（植物学专业论文）两种不同演化地位蕨类植物卵发生及受精作用的研究.pdf

论文题目：两种不同演化地位蕨类植物卵发生及受精作用的研究 学科专业：植物学 学位申请人：代小菲 指导教师：曹建国副教授 王全喜教授 摘要 配子发生、受精作用是蕨类植物有性生殖的重要环节。本实验室首次在水蕨 ( c e r a t o p t e r i st h a l i c t r o i d e s ) 成熟卵细胞上方发现了一种新的交配结构受精 孔，它是精子进入卵细胞的通道，但受精孔在蕨类植物卵发生中是否普遍存在， 不同演化地位的蕨类植物卵发生是否相同尚未可知。本研究选用两种演化地位不 同的蕨类植物，即薄囊蕨纲水龙骨科的阔鳞瘤蕨( p h y m a t o s o r u sh a i n a n e n s i s ( n o o t ) s gl u ) 与原始薄囊蕨纲紫萁科的紫萁( o s m u n d a j a p o n i c at h u n b ) 为材料，通 过对它们卵发生的研究，探讨不同演化地位蕨类植物卵发生的差异，并对紫萁的 受精作用进行了初步研究，探讨了其受精作用的细胞学机制。本文对阐明不同演 化地位蕨类卵发生特点及其受精作用机制具有一定的科学意义，对揭示蕨类植物 有性生殖的演化规律也具有重要的参考价值。 本文的主要结果如下： 1 阔鳞瘤蕨和紫萁卵发生均经历了原始细胞、初生细胞、中央细胞、卵细胞 等发育阶段，其中卵细胞的发育时期最为复杂。 2 阔鳞瘤蕨在卵发生过程中，首先是腹沟细胞与卵细胞分离，产生了分离腔， 但两细胞仍通过孔区相连，孔区位于卵细胞上表面的侧方，直径约为2 5 1 皿n ，孔 区处胞间连丝发达。腹沟细胞可能具有一定的自噬作用，它通过孔区将卵细胞内 的物质吸入腹沟细胞或分离腔内，使卵细胞内的膜物质无法在孔区沉积，受精孔 形成，其上方无卵膜覆盖。成熟卵细胞内质体退化，线粒体发达，细胞核产生大 量的核外突。 3 在紫萁颈卵器发育早期即可见其壁细胞的液泡内有嗜锇性颗粒，这些嗜锇 颗粒随着卵的发育逐渐增多。在卵发生过程中，腹沟细胞与卵细胞逐渐分离产生 了分离腔，成熟卵细胞质膜外侧形成了一层较薄的卵膜，在其上方并没有发现类 似受精孔的结构。但卵膜上方的侧面常见因其断裂而形成的缺口。成熟的卵细胞 内质体发达，含有多个淀粉粒，细胞核为规则的椭球形，无核外突产生。 4 紫萁进行受精时，卵细胞迅速收缩，精子的大部分细胞器进入卵细胞。精 子进入卵细胞后，在精卵的结合处会产生大的囊泡，它具有阻止其他精子进入卵 细胞的作用，从而避免多精受精。 关键词：蕨类植物；阔鳞瘤蕨；紫萁；卵发生；受精作用；受精孔 论文类型：理论研究 i l t h e s i st o p i c ：s t u d yo no o g e n e s i sa n df e r t i l i z a t i o ni nt w of e r n sw i t l ld i f f e r e m e v o l u t i o n a r ys t a t u s e s p r o f e s s i o n a ld i s c i p l i n e s ：b o t a n y d e g r e ea p p l i c a n t ：d a ix i a o f e i i n s t r u c t o r ：a s s o p r o f c a oj i a n g u o p r o f w a n gq u a n x i a b s r a c t g a m e t o g e n e s i sa n df e r t i l i z a t i o na r et w op r i n c i p a le v e n t sd u r i n gt h es e x u a l r e p r o d u c t i o np r o c e s so ff e r n s o u rl a bf i n d san e wm a t i n gs t r u c t u r e ，i e t h e f e r t i l i z a t i o np o r e ，i nt h em a t u r ee g gc e l lo fc e r a t o p t e r i st h a l i c t r o i d e s i ti sag a t e w a y t h r o u g hw h i c ht h es p e r me n t e r st h ee g gc e l l h o w e v e r , i ti ss t i l ln o tc l e a rw h e t h e rt h e f e r t i l i z a t i o np o r ee x i s t su n i v e r s a l l yi nf e r n so rw h e t h e ro o g e n e s i so ff e r n s 、析廿1 d i f f e r e n te v o l u t i o n a r ys t a t u s e si st h es a m ei ns e x u a lr e p r o d u c t i o n t w of e r n sw i t l l d i f f e r e n te v o l u t i o n a r ys t a t u s e s a r e c h o s e n ，t h e ya r ep h y m a t o s o r u sh a i n a n e n s i s ( p o l y p o d i a c e a e ) a n do s m u n d aj a p o n i c a ( o s m u n d a c e a e ) t h es t u d i e ss h o wag r e a t d i f f e r e n c eo no o g e n e s i si nt h et w ok i n d so ff e r n s b e s i d e s ，i tc o n d u c t sap r i m a r ys t u d y i n t ot h ef e r t i l i z a t i o no ft h ef e mo s m u n d a j a p o n i c a t h i ss t u d yh a ss o m es c i e n t i f i c s i g n i f i c a n c ei ne x p l a i n i n gt h eo o g e n e s i sf e a t u r e sa n df e r t i l i z a t i o nm e c h a n i s m so ft h e f e r n sw i t hd i f f e r e n te v o l u t i o n a r ys t a t u s e s m o r e o v e r , i th a ss o m ei m p o r t a n tv a l u ei n r e v e a l i n gt h ee v o l u t i o no ft h ef e ms e x u a lr e p r o d u c t i o n t h em a j o rc o n t e n t sa n dr e s u l t so ft h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ： 1 t h eo o g e n e s i sp r o c e s so fp h y m a t o s o r u sh a i n a n e n s i sa n do s m u n d a j a p o n i c a u n d e r g o e ss t a g e so fi n i t i a lc e l l ，p r i m a r yc e l l ，c e n t r a lc e l la n de g gc e l ld e v e l o p m e n t ， a m o n gw h i c ht h ee g gd e v e l o p m e n ti st h ek e ys t a g ei no o g e n e s i s 2 d u r i n go o g e n e s i so fp h y m a t o s o r u sh a i n a n e n s i s ，t h ev e n t r a lc a n a lc e l la n d t h e e g gc e l la r es e p a r a t e d ，w h i c hr e s u l t si nt h ef o r m a t i o no fas e p a r a t i o nc a v i t y t h et w o c e l l sa r e ，h o w e v e r , c o n n e c t e db yap o r er e g i o nw h i c hi sl o c a t e di nt h es i d eo ft h eu p p e r s u r f a c eo ft h ee g g t h ed i a m e t e ro ft h e p o r er e g i o n i sa b o u t2 5 u r n ，w h e r e i i i p l a s m o d e s m a t ad e v e l o p e dw e l l t h ev e n t r a l c e l l m a ye x p e r i e n c e ap r o c e s so f a u t o p h a g y i tm a ya b s o r bm a t e r i a l si nt h ee g gj u s tb e h i n dt h ep o r er e g i o ni n t oi t s e l fo r t h es e p a r a t i o nc a v i t y , w h i c hr e s u l t si nn od e p o s i t i o no ft h ee g gm e m b r a n eo nt h ep o r e r e g i o n w i t ht h eh e l po ft h ev e n t r a lc e l l ，af e r t i l i z a t i o np o r ei sf o r m e di nt h ep o r e r e g i o n i nt h em a t u r ee g g ，p l a s t i d sa r ed e g e n e r a t e da n dt h em i t o c h o n d r i ab e c o m ew e l l d e v e l o p e d t h en u c l e u sp r o d u c e sn u m e r o u sn u c l e a re v a g i n a t i o n s 3 i nt h ee a r l ys t a g eo ft h ea r c h e g o n i ad e v e l o p m e n to fo s m u n d aj a p o n i c a ，t h e o s m i o p h i l i cm a t e r i a l so c c u ri nt h ev a c u o l e so f t h ej a c k e tc e l l so ft h ea r c h e g o n i u m ，a n d t h e s em a t e r i a l si n c r e a s ew i t l lt h e d e v e l o p m e n to ft h ee g g d u r i n go o g e n i s i s ，a s e p a r a t i o nc a v i t yi sf o r m e d b e t w e e nt h ee g ga n dt h ev e n t r a lc a n a lc e l l at h i ne x t r ae g g m e m b r a n ei sf o r m e do u t s i d et h ep l a s m a l e m m aw h e nt h ee g gm a t u r e s a tt h es i d eo f t h eu p p e rs u r f a c eo ft h em a t u r ee g g ，a ni n d e n t a t i o no ft h ee g gm e m b r a n ei so f t e ns e e n t h ei n d e n t a t i o nm a yb ef o r m e db yt h eb r e a k d o w no ft h ee g gm e m b r a n e h o w e v e r , a c e r t a i nf e r t i l i z a t i o np o r ei sn o td i s c o v e r e di nt h em a t u r ee g go fo s m u n d a j a p o n i c a t h e p l a s t i d si n s i d et h em a t u r ee g gb e c o m ew e l ld e v e l o p e da n df i l l e d 、析t hs t a r c hg r a i n s t h en u c l e u si se l l i p s o i d a la n dn on u c l e a re v a g i n a t i o n sf o r m e d 4 t h ee g go fo s m u n d a j a p o n i c as h r i n k so b v i o u s l ya tf e r t i l i z a t i o n m o s to ft h e o r g a n e l l e so ft h es p e r m a t o z o i de n t e rt h ee g gc e l l al a r g ev e s i c l ei sf o r m e da tt h ej o i n t r e g i o no ft h es p e r m a t o z o i da n dt h ee g g t h ev e s i c l ec a np r e v e n to t h e rs p e r m se n t e r t h ee g g ，a n da v o i dp o l y s p e r m y k e yw o r d s ：f e r n s ；p h y m a t o s o r u sh a i n a n e n s i s ；o s m u n d aj a p o n i c a ；o o g e n e s i s ； f e r t i l i z a t i o n ；f e r t i l i z a t i o np o r e t h e s i st y p e ：t h e o r e t i c a ls t u d y i v a b a r b c c c c p c s e e m e r f f e f p g i c j b m m l s m n c m t r n n c c n e n e v n s n u s o c 附属微管带 颈卵器 基部细胞 中央细胞 细胞板 染色体 卵细胞 卵膜 内质网 鞭毛 受精卵 受精孔 高尔基体 原始细胞 颈部壁细胞 线粒体 多层结构 单核颈沟细胞 微管带 细胞核 颈沟细胞 卵核 核外突 精核 核仁 嗜锇冠 名词缩写表 a c c e s s o r yb a n do fm i c r o t u b u l e s a r c h e g o n i u m b a s a lc e l l c e n t r a lc e l l c e l lp l a t e c h r o m o s o m e e g g e g gm e m b r a n e e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m f l a g e l l a f e r t i l i z e de g g f e r t i l i z a t i o np o r e g o l g ib o d y i i l i t i a lc e l l - j a c k e tc e l lo ft h en e c k m i t o c h o n d r i o n m u l t i l a y e r e ds t r u c t u r e m o n o n u c l e a t e dn e c kc a n a lc e l l m i c r o t u b u l a rr i b b o n n u c l e u s n e c kc a n a lc e l l n u c l e a ro fe g g n u c l e a re v a g i n a t i o n m a l en u c l e u s n u c l e o l u s o s m i o p h i l i cc r o w n v i i v l l i 嗜锇物质 质体 初生细胞 胞间连丝 质膜 孔区 分离腔 精子 顶部细胞 毛状体 液泡 营养细胞 腹沟细胞 同心圆膜囊泡 囊泡 内质网囊泡 嗜锇性囊泡 细胞壁 o s m i o p h i l i cm a t e r i a l p l a s t i d p r i m a r yc e l l p l a s m o d e s m a t a p l a s m a l e m m a p o r er e g i o n s e p a r a t i o nc a v i t y s p e r m a t o z o i d t o pc e l l t r i c h o m e v a c u o l e v e g e t a t i v ec e l l v e n t r a lc a n a lc e l l v e s i c l eo fc o n c e n t r i cm e m b r a n e v e s i c l e v e s i c l eo fe n d o p l a s m i cr e t i c u l u m v e s i c l ec o n t a i n i n gt h eo s m i o p h i l i cm a t e r i a l s c e l lw 甜l 叫 p 陀 m h 豫 蹄代 晡 v w 坝 w 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：氏嘶日期：p 幔叼 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 枷慨签拗强川 上海师范丈学硕上学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 蕨类植物生殖生物学研究概况 蕨类植物在植物界中处于演化的一个特殊位置，它既属于高等的孢子植物， 又属于低等的维管植物，是苔藓植物与种子植物之间的一个过渡类群，在植物进 化过程中有着承上启下的作用。地球上生存的蕨类植物约有1 2 0 0 0 多种，我国约 有2 6 0 0 种，占世界蕨类植物的1 6 7 ，是世界蕨类植物种类最丰富的区域之一。 作为地球上生物界的一员，蕨类植物对人类的生产和生活有着重要的贡献。蕨类 植物在药用、食用、环境指示、工业、农业、园艺等方面都具有一定的应用价值 ( 刘媛等，2 0 0 6 ) 。其中，阔鳞瘤蕨具有较高的观赏价值( 陆树刚和林尤兴，2 0 0 0 ) 。 紫萁既可食用又可药用，具有很高的经济价值( 徐皓，2 0 0 5 ) 。 蕨类植物的生活史是孢子体世代占优势的异型世代交替，孢子体和配子体均 可独立生活。孢子体体积较大，具有双套染色体，一般为多年生草本，具有根茎 叶的分化以及较为原始的维管组织。配子体微小，仅有几毫米，只含有单套的染 色体。由于肉眼较难观察到，常被研究者忽视。 自光学显微镜应用于生物学之后，蕨类植物的配子体世代才逐渐被人们所认 识。k a u l f u s s ( 1 8 2 7 ) 首次具体描述了蕨类植物原叶体的发育。l i n d s a y ( 1 9 7 4 ) 首次具体的描述了蕨类植物孢子的萌发。此后，人们开始对配子体的形态发育进 行了大量研究。其中，贡献较大的有s t o k e y 和n a y a r 。s t o k e y ( 1 9 4 0 ；1 9 4 2 ；1 9 4 5 ； 1 9 4 8 ；1 9 5 0 ；1 9 6 0 ) 研究了多个科属的配子体形态发育，n a y a r ( 1 9 7 1 ) 总结了 同型孢子真蕨类的配子体形态发育特征，并且在光镜水平上研究了精子器与颈卵 器的形成与发育。蕨类植物的有性生殖器官产生于配子体世代，其结构、位置及 分化，精子和卵细胞的形态、受精作用的过程，对蕨类植物各类群的系统分类具 有重要的意义( 吴兆洪和秦仁昌，1 9 9 1 ) 。但由于光镜分辨率和研究方法的限制， 蕨类植物生殖发育的研究进展缓慢。2 0 世纪3 0 年代，德国人e r u s k a 发明了透 射电镜( t e m ) ，人类的视野开始进入超微领域。不久，透射电镜技术开始应用 第一章文献综述上海师范大学硕上学位论文 于植物材料上，蕨类植物生殖生物学的超微结构工作才得以展开。 1 1 1 蕨类植物精子发生研究进展 在精子发生( s p e r m a t o g e n e s i s ) 方面，前人对蕨、问荆、苹等做了大量细致 的研究。首先是m a n t o n ( 1 9 5 9 ) 利用透射电镜技术对蕨类植物蕨( p t e r i d i u m a q u i l i n u m ) 精子进行了观察，他为后来学者对蕨类植物生殖生物学的研究提供了 基本的研究方法与基础资料。2 0 世纪6 0 年代以来，蕨类植物超微结构的研究得 到了广泛开展。d u c k e r 和b e l l ( 1 9 6 9 ) 研究了木贼属( e q u i s e t u m ) 3 个种精子 的多层结构，认为蕨类植物精子的多层结构由四层组成。b e l l ( 1 9 7 1 ；1 9 7 4 a ，b ； 1 9 7 6 ；1 9 7 8 ) 主要研究了蕨( p t e r i d i u ma q u i l i n u m ) 精子发生的超微结构，如蕨 精子多层结构的起源、多层结构的发生、微管在鞭毛发生中的作用、微管一核膜 复合体等。b e l l ( 1 9 8 7 ) 认为精细胞一般经历生毛体的发生、多层结构的发生、 核塑性以及鞭毛发生等阶段；最终发育成为一个具鞭毛的螺旋状精子。d u c k e r ( 1 9 7 3 ) 研究了木贼( e q u i s e t u mh y e m a l e ) 的精子发生，d u c k e t t 和b e l l ( 1 9 7 7 ) 研究了木贼( e q u i s e t u mh y e m a l e ) 成熟精子的超微结构，并绘制了相关示意图。 m y l e s 和b e l l ( 1 9 7 5 ) 对苹( m a r s i l e av e s t i t a ) 成熟精子的超微结构进行了详细 研究，m y l e s 和h e p l e r ( 1 9 7 7 ；1 9 8 2 ) 又报道了苹( m a r s i l e av e s t i t a ) 的精子发 生，他t f 禾f j 用秋水仙碱干预微管的组装来研究核变形的问题，并指出微管可能是 引导核变形的因素之一。r o b b i n s 等( 1 9 7 5 ；1 9 7 8 ) 对石松属( l y c o p o d i u m ) 的 精子发生过程中的一些超微结构进行了描述。k o t e n k o ( 1 9 9 0 ) 对球子蕨( o n o c l e a s e n s i b i l i s ) 的精子发生进行了详细研究，并提出了一些独特的见解。r e n z a g i l a 和d e n g a t e ( 1 9 9 8 ) 详细描述了卷柏属( s e r a g i n e l l a ) 成熟精子的超微结构，并 绘制了三维重构图。r e n z a g i l a 等( 1 9 9 9 ) 又对卷柏属( s e r a g i n e l l a ) 的精子发生 进行了描述。曹建国等( 2 0 0 3 a ，b ；2 0 0 5 ) 分别对桂皮紫萁( o s m u n d ac i n n a m o m e a v a t a s i a t i c a ) 和绵马鳞毛蕨( d r y o p t e r i sc r a s s i r h i z o m a ) 的精子发生以及成熟精 子的超微结构进行了详细的研究。曹建国( 2 0 0 9 a ，b ) 等对营专性无配子生殖的 傅氏凤尾蕨( p t e r i s f a u r i e ) 的精子发生以及成熟精子的超微结构进行了详细的报 道，并与其他蕨类植物的精子进行了比较。另外，蕨类工作者还对铁角蕨 2 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 ( a s p l e n i u m t r i c h o m a n e s ) ( g o r i ，19 9 7 ) 、对开蕨( p h y l l i t i ss c o l o p e n d r i u m ) ( m u c c i f o r a ，2 0 0 0 ) 、海金沙( l y g o d i u mj a p o n i c u m ) ( s a k a u s h i ，2 0 0 3 ) 等蕨类 植物的精子发生的超微观察进行了细致的研究。近些年，结合其他技术对蕨类植 物精子的研究有所增多。d o o n a n 等( 1 9 8 6 ) 以免疫荧光和电镜技术为手段对羽 叶里白( p l a t u y z o m a m i c t o p h y l l u m ) 生毛体发生进行了定位研究。v a u g h n 等( 1 9 9 3 ) 用免疫电镜技术证明了c e n t r i n 蛋白是蕨类植物多层结构的组分。h o f f m a n 等 ( 1 9 9 4 ) 指出生毛体是蕨类植物精细胞中的维管组织中心之一。h o f f m a n 和 v a u g h n ( 1 9 9 5 ) 研究了水蕨( c e r a t o p t e r sr i c h a r d i i ) 产精细胞翻译后微管蛋白的 修饰问题。总体而言，对蕨类植物精子发生过程的研究相对较多。 1 1 2 蕨类植物卵发生研究进展 颈卵器是蕨类植物的雌性生殖器官，通常产生于配子体生长点下方，外形似 烧瓶状，内含颈沟细胞、腹沟细胞和卵细胞。在蕨类植物卵发生( o o g e n e s i s ) 的 研究中，研究最早并且全面的是蕨( p t e r i d i u ma q u i l i n u m ) 的卵发生。b e l l ( 1 9 6 1 ) 用放射自显影法对蕨( p t e r i d i u ma q u i l i n u m ) 卵发生过程中的核质互作进行了研 究，认为在成熟卵的某一时期脱氧核糖核酸曾分散于整个卵细胞中。b e l l 与 m i a h l e t h a l e r ( 1 9 6 2 a ，b ) 对蕨( p t e r i d i u ma q u i l i n u m ) 卵发生过程中的细胞超微 结构变化进行了研究，他们发现在成熟卵细胞周围有一层特殊的膜，即卵膜。 c a v e 和b e l l ( 1 9 7 4 ) 用细胞化学的方法对卵膜的性质进行了分析，结果表明卵 膜是由脂类物质构成的，他们认为卵膜是由卵细胞自身所产生的。b e l l 与 m i i h l e t h a l e r ( 1 9 6 4 ) 发现线粒体在中央细胞阶段和幼卵阶段时相对退化，当卵细 胞产生核外突后，线粒体发育良好。他们认为，这些线粒体是由核外突发育而来 的。b e l l ( 1 9 7 2 ) 发现核外突与卵细胞的细胞核之间由一窄小的通道相连，他认 为，核外突并非是细胞核的不规则延伸，而是特别形成的，被膜上无核孔，不久， 核外突会与核脱离最终分化为线粒体。b e l l ( 1 9 8 3 ) 在蕨( p t e r 锄u ma q u i l i n u m ) 的核外突中观察到类似于核仁的物质，称为微核仁。他认为，微核仁产生于细胞 核并通过核外突最终释放于细胞质中，这可能与核质交流有密切关系。b e l l ( 1 9 7 6 ) 总结了蕨( p t e r i d i u ma q u i l i n u m ) 的卵发生经历了初生细胞阶段、中央 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 细胞阶段、幼卵阶段、发育卵阶段后最终发育为成熟的卵细胞。b e l l ( 1 9 7 4 ) 还 对欧洲鳞毛蕨( d r y o p t e r i s f i l i x - m a s ) 的卵发生进行了研究，他发现该种的卵细胞 在成熟过程中细胞核也会产生核外突，他认为膜上的电子暗物质是关于膜生长的 酶复合体。c a v e 和b e l l ( 1 9 7 5 ) 发现酰基转移酶的活性与核外突的膜结构相关， 证明了核外突结构并不是细胞核暂时性的延伸，而是由核膜局部生长而形成的。 b e l l ( 1 9 8 0 ) 对栗蕨( h i s t i o p t e r i si n c i s e s ) 卵发生过程中的核质互作也作了相关 报道。另外，b e l l ( 1 9 8 6 ) 对蕨类植物中一些原始种类如块茎蕨( t o d e ab a r b a r a ) 、 双扇蕨( d i p t e r i sc o n g u g a t a ) 、欧洲紫萁( o s m u n d ar e g a l i s ) 、观音坐莲( a n g i o p t e r i s e v e c t a ) 等的卵发生进行了研究，它们的卵在发育过程中始终含有丰富的淀粉粒， 并且不产生核外突。包文美等( 2 0 0 3 ) 对桂皮紫萁( o s m u n d ac i n n a m o m e av a r a s i a t i c a ) 的卵发生进行了详细的研究。杨耐英( 2 0 0 9 ) 等阐述了水蕨( c e r a t o p t e r i s t h a l i c t r o i d e s ) 颈卵器内细胞发育的特点。曹建国等( 2 0 0 8 ；2 0 0 9 ；2 0 1 0 b ) 详细 阐述了水蕨( c e r a t o p t e r i st h a l i c t r o i d e s ) 的卵发生过程，认为卵膜是由卵细胞内 嗜锇性的囊泡与内质网片层附着于质膜内表面形成的。他们在水蕨( c e r a t o p t e r i s t h a l i c t r o i d e s ) 成熟卵细胞卵膜上方首次发现了受精孔结构，并证明了该孔是精子 进入卵细胞的通道结构。他们还提出，腹沟细胞在受精孔的形成过程中发挥了重 要的作用。但不同演化地位蕨类是否都具有受精孔仍然未知。总体而言，蕨类植 物卵发生的研究相对较少，仍有许多问题值得研究。 1 1 3 蕨类植物受精作用研究进展 受精作用是指单倍体的精子与卵细胞的融合过程，它是单倍体世代向二倍体 世代转换的转折点，因此始终是生命科学研究的核，1 1 , 之一。但由于被子植物与人 类生活相对密切，人们的兴趣主要集中于对被子植物有性生殖的研究，而对蕨类 植物受精作用的研究并不多( 李兆亮等，1 9 9 5 ) 。 最早关于蕨类植物受精作用( f e r t i l i z a t i o n ) 的报道是对蕨( p t e r i d i u m a q u i l i n u m ) 的研究。b e l l 等报道了蕨( p t e r i d i u ma q u i l i n u m ) 受精作用后精核的 变化情况以及卵的一些特征( d u c k e t t 和b e l l ，1 9 7 1 ；d u c k e r 和b e l l ，1 9 7 2 ；b e l l ， 1 9 7 5 ) ，他们推测精子是通过打破卵膜惊厥性地进入卵细胞的( b e l l 和d u c k e t t ， 4 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 1 9 7 6 ) 。m y l e s ( 1 9 7 8 ) 对具异型孢子的蕨类植物苹( m a r s i l e av e s t i t a ) 的受精作 用进行了研究，阐述了精子入卵的方式以及精子入卵前后颈卵器的变化情况。 f a s c i a t i 等( 1 9 9 4 a ，b ) 研究了同型孢子蕨类植物蹄盖蕨( a t h y r i u m f i l i x - f e m i n a ) 的受精作用，他们认为在该种的卵细胞上方，存在一个精子接受位点，精子通过 此位点通过螺旋状旋转在卵膜上钻出一个孔后并通过该孔进入卵细胞的。s m i t h 和r e n z a g l i a ( 2 0 0 8 ) 描述了水蕨( c e r a t o p t e r i sr i c h a r d i i ) 的受精作用，重点阐述 了精子的结构及其动态性在受精过程中所起的作用。曹建国等( c a oe ta l ，2 0 0 9 ) 对水蕨( c e r a t o p t e r i st h a l i c t r o i d e s ) 受精作用进行了详细的研究，他们发现精子 通过成熟卵细胞上方的受精孔进入卵细胞，当精子进入卵细胞后，卵细胞内会产 生一些同心圆膜囊泡来封堵受精孔。曹建国等( c a oe ta l ，2 0 1 0 a ) 还对水蕨合予 的发育进行了研究，详细报道了水蕨精核与卵核的融合、精子细胞器的消化以及 细胞膜与细胞壁的重建等过程。 总的来说，自透射电镜技术应用于蕨类植物生殖生物学的四十年余年来，虽 然国内外学者已经做了许多工作，但涉及的种类并不多，研究内容也不够全面。 相对而言，人们对蕨类植物精子发生的研究较多，而对卵发生及受精作用的研究 较为薄弱，尤其对不同演化地位蕨类植物的卵发生与受精作用缺少详尽的研究。 蕨类植物生殖生物学的研究远落后于被子植物。 1 2 蕨类植物是研究生殖生物学的良好实验材料 蕨类植物配子体培养简单，一般情况下，孢子在普通的培养基上很容易生长 发育为原叶体。配子体世代生长速度比较快，在条件适宜的情况下，孢子一般 l 一2 月左右即可达到性成熟。配子体结构简单，精子器和颈卵器直接暴露在配子 体表面，可直接置于显微镜下进行活体观察研究。蕨类植物受精作用的发生可通 过控制精子器内精子的释放、颈卵器的开裂等方式来进行调控。 总之，蕨类植物是开展生殖生物学研究的良好实验材料。 1 3 阔鳞瘤蕨研究概况 阔鳞瘤蕨( p h y m a t o s o r u sh a i n a n e n s i s ( n o o t ) s gl u ) 隶属于真蕨亚门 5 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 ( f i l i c o p h y t i n a ) 薄囊蕨纲( l e p t o s p o r a n g i o p s i d a ) 水龙骨目( p o l y p o d i a l e s ) 水龙 骨科( p o l y p o d i a c e a e ) 瘤蕨属( p h y n a t o s o r u s ) ，石生或附生于树干上，叶片革质， 四季常青，是室内外造景的优良观赏植物( 陆树刚和林尤兴，2 0 0 0 ) 。 阔鳞瘤蕨是n o o t e b o o m ( 1 9 9 7 ) 发表的新种。不久，陆树刚对阔鳞瘤蕨进行 了分类学研究，将其归属于瘤蕨属( l u ，1 9 9 8 ) 。石雷对阔鳞瘤蕨的孢子形态进 行了研究，首次报道了阔鳞瘤蕨的孢子形态特征，为其新种的成立提供了有力证 据( 石雷，2 0 0 2 ) 。徐艳等对其配子体形态发育进行了报道( 徐艳，2 0 0 5 ) 。总的 来说，有关阔鳞瘤蕨的报道并不多，在生殖生物学方面尚属空白。 1 4 紫萁研究概况 紫萁( o s m u n d aj a p o n i c at h u n b ) 在秦仁昌分类系统中隶属于真蕨亚门 ( f i l i c o p h y t i n a ) 原始薄囊蕨纲( p r o t o l e p t o s p o r a n g i o p s i d a ) 紫萁目( o s m u n d a l e s ) 紫萁科( o s m u n d a c e a e ) 紫萁属( o s m u n d a ) ，为多年生的草本地生蕨类植物( 吴 兆洪和秦仁昌，1 9 9 1 ) 。紫萁别名高脚贯众，水骨菜，老虎台，老虎牙等，幼叶 又称薇菜，营养价值极高。可食用和药用，具有很高的经济价值( 戴金凤等，1 9 9 9 ； 徐皓，2 0 0 5 ) 。 由于紫萁具有较高的经济价值，又是蕨类植物演化的中间类群，因此广受瞩 目。学术界对紫萁的研究涉及生态学、营养学、医药学、人工引种栽培和产品加 工等多个领域( 何义发，2 0 0 2 ) 。但紫萁( o s m u n d aj a p o n i c at h u n b ) 孢子难以 保存，几天之后活性就会消失。当外界条件不适宜时，紫萁的原叶体可生长数年。 紫萁有性生殖对环境条件要求比较高，因此，在生殖生物学方面研究较少。b e l l ( 1 9 8 6 ) 曾报道过欧洲紫萁( o s m u n d ar e g a l i s ) 卵发生；包文美等( 2 0 0 3 ) 曾对 桂皮紫萁( o s m u n d ac i n n a m o m e av a t a s i a t i c a ) 的卵发生进行了的研究。总的来 说，关于紫萁卵发生的研究并不全面，受精作用的研究也没有报道。 1 5 本论文研究的目的意义 6 2 0 0 9 年本实验室通过对水蕨卵发生的研究，在水蕨的卵细胞上方发现 了一种新的结构受精孔，这是在蕨类植物卵细胞中的首次发现。通过 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 进一步的受精实验发现，它是精子进入卵细胞的通道，这对于揭示蕨类植 物的受精作用机理具有非常重要的意义，但不同演化地位蕨类是否都具有 受精孔仍值得迸一步研究，受精孔的细胞学发生机制以及生物学功能仍然 需要深入探讨。 受精是单倍体精子与卵子相互结合而启动新生命发育的过程，因此始 终是生命科学研究的核心之一，但关于蕨类植物受精作用的研究并不多。 2 0 0 9 年本实验室报道了水蕨受精时精子入卵的方式，但不同演化地位的蕨 类植物受精方式是否一致值得深入研究。另外，蕨类植物阻止多精受精的 机制尚不清楚，受精后精子细胞质的命运、精核与卵核的融合等系列事件 也缺少研究。本研究对于揭示蕨类植物的受精作用机理具有十分重要的科 学价值。 7 第二章材料与方法上海师范大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 实验材料 本研究选取的阔鳞瘤蕨( p h y m a t o s o r u sh a i n a n e n s i s ( n o o t ) s gl u ) 孢子采 自海南省尖峰岭鸣凤谷。 紫萁( o s m u n d a j a p o n i c at h u n b ) 孢子采自浙江省天目山。 2 2 实验方法 2 2 1 孢子的采集 阔鳞瘤蕨的孢子约在8 月左右成熟。孢子囊群在中脉两侧着生，成熟的孢子 呈黄色。将具有成熟孢子囊的叶片采下夹放于光滑洁净的白纸中，然后置于阴凉 通风处令孢子自然散落。约l o 天左右，白纸上可见自然散落的黄色孢子。将孢 子收集于硫酸纸袋中，置于4 冰箱备用。 紫萁孢子的生命力较弱，室温下几天就逐渐失去活性，掌握紫萁孢子的成熟 时期至关重要。紫萁孢子成熟于4 月中下旬。孢子囊群密集，着生于孢子羽片的 叶缘上，成熟的孢子呈绿色。采集时，将具成熟孢子囊群的孢子羽叶轻放于光滑 洁净的白纸中，轻轻抖动白纸，白纸上就会撒满绿色的孢子。将孢子收集入干燥 的硫酸纸袋中，置于4 冰箱备用，但仍需尽快接种。 2 2 2 配子体培养 接种前需将培养基和接种器械高温灭菌，接种过程在超净工作台上进行，接 种采用的培养基为改良的k n o p s 固体培养基，琼脂浓度为1 5 。灭菌好的培养 基倒入直径为6 c m 的培养皿中冷却后使用。 将阔鳞瘤蕨成熟孢子置于1 0 m l 的离心管内，用无菌水浸润2 4 h 后离心弃上 8 上海师范人学硕士学位论文 第二章材料与方法 清液。5 的次氯酸钠对孢子消毒3 - 5 m i n ，然后用无菌水冲洗3 次，获得无菌的 孢子悬浊液。将此悬浊液均匀接种在培养基上，用封口膜将培养皿封口。培养皿 先置于黑暗处培养2 4 h ，以促进孢