（无线电物理专业论文）dna复制起始蛋白mcm6cdt1相互作用的研究.pdf

yjj， ， _ y 1 7 4 燃嶝 s t u d i e so ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n d n ar e p l i c a t i o ni n i t i a t i o n p r o t e i n s m c m 6a n dc d t l d e p a r t m e n t ：p h y s i c s s p e c i a l i t y ： bi o m o l e c u a r n m r s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r g u a n gz h u a u t h o r ：慢iz h u n a p r i l ，2 0 10 ， 一 、 j - ， f 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名： 日期：型么丝t 、 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定。 黼黼摊：粥y 撇名：缈 ， 。 日期：7 b 、j 。么p日期：2 oc o 石lo 魏准博士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 陈群教授华东师范大学主席 张善民教授华东师范大学 赖立辉教授华东师范大学 林东海研究员中国科学院上海药物研究所 日7 f r r h研究员中国科学院上海有机化学研究所 、 论文摘要 在所有真核细胞中，基因组d n a 的复制都受到严格的控制，以保证在每个细 胞周期中d n a 仅准确的复制一次。d n a 复制的起始阶段是整个复杂的复制过程中至 为关键的一步，该过程受复制前复合物( p r e r e p l i c a t i o nc o m p l e x ，p r e r c ) 的严格控 制。微小染色体维持蛋白( m i n i c h r o m s o m em a i n t e n a n c e ，m c m ) 复合物是p r e r c 的重要组分，该复合物是由同一家族结构类似的6 个亚单位( m e r e 2 m c m 7 ) 组成， 目前被认为是d n a 复制过程中的解链酶并在复制叉的延伸过程中起关键作用。在 细胞周期的m 晚期和g 1 早期，m c m 2 7 复合物依赖于另一个p r e r c 的重要亚单位 c d c l 0 依赖性转录因子( c d c l 0d e p e n d e n tt r a n s c r i p t l ，c d t l ) 而结合到染色质上面。 m c m 6 是m c m 2 7 复合物中的一个亚单位，由位于蛋白中部的m c m 结构域和c 末 端尚未被研究的结构域构成。 本文研究表明，高度保守的m c m 6c 末端能够与c d t l 相互作用。我们将与 c d t l 相互作用的区域称为c d t l 结合结构域( c d t lb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) ，并通过高 分辨率核磁共振实验解析出其空间结构，c b d 的结构呈现典型的 w i n g e d h e l i x ” 折叠。 w i n g e d h e l i x ”折叠通常参与蛋白质核酸的相互作用，本文的研究发现c b d 同d n a 没有直接相互作用，表明c b d 特异性的参与蛋白质一蛋白质之间的相互作 用。同时我们也发现了为于c d t l 上面与m c m 6 相结合的区域( m c m 6b i n d i n g d o m a i n ，m b d ) 。利用核磁共振滴定实验，我们确认出位于c b d 上面直接参与c d t l 相互作用的氨基酸，e 7 5 7 和l 7 6 6 。我们通过生化学以及细胞学实验验证了这两 个氨基酸在m c m 6 c d t l 相互作用中的关键作用。 在解析c b d 结构的基础上我们已经解析出高分辨率的c b d m b d 复合物结 构。研究表明，c d t l 在m c m 2 7 复合物的染色质结合过程中起关键作用，但是c d t l 作用的分子机制目前仍未知。为了阐明c d t l 在p r e r c 形成过程的具体作用机制， 在对c b d m b d 复合物进行生化以及结构学研究基础上，我们已利用爪蟾卵提取 物设计、进行相关实验，并取得令人鼓舞的结果。我们认为，m c m 6 通过其c b d 与c d t lm b d 的相互作用可能引起m c m 2 7 复合物与染色质相结合而完成p r e r c 的装配，我们已经完成以及正在进行中的研究工作为深入理解d n a 的复制起始机 理提供了重要依据。 关键词：d n a 复制起始，复制前复合物装配，染色质结合，c d t l 结合结构域，m c m 6 结合结构域，核磁共振结构 - - a b s t r a c t i na l le u k a r y o t i cc e l l s ，i n i t i a t i o no fg e n o m i cd n a r e p l i c a t i o ni st i g h t l yc o n t r o l l e dt o e n s u r et h a td n a r e p l i c a t i o no c c u r so n l yo n c ei ne a c hc e l lc y c l e d n ar e p l i c a t i o n i n i t i a t i o ni st h ec r i t i c a ls t e pd u r i n gt h ew h o l ed n a r e p l i c a t i o np r o c e s s ，i n i t i a t i o n s t e pi ss t r i c t l yc o n t r o l l e db yt h ef o r m a t i o no fp r e r e p l i c a t i o nc o m p l e x ( p r e r c ) w h i c h i sc o m p o s e do fs e v e r a li m p o r t a n tp r o t e i nc o m p l e x e sa n dp r o t e i n si n c l u d i n gt h e m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c em c m c o m p l e x t h em c mc o m p l e xi sc o m p o s e do f s i xe v o l u t i o n a l l yc o n s e r v e dp r o t e i n sm c m 2 - m c m 7 ，a n di ti sb e l i e v e dt ob et h e r e p l i c a t i v eh e l i c a s ei ne u k a r y o t i cs p e c i e s ，a n di tp l a y se s s e n t i a lr o l e si nt h ei n i t i a t i o n a n de l o n g a t i o np h a s e so fd n a r e p l i c a t i o n d u r i n gl a t em a n de a r l yg 1 ，t h em c r n 2 7 c o m p l e xi sl o a d e do n t oc h r o m a t i nt of o r mp r e r ci nac d t1 d e p e n d e n tm a n n e r m c m 6 i so n eo ft h es i xs u b u n i to ft h em c m 2 7c o m p l e x ，a n di tc o n t a i n st h eh i g h l yc o n s e r v e d m c md o m a i nia n do n eu n c h a r a c t e r i z e dc t e r m i n a ld o m a i n i nt h i ss t u d yw ed e m o n s t r a t et h a tt h ep r e v i o u s l yu n c h a r a c t e r i z e dc t e r m i n a ld o m a i n o fh u m a nm c m 6i st h ec d t lb i n d i n gd o m a i n ( c b d ) w i t ht h eu s eo fh i g h - r e s o l u t i o n n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( n m r ) t e c h n i q u e ，w es o l v e dt h e3 ds t r u c t u r eo fc b d t h es t r u c t u r eo fc b de x h i b i t sa t y p i c a l “w i n g e d h e l i x f o l dt h a ti sg e n e r a l l yi n v o l v e d i np r o t e i n - n u c l e i ca c i di n t e r a c t i o n n e v e r t h e l e s s t h ec b df a i l e dt oi n t e r a c t 、机t hd n a i no u rs t u d i e si n d i c a t i n gt h a ti ti ss p e c i f i cf o rp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n a l s o ，w e m a p p e dt h e m c m 6b i n d i n gd o m a i n ( m b d ) o fc d t l b a s e do nn m rt i t r a t i o n e x p e r i m e n ta n dg s tp u l l d o w na s s a yw ei d e n t i f i e de 7 5 7 a n dl 7 6 6o nc b d a r et h e c r i t i c a lr e s i d u e sf o rt h ei n t e r a c t i o nw i t hc d t l t h ef u n d a m e n t a lr o l eo ft h e s et w o r e s i d u e si nm c m 6 c d t ii n t e r a c t i o nw a sf u r t h e rc o n f i r m e dw i t hs u b c e l l u l a r c o l o c a l i z a t i o na s s a y b a s e do nt h ec b ds t r u c t u r e ，w eh a v ed e t e r m i n e dt h eh i 曲r e s o l u t i o ns t r u c t u r eo f t h ec b d m b dc o m p l e x a c c u m u l a t i n gs t u d i e si n d i c a t et h a tc d t lm e d i a t et h e c h r o m a t i nl o a d i n go fm c m 2 7c o m p l e x ；h o w e v e rt h ed e t a i l e dm o l e c u l a rm e c h a n i s m r e m a i n se l u s i v e i no r d e rt oe l u c i d a t et h ed e t a i l e dr o l ep l a y e db yc d t li nt h ep r e r c a s s e m b l y ，w ea r ec u r r e n t l yu t i l i z i n gx e n o p u se g ge x t r a c ts y s t e mt oi n v e s t i g a t et h e b i o l o g i c a lc o n s e q u e n c e o fm c m 6 - c d t li n t e r a c t i o n b a s e do n o u r p r e v i o u s b i o c h e m i c a la n ds t r u c t u r a ls t u d i e s ，w eh a v eg o tq u i t ee n c o u r a g i n gr e s u l t si nt h e f u n c t i o n a li n v e s t i g a t i o n s w es p e c u l a t et h a tc d tld i r e c t sm c m 2 - 7c o m p l e xc h r o m a t i n l o a d i n gt oa c c o m p l i s hp r e r cf o r m a t i o nt h r o u g ht h ed i r e c ti n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e m b do fc d tla n dc b do fm c m 6 i nc o n c l u s i o n o u rs t r u c t u r a la n df u n c t i o n a ls t u d i e s 9 _ 1 i nm c m 6 一c d t li n t e r a c t i o nw i l ld e f i n i t e l yh e l pt ob e t t e ru n d e r s t a n dt h ep r o c e s so f m c m 2 7c o m p l e xc h r o m a t i nl o a d i n ga n dp r e r ca s s e m b l yw h i c ha l et h ev i t a ls t e p si n e u k a r y o t i cd n ar e p l i c a t i o n k e yw o r d s ：d n ar e p l i c a t i o ni n i t i a t i o n ，p r e - r e p l i c a t i o nc o m p l e xa s s e m b l y , c 1 1 r o m a t i n l o a d i n g ，c d tlb i n d i n gd o m a i n ，m c m 6b i n d i n gd o m a i n ，n m r s t r u c t u r e 7 目录 第一章真核细胞d n a 复制起始介绍1 前言d n a 复制与细胞周期介绍1 1 1 前复制复合物的形成以及装配2 1 1 1 前复制复合物的装配2 1 1 2 前复制复合物的调控3 1 2 组成前复制复合物的重要蛋白4 1 2 1 起点识别复合物( o r i g i nr e c o g n i t i o nc o m p l e x ，o r c ) 4 1 2 2 细胞分裂周期蛋白6 ( c e l ld i v i s i o nc y c l e6 ，c d c 6 ) 5 1 2 3c d c l o 依赖性转录因子( c d c l od e p e n d e n tt r a n s c r i p t l ，c d t l ) 6 1 2 4 微小染色体维持蛋白( m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c e ，m c m ) 6 第二章结构生物学介绍8 前言结构生物学简介8 2 1x 射线晶体学9 2 2 冷冻电子显微镜技术研究蛋白结构1 0 2 3 核磁共振研究蛋白质结构1 2 2 3 1 样品制备1 3 2 3 2 蛋白纯化及鉴定1 4 2 3 3 样品缓冲液优化1 5 2 3 4 样品标记1 5 2 3 5 核磁共振实验1 6 2 3 5 1 核磁共振基本原理1 6 2 3 5 2 核磁共振仪器1 7 2 3 5 3 核磁共振基本实验参数1 7 2 3 5 3 1 化学位移1 7 2 3 5 3 2 自旋偶合1 8 2 3 5 3 3 弛豫参数，t 1 ，t 2 1 9 2 3 5 3 4n o e - n u c l e a ro v e r h a u s e r 效应1 9 2 3 5 4 多维核磁共振实验的基本原理2 l 2 3 5 5 蛋白质核磁共振实验及图谱解析策略2 3 2 3 5 6 结构计算2 8 2 3 5 6 1 距离约束2 9 2 3 5 6 2 二面角约束2 9 2 3 5 6 3 残留偶极偶合( r d c ) 3 0 2 3 5 6 4 计算方法3 0 第三章m c m 6 一c d t l 相互作用的生化学研究3 2 前言研究路线介绍3 2 3 1 实验材料和方法3 3 3 1 1 菌株和载体3 3 3 1 2 主要试剂3 3 3 1 3 主要仪器和设备3 3 3 1 4 酵母双杂交基本原理3 4 3 1 5 酵母细胞的培养3 5 3 1 6 酵母细胞的转化3 5 3 1 7 蛋白质浓度测定3 5 3 1 8w e s t e r nb l o t 分析3 6 3 1 9 细胞培养和转染3 6 3 1 1 0 免疫荧光技术3 6 3 1 1 1g s tp u l 卜d o w n 实验3 7 3 1 1 2 点突变载体的构建3 7 3 1 1 3c b d 的克隆、表达与纯化3 8 3 1 1 4m b d 的克隆、表达与纯化3 8 3 1 1 5 同位素标记c b d 与m b d 样品制备3 9 3 2 实验结果部分3 9 3 3 本章小结4 6 第四章应用核磁共振研究m c m 6c b d 与c d t lm b d 之间的相互作用4 7 4 1c b d 结构解析以及与m b d 之间的相互作用i 4 7 4 1 1 核磁共振实验4 7 4 1 2 数据处理4 8 4 1 3图谱解析与结构计算4 8 4 1 4c b d 与c d t l 多肽结合常数的测定4 8 4 1 5 结果与讨论部分4 9 4 1 5 1 样品溶液条件优化4 9 4 1 5 2c b d 序列指认与结构计算5 1 4 1 5 3c b d 空间结构描述5 4 4 1 5 4c b d 与m b d 相互作用的核磁共振研究5 6 4 1 5 5c b d 与d n a 没有相互作用的研究6 1 4 1 6 本节小结6 3 4 2c b d 与m b d 复合物结构的解析6 3 4 2 1核磁共振实验6 3 4 2 2 m b d 与c b d 的核磁共振滴定实验6 4 4 2 3m b d 序列指认与空间结构6 4 4 2 4 m b d 与c b d 相互作用研究6 7 4 2 5 本节小结6 9 全文总结7 0 附录：7 1 附录im c m 6 一c d t l 相互作用研究流程图7 2 附录i i用以研究m c m 6 以及c d t l 所使用的主要引物序列7 3 附录i i i 缩写词及英汉对照7 6 参考文献7 9 攻读学位期间发表和待发表的论文8 3 致 射8 4 第一章真核细胞d n a 复制起始介绍 前言d n a 复制与细胞周期介绍 脱氧核糖核苷酸( d n a ) 是承担生物遗传使命、主导生物发育和进化的关键分 子。贮存遗传信的特殊d n a 片段称为基因，它编码蛋白质的氨基酸序列，从而决 定蛋白质的功能。通过蛋白质的作用，d n a 实际上控制着细胞和生物体的生命过 程。1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 发现了d n a 的双螺旋结构，开启了分子生物学时代。 分子生物学使生物大分子的研究进入一个崭新的阶段，使遗传学的研究深入 到分子层次，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。 基因组d n a ( g e n o m i cd n a ) 复制是遗传信息贮存和传递的关键步骤，该过 程受到严格的控制以保证在每个细胞周期中d n a 准确无误的进行一次。d n a 复制是一非常复杂的酶学过程，它需要多种酶和蛋白质协同作用。原核生物和真 核生物d n a 复制均涉及到拓扑异构酶、解旋酶、单链结合蛋白、引物合成酶、d n a 聚合酶及连接酶等酶和蛋白质的参与。基于真核细胞比原核生物的复杂性，其 d n a 的复制过程中亦存在很多不同之处，本文的研究对象为真核生物d n a 复制复 制起始相关蛋白，故将以真核生物的d n a 复制系统展开介绍。 细胞周期( c e l lc y c l e ) 是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂 ( m i t o s i s ) 结束后生长到下一次分裂结束的循环过程。这是一个细胞物质积累与 细胞分裂的循环过程。可分为四个阶段( 图l - 1 ) ：g ，期( g a p l ) ，指从有丝分裂 完成到期d n a 复制之前的间隙时期；s 期( s y n t h e s i sp h a s e ) ，指d n a 复制的阶段； g ：期( g a p 2 ) ，指d n a 复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；m 期又称d 期 ( m i t o s i so rd i v i s i o n ) ，细胞分裂发生到结束的时期。从细胞增殖的角度来看， 可将高等动物的细胞分为三类：连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又 称为周期细胞，如部分骨髓细胞、表皮生发层细胞。休眠细胞，暂不分裂但在 适当的刺激下可重新进入细胞周期，称g 。期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。 不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如 神经、肌肉、多形核细胞等( 1 ) 。 d n a 复制必须与细胞的分裂周期准确协调，以便基因组的两份拷贝在细胞分 裂时已经准备完毕。细胞周期受多种复杂调控机制的严格控制，该调控由信号传 导通路来实现，并决定细胞的分裂、分化和凋亡等重要过程。研究发现参与细胞 周期调控的核心蛋白分子是细胞周期素( c y c l i n ) ，周期素依赖性蛋白激酶 ( c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e s ) c d k s 和c d k 的抑制性蛋白( c d k i ) ( 2 - 4 ) 。不同的 c y c l i n 和c d k 及c d k i 与其他相关调控蛋白精确调控细胞周期的每一个阶段。细 胞调控有两大机制，一是细胞周期驱动机制；二是细胞周期监控机制，在细胞周 期的许多时相点上存在细胞周期检测点( c e l lc y c l ec h e c k p o i n t ) ，其中有两个时 期被认为是关键控制点，一个是由g 1 期进入s 期，另一个是由g 2 期进入m 期。 这些检测点对细胞周期进程进行严格监测，使d n a 复制和有丝分裂准确无误地执 行。 细胞周期 袋色体程纲瞻绣内鹄鲴隧 麓笈翻于繁色体约纲魏 图1 - 1细胞周期示意图 1 1 前复制复合物的形成以及调控 1 1 1 前复制复合物的装配 s 期的起始时间的控制是由前复制复合物( p r e r e p l i c a t i o n c o m p l e x ，p r e r c ) 在复制原点( r e p l i c a t i o no r i g i n ) 的装配决定的。p r e r c 组装 ( p r e r ca s s e m b l y ) 发生于在m 晚期和g 1 期，组成p r e r c 的蛋8 蛋白复合物目 前已知至少包括起点识别复合物( o r i g i nr e c o g n i t i o nc o m p l e x ，o r c ) 、细胞分 2 裂周期蛋白6 ( c e l ld i v i s i o nc y c l e6 ，c d c 6 ) 、c d c l o 依赖性转录因子( c d c l o d e p e n d e n tt r a n s c r i p t l ，c d t l ) 以及微小染色体维持蛋白( m i n i c h r o m s o m e m a i n t e n a n c e ，m c m ) 。p r e r c 的组装过程高度准确如图i - 2 所示，首先o r c 特异 性识并结合d n a 复制原点，o r c 的结合将引导c d c 6 和c d t l 与之相结合，最终 m c m 2 7 复合物依赖于c d t l 结合于染色质复制原点，完成p r e r c 的组装。一旦 p r e r c 装配完毕，细胞在接受到其他调控信号，( c d k 和c d c 7 激发c d c 4 5 以及 g i n s 复合物结合于p r e r c ) ，最终d n a 复制过程所需的酶类以及蛋白因子组成复 制体( r e p l i s o m e ) 开始d n a 的复制( 5 ，6 ) 。 图1 - 2 前复制复合物的装配示意图 1 1 2 前复制复合物的形成及其调控 p r e r c 承担着控制d n a 复制起始的重要任务，其本身受到多种机制的调控 以保证已经被复制的d n a 不会重新开启复制。p r e r c 受细胞周期调控蛋白 c y c l i n c d k s 复合物的严格控制( 7 ) 。c y c l i n 细胞内含量随细胞周期进程发生周期 性变化，它通过与c d k s 形成复合物调控其活性。在g 卜s 阶段，c y c li n 与c d k 2 形成s - c d k 复合物，s - c d k 在短期内被激活，首先使c d c 6 磷酸化，使其脱离o r c ， 磷酸化的c d c 6 随后经泛素化途径降解( 8 ) 。s - c d k 在其他蛋白激酶的辅助下，使 o r c 磷酸化( 9 ) ，并促进m c m 环状复合物沿d n a 向前滑动行使解链酶的功能，启动 d n a 复制。s - c d k 还可以将某些m c m 磷酸化，磷酸化后的m c m 将丧失解链酶活性， 并且被输出细胞核( 1 0 ，1 1 ) 。其它一些c d k 也参与阻止p r e r c 的再次形成，从而 保证了d n a 的复制当且仅当一次。 c d t l 是组成p r e r c 的重要蛋白，所以对c d t l 功能的调控直接影响着p r e r c 的功能，从而对d n a 复制产生影响。在真核细胞中存在多种调控机制对c d t l 的 功能进行有效调控。在高等真核细胞中存在一个特异性的c d t l 抑制因子g e m i n i n ， 它在g l 末期开始出现，在s 期、m 期大量积累( 1 2 ) 。g e m i n i n 能够与c d t l 形成较 强的直接相互作用使c d t l 失去活性，继而影响p r e - r c 的完整性以及稳定性，阻 碍m c m 复合物定位于染色质上，造成d n a 复制起始的停滞。在s 期，哺乳动物细 胞的c d t l 被c d k 磷酸化后会进入依赖于s k p 2 的降解途径( 1 3 ) ；在非洲爪蟾中， 虽然c d t l 的降解也是依赖于c d k 的活性的，但c d t l 并不是被直接磷酸化而是 c d k 促使细胞进入s 期，复制起始产生后，c d t l 的降解依赖于蛋白酶体( 1 4 ) ， 或被a p c 降解或是由p c n a 介导的依赖于c u l 4e 3 连接酶的降解途径( 1 5 ，1 6 ) 。 1 2 组成前复制复合物的重要蛋白 本文的研究工作重点集中于m c m 6 与c d t l 的相互作用，故本章将对组成 p r e r c 的蛋8 蛋白复合物进行较为详细的介绍 1 2 1 起点识别复合物( o r i g i nr e c o g n i t i o nc o m p l e x ，o r c ) o r c 蛋白首先在裂殖酵母中被发现能够特异性结合d n a 复制原点。在所有研 究的真核生物中，o r c 复合物都是以异6 聚体的形式存在，o r c 复合物由六个亚 单位构成( 1 7 ) 。其各亚单位的命名是根据分子量由高到低o r e l 一o r c 6 。 1 o r c 蛋白结构特征 o r c l 5 具有典型的a 从+ 结构( a t p a s e sa s s o c i a t e dw i t hd i v e r s ec e l l u l a r 4 a c t i v i t i e s ) ，其包括w a l k e ra 和w a l k e rba t p 结合结构域，该结构可以使环状的 蛋白复合物能环绕双链结构的d n a ( 1 8 ) 。o r c 6 是o r c 家族中比较特别的成员，o r c 6 与其它压单位o r c l - 5 没有结构的相似性。而且与其它压单位相比，o r c 6 在不同物 种间的保守性较差( 1 9 ) 。 2 o r c 蛋白定位与功能 在裂殖酵母中，6 个o r c 亚单位蛋白在整个细胞周期中都是附着在染色质上 ( 2 0 ) 。但是在较为高等的模式生物中，o r c 的定位及分布与酵母不同。例如在人 h e l a 细胞中，o r c l 在s 期从染色质上面脱离，在有丝分裂末期又重新结合到染 色质上面( 2 1 ) 。除了结合于d n a 复制起点，人o r c 2 还在整个细胞周期中结合于中 心体( c e n t r o s o m e ) ( 2 2 ) 。这表明，除了参与p r e r c 形成的主要功能，o r c 各个 亚单位还具有其它重要的功能。 1 ：2 2 细胞分裂周期蛋白6 ( c e l ld i v i s i o nc y c l e6 ，c d c 6 ) c d c 6 最先在裂殖酵母中发现其缺失突变能够引起酵母细胞的停滞，该蛋白 在所有真核细胞中都是保守的( 2 3 ) 。在d n a 复制起始阶段，c d c 6 发挥关键作用， 如果c d c 6 被敲除将直接导致p r e r c 无法形成( 2 4 ) 。另外，c d c 6 在调控细胞周期 方面同样具有重要作用。 1 c d c 6 蛋白结构特征 c d c 6 具有典型的a a a + 结构，在酵母中，如果令其a t p a s e 产生突变会产生致 死效应。a t p a s e 的活性至少在两方面影响到c d c 6 的功能，其一，影响到o r c 跟 d n a 结合的特异性( 此现象目前仅在酵母中发现) 。其二，m c m 复合物的染色质结 合需要c d c 6 的a t p a s e 活性。w a l k e ra 和w a l k e rb 模体中的突变将导致c d c 6 的a t p 结合以及水解活性丧失( 2 5 2 8 ) 。目前对c d c 6 的结构学研究依然比较有限， 仅有关于c d c 6 在嗜盐古生菌中同源物的晶体结构被报道( 2 9 ) 。 2 c d c 6 与肿瘤 5 c d c 6 在d n a 复制起始以及细胞周期调控方面的重要作用使其成为分子肿瘤 学研究的重要蛋白。c d c 6 的高水平表达已经在5 5 9 6 的脑瘤中被验h i ( 3 0 ) ，在大约 5 0 的非小细胞肺癌中c d c 6 亦高水平表达( 3 1 ) 。 1 2 3c d c l o 依赖性转录因子( c d c l od e p e n d e n tt r a n s c r i p t l ，c d t l ) c d t l 最初作为细胞周期调控基因发现于裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) ，其启动子区域能够跟转录因子c d c l o 免疫共沉淀故被称为c d c l o 依赖 性转录因子。早期的研究表明，c d t l 缺失细胞产生d n a 复制缺陷的表型，表明 其功能与d n a 复制相关。后期对c d t l 的深入研究证明，c d t l 定位于细胞核，在 o r c 存在的条件下能够与d n a 相结合。有报道称，c d t l 能与c d c 6 有相互作用， 该相互作用可能有助于固定c d t l 附着于染色质上面。在爪蟾卵提取物中的研究 证明，如果把其中的c d t l 除去，o r c 复合物以及c d c 6 与d n a 的结合不受影响， 然而m c m 不能再与d n a 相结合，表明c d t l 对d n a 复制的作用主要是把m c m 2 7 复 合物引导于染色质上面从而完成p r e r c 的装配( 3 2 - 3 7 ) 。前期的大量研究将c d t l 大致分为三个功能结构域：( 1 ) 位于c d t l 中间为主要的与g e m i n i n 相结合的部分， ( 2 ) 氨基末端调控c d t l 的降解过程区域并包含第二个与g e m i n i n 相结合的位点， ( 3 ) 羧基末端与m c m 相结合区域( 3 8 ) 。 鉴于c d t l 在p r e - r c 装配过程中的重要作用，c d t l 与临床存在着必然的联 系。c d t l 已经被认为是癌基因，在多种细胞中的过量表达将引起d n a 重新复制 ( 3 9 - 4 1 ) 。以人上皮成纤维细胞为研究对象，经人巨细胞病毒感染之后，诱发c d t l 的表达( 4 2 ) 。目前对c d c 6 的结构学研究日益成为热点，g e m i n i n 与c d t l 相互作 用的结构域复合物晶体结构已经被解析，最近小鼠c d t l 羧基端4 5 0 - 5 5 7 部分的 核磁共振结构已经发表( 4 3 ，4 4 ) 。 1 2 4 微小染色体维持蛋白( m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c e ，m c m ) 微小染色体维持蛋白( m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c e ，m c m ) 是2 0 世纪8 0 年 代b i k - k w o o nt y e 在突变的酵母中发现，然后通过分子和生物化学实验方法分离 提取出来的它由至少6 个亚单位组成，包括m c m 2 m c m 7 ，存在于所有真核细胞 ( 4 5 ) 。 1 m c m 蛋白结构 6 9 ， m c m 蛋白在结构上存在高度相似的区域，其中最大的保守性结构区域是一 个由约2 0 0 个氨基酸组成的中心区域( m c mb o x ) ，其编码两个依赖d n a 的三磷酸 腺苷酶( a t p a s e ) 模体( m o t i f ) ( 4 6 ) 。除了m c mb o x 区域之外，m c m 2 。7 各亚单位在 结构上存在很大差异。细胞内的大部分m c m 2 7 蛋白以1 ：1 ：1 ：1 ：1 ：1 的形式形成六聚 体( 4 7 ) 。m c m 2 7 复合物目前被认为是d n a 复制过程中的解链酶并在复制叉的延伸 过程中起关键作用( 4 8 5 0 ) 。这表明除了保守的三磷酸腺苷酶活性，各亚单位在 细胞内应执行其它不同的细胞功能。越来越多的研究结果逐步发现m c m 2 7 六聚 体各亚单位参与其它重要的细胞事件，例如转录过程、染色体结构变化的等。 m c m 2 1 目一e , 够跟组蛋白h 3 有很紧的结合，m c m 5 的羧基端能够跟s t a tq 相互结合。 由于m c m 各亚单位分子量很大，并且相互之间存在相互作用，故对于m c m 家族 蛋白结构的研究进展较为缓慢，已经有报道的结构包括m e t h a n o t h e r m o b a c t o r t h e r m a u t o t r o p h i c u s m c m ( m t h m c m ) 氨基端结构域的晶体结构，s u l f o l o b u s ( s s o m c m ) 氨基端结构域的晶体结构( 5 1 ，5 2 ) 。2 0 0 9 年1 1 月，c e l l 刊登了d i f f l e y 的最新研究 进展，该文首次报道了酵母m c m 2 7 复合物的电镜结构，这为理解真核细胞d n a 复 制起始过程提供了宝贵的信息( 5 3 ) 。 2 m c m 蛋白在细胞周期的表达以及在d n a 复制起始过程中的作用 在细胞周期中，当细胞从g 1 期进入s 期，必须有复制前复合物( p r e - r c ) 的 形成，m c m 2 7 复合物是p r e r c 的重要组成部分，是d n a 复制中的解链酶并在复 制叉的延伸过程中起重要作用。在s 期，c d k s 和c d c 7 d b f 4 激酶活化p r e - r c ， d n a 解链，建立双向复制叉，同时使m c m 从p r e - r c 解离。在正常情况下，m c m 蛋 白表达水平随着细胞周期的变化而改变， 值，当细胞进入g 0 期和分化、衰老时， ( 5 0 ) 。 3 m c m 蛋白与肿瘤发生 m c m 蛋白的表达在g 1 s 转换期达到峰 m c m 蛋白表达的水平下降甚至检测不出 m c m 在细胞d n a 复制期激活，在细胞静止期失活，使其有可能成为肿瘤研究的 标志物。研究表明m c m 水平的增高不但标志着恶性细胞的增殖，而且也标志着非 典型性细胞和潜在恶性细胞的增生，因此m c m 可以作为肿瘤诊断的有效标志物。 研究表明，将m c m 5 用于检测宫颈涂片诊断异常的前驱恶性细胞具有高度的特异性 和敏感性( 5 4 ) 。m e r e 2 比k 1 6 7 b 匕更好地反映脑胶质瘤细胞的增殖情况并对预后判断 7 更有指导意义( 5 5 ) 。 第二章结构生物学介绍 前言结构生物学简介 结构生物学是近些年发展起来一门以生物物理学和生物化学手段来研究生 物大分子( 如蛋白质分子和核酸分子) 的三维结构，并研究结构与对应功能的关 系的学科。由于结构生物学能够解释生物大分子的构象和相互作用的方式，而所 有的生命活动都是通过各种生物大分子的相互作用来实现的，因