸性开环，增强了固定相 表面极性，从而增加整体柱的亲水性，获得了一种亲水性毛细管液相色谱整体柱。 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 第三章聚甲基丙烯酸酯类毛细管液相色谱整体柱的应用 毛细管液相色谱整体柱通过固定相与毛细管内壁的键合，避免了传统的颗粒填充电 色谱柱所必需的封口，提高了毛细管液相色谱柱的稳定性。此外，固定相的性质可通过 改变聚合单体的类型和含量来调节，例如在制备整体固定相时，通过引入甲基丙烯酸和 2 一二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯单体可增加固定相表面的亲水性。通过考察流动相中乙腈 体积的改变，探讨了整体柱对极性物质的保留机理。 3 1 中性化合物的分离 3 1 1 引言 ： 亲水作用色谱( h y d r o p h i l i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y , h i l i c ) 具有和正相液相色谱 ( n o r m a lp h a s eh p l c ，n p l c ) 类似的保留行为，能为强极性的待测样品提供合适的保留； 它采用水水溶性有机相作为流动相，又能显著改善样品在流动相中的溶解度。此外， 它在体现和r p l c 正交的选择性的同时，具有与r p l c 相媲美的柱效和对称的峰形，因 此是一种非常适合于强极性和强亲水性样品定性定量分析的液相色谱替代技术，并得到 越来越广泛的重视和应用。本文就亲水作用色谱的起源、分离特点、常用固定相和选择 特性等，尤其是以亲水作用色谱为核心的液相色谱联用技术及其应用研究进行综述。 亲水作用色谱的概念由a l p e r t 于1 9 9 0 年首次提出【1 0 3 】。他指出，虽然样品在亲水作 用色谱上的流出顺序和传统的n p l c 类似，即极性越强的样品在色谱柱上的保留越强， 但在亲水作用色谱分离模式中：( 1 ) 流动相中水是强洗脱溶剂；( 2 ) 化合物的保留是基于 分配机理而非传统的n p l c 的表面吸附机理。在亲水作用色谱分离体系中，常使用硅胶 【1 0 4 ，1 0 5 1 、氨型1 0 6 0 7 1 、二醇基【1 0 8 】、氰基【1 0 9 1 等正相色谱填料或者特殊设计的表面含有极 性基团的亲水作用色谱专用填料作固定相。流动相中除了将水作为强洗脱剂外，乙腈或 异丙醇往往被作为弱洗脱剂。甲醇的洗脱能力虽介于两者之间，但不仅未体现出独特的 和有用的选择性，反而有可能增加分离的不稳定性和较差的峰形【1 1 们。异丙醇的粘度在 常温时较高，容易产生过高的柱压降，因此在亲水作用色谱中一般采用乙腈水体系作 为流动相，其中水相的比例为5 4 0 以保证其显著的亲水作用【l l 。考虑到盐在高浓 度有机相中的溶解度，通常在亲水作用色谱分离中采用5 2 0m m o l l 的挥发性缓冲盐， 如甲酸铵、乙酸铵和重碳酸铵等。 3 1 2 实验部分 3 1 2 1 仪器 l a ba l l i a n c e 液相色谱泵( 美国) ； l a ba l l i a n c em o d e5 0 0 紫外- 可见光检测器( 美国) ； k y k y - 1 0 0 0 b 型扫描电子显微镜( s e m ，中国科学院科学仪器j 。1 ； 一种亲抽 生毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 超级恒温器( 上海实验仪器总厂) ； b 2 1 2 酸度计( 日本) ； s k 2 2 0 0 h 台式超声波清洗器( 上海科导超声仪器有限公司) ； s h b i i i 循环水式多用真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) ； 电热恒温鼓风干燥箱( 上海景宏实验设备有限公司) 。 3 1 2 2 试剂与材料 w d 7 0 硅烷偶联剂y ( 甲基丙烯酰氧) 丙基三甲氧基硅烷“一m a p s ，纯度9 5 ，武汉凯 博试剂有限公司) ； 甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) ( 纯度9 9 ，美国a c r o s 公司) ； 乙二酸二甲基丙烯酸酯( e d m a ) ( 纯度9 8 ，美国a c r o s 公司) ； 2 二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯( d a m a ) ( 纯度为9 9 ，美国a c r o s 公司) ； 偶氮二异丁腈( 化学纯，武汉盛世精细化学品有限公司) ； 甲基丙烯酸( m a a ) ； 甲醇( 分析纯，大连信江) ； 十二醇( 分析纯，天津市化学试n - - 厂) ； 环己醇化学纯，上海化学试剂有限公司) ； 内径10 0l , t m ，外径3 7 5l , t m 的熔融石英毛细管( 河北永年) ； 内径2 5 t m ，外径3 7 51 t m 的熔融石英毛细管( 河北永年) ； 聚四氟乙烯管的内径和外径分别为2 5 0 和5 0 0l , t m ； 乙腈( 色谱纯，大连信江) ； 实验用水均为m i l l i q 水( 1 8 3m r 2 c m ) ； 其它无机试剂均为分析纯。 3 1 2 3 液相色谱整体柱的制备 同第二章第一节。 3 1 2 4 溶液配备 乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。磷酸三乙胺( t e a _ p ) 缓冲储备液配制：磷酸溶液 用三乙胺调至所需的p h 值，定容至2 5 0m l ( 磷酸根的浓度为5 0 0m m o l l ) 。流动相的配 制：将适量体积的乙腈、t e a p 储备液和二次水混合。运行前，流动相超声2 0m i n 脱气。 3 1 2 5 色谱实验 所有的液相色谱实验均在室温条件下进行。所制得的聚甲基丙烯酸酯类毛细管液相 色谱整体柱首先用甲醇冲洗2 4h ，以除去色谱柱内致孔剂和未参与反应的单体和交联 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 剂，然后先用流动相平衡2 4h 。流动相用不同比例的乙腈5m m o l l t e a p 缓冲液缓冲溶 液配制，使用前用0 4 5l x m 有机滤膜过滤并超声脱气。直接进样：进样时间，3s ；流速， 1 t l m i m 检测波长，2 1 41 1 1 1 1 ；以甲苯为测试液，由于甲苯为非极性物质，所以甲苯的 出峰时间即为死时间。 3 1 3 结果与讨论 3 1 3 1 压力的影响 通过图2 - 5 可以知道，在一定压力范围内，压力与流速呈线性关系。由于实验条件 限制，本实验通过控制压力进而控制流速，如图3 - 1 为压力对中性物质分离的影响。当 柱压从1 5 0p s i 变化2 0 0p s i 时，保留时间缩短，但分离度也明显下降。在柱压为1 7 5p s i 时，各物质之间达到基线分离，保留时间在6m i n 内。故选择在毛细管柱两端施加1 7 5p s i 的压力作为最佳分离压力。 i 一j l 15 0 p s i 17 5 p s i 2 0 0 p s i 图3 - 1 压力对中性物质分离的影响 实验条件：流动相为乙腈一t e a l 缓冲液( 5r e t o o l l ) p h = 6 = 检测波长：2 1 4n m 。 3 1 3 2 保留机理 根据a l p e r t 的定义【1 0 3 1 ，极性组分在h i l i c 中的保留基于分配机理。在此之前，已 有不少研究表明，当使用水水溶性有机溶剂作流动相时，亲水性的固定相表面会固着 一层富水层；而一些糖类化合物在氨基衍生的硅胶固定相上的保留也确实包含分配机理 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 1 1 1 6 ，1 1 7 1 。g u o 等【1 1 8 】以及q u i m i n g 等【1 1 9 1 的研究结果表明，尽管不同的固定相填料表现出 不同的选择性，但影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的 比例。h i l i c 分离通常都以乙腈和水作为流动相，而且需要比较高的乙腈浓度( 6 0 ) 。 为了考察聚( g m a - c o d a m a e d m a c o m a a ) 的性质，选用甲苯，二甲基甲酰胺( d m f ) ， 甲酰胺，硫脲为分析物。流动相为乙腈t e a p ( 5m m o l l ) ，p h = 6 ，乙腈浓度变化从9 0 至i j4 0 。 皇1 7 1 4 吕 一1 1 口 o o 昌e 4 8 u 星5 2 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 a c n ( v v ) 一_ 一甲苯 - 二甲基甲 酰胺 一甲酰胺 _ 一硫腮 图3 2 几种分析物的保留时间与乙腈浓度关系 实验条件：流动相为乙腈- t e a p 缓冲液( 5m m o l l ) ；p h = 6 ：检测波长：2 1 4n l n 。 图3 2 为流动相中乙腈浓度改变对保留时间的影响。当a c n 8 0 时，非极性物质 甲苯最先出峰，然后为三种极性物质d m f 、甲酰胺、硫脲按照极性由小到大依次被沈 脱。随着乙腈浓度的降低，甲苯的保留时间逐渐增大，当a c n 8 0 时，表现为亲水作 用，而当a c n 6 5 时， 出峰顺序为：甲酰胺、对甲基苯胺、对硝基苯胺、硫脲。a c n 浓度从6 5 降低到5 5 ， 出峰顺序为：甲酰胺、对甲基苯胺、硫脲、对硝基苯胺。当a c n 6 0 的时候，亲水作用起到主要作用，且随 着乙腈浓度增加亲水作用增强；当a c n 6 0 的时候，疏水作用起到主要，随着乙腈浓 度的下降，疏水作用增加。当p h = 4 时，整体固定相表面带正电，对甲基苯胺完全质子 化，而对硝基苯胺弱质子化。这种结果表明，对于可解离的物质，固定相与物质间的静 电作用也对保留起到影响。 3 2 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 9 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 a c n ( v v ) 图3 6 乙腈浓度对极性物质的影响 - 对甲摹 苯胺 _ 卜一对硝基 苯胺 实验条件：流动相为乙腈t e a l 缓冲液( 5m m o l l ) ：p h - - 4 ：检测波长：2 2 0n r l l 。注：对甲基苯胺( p k a = 5 0 8 ) ：对硝基 苯胺0 k a = 0 9 8 ) 。 3 e 、_ ， o c 订 o l o 母 d o24681012 time ( mjn 图3 7 极性物质分离 实验条件：流动相为乙腈t e a f ( 6 0 v v ) 缓冲液( 5m m o l l ) ：p h = 4 ：检测波长：2 2 0n m 。注：对甲基苯胺( p k a = 5 0 8 ) ； 对硝基苯胺0 k a = o 9 8 ) 。注：1 甲酰胺；2 对甲基苯胺；3 硫脲；4 对硝基苯胺。 3 2 4 小结 利用该亲水整体柱分离了几种极性化合物。考察了离子强度和乙腈浓度对分离的影 响，探讨了分离机理。在高乙腈浓度下，亲水作用起到主要作用，在低乙腈浓度下，疏 水作用起主要作用。 3 3 ijh昌v昌h-iiohpaopo凹 6 5 3 2 ， o 1 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 第四章结论与展望 本文利用甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 、2 一二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯( d a m a ) 及甲 基丙烯酸( m a a ) 为单体，已二酸二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 为交联剂，并通过优化致孔剂 十二醇含量、反应时间、反应温度等参数制备了通透性好的毛细管液相色谱整体柱。并 利用酸性开环，使甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 的环氧基团开环生成两个醇羟基，增 加整体柱的极性，从而增加了整体住的亲水性。通过分离极性物质探讨了分离作用机理。 对于中性极性物质，利用亲水作用进行分离；对于离子型化合物，可以利用酸碱性使整 体柱表面固定相带上电荷，利用静电作用亲水作用混合模式进行分离。实验结果表明， 在高乙腈( a c n ) 浓度下，对于极性组分的保留表现为亲水作用；在流动相p h 较低的条 件下，对于离子型组分的保留主要表现为亲水作用，而静电作用较弱。 近年来，随着蛋白质组学、代谢组学、中药现代化、环境保护等领域研究的迅速发 展，面对非挥发性复杂体系样品中亲水性组分高效分离与高灵敏检测的要求，亲水作用 色谱已成为近年来色谱领域研究的热点之一。以“亲水作用色谱 或“h y d r o p h i l i c i n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y 为主题词，w e bo fs c i e n c e 收录的文献数目在1 9 9 0 年至1 9 9 9 年为4 1 篇，2 0 0 0 年至2 0 0 5 年为1 0 4 篇，而从2 0 0 6 年至2 0 0 9 年4 月不到3 年的时间内 已有3 0 0 多篇文献报道。这是由于亲水作用色谱的应用领域不断扩展，越来越多的适用 于不同样品性质和分析目的的亲水作用色谱分析方法得到了开发。通过改进流路设计， 亲水作用色谱和其他色谱分离模式的正交性也已经在一定程度上得以实现。可以预见， 在不久的将来，会有更多的具有独特选择特点的新型亲水作用色谱填料面世，并成功地 用于多种在线联用及多维液相色谱方法中，为复杂的亲水样品的分离分析提供更多的有 力工具。 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 【1 】 【2 】 【3 】 【1 7 】 【1 8 】 【1 9 】 【2 0 】 参考文献 v i s s e r s ，j p c ，c l a e s s e n s ，h a ，c r a m e r s ，c a ，m i c r o c o l u m nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ： i n s t r u m e n t a t i o n ，d e t e c t i o na n da p p l i c a t i o n j c h r o m a t o g r a1 9 9 7 ，7 7 9 ，1 2 8 h o r v a t hc g ，p r e i s sb a ，l i p s k ys r ，f a s tl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i n v e s t i g a t i o no f o p e r a t i n gp a r a m e t e r sa n dt h es e p a r a t i o no fn u c l e o t i d e so i lp e l l i c u l a ri o ne x c h a n g e r s , a n a l 。c h e m ，1 9 6 7 ，3 9 ：1 4 2 2 - 1 4 2 8 i s h i id ，a s a ik ，h i b ik ，j o n o k u c h it ，n a g a y am ，as t u d yo fm i c r o h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ：1 d e v e l o p m e n t o f t e c h n i q u e f o rm i n i a t u r i z a t i o no f h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , j c h r o m a t o g r ，1 9 7 7 ，1 4 4 ：1 5 7 1 6 8 s c o t tr p w ：，k u c e r aj ，t h ee x c l u s i o np r o p e r t i e so fs o m ec o m m e r c i a l l ya v a i l a b l es i l i c a g e l s ，j c h r o m a t o g r ，1 9 7 6 ，1 2 5 ：2 51 - 2 6 3 k u c e r a 只，e d ，m i c r o c o l u m ns e p a r a t i o n s ，e l s e v i e r ：a m s t e r d a m ，1 9 8 4 n o v o t n ym ，e d ，m i c r o c o l u m nh i g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , a m s t e r d a m ， 】9 8 5 s c o t tr p ，e d ，s m a l l - b o r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o l u m n ，w i l e y i n t e r s c i e n c e ：n e w y o r k ，1 9 8 4 y a n ge j ，m i c r o b o r ec o l u m nh p l c ，j h i g h r e s o l u t c h r o m a t o g r ，1 9 8 3 ，6 ：3 4 8 3 5 8 v e r z e l em ，w e e r d tm d e ，d e w a e l ec ，j o n yg j d e ，m i c r o c o l u m ni c ：i si tw o r t hi t ? i c g c1 9 8 6 ，4 ：1 1 6 2 1 1 6 9 n o v o t n ym ，r e c e n ta d v a n c e si nm i c r o c o l u m nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , a n a l c h e m ， 1 9 8 8 6 0 ：5 0 a k 51 0 a v i s s e r sp c j ，r e c e n td e v e l o p m e n t si nm i c r o c o l u m nl i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，j c h r o m a t o g r a ，1 9 9 9 ，8 5 6 ：1 1 7 1 4 3 g u a ny ，z h o ul ，s h a n gz ，d r y p a c k e dc a p i l l a r yc o l u m n sf o rm i c r oh p l c ，j h i g h r e s o l u t c h r o m a t o g r ，1 9 9 2 ，1 5 ：4 3 4 4 3 6 于世林，高效液相色谱方法及应用，第一版，化学工业出版社，1 9 9 9 ，2 7 - 2 8 s o o nm h ，d a n i e lw ：a ，p a c k i n g i n d u c e db r i t t l e n e s si np o l y i m i d e a n da l u m i n u m c l a d f u s e d s i l i c ac a p i l l a r i e s ，a n a l c h e m ，1 9 8 7 ，5 9 ：1 5 8 3 1 5 8 4 v i s s e r sj p ，v a nd e nh o e fe c j ，c l a s e s s e n sh a ，l a v e nj ，c r a m e r sc a ，j m i c r o c 0 1 s e p ，1 9 9 5 ，7 ：2 3 9 2 4 5 s h e l l yd c ，a n t o n u c c iv l ，e d k i n st j ，d a l t o nt j ，h s i 【g h t si n t ot h es l u r r yp a c k i n g a n db e ds t r u c t u r eo fc a p i l l a r yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n s ，j c h r o m a t o g r ，1 9 8 9 ， 4 5 8 ：2 6 7 2 7 9 s o o nm h 。，d a n i e lw a ，p a c k i n g i n d u c e db r i t t l e n e s si np o l y i m i d e a n da l u m i n u m c l a d f u s e d - s i l i c ac a p i l l a r i e s ，a n a l c h e m ，1 9 8 7 ，5 9 ：1 5 8 3 1 5 8 4 v i s s e r sj p ，v a nd e nh o e fe c j ，c l a s e s s e n sh a ，l a v e nj ，c r a m e r sc a ，j m i c r o c 0 1 s e p ，1 9 9 5 ，7 ：2 3 9 2 4 5 t o n gd ，b a r t l ek d ，c l i f f o r da a ，e d g ea m ，j m i c r o c 0 1 s e p ，19 9 5 ，7 ：2 6 5 2 8 7 i b e r e rg ，h a h nr ，j u n g b a u e ra ，m o n o l i t h sa s s t a t i o n a r yp h a s e sf o rs e p a r a t i n g b i o p o l y m e r s 一一f o u r t h g e n e r a t i o nc h r o m a t o g r a p h ys o r b e n t s ，l c g c ，1 9 9 9 ，1 7 ( 1 1 ) ： 9 9 8 10 0 5 【21 】m i n a k u c h ih ，n a k a n i s h ik ，s o g an ，i s h i z u k an ，t a n a k an ，0 c t a d e c y l s i l y l a t e d 3 5 1 j 1 j 1 j 1 j 1i1jj q 习q 刀 研町 加 n 他 b h 垮 垣 r l r i r l r i r l r t r l r l r l r l r l r l r 【 一种亲水性毛细管液相色谱整体柱的制备及应用 p o r