（海洋生物学专业论文）三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种鉴定.pdf

三株筛细菌苗株胞外多糖研究和菌种鉴定 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种鉴定 摘要 三株从海水中分离的蓝细菌菌株a 1 0 4 、a 1 0 9 、a 11 5 在其生长过程中可以向周 围培养基中分泌大量粘性多糖类物质，采用单次单因子方法对培养基组成( 不同 n a c i 浓度、不而 m g s 0 4 浓度) 和培养条件( 温度、光照强度) 进行优化研究，最 终得到这三株菌生产胞外多糖类物质的最佳培养基成分和最佳培养条件：a 1 0 4 ： 6 0g l n a c i ，0 6g l m g s 0 4 ，a 1 0 9 ：4 0g l n a c i ，0 7g l m g s 0 4 ，a 11 5 ：3 0 g l n a c i ，o 8g l 。m g s 0 4 最适培养条件：均为2 8 c ，光照强度分别为 3 6 0 0 ，2 7 0 0 ，3 6 0 0l u x 。a 1 0 4 、a 1 0 9 、a 11 5 胞外多糖产量在上述条件下分别在第1 2 天，9 天和1 1 天达到8 5 7g l ，7 5 3g l 。和6 9 8g l 。 因为这三株菌所产胞外多糖均为水溶性多糖，因此采用了乙醇沉淀的方法从 培养物i - 清中沉淀出多糖类物质，并使用s e v a g 方法去除多糖沉淀中的蛋白质， 使用紫外扫描方法检测蛋白质是否除尽，除净蛋白质的多糖粗品使用透析方法去 除小分子杂质，通过分子筛层析( s e p h d e x g 一1 0 0 ，s e p h d e x g 一7 5 ) 方法进一步纯 化，发现这三株菌所产胞外多糖为分子量均一的单一多糖。通过分子筛层析 ( s e p h a r o s e4 b ) 测定它们的分子量分别为：2 5 k d ，3 8k d 和4 6 k d 。通过硫酸基 团含量测定，糖醛酸含量测定，未发现这三种胞外多糖中有这两种基团存在。通 过薄层层析( t i 。c ) 分析它们的单糖组成，三种多糖均只含有葡萄糖一种单糖组 分。 采用形态观察和1 6 s r r n a 基因序列分析相结合的方法对这三株菌进行了菌 种鉴定，发现，从形态学角度出发，这三株菌的形态、大小、分裂方式与伯杰氏 手册中对q v a n o t h e c e 的形态描述一致。从1 6 s r r n a 基 訇) - y y t j 分析方法出发，这 三株菌的1 6 s r r n a 基因序列与d a c t y l o c o c c o p s i s 标准菌株d a c t v l o c o c c o p s j s s p p c c 8 3 0 5 的1 6 s r r n a 基因序列相似度分别达到：9 9 、9 9 、9 8 。因此，这三 株菌究竟属于哪个属还需要其他鉴定方法的辅助分析来进一步判断。 关键词：蓝细菌、胞外多糖、菌种鉴定 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种鉴定 i n v e s t i g a t i o no nt h ee x o p o l y s a c c h a r i d e s ( e p s ) f r o mt h r e e c y a n o b a c t e r i a ls t r a i n sa n di d e n t i f i c a t i o no ft h e s es t r a i n s a b s t r a c t t h r e ec y a n o b a c t e r i a ls t r a i n si s o l a t e df r o mm a r i n ew a t e ri nc h i n ac a n r e l e a s ea na m o u n to fe x o p o l y s a c c h a r i d e s ( e p s ) t ot h ec u l t u r em e d i u m t h e o p t i m a lc u l t u r em e d i u mc o m p o n e n t s ( n a c lc o n c e n t r a t i o na n dm g s 0 4 c o n c e n t r a t i o n ) a n dc u l t u r ec o n d i t i o n s ( t e m p e r a t u r ea n d1 i g h ti n t e n s i t y ) f o re x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c t i o nb yt h et h r e es t r a i n sw e r ei n v e s t i g a t e d u s i n g “o n e v a r i a b l e a t a t i m e ”m e t h o d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e o p t i m a lm e d i u mc o m p o n e n t sw e r e ：a 1 0 4 ：6 0g l n a c i ，0 6g l m g s 0 4 ，a 1 0 9 ：4 0 g l n a c l ，0 7g lm g s 0 4 ，a 1 1 5 ：3 0g l n a c i ，0 8g l m g s 0 4 a n dt h eo p t i m a l c u l t u r ec o n d i t i o n sw e r e ：a 1 0 4 ：2 8 ，3 6 0 0l u x ：a 1 0 9 ：2 8 2 7 0 0l u x ：a 1 1 5 ： 2 8 c ，3 6 0 0l u x u n d e r t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o n e n t sa n dc u l t u r e c o n d i t i o n s ，t h es t r a i n sa 1 0 4 ，a 1 0 9 ，a l1 5r e a c h e d8 5 7gl ，7 5 3g1 。一1a n d 6 9 8gl o fe p so n1 2d a y ，9d a y ，1 1d a y ，r e s p e c t i v e l y e t h a n o lw a su s e dt op r e c i p it a t et h es o l u b l ee x o p o l y s a c c h a r i d e sf r o m c u l t u r es u p e r n a t a n t ，p r o t e i na n do t h e rs m a l lm o l e c u l ri m p u r i t yo ft h e c r u d ee x o p o l y s a c c h a r i d e sw e r er e m o v e du s i n gs e v a gm e t h o da n dd i a l y s i s ， r e s p e c t i v e l y a f t e rp u r i f i c a t i o no fc r u d ee x o p o l y s a c c h a r i d e sb yg e l f i l t e rm e t h o d ，p u r l f i e d e x o p o l y s a c c h a r i d e sw e r ef o u n dt ob es i n g l e m o l e c u l a rm a s sp 0 1 y s a c c h r i d e s t h em o l e c u l a rm a s so ft h et h r e e e x o p o y s a c c h a r i d e sw e r e2 5 k d ，3 8 k da n d4 6 k d s u l f a t ea n du r o n i ca c i d 4 w e r en o tf o u n di nt h e s ee x o p o l y s a c c h a r i d e s m o n o s a c c h a r i d e sc o m p o n e n t s o ft h ee x o p 0 1 y s a c c h a r i d e sw e r ea n a l y s is e du s i n gt l c t h er e s u l t so fi d e n t i f i c a t i o no ft h es t r a i n sb a s e do nm o r p h o l o g i c a la n a l y s i sw e r en o tc o n s i s t e n tw i t ht h er e s u t sb a s e d0 1 1 6 s r r n ag e n es e q u e n c ea n a l y s i s s o ，f u r t h e ri n v e s t i g a t i o ns h o u l db ed o n e u s i n go t h e ri d e n t i f i c a t i o nm e t h o d s 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种箍定 k e yw o r d s ： c y a n o b a c t e r i u m ，e x o p 0 1 y s a c c h a r i d e s ， i d e n t if i c a t i o n 株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种签定 第一章蓝细菌胞外多糖综述 1 - 0 前言 蓝细菌是一类在系统发育上相关的革兰氏阴性原核微生物，它们的细胞与 典型的革兰氏阴性菌一致，细胞壁由粘肽( 含八种氨基酸和二氨基庚二酸以及 氨基葡萄糖) 等组成，壁外常形成粘性胶质鞘，因此，也称为粘藻( 黄泽波， 刘永定，1 9 9 7 ) 。但其光合器官在功能和结构方面与真核生物类似，具有与植 物类似的放氧光合作用( c a s t e n h o l za n dw a t e r b u r y ，1 9 8 9 ) 。但有些种类在黑 暗中也能生长，还有些种类在无氧条件下，可以利用硫化物作为电子供体来进 行光合作用。有些种类能将大气中的氮气固定为化合态氮，因此营养要求极低 ( s m i t h ，1 9 8 3 ：s t a la n dm o e z e l a a r ，1 9 9 7 ：c o h e ne ta ，1 9 8 6 ) 。 蓝细菌的形态多科，多样，从单细胞到丝状多聚体( w h i t t o n ，1 9 9 2 ) 。蓝细 菌分布极广，在大部分自然光可以照射到的地方都能够发现大量存活的菌群， 包括陆地及海洋，数量庞大，大约有1 5 0 属、2 0 0 0 种( 黄泽波，刘永定，1 9 9 7 ) ， 许多种类还能生活在极端环境下。这种广泛的分布反映出其种类繁多，具有丰 寓的生理学特性，具有很强的耐受环境压力的特性( s h e l e fa n ds o e d e r ，1 9 8 0 ) 。 蓝细菌的生态，生理，生化多样性使其在工业生产中具有不可忽视的潜力， 目前，拟将蓝细菌可以将光能转化为可重复利用的化学物质的特性应用于食 品，医药等_ - c k 领域的研究已经广泛开展( m a r t ina n dw y a t t ，1 9 7 4 ；b u r l e w ， 】9 5 3 ：s h e i e fa n ds o e d e r ，1 9 8 0 ：c r e s s w e l lp t 日，1 9 8 9 ) 。例如，有些蓝细 菌长期以来被用作食品来源，如螺旋藻。有些蓝细菌可以产生一系列有用的化 合物如：藻胆蛋白、磷光染料、药物和疫苗等。例女胞外多糖，已证明在污染 处理方面具有应用价值。蓝细菌作为生物肥料和在沙漠治理方面的生物技术应 用在于它们能适应较广的生境、能够固定空气中的氮元素、能够产生植物促长 物质以及分泌具有较高粘性的胞外聚糖等( p a in t e r ，1 9 9 3 ) 。 1 1 蓝细菌胞外多糖 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种鉴定 多糖是由多个单糖分子通过糖苷键连接而形成的聚糖。在自然界中分布极 广，在高等植物，藻类，菌类及动物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生 物聚合物。近年来，随着多糖在食品、饲料等工业中的应用日益广泛，以及调 节免疫功能、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射等功能的发现，多糖研究日益受到人们 的重视。 微生物多糖由于具有其他植物提取多糖所不具有的优点而受到关注。其中 蓝细菌多糖研究正在蓬勃开展。寻找能够生产具有潜在应用价值的多糖的蓝细 菌菌株的工作正在开展( b e n e m a n n ，1 9 9 0 ) 。 蓝细菌多糖根据其在细胞中的分布可分为：贮藏多糖、细胞外被多糖，细 胞外被多糖又可以分为：蓝细菌的细胞壁多糖、蓝细菌的鞘多糖、蓝细菌的荚 膜和粘质多糖以及蓝细菌鞘、荚膜和粘质多糖释放到周围环境中的水溶性多 糖。通常，我们将蓝细菌的鞘多糖、蓝细菌的荚膜和粘质多糖、蓝细菌鞘、荚 膜和粘质多糖释放到周围环境中的水溶性多糖统称为蓝细菌胞外多糖。 有关蓝细菌中糖类贮藏产物的最早记载是1 9 3 8 年。后来有人用电镜观察 了灰色念珠藻中存在的。一颗粒，其形和大小一致，其中含有约3 的蛋白质， 而干重的9 5 为葡萄糖，链长分布与其它细菌糖原类似。例如：钝顶螺旋藻的 贮藏多糖为葡聚糖，由a ( 1 4 ) 葡萄糖( 约占葡萄糖的8 5 ) 链和c i ( 1 6 ) 分支组成( b e r t o c c h io ta - ，1 9 9 0 ) 。 蓝细菌的细胞壁多糖与革兰氏阴性细菌的一般结构类似，由不同的糖和与 酰胺连接的b 一羟基一脂肪酸形成，但它们之间有一定的区别。目前已研究的 细胞壁多糖组分主要为葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖，阿拉伯糖。鼠李糖和 糖醛酸也在一些种类中被检测出，氨基糖类在很多单细胞种类中发现。有人从 钝顶螺旋藻细胞壁中分离并鉴定了一种同多糖，这是同多糖在蓝细菌细胞壁中 出现的唯一例子。该同多糖产率很低，不到细胞干重的1 ( v a n e y k e l e n b u r g ，1 9 7 8 ) 。在对柱孢鱼腥藻、多变鱼腥藻的营养细胞、异形胞和厚 壁袍子的细胞壁中的多糖类物质的研究中发现柱孢鱼腥藻异形胞和厚壁袍子 细胞壁聚糖的主要成分为葡萄搪，但在营养细胞的细胞壁中甘露糖是其主要成 分。柱孢鱼腥藻异形胞和厚壁孢子外被多糖的结构是一致的，其骨架结构由甘 三株蓝细茁菌株胞外多糖研究和菌种鉴定 露糖和葡萄糖以b ( 1 一：j ) 键连接，比例为1 ：3 ，甘露糖、葡萄糖、半乳糖和 木糖出现在侧链末端位置上。 许多蓝细菌菌株在染色之后可看到在其膜外有类似多糖的包埋物，不同的 菌株包埋物的厚度、粘稠度及外观上都有所不同。这些结构可分为三种类型， 分别为鞘、荚膜、粘质多糖( 图1 ) 。鞘是一层较薄的电子致密层，松散地围绕 在细胞及细胞团的周围，在光学显微镜下不用染色也能看到；荚膜较厚，粘度 较大，与细胞紧密结合，轮廓光滑，与颗粒外泌有关；粘质多糖指弥散在微生 物周围的粘性物质，不能够反映细胞形态。 对蓝细菌细胞外多糖的研究很多是以鞘多糖为材料进行的。在蓝细菌的鞘多 糖中，葡萄糖、半乳糖和甘露糖是最常见的单糖组分，阿拉伯糖、木糖、鼠李 糖和糖醛酸也是常见的组分。如在微小色球藻中鉴定出了葡萄糖和四种o 一甲基 取代的糖。柱孢鱼腥藻的鞘含有大量的糖，几乎占鞘总重量的全部。尽管其单 糖残基种类与细胞壁的相同但其比例不同。 对蓝细菌荚膜和粘质多糖的研究较少。已知多种念珠藻能产生粘性的荚膜 和粘质。上述念珠藻除了能产生细胞多糖外，也能产生荚膜多糖。由于其中的 糖类与多肽是联合在一起的，因此被认为是蛋白聚糖，但糖肽连接的确切性质 还不清楚。其糖组分为葡萄糖、半乳糖、木糖、墨角藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、 鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，但这些单糖的比例在不同菌株中有所不同。 有人对钝顶螺旋藻水溶性多糖进行了系列研究，发现这种多糖的主要组分为甘 露糖、葡萄糖、半乳糖和葡糖醛酸。还有人也报道了钝顶螺旋藻多糖的组分， 所报道的多糖则含有阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡糖醛酸。 4 i l i q ：多其它微生物一样，蓝细菌能产生大量的胞外粘质类物质，在性质上 它们主要为多糖类。其实，这些多糖是由蓝细菌胞外的鞘、荚膜和粘质多糖中 的部分多糖以水溶物的形式施放到周围环境中的，水溶性胞外多糖( e p s ) 很容 易从培养基中分离出来，因此在工业应用中具有很大优势。 三株蓝细菌苗株胞外多糖研究和菌种鉴定 图1 图1 ：鞘、荚膜、粘液形态对照 a ：c h r o o c o c c u ss p ( 左) ，只h o _ r m l c 1 u ms p ( 右) 的鞘 b ：c v a n o t h e c ec e4 ( 左) ，n o s t o cs p ( 右) 的荚膜 c ：c y a n oz h e c ep c c 9 2 2 4 ( 左) ，n o s t o cp c c 7 9 0 6 ( 右) 的粘液 4 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种签定 1 2 蓝细菌胞外多糖的生理功能 蓝细菌胞外多糖对于蓝细菌来说具有重要的生理功能。主要可以分为以下 几个方面具体阐述。 第一，抵抗二f 旱。现在推测，微生物包括蓝细菌所产的胞外多糖在保护微 生物免受所处极端环境对它们可能造成的危害的过程中起到重要的作用。目 前，很多关于产胞外多糖的蓝细菌有在沙漠或盐湖环境中对抗干旱的能力。例 如对耐盐菌株n o s t o cc o l f l f f l u n e 的研究表明：它分泌的胞外多糖为该菌株在干 旱地区的生存建立了一个储水库，在细胞和周围环境之问起到重要的缓冲作用 ( h i l le ta ，1 9 9 4 ) 。在随后的对c o f f # i i u t cs p c i f e n 所产胞外多糖进行的 研究中发现：如果将该菌所产的胞外多糖加入到人造膜中，可以防i t 人造膜熔 化，而细胞膜熔化是细胞在干旱随之重新水化过程中所面临的最严重的损害。 该作者从而推断胞外多糖是在细胞面临干旱的时候保持细胞正常状态的稳定 剂。对许多株分离自沙漠的蓝细菌释放的胞外多糖的研究表明：胞外多糖在维 持干旱条件下的细胞表面的湿润起到了重要的作用。因为在这些干旱环境中， 连续几个月微生物所能得到的水源只有早上的露水( c o s t e r t e ne ta ，1 9 8 1 ) 。 第二，提高吸收光能的能力。蓝细菌的能量来自于光能，但深海蓝细菌因 为所处的环境使其在接受光i i i i 过程中受到海水中悬浮颗粒的影响，而蓝细菌 所分泌的胞外多糖可以黏着：悬浮颗粒，增加光在海水中的通透性，从而增强自 身i 吸收光能的能力。 笫三，胞外多糖还可能具有的一个作用就是保护固氮酶免受氧气的侵害。 固氮酶是一种需要严格厌氧环境的酶，在氧气存在的条件下，该酶就会失去活 性。而胞外多糖可以在细胞和大气之问形成隔膜，从而保护固氮酶不与大气中 的氧气直接接触。 4 笫四，其他功能。有些研究还表明，胞外多糖可以作为铁离子和钙离子螯 合剂，而铁离子和钙离予对于固氮酶活力是极其重要的。另有几项研究表明， 大多数蓝细菌胞外多糖都带有负电荷，而负电荷在隔离或者固定金属离子方面 是非常重要的，金属离子的隔离和固定对细菌的生长有很大的影响作用。特别 是蓝细菌# c r o ( y sz i sf j o s - a q u a es p c 3 4 0 ，它生长= 在碱性环境中，包裹在 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种鉴定 其细胞周围的胞外多糖在它的营养摄取方面起到了重要的作用。它可以促进铁 离子和镁离子的积累。这两种离子在碱性水环境中溶解度较小，但是他们对细 胞的生长极其重要。 保护蓝细菌免于被捕食。关于5 0 s t o d 生态学的综述指出：围绕在细胞周 围的粘液可以使产胞外多糖微生物相对于其他不产胞外多糖的微生物免于受 到捕食。 对于与高等植物共生的蓝细菌来说，它们的胞外多糖可以使它们黏附与 植物的表面( b a r o ra n ds h i l o ，1 9 8 8 ) 。例如：蓝细菌a n a b a e n aa z o l l a e 释 放的胞外多糖对于它黏附与宿主植物a z o l l af i l i c u l o i d e s 的表面有很重要 的作用。最近，有人证明：n o s t o c 菌株纤维状菌丝体之所以能够紧密粘贴于 小麦的根部，就是因为它周围围绕的大量的多糖矩阵( c o s t e r t o ne t a ，1 9 8 7 ： w h i t e f i e l d ，1 9 8 8 ) 。 从上面所叙述的研究，我们可以得到以下结论：蓝细菌胞外多糖可能担负 了蓝细菌的多项生理功能。而这些功能因菌株的不同，自然栖息环境物理及化 学性质的不同而有所差别。 1 3 蓝细菌胞外多糖的化学组成及性质 资料显示，到目前为止，有7 0 株蓝细菌分泌的胞外多糖得到研究，大部 分工作是关于胞外多糖的组成研究。所研究的蓝细菌都属于i 、i i i 、i v 类( 表 1 卜1 3 ) ，还未见到有关第1 i 类群蓝细菌产胞外多糖的报道。 总的来说，在蓝细菌胞外多糖组成中只发现了l o 种不同的单糖。有葡萄糖、 戊糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、脱氧己糖、酸性葡糖醛己 糖、葡糖醛酸。然而只有1 株c h r o o c c c u s 菌株、l 株6 1 0 e o t h e c 滴株、2 t i s y n e c h o c u c c u s j 菌株所产胞外多糖的确切组成成分得以测定。在胞外多糖中出 现频率最高的是葡萄糖，随后是半乳糖、甘露糖、鼠李糖。在绝大多数胞外多 糖中，葡萄糖是含量最丰富的单糖，但也有一些多糖中，其它单糖如半乳糖、 岩藻糖的含量高于葡萄糖，只有少量的多糖中含有核糖。在所有研究过的多糖 中都发现具有酸性的糖，当鉴定糖醛酸时，只发现了葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。 三株蓝细菌苗株胞外多糖研究和菌种鉴定 大约有一半的多糖中同时含有以上两种物质。 从蓝细菌多糖的单糖组成中可以得到蓝细菌多糖与其它微生物多糖的一 些不同性质： ( 1 ) 绝大多数蓝细菌多糖具有阴离子特性，其中许多都含有两种不同的 糖醛酸，其它种类的微生物很少具有这种特性。 ( 2 ) 蓝细菌多糖经常发现有一种或两种戊糖，这也是其它原核生物中一般 所缺少的。 ( 3 ) 大多数蓝细菌胞外多糖结构非常复杂，由6 种以上的单糖组成，这是与 其它种类的显著区别，其它微生物的单糖种类在4 种以下，有人认为这是因为 蓝细菌在进化上属于较低位罱。在多糖中出现的大量单糖及其不同的连接类 型，形成非常复杂的重复单位及较大范围的结构域。 关于生长条件是否能够对多糖的组成产生影响也有少量的研究。多糖组成 在不同批次培养时是否有变化，这一点在工业生产中是十分重要的。报道表明 多糖组成在细胞生长过程中会发生变化：两株s y n e c h o c y s t i 硝i 株的多糖分子 量会改变，其中一株当培养时间延长后，会产生一种不同类型的多糖； s p i r u l i n a p l a t e n s i sp c c 8 d 5 在培养后期，其多糖中半乳糖的含量有少许减 少。在另一方面，c y a n o s p i r ac a p s u a t a 在其生长的整个阶段以及在不同的生 长条件下，其胞外多糖的单糖组成都很稳定，从细胞生长不同阶段取样测定其 多糖组成，结果都相同。而且不同的光照条件对单糖组成或单糖形成的结构单 位没有影响。c a p s u j a t e 经过1 0 年的培养，合成的胞外多糖仍然相同。以 上结果表明该菌在产胞外多糖方面是很稳定的。这些特点使其极易在工业生产 中得以应用。许多其它种类微生物在自然生长下能产生胞外多糖，而在实验室 条件下就丧失了这种特性。 此外，多糖水解条件对单糖的测定有很大的影响。特别是糖醛酸对测定结 果影响较大，随着羧基的出现，使得单糖之间的糖苷键很稳定，在水解时就有 可能不完全；或者在水解较为彻底时，糖醛酸会降解或内酯化。这样，鉴定糖 醛酸只能是通过一种特殊的比色方法来进行。而且，其它糖类在强酸下会降解， 因此对每一种多糖都要有合适的水解条件进行处理。 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种鉴定 a n a c y s t i s n i d u l a n sk 1 c h r o o c o c c u s5 14 695 1 9 11 061 0 0 一 i 0 7 28 m l n u t u sb 4 17 9 c y a n o t h e c es p 9 22 01 4t r 1 0 c y a n o t h e c es p 0 4 03t r 13 1 005 c e 4 c v a n o t h e c es p 一 1 10 3280 71 0 0 9 c e9 c y a n o t h e c es p 一 3 11406l0 c h1 +一2 5 c v a n o t h e c es p 5 81 51 4130 81 0 0 133 十十 59 e t2 c y a n o t h e c es p 2 12231 1810 e t5 c y a n o t h e c es p 一1 50 10 32 31 0 0 39 一+ i r2 0 c v a n o t h q c es p 02060 10 2l20 35 9 一+ + p c c8 8 0 l c v a n o t h e c es p p e1 3 3 81 1 1 00 9 1 0 c v a n o t h e c es p 6 1 0 22 210 3010 7 p e1 4 8 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种鉴定 c v a n o t h e c es p 一 3 1l _ 2050 4l003 + t i4 c v a n o t h e c es p 041 22 910 t p5 c y a n o t h e c es p 182l06011 0 1 5 +十 t p1 0 c v a n o t h e c es p i50120 0 510 1 8 + v i 1 3 c v a n o t h e c es p 一l80 2281 01 0 2 9 一十 v i 2 2 c v a n o t h e c es pl6246 84 8 6 s o m 2 1 6 s o m 2 甜0 0 0 t h e c es d p c c6 9 0 9 m i c i o c v s t i s + a e i f l g i n o s ak 3 a g i c r o c v s f i s 122 0 + 804l0 一 1 0 + 2 616 一+ 1 0 +20 10l03o3 0 2 8 s w t e c l o c v sc i s5 52 、6 03 4 8382 8 35 s di c c6 7 1 4 s v n e c h o c v s t i s 一 6010673936 s dp c c6 8 0 3 4 3 + 0 9 三堡望塑堕堕壁丝丛兰塑堑壅塑堕翌竺塞 l y n g b y a t rt r 1 784 023 5t rtr c o n f e r v o i d e s m i c r o c o j e u s 一+ s p ( 2 s t r a i n s ) o s c i l l a t o r i at rt r 1 6 03 3 02 1 74 5 1 2 3 a m p h i b i a n o s c i l l a t o r i a5 1l _ 71 50 2 961 5 63 440 c o r a l l i n a ec j l p h o r m i d i u # 7 e c t o c a r p ic 8 6 3 13 472 32” 一80 p h o r m i d i u mt rt r1 2 6 3 66i 0 91 873 e c t o c a r p ik 5 p h o r m i d i u mt r t r415 9 1872 7 6 5 c c t o c a r p im e 5 p h o r m i d i 一tr4 15 21 1 52 e c t o c a r p in 1 8 2 t r p h o r m i d i u m 0 60 53 44 301 5 3155 5 f o v e o l o r o m c 5 2 p h o r m i d i u m1 7702 8 23 77 1 2 02 8 38 f o v e o a r u m m e u p h o r m i d i u m 一0 93 4 83 3 61 1 2t r 1 1 m i n u r u md 5 p h o r m i d i u m1 86074 1 9 11 27 m i n u t u mr t 6 2 0 p h o r m i d i u m2 1t r1 3 44 9 271 6 77 4 s p c c a p l 4 6 3 4 p h o r m i d i u m252 11 2 9 3 032 2 035t r1 3 6 s p p h g 9 l 3 8 6 6 7 2 4 2 2 9 9 2 8 7 1 89 2 87 2 9 4 05 1 7 1 2 0 1 1 3 o 0 三壁堕塑堕堕堡丝丛兰塑竺塑翌堕盐鉴星 表1 3 ：第1 v 、v 类蓝细菌胞外多糖的单糖组成 类群i v ， a n a b a e n a10 1 05 0 1 0 4 0 10 c v l i n d r i c a a n a b a e n a 订o s - a q u a ea 3 7 a n a b a e n as pc 5 c v a n o s p i m c a p s l f i a t e a t c c 4 3 1 9 2 类群v 一 + 1 0l0 m a s t i g o c l a d u s 十+十 8 8 0 + 1 o lo 3 03 9 0 一 l0 5 1 5 2 0 附注：表1 、2 、3 中a r a = a r a b in o s e ( 阿拉们糖) f u c = f u c o s e ( 岩藻糖) g a l = g a l a c t o s e ( 半乳 糖) g l c = g l t l c o s e ( 葡萄糖) m a n - m a n n o s e ( 露糖) r h a = r h a m n o s e ( 鼠李糖) r i b = r i b o s e ( 核糖) x y l = x y l o s e ( 木糖) g a l a = g a l a c t u r o n i ca c i d ( 半乳糖醛酸) ，g i c a = g l u c u r o n i ca c i d ( 葡萄糖醛酸) u r a = i l r or l i ca c i d ( n o ti d e n t i f i e d ) ( 糖醛睃) 十= p e e s e n t ( n o tq u a n t i f ie d ) ( 存在，未定量) = a b s e n t ( 不存竹：) ，t i = t r a c e ( 痕越) 1 4 胞外多糖的释放和产多糖的影响因子 通常，释放多糖的蓝细菌的特征是细胞或细胞团被荚膜或粘液包裹。因此， 释放多糖被认为是起源于这些外层物质中的可溶性部分。有些数据似乎支持这 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种鉴定 种观点：一些a f o s - a q u a e 菌株，p h o r m d j u m 菌株，c a p s u j a t a 菌株， 荚膜及释放多糖具有相同的单糖成分；在c a p s u a t a 中，两种多糖都有相 同的分子量。 从形态上看，ec a p s u a t a 及c y a n o t h e c e1 6 s o m 2 菌株尽管在生长过程 中有大量的多糖释放到周围的培养基中，但英膜的厚度基本保持不变。因此， 有可能多糖的释放及合成是以同样的速率进行的。相反，p o r p h y r i d u m 及 r h o d e i i a 表现出了完全不同的特性，随着培养时间的延长，荚膜的厚度不断 增加。 n o s t o cs p 2 s 9 b 的粘液鞘主要是在蓝细菌生长周期中的无性时代，当连锁 体解体时，其中的物质被释放，只剩下空壳。在任何情况下，除了释放多糖的 起源外，在多糖的释放方面，迄今为止报道的菌株没有一个相同的方式。 在一h a l o p h y t i c a , sp j a t e n s i s 和ec a p s u a t a 菌株中，多糖的产生与 生物量的累积成平等关系，因此释放多糖被认为是一个初级代谢物。在另一方 面，爿r o s a a q u a a 3 7 及爿c y i n d r c ai o c 释放多糖的产生发生在整个生 长期，但最高的产生速率是在对数生长后期，或稳定期。相反，在n o s t o 滴株 中，多糖合成及释放的最高速率在培养前期出现。所有这些发现指出对每种菌 株都应当仔细研究，以便找到最佳培养条件及多糖产生条件。目前，可以得到 的许多数据只是在小规模培养条件下进行了测定，结果显示，除了c a p s u a 妇 及一些c y a n o t h e c e 菌株，几乎所有菌株的多糖产率都很低。c a p s u j a a 在 一个露天的池子中培养后，产率达1 1 6 m g l ：在发酵罐中可达到1 4 4 m g l ，与 其它产多糖光合微生物具有很强的可比性。产量低于一些其它一些微生物产胞 外多糖的缺点可以由光合微生物的一些优势来弥补：( 1 ) 它们可以利用再生的 廉价物质，可行光合作用，并且其中多种可固氮；( 2 ) 许多种类可在咸水或废 水中生长；( 3 ) 可以把c 0 2 作为碳源；( 4 ) 可同时产生多种有效成分。 1 5 蓝细菌胞外多糖的特性及可能的用途 前面已提到过的大多数蓝细菌，它们所具有的理化性质，结构特性，流变 学特性方面已经有一些研究。但是这方面的数据不多，因此要预测其潜在用途 三株蓝纠菌菌株胞外多糖研究和菌种箍定 较为困难。 对多糖性质影响大的因素之一是其分子量，它必须有较高的分子量。通过 对7 种细菌多糖的分子量进行测定，其中有5 种超过了1 0 0 0k d a 最高分子量在 1 4 d - - 2 8 0 0 k d a ，这依赖于不同的分析方法。 另一个影响因素是多糖中的多肽组份或者是其它非糖成分，如有机或无机 组分，对这些非糖成分的研究刁开始进行。在几乎所有研究过的多糖中都存在 蛋白质，但只有c a p s u l a t a 及n c a l e i c o l 硝i 株的氨基酸成分得以测定；其 它只测定了蛋白含量。在口c a p s u a a 菌株中，富含c l y ，a l a ，v a l ，l e u ，i l e ， p h e 在c a l c i c o l a 菌株多糖中的蛋白质也存在上述几种氨基酸，这些氨基酸 与大分子的疏水性有很大的关系。 前面已提到过，多糖的化学组成及其物理特性之间的联系都存在一定的不 确定性，这是因为缺少大分子的二、三级结构。尽管如此，还是能预测一些功 能的。例如：当大分子出现乙酰基团以及一些脱氧糖如岩藻糖和鼠李糖时，多 糖分子具有乳化特性，也有报道乙酰基团会阻止阳离子结合，或凝胶的形成， 但会刺激凝胶的膨胀。而且乙酰基团会使多糖分子稳定。 含有高浓度：带电成分的多糖在金属离子存在时会形成稳定的凝胶，并且极 有希望作为污水中有毒金属的去除剂。但仅靠带电基团的数量并不能预测其吸 附离子有能力，因为有些带电基团在大分子高级结构中无法接近金属离子，离 子的吸收依赖于多糖的电荷数量及电荷分配。金属结合能力可通过测定阴离子 密度来估计。大分子中的带电基团特别是硫酸根，在对颗粒絮凝时起关键作用。 ；特电基团对多糖的疏水性有显著影l i l 自，可提高大分子对水分子的结合能力，结 果水溶液的粘度会增加。另一方面，微生物多糖由于分子中酸性基团的出现使 其保水力增强。以上试验数据对预测多糖的特性时显得不足。 总之，蓝细菌多糖在医药，食品，石油工业以及在环境治理中的用途主要 可分为以下几个方面： 一、蓝细菌多糖的生物活性应用 有人对钝顶螺旋藻水溶性多糖的生物活性进行了研究，发现它具有提高核 酸内切酸活性、促进d n a 修复合成、抗辐射等方面的作用。对极大螺旋藻多糖 三株蓝细菌苗株胞外多耱研究和菌种鉴定 的抗氧化特性进行的研究发现其具有显著的清除自由基的活性，但对超氧阴自 由基没有显著作用；在低浓度( 2 5 x 1 0 4 9 l ) 下，它们可以清除脂质自由基，但 在较高浓度下清除脂自由基的活性有所下降。p a t t e r s o n 等( 1 9 9 3 ) 对大约6 0 0 株( 3 0 0 种) 蓝细菌的提取物进行了抗病毒活性的筛选，发现其中很多具有抗h i v 活性的物质是硫脂类或多糖类。多种念珠藻的胞外产物及细胞提取物有广谱的 抗菌作用。h o r i 等( 1 9 9 4 ) 报道地木耳及其纤维状物质具有明显的降低大鼠胆固 醇的作用，这种纤维状物质应为多糖类，但这种“食用纤维”的具体成分还不 清楚。目前，还发现某些蓝细菌胞外多糖具有抑制癌细胞和免疫增强作用。以 上事实说明，蓝细菌多糖具有潜在的生物活性应用价值，但有关方面的研究还 需大力加强。 二、蓝细菌多糖的流变学特性应用 蓝细菌多糖的流变学特性应用主要体现在絮凝剂，乳化剂的应用。随着工 业的发展，对具有不同工业用途的天然聚合物的需求不断增加，同时一些具有 高粘度的微生物多糖如黄原胶( x a n t h a n ) 在工业上的成功，使得人们对从细菌 中获得多糖类聚合物尤其是胞外多糖有了持续的兴趣。 和其它微生物一样，许多蓝细菌能分泌大量的胞外多糖。这些多糖可以是 溶解在培养基中的或形成一胶层包被细胞，赋予培养液特殊的流变学特性。因 此，近年来蓝细菌多糖的研究逐步受到了重视，对单细胞的或丝状的、淡水的 或海生的蓝细菌都有研究。由于目前所研究的蓝细菌多糖的单糖组分有显著的 不同，具有很好的多样性。同时我们现在研究的蓝细菌种类又极为有限，因此 蓝细菌多糖的研究具有很大的空白需要填补。如果进行深入系统的研究，很有 可能发现在化学或流变学特性方面不同的多糖，以适应于不同的工业用途。 有关蓝细菌胞外多糖的流变性特性只是最近才开始研究，而且极不全面。 但已有事实表明，这些多糖拥有在工业上有应用价值的溶液特性。如蓝螺藻除 有荚膜围绕细胞外，还能产生大量的胞外多糖。这种胞外多糖在低浓度下就能 形成很高粘度的溶液其流变学特性的切力依赖性与黄原胶类似，其时间依赖又 与些豆科植物中的半乳甘露聚糖类似。由于其粘弹特性可与市场上的其它微 生物多糖相比，而且初步的技术试验表明该胞外多糖具有良好的悬浮和乳化特 4 三株蓝细菌菌株胞外多糖研究和菌种监定 性，因此具有很好的应用前景。在培养cc a p s u a t a 的过程中，培养液的粘 度逐渐增加，经过研究发现这主要是因为分泌到培养基中的胞外多糖引起的。 前面提到的席藻、环圈项圈藻、沙漠眉藻和集胞藻等的胞外多糖显示的的 絮凝和胶化能力，可望开发为在工业上有用的新产品，包括应用于水库中固体 物质的还原，改进干型土壤的持水能力和废水处理等方面。我们的结果表明， 几种念珠藻的多糖，包括细胞提取物和胞外多糖，都具有很高的粘度，可与琼 脂、褐藻酸和一些商用果胶、树胶相比。由于所选用的念珠藻都是可食用的种 类，因此有希望开发为食品工业上的悬浮剂、增稠剂等。 三、蓝细菌及其多糖在土壤改良及沙漠洽理中潜在的应用前景 蓝细菌和藻类通常被认为是水生的，但也有在土壤中生活的种类，它们是 土壤肥力的重要来源之一。在沙漠和贫瘠的土壤中，当其它生物难以生长时， 它们就显得更为重要。这主要是因为它们是自养生物，不需要外源有机碳，其 中的固氮蓝细菌还能固定空气中氮，而氮在沙漠中尤为缺乏。蓝细菌还能够在 干燥和极端温度环境中生存，有些种类能在高达7 0 的环境中积极生长，这使 得它们特别适宜于作为贫瘠环境尤其是沙漠中的初级拓荒者。有人调查在火山 爆发后的无生命地带，首先出现的生命是蓝细菌。有些蓝细菌能在高p 和盐度 条件下生长，而这又是沙漠土壤的另一特点。经过调查发现，在贫瘠的土壤中 成功的蓝细菌和藻类拓荒者有丰富的鞘或英膜状物。这说明蓝细菌胞外多糖在 蓝细菌在贫瘠土壤中的生长起了积极的作用。 如上所述，这些物质在性质上为多糖类，它们对土壤的从头形成可能是重 要的，因为它们能保持土壤湿润，而且由于具有很好的粘性，可以将土壤颗粒 累积在一起，防止水和风的侵蚀。这些物质还可以被异养微生物用作碳源和氮 源，为土壤的其它组分提供起始物质。例如在稻田中，当水分充足时，固氮蓝 细菌能迅速繁贿，为水稻的生长提供氮源。它们产生的大量胞外蛋白聚糖，可 以形成粘质或胶质，在旱季时固定水分。以这种方式保持的土壤水分可以被水 稻利用，这样在有些地区可以延长水稻的生长季节，使更多的植株成熟，从而