（分析化学专业论文）鱼体、畜禽可食用组织中硝基苯的提取及分析测定方法研究.pdf

摘要 2 0 0 5 年末由于中石油吉化公司双苯厂爆炸( 1 1 1 3 事故) ，导致大量硝基苯进入松花 江水体，致使水体受到严重污染。为考察和监控硝基苯对水体、水生生物及沿岸禽畜的 污染及危害程度，国家特设立。国家科学技术部科技专项研究基金( 批准号2 0 0 6 b a 6 1 8 a ) ，用以分析和研究水体及生物体内硝基苯的提取方法及分析测试方法。从水体或生 物体内提取硝基苯的前处理过程难度较大，尤其是从鱼体及畜禽等的可食用组织部分中 提取硝基苯的前处理的难度更大。本研究是在水体中硝基苯的提取基础上，以鱼体及畜 禽等的可食用组织为研究对象，对硝基苯的有效提取方法及硝基苯的定性和定量分析测定方 法进行研究，旨在建立一种简便、快捷、高效的硝基苯提取的前处理方法及准确性高、 重现性好的硝基苯定性及定量检测方法，为实际应用提供理论依据。 本实验通过对比索氏、超声、匀浆和水蒸气蒸馏四种鱼体中硝基苯的提取方法，并 通过回收率对四种方法进行评价。实验得出：索氏提取法回收率最高为8 4 3 ，平均回 收率为7 9 2 ；超声法和水蒸气蒸馏法回收率较低为7 0 左右；匀浆提取法回收率比索 氏提取法测得的回收率稍低为7 7 4 。四种提取方法所得到回收率范围在6 5 6 - 8 4 3 ， 相对标准偏差均小于1 0 。但索氏提取法操作步骤烦琐、费时，而匀浆法比索氏提取法 操作简便、快捷，且溶剂使用量少，回收率也与索氏法接近，因此，拟提出建立匀浆提 取法作为鱼体、畜禽等可食用组织中硝基苯的提取方法。并通过正交实验对提出的匀浆 前处理方法进行了优化，以得到更高的回收率结果。匀浆法优化实验为三因素三水平正 交实验，考察了匀浆时间、提取溶剂种类以及净化柱填加中性氧化铝的量三个因素对回 收率指标的影响，得出结论为：溶剂种类为影响回收率的最显著因素。所以，确定最佳 实验条件为：丙酮：正己烷混合溶剂为提取溶剂，匀浆时间为l m i n ，净化柱填加中性氧 化铝为4 9 。通过加标实验对得到的最优方法进行多次验证，验证结果表明，在正交实验 所得到的最佳实验条件下所得到的回收率分布在8 7 2 9 2 8 之间，平均回收率为 8 9 8 5 ，相对标准偏差小于3 。在实验过程中发现有一个干扰峰，其保留时间与硝基 苯的保留时间相近，本实验对几种鱼种进行了测定，发现只有鲤鱼中含有该杂质峰，而 其它鱼种包括鲫鱼、鲢鱼、草鱼等，并未发现在硝基苯保留时间附近出现此杂质峰，因 此初步认定该干扰峰可能与鱼的种类有关。实验证明匀浆法法具有回收率高、稳定性好、 灵敏度高、定性准确等优点。 本实验还对一部分取自松花江污染水域及地区的鱼样和畜禽样品通过匀浆提取法 进行了实际测定，得到的实验结果参考国家标准对水体中硝基苯的检测限1 7 u g l 进行 衡量，但都低于参考的规定检出限。 关键词：鱼体畜禽；可食用组织；硝基苯；匀浆提取法；g c m s a b s t r a c t i nt h i se x p e r i m e n tw ec o n t r a s tf o u rk i n d so fe x t r a c t i o np r e t r e a t m e n tm e t h o d s ，w h i c ha r e s e p a r a t e l ys o x h l a t ，s u p e r s o n i c ，h o m o g e n i z a t i o na n ds t e a md i s t i l l a t i o n m e a n w h i l e ，t h r o u g h t h er e t u r n s - r a t i o ，w em a k ea no b j e c t i v e a p p r a i s a lo ft h e f o u rm e t h o d s i nw h i c ht h e r e t u r n s - r a t i oo fs o x h l e te x t r a c t i o nm e t h o di st h eh i g h e s t ，t h er e t u r u s - r a t i oo f h o m o g e n i z a t i o n e x t r a c t i o nm e t h o di sab i tl o w e r - 一a b o u t7 7 a n dt h er e t u r n s - r a t i oo fs u p e r s o n i cm e t h o da n d t h es t e a md i s t i l l a t i o ni st h el o w e s t - 一7 0 o rs o h o w e v e r t h ep r o c e d u r eo fs o x h l e te x t r a c t i o n m e t h o di sh o m o g e n i z a t i o na n dt i m e - c o n s u m i n g ，w h i l eh o m o g e n i z a t i o ne x t r a c t i o nm e t h o di s e a s y t oo p e r a t ea n dt h ep r o c e d u r ec a nb ed o n em u c hm o r eq u i c k l y ；b e s i d e s ，t h ea m o u n to f t h e s o l v e n tu s e di sf e w e r w h a t sm o r e ，t h er e t u r n s - r a t i oo f h o m o g e n i z a t i o ne x t r a c t i o nm e t h o di s l o w e rt h a nt h a to fs o x h l e te x t r a c t i o nm e t h o d t h e r e f o r e ，w ed r a wu pa p l a nt oe s t a b l i s ht h e h o m o g e n i z a t i o ne x t r a c t i o nm e t h o d ，ap r e t r e a t m e n tm e t h o dt oe x t r a c tn i 仃o b e n z e n ef r o mt h e e d i b l et i s s u e so ff i s h 。d o m e s t i ca n i m a l sa n dp o u l t r y w ea l s oo p t i m i z et h eh o m o g e n i z a t i o n p r e t r e a t m e n tm e t h o dt h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n ti no r d e rt oo b t a i nar e s u l to fh i g h e r r e t u r n s - r a t i o h o m o g e n i z a t i o no p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n ti sa no r t h o g o n a le x p e r i m e n to ft h r e ef a c t o r s a n dt h r e eh o r i z o n t a l w ee x a m i n et h ei n f l u e n c ef a c t o r s o ft h er e t u r n s r a t i oo nt h eb a s i so f t h r e ef a c t o r s ：t h et i m eo fh o m o g e n i z a t i o n , t h et y p eo fe x t r a c t i n gs o l v e n ta n dt h ea n a o u n to f a 1 2 0 3w h i c hi sf i l l e di nd e c o n t a m i n a t i o nc e n t e r t oc o n c l u d e ，w ec a l ld r a wac o n c l u s i o nt h a t t h et y p eo fs o l v e n th a st h eg r e a t e s te f f e c t so nr e t u r n s - r a t i oa n dw ec a ng e tt h eb e s te x t r a c t i n g r e s u l to nt h e s ec o n d i t i o n s ：f i r s t l y t h eb e s te x t r a c t i n gs o l v e n ti sm i x e ds o l v e n to fa c e t o n ea n d h e x a n e s e c o n d l y ，t h et i m eo fh o m o g e n i z a t i o ni s l m i n u t e t h i r d l y ，t h ea m o u n to fa 1 2 0 3 w h i c hi sf i l l e di nd e c o n t a m i n a t i o nc e n t e ri s4 9 w ee x a m i n e dt h eo p t i m i z a t i o nm e t h o d t h r o u g ha d d i n g s i g ne x p e r i m e n ta n dt h er e s u l to ft h ee x p e r i m e n ts h o w st h a tt h er e t u r n s r a t i o i s8 7 2 - 9 2 8 o nt h ec o n d i t i o no fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h ea v e r a g er e t u r n s r a t i oi s 8 9 8 5 ，a n dt h er s di ss m a l l e rt h a n3 s ow ec a l ls a yt h a tt h ee x p e r i m e n ti sac e r t a i n f e a s i b i l i t y i nt h i se x p e r i m e n t , w ea l s od e t e r m i n e ds o m es a m p l e so f 矗s ha n dp o u l t r yw h i c hc o m e f r o mt h ep o l l u t e dw a t e ra n da r e a $ i ns o n g h u ar i v e rb yu s i n gh o m o g e n i z a t i o ne x t r a c t i o n m e t h o d r e f e r r i n g t ot h en a t i o n a ls t a n d a r dt h a tt h em a x i l n u me x a m i n a t i o nl i m i to f n i t r o b e n z e n ei nw a t e r si s1 7 u g l , w eg o tt h er e s u l to ft h i se x p e r i m e n t - 一- n i 订o b e n z e n ew e r e f o u n di ns o m es a m p l e sb u tt h ea m o u n to fh i t r o b e n z e n ei na l lo ft h es a m p l e sw e r el o w e rt h a n t h el i m i t k e yw o r d s ：e d i b l et i s s u e so ff i s h ，d o m e s t i ca n i m a l sa n dp o u l t r y ；n i t r o b e n z e n e ； h o m o g e n i z a t i o ne x t r a c t i o nm e t h o d ；g c m s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：翟! ! 马 日期：芝2 ：里 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：糊 日 期：啤z 。金 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：覃陋 i e i 期：竺乒e 圭：墨 电话： 邮编： 引言 硝基苯( n i t r o b e n z e n e ) ，又名密斑油( o i lo f m i r b a n e ) 。本品为淡黄色透明油状液体， 有苦杏仁味，沸点在2 1 0 9 左右，相对密度( 水= 1 ) 1 2 0 ，相对密度( 空气= 1 ) 4 2 5 ，不溶 于水，溶于乙醇、乙醚、苯等多数有机溶剂，性质较稳定，常用作溶剂，制造苯胺、染 料等。分子式为c 6 h 5 n 0 2 ，分子量为1 2 3 1 1 ，结构式如图1 1 。 o 。夕 图1 1 硝基苯的化学结构式 硝基苯是有机合成的原料，最重要的用途是生产苯胺染料，还是重要的有机溶剂。 环境中的硝基苯主要来自化工厂、染料厂的废水废气，尤其是苯胺染料厂排出的污水中 含有大量硝基苯。贮运过程中的意外事故，也会造成硝基苯的严重污染。硝基苯在水中 具有极高的稳定性。由于其密度大于水，进入水体的硝基苯会沉入水底，长时间保持不 变。又因为它在水中有一定的溶解度，所以造成的水体污染会持续相当长的时间。硝基 苯的沸点较高，自然条件下蒸发速度较慢，与强氧化剂反应生成对机械震动很敏感的化 合物，能与空气形成爆炸性混合物。倾倒在环境中的硝基苯，会散发出刺鼻的苦杏仁味。 8 0 以上时，其蒸气与空气的混合物具爆炸性，倾倒在水中的硝基苯，以黄绿色油状物 沉在水底。当浓度为5 m g l 时，被污染水体呈黄色，当浓度超过3 3 m g l 时可造成鱼类 及水生生物死亡。2 0 0 5 年末吉化公司双苯厂爆炸引起松花江水体的污染，对鱼体中硝基 苯的检测就更具有实际意义。国家对本次事故设立了国家科学技术部科技专项研究基 金( 批准号2 0 0 6 b a 61 8 a ) 。为此，本实验开展了对鱼体及畜禽中硝基苯提取的前处理 方法及分析测定研究。 第一章前言 1 1 硝基苯污染概述及国内外研究现状分析 随着生产和科学技术的发展，人们对环境问题的认识逐步深化，只靠常规项目，并 不足以说明环境问题，更不能客观的反映环境质量状况。一批危害环境和人体健康的有 毒污染物，特别是占有毒化学物质绝大多数的有机化合物没有包括在内。而现代医学的 发展恰恰证明，即使在低浓度下，有毒有机物也可能对人体健康和环境造成严重的、甚 至是不可逆转的影响。2 0 世纪6 0 年代末，有机污染物的监测分析，包括美国在内，无 论是制定的标准还是实行的监测与控制，都还只有综合指标，如c o d 、t o c 等。只是 到了2 0 世纪7 0 年代，色谱和色谱质谱联用技术的痕量有机分析测试技术发展起来后， 有毒有机物的监测与控制才真正列入美国环保局污染防治计划，并得以付诸实施1 1 i 。 1 9 7 7 年6 月美国环保局根据实测检出率、污染物毒性、环境效应和经济效应等因素从 6 5 种化合物及化合物类中筛选出1 2 9 种污染物作为水中优先监测及控制污染物，其中硝基 苯“榜上有名”。我国学者在这方面进行了大量的研究，其中对南京市水源水、z 流域水质、 广州市水源水及自来水中有机污染物进行了鉴定和分析，结果表明水源中有机污染物种类 多样1 2 - 4 1 。据有关资料报道在世界各种水体中，已检出各种有机化合物2 2 2 1 种，在饮用水 中也己检出7 6 5 种，而其中有1 1 7 种被认为或被怀疑为致癌物。在美国环保局( e p a ) 规定的 1 2 9 种优先污染物划分名单中，有机化合物为1 1 4 种。我国环保局公布的水中优先控制污 染物黑名单中共有1 5 类6 9 种有害化学污染物，其中有机毒物为5 8 种。这些污染物大多具 有三致性”，且具有长效性和不可逆性1 5 6 1 。1 9 9 2 年我国提出的水中优先控制污染物名单作 为我国水污染控制、监测的依据和标准，其中硝基苯也在名单内l j ”。 松花江是沿江两岸农业生产和农民生活的主要水源地，是国家重要的绿色食品基地 和商品粮基地。其生态环境保护极为重要，备受国内外关注。自中石油吉化公司双苯厂 爆炸( 1 1 1 3 事故) 后，大量硝基苯进入松花江水体，造成污染。松花江是沿岸畜禽饮 水、农业灌溉及部分农村饮用水的主要水源，水源的污染必将严重威胁和影响松花江流 域及沿岸的农业生产和农村经济社会发展。硝基苯及苯系物通过农牧业渔业用水进入农 业生态系统和食物链，将威胁沿江人民健康。 硝基苯在水体中的提取及测定方法已有很多文献报道i s - 1 2 l 。而鱼体及畜禽可食用组织 中硝基苯的提取及测定方法的报道并不多见，少数相关报道也只是围绕几种常规测定方法 进行测定或是硝基苯对鱼体其它方面的影响，如v i a r e n g o 等n 司人的研究，国家标准方法也 未对其进行规定。因此，对畜禽鱼类产品中的硝基苯的分离提取以及分析监测方法的建立 和研究具有重要的实际意义，科学准确地提供分析检测结果对防治也是十分必要的。 环境样品基体复杂，待测物浓度低，不同物质以多相非均一态存在，因此要获得数 据准确、重现性好的分析结果，样品前处理是重要环节，而且往往是样品分析成败的关 键，这一点在环境样品物质分析中尤为重要。为此，探索快速、高效、简便、易自动化 2 的样品前处理方法已成为当今环境分析的重要研究方向之一，从而使前处理技术在环境 分析中具有广泛的应用。残留分析不仅要求精细微量的操作手法和高灵敏度的检测分析 仪器，同时对样品的前处理要求也十分严格，尤其是对环境和食品等样品的痕量和超痕 量农药残留进行分析检测更是一项艰巨任务，它需要大量细致的样品分离和净化等前处 理过程。前处理干净与否直接关系到分析的一致性和准确性1 1 4 i 。 迄今为止，国内外对水体中的有机污染物的提取测定包括硝基苯在内已展开了大量 的研究，对水体中的水生生物( 典型生物为鱼) 的有毒污染物的提取测定有一定研究， 但主要研究方向为有毒污染物在水生生物体内的致毒性等，少有针对有毒污染物提取测 定的报道。环境水中硝基苯主要来自染料、香料、炸药等有机合成工业废水，刘明、王 福军、雷军等1 1 5 j 探讨了固相萃取高效液相色谱法测定水中硝基苯的分析方法。王建刚、 郭景海等1 1 6 1 建立的高效液相色谱法测定废水中硝基苯含量，研究表明，硝基苯车间排放 的废水中硝基苯平均含量为0 1 6 ，废水如不加处理直接排放，势必造成环境污染。测 定硝基苯的方法主要有还原偶氮光度法( 最低检出浓度为0 2 m g l ) 及气相色谱法，如尹 莉莉、张万峰等1 1 7 l 利用还原偶氮光度法测定废水中硝基苯。在环境监测中使用的气相 色谱法是以苯作溶剂进行萃取，浓缩及净化后，用p e g a 、d e g a ( 固定液) 的玻璃填充 柱分离，以电子捕获检测器检测，最低检出限浓度低于l i _ t g l 。国外测定水及大气中的 苯胺及硝基苯大多使用气相色谱法。美国e p a ( 美国环境保护局) 法测定硝基苯用f i d ( 氢火炎焰检测器) 或e c d ( 电子捕获检测器) 检测，检出限分别为3 9 牡及1 3 7 9 9 l 。 日本环境厅推荐使用溴化处理后的e c d 气相色谱法测定苯胺，而硝基苯也用e c d 检测， 方法的检测限为0 1 m g l 。h f i j e kt o r m i s ，h o n y sd a v i d 等i l 卅利用匀浆萃取法对蛋白质等 进行提取研究。h o l f o r dk e n n e t hc ，s e z g i n t f i r km u s t a f ak e m a l 等i l9 l 用匀浆法对氨基酸、 多肽等进行提取的研究也都有报道。但把匀浆法应用到硝基苯的提取上还少有报道。 在识别干扰物质方面，一般的测定方法为检测器为电子捕获的气相色谱，这就使与 硝基苯保留时间相近处的干扰物质大大的影响了测定结果，用气相色谱质谱联用来对 其进行定性检测就保证了分析测定的准确性，减小误差。因此，对畜禽鱼类产品中硝基 苯的分离提取以及分析监测方法的建立和研究具有重要的实际意义。 1 2 几种前处理方法的介绍 在硝基苯的测定方法中，分为前处理和定量测定两部分。样品的前处理即硝基苯的 提取、浓缩及净化是硝基苯分析中工作量最大、对分析结果有重大影响的步骤。而对畜 禽鱼类中可食用组织中硝基苯测定的前处理方法的文献又相对较少。所以本实验的重点 是硝基苯的前处理提取方法，下面简要对几种前处理方法的研究进展做简要介绍。 1 2 1 水蒸气蒸馏法 水蒸气蒸馏法适用于具有挥发性的、能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应， 且难溶或不溶于水的成分的提取。此类成分的沸点多在1 0 0 以上，并在1 0 0 左右有 一定的蒸气压。文献报道较多的为各种挥发油成分的提取，如陈华、辛广等1 2 0 i 对没药挥 发成分的提取，通过水蒸气蒸馏法提取、鉴定出4 1 种化学成分。迄今为止，水蒸气蒸 馏法仍为一种较传统的提取方法。 但传统水蒸气蒸馏法存在一定的缺点，如装置中的胶塞可能在提取过程因有机溶剂 的浸泡而污染样品，提取时间长等。虽然已经有人提出各种改进方法如付湘林、谭俊杰 等2 1 1 提出对水蒸气蒸馏装置磨1 ：3 塞的改进，付彩霞等1 2 2 1 提出对蒸汽导管的改进等，但在 具体实施上还没有得到普及。 1 2 2 索氏提取法 索氏提取法主要是利用相似相溶原理通过反复抽提，使样品中的有机成分溶解于有 机溶剂中，然后蒸发有机溶剂，剩余物为样品中所要提取物。也就是利用溶剂回流及虹 吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取。萃取前先将固体物质研碎，以增加固液 接触的面积。然后将固体物质放在滤纸套内，置于提取器中，提取器的下端和盛有溶剂 的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管。加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的 支管上升，被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管的 最高处时，含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质，如此重复，使固体 物质不断为纯的溶剂所萃取，将萃取出的物质富集在烧瓶中。该法是经典的样品前处理 方法，它能保证样品基体与提取溶剂的密切接触，萃取完全口”，常被用于分离实验，如 王萍等1 2 4 1 用索氏提取法分离聚丙烯酰胺与丙烯酰胺，效果较好。还有人1 2 5 i 用索氏提取法 对昆虫蛹油进行提取。但该方法操作步骤比较烦琐、费时，一般作为其它提取方法的对 照法2 6 i 。 1 2 3 超声萃取法 。 超声波是一种机械振动在媒质中的传播过程，其频率一般在2 0 k h z 以上。超声波具 有聚束、定向、反射、投射等特性，作用于液液、液固两相、多相体系、表面体系以及 膜界面体系会产生一系列的物理、化学作用并在微环境内产生各种附加效应。由于这种 特性，超声波萃取技术作为一种有效手段在多种环境样品分析的前处理中被广泛研究和 使用。近年来，超声波在食品工业中也得到了应用和发展，如超声乳化、超声过滤、超 声萃取等1 2 刀。我们这里说的超声萃取法，也叫做超声提取法，是指从样品中利用超声效 应提取硝基苯、苯等有机污染物的方法。超声波法在植物有效成分提取中得到广泛应用 i 捌，如杜晓刚等1 2 9 荆用超声波萃取法测定茶叶中有机磷类的农药残留。应用超声技术来 强化提取过程，可有效提高提取效率，缩短提取时间。而且，超声波破碎过程是一个物 理过程，浸泡提取过程中无化学反应，被浸泡的化学成分的结构和性质不会发生变化娜l 。 1 2 4 匀浆萃取法 匀浆萃取是指生物组织通过加入萃取溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取活体组织中 有效成分的一种提取方法。应用该方法对氨基酸、多肽、蛋白质和包含体进行提取的研 究都有报道1 1 8 - 1 9 1 1 3 1 - 3 2 1 ，但将此方法应用到水生生物组织中污染物的提取方面的研究少有 文献报道。本实验室首次将匀浆萃取应用到水生生物组织中硝基苯的提取方面，即将鲜 样品一水生生物组织与萃取溶剂在匀浆萃取装置中混合匀浆，通过机械及液力剪切作用 将样品撕裂和粉碎，使样品破碎和硝基苯的萃取同步进行，以达到对样品中硝基苯快速、 4 强化提取的目的。应用该方法对氨基酸、蛋白质和萜类物质进行提取的研究也有报道 1 3 5 - 3 5 1 。 匀浆萃取装置具有强度很高的粉碎效果、对各种动物、植物的组织均能起到匀浆和 混合的作用。在不同的速度下，能破碎不同的细胞膜，尤其对各类纤维性较强的植物以 及动物组织的小量内脏、肌肉等进行粉碎、分析更为适合。对有机和水，不相容的两种 夜体之间的高效分散、乳化和水中微量有机化合物、脂溶物、有机溶酶、可溶性物质的 萃取也非常适用。如赵春建，祖元刚等脚j 利用匀浆法提取沙棘果中总黄酮，结果表明， 在优化的条件下，匀浆法对沙棘果总黄酮的提取率为o 7 6 ，与回流提取相比匀浆提取 法具有提取时间短，提取溶剂用量少等优点。他们1 3 7 l 还用匀浆法萃取了烟叶中茄尼醇， 茄尼醇的提取率为0 7 2 2 ，分别是超声提取、索氏提取的1 3 2 、1 6 2 倍。尽管如此， 匀浆法的应用研究也只限于植物样品的提取，把匀浆提取法应用在鱼体和畜禽等可食用 组织提取方面的研究报道还比较少见。 对比几种前处理方法，匀浆法显出其具有的显著优势：溶剂使用量少，提取速度快， 提取效率高且稳定等优点。溶剂使用量少：索氏提取法使用溶剂量较大，一般在几百毫 升，而匀浆法使用溶剂量较少，不到索氏提取法使用量的1 3 。提取速度快：一般前处 理方法提取时间较长，如索氏提取至少要2 、3 个小时，水蒸气蒸馏法在蒸馏步骤也较 耗时间，匀浆萃取法的匀浆过程同时又是物料与提取剂充分混合的过程，因此实质上是 一种强化固液传质过程。当固相和液相接触时，固体表面存在液体膜，在匀浆刀充分 匀浆的情况下，此膜的厚度可随搅拌的速度的增加而变薄，使包在其中的目标成分能充 分地溶解出来。因此相应缩短了萃取时间、传质途径，提高了传质速率，达到了强化萃 取的目的。在前处理最佳条件的处理上，一般是停留在匀浆后的溶剂，净化等方面，而 在匀浆过程的最佳条件m i 的探讨上较少。 1 3 硝基苯的主要检测方法 现有报道的检测方法一般都是针对各种水体中硝基苯类的测定p 9 媳8 3 l ，如极谱法、 液相色谱法、气相色谱法等1 4 1 - 4 3 1 。 1 3 1 极谱法 王玉民，曹晓群等i 报道了极谱法测定废水中邻硝基苯酚的含量，邻硝基苯酚属电 活性物质，实验发现其与镉离子共存时能在氯化钾底液中产生新峰，继续在此溶液中加 入1 3 - c d ，新峰的峰电位负移，峰电流增大，而且峰电流随o - n p 浓度的增大而增大。利 用o - c d c d 2 + 包络物测定o - n p 的含量，灵敏度比利用o n p 本身峰电流来测定o - n p 的 含量的灵敏度提高许多，线性范围也增宽。 1 3 2 高效液相色谱法 刘明，王福军等1 1 5 i 利用固相萃取高效液相色谱法对水体中硝基苯进行了测定。方 法在3 0 0 i _ t g l - 3 0 m g l 范围内具有良好的线性关系( r - - - 0 9 9 9 8 4 ) ，回收率为8 9 5 一9 2 3 ， r s d 1 5 ，方法检出限为o 0 2 1 “班。王建刚，郭景海等i l6 l 报道了高效液相色谱法测 定废水中硝基苯含量，采用反相高效液相色谱系统，用s p h e r i s o r bc 1 8 色谱柱( 2 5 0 s m i n x 4 6m m x s i t m ) ，甲醇水醋酸( 7 0 ：2 9 ：1 ) 为流动相，流速0 9m l m i l l 1 ，2 6 2 n m 为检 测波长。回收率为9 7 0 - 1 0 1 4 ，相对标准偏差小于2 5 ，线性范围在0 4 1 0 0 1 t g m l 。 周秋华，孙冲等i 惦i 还报道了高效液相色谱质谱法测定废水中微量氯苯酚和硝基苯酚， 也取得较好结果。 1 3 3 气相色谱法 张爱丽，周集体等i 拍i 报道了液液微萃取气相色谱法测定小量水样中痕量硝基苯， 使用f i d 检测器和d b 1 大口径毛细柱不需要对有机相进行干燥处理。利用有溶剂效应 的柱温程序提高了柱效和检测灵敏度。1 0 m l 水样可获得0 5 r t g l 的检测下限。方法的精 密度优于4 ，回收率大于9 5 。李杰等1 4 7 j 报道了气相色谱法测定水及空气中的苯胺和 硝基苯，采用大口径毛细管色谱柱和氮磷检测器( n p d ) 建立了水及空气中苯胺及硝基苯 的定量分析方法，线性范围0 - 8 0 1 t g l ，检测下限l p l 。 另外还有光度测定法等，如尹莉莉，张万峰等l ”l 报道了水中硝基苯的还原偶氮光度 法测定，通过对实验条件中以缓冲溶液对p h 值进行调节，也取得较好的实验结果。 1 4 气相色谱质谱联用技术( g c m s ) 在微量有机污染物测定发面的应用 c r c m s 是一种高效的分析技术，该技术利用气相色谱的分离能力让混合物中的组 分分离，并用质谱鉴定分离出来的组分( 定性分析) 以及其精确的量( 定量分析) 。气 相和质谱控制、数据的记录、分析都由电脑完成。气质联用具有非常高的灵敏度( 1 0 4 5 克) ，并且可以分析的范围非常广泛，例如农药、环保、药物、兴奋剂等方面都可以进 行分析i s o , s 4 - s s l 。 一般硝基苯的检测是采用气相色谱法进行测定的，配备电子捕获检测器。但在实际 测定中我们发现，在与硝基苯相近的保留时间处，有非硝基苯物质流出，而电子捕获检 测器以保留时间定性就很难保证测定结果的准确性。也就是说，常规的气相色谱法1 4 4 l 不能够满足我们的分析测试要求，因此，我们采用气质联机( g c m s ) 对其进行定性测 定，保证了测定结果的准确性。 1 4 1g c m s 的特点 l 、气相色谱法的特点 气相色谱法是利用不同物质固定相和流动相分配系数的差别，使不同化合物从色谱 柱流出的时间不同，以达到分离的目的。气相色谱法提供保留时间和强度二维谱图。气 相色谱法定性依据是色谱峰的保留时间，定量依据则是色谱峰高或峰面积。作为定性和 定量分析方法，气相色谱法最大的特点在于高效的分离能力和高的灵敏度，因此是分离 混合物的有效手段。在几分钟内几十甚至上百组分的混合物可得到有效的分离。 2 、质谱法的特点 质谱法是利用带电粒子在磁场或电场中的运动规律，按其质核比( m z ，质量和电荷 的比1 实现分离分析，测定离子质量及其强度分布。主要特点是能给出化合物的分子量、 元素组成、经验式及分子结构信息，具有定性专属性强、灵敏度高、检测快速的优势。 质谱检测的是离子质量，能够提供待测化合物特征离子的单同位素质量，这是质谱 6 法的独到之处1 鲥鄹l 。 3 、g c m s 的特点 无论是气相色谱法还是质谱法都各有长处和短处。g c m s 联用则能够使两者的优、 缺点得到互补，充分发挥气相色谱法高分离效率和质谱法定性专属性的能力，兼有两者 之长，因而解决问题能力更强，具有更大的优势。g c m s 相比较于普通气相色谱有以 下的优点，如表1 t l 。 。 表1 1g c m s 法优点表 定性能力高用化合物分子的指纹质谱图鉴定组分。大大优于色谱保留 时间，g c 船的定性指标有分子离子、功能团离子、离子 峰强比、同位素离子峰、离子反应的母子离子质量数以及 总离子流色谱峰、选择离子色谱峰和选择反应色谱峰所对 应的保留时间窗 一般应用可省略其它色谱g c m s 联用仪的全扫描工作方式是最通用的灵敏度极高 检测器 的色谱检测器，而选择离子和选择反应工作方式是最可变 和最具有选择性的最高灵敏度的色谱选择性检测器，所以 应用时可省略其它色谱检测器 分离尚未分离的色谱峰用提取离子色谱、选择离子监测法和选择反应监测法，可 分离总离子流色谱图上尚未分离或被化学噪音掩盖的色 谱峰 提高定量分析精度可用同位素稀释和内标技术提高定量精度和定性能力 提高仪器功能，实现分析计算机的多功能使仪器的结构更简单，操作更方便，更易 自动化于实现分析工作的自劫化 1 4 2g c m s 的检测方式 在g - c m s 中，四极质量分析器有全扫描( s c a n ) 和选择离子监测( s i m ) 两种模式。 l 、全扫描检钡o ( s c a n l 全扫描方式是最常用的一种扫描方式，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子 和碎片离子的质量，得到是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索。一般在未知化合物 定性分析时，多采用全扫描方式。为了检验色谱的分离效果和有利于未知化合物的鉴定， 扫描参数选择需要兼顾既能获得好的质谱图，又能有好的总离子流色谱图，因此要考虑 影响质谱图质量的各种因素，包括扫描质量起点和终点、扫描时间、信号阈值、倍增工 作电压等。 2 、选择离子检测( s 讧) 选择离子检测是g c m s 联用中一种高灵敏度、高选择性的检测技术，是混合物进 行定量分析的一种常用方法，具有广泛的应用前景。选择离子监测方式不是连续扫描某 一质量范围，而是跳跃式的扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。s i m 主 要用于目标化合物检测和复杂化合物中杂质的定量分析。定性分析一般不采用s i n i 扫描 方式，因离子数目少，谱库检索没有意义，但在特殊需要的情况下，如类型化合物的跟 踪，选择的离子数目达8 1 0 个以上时，s i m 谱图也能进行谱库检索。s i m 扫描方式的 参数设置，主要是特征离子质量的选择和每个离子扫描停留时间以及扫描质量的窗口， 其它和全扫描一样。 1 4 3g c m s 的应用实例 现在，g c m s 己得到极为广泛的应用，如环境污染物分析、药物分析、食品添加 剂分析等1 5 7 棚l 。 l 、农药残留分析 8 0 年代，开始有报道用g c m s 检测水果、蔬菜以及土壤、水体等中的农药残留眇- 7 2 1 。 用于农药残留检测工作，特别是农药代谢物、降解物的检测和多残留检测，具有突出的 优点。g c m s 联用在环保领域用于检测许多种有机污染物，特别是一些较低浓度的有 机化合物，如多氯联苯( p c b s ) 、二恶英( d i o x i n ) 等的标准方法就规定用g c m s l 7 3 1 。g c m s 联用在农药残留检测特别是农药多残留检测方面的应用也越来越广泛。j u l i ef i l l i o n l 7 4 1 用g c m s 结合选择离子扫描模式，研究了蔬菜水果中1 9 1 种农药残留的分析方法，检 测限根据农药的种类而有所异同，主要分布在0 0 2 u g m l - 0 2 u g m l 之间。王建1 15 l 用 s i m g c m s 同时测定蔬菜中敌敌畏、甲胺磷、甲拌磷、氧乐果、甲基对硫磷、克百威 共六种杀虫剂的残留量并进行阳性确证，检出限为：2 0 x 1 0 1 0 m g k g 一1 6 x l o - s m g k g ，添 加回收率为7 2 1 2 5 ，相对标准偏差为6 7 2 0 。杨云【76 l 研究了用微波辅助萃取 g c m s 测定植物中的扑草净，检出限为：2 2 x 1 0 。o m g k g 。 2 、药物分析 2 0 世纪7 0 年代，g c m s 已用于苯并二氮杂卓类药物的检测1 7 7 l 。血、尿、唾液、毛 发等样品中苯并二氮杂卓类药物与具有药理活性代谢物的应用文章已有不少报道。1 9 9 1 年芬兰的l i l ls u n d e 等1 7 3 j 用s p e 、t l c 与g c m s 联合同步检测了巴比妥类、苯并二氮 杂卓类、安非他明类、吩噻嗪类、阿类、卡马西平和其他常用的约3 0 0 种镇痛药物。美 国r o c h e 生物医学实验室k i n g 等1 7 9 1 应用酶水解，以氘代物做内标，用t o x i 1 a bv cm p 3 微柱净化，m t b s t f a i t b d m s c i 盘上衍生化，g c m s ( s i m ) 分组测定了尿中8 种 安定类药和代谢物。 3 、食品与环境样品分析 g c m s 在食品与环境样品中也得到广泛应用 8 0 4 2 1 。尤其是选择离子监测的应用更 为广泛。1 9 8 4 年陈代线等人测定了水中三氯乙烯含量l ，方法回收率为9 4 o ，取得较 好检测效果。邱月明等i 朽1 用选择离子检测法分析了土壤中p p t 级多氯二苯并二恶英，方 法简便且回收率较高。2 0 0 0 年宋崇林等i 撕i 使用离子检测的方法选择性的检测柴油机排 气中多环芳香烃，采用1 4 种多环芳香烃混合标准样品绘制校准曲线，以外标法对柴油 机排气微粒中的p a h s 进行定量分析，重复性好，回收率在7 9 8 9 范围内，该方法用 于柴油机排气微粒中多环芳香烃排放量的测定取得了满意的效果。 8 1 5 研究意义 由于鱼体及畜禽基质复杂，提取硝基苯的前处理方法难度较大。因此，本论文的实 验重点为硝基苯在鱼体及畜禽可食用组织中的提取部分。由于国家标准尚未对硝基苯在 肉类食品中给出相应的检测限，因此本文对鱼体及畜禽中的检测限参考水体中硝基苯含 量限度( 国家标准) 进行衡量。在检测的前处理方法中，文献报道较多的也为水体中硝 基苯的提取、检测，而肉类食品中( 包括水产品) 的检测多为苯胺类，未见直接涉及到 硝基苯检测的报道。因此，本文拟提出建立一种简便、快速的鱼体、畜禽可食用组织中 硝基苯的提取方法，有望对肉类食品中的硝基苯的检测提供一定的理论依据，实验具有 一定的实际意义。 9 第二章鱼体中硝基苯的提取和分析测定方法的建立 硝基苯在水体中的提取及测定方法已有很多文献报道。而在鱼体及畜禽可食用组织 中，硝基苯的提取及测定方法的报道并不多见，少数相关报道也只是围绕几种常规测定 方法进行测定或是硝基苯对鱼体其它方面如毒理等的影响。国家标准方法也未对鱼体及 畜禽可食用组织中硝基苯的提取及测定方法进行规定。样品基体复杂，待测物浓度低， 不同物质以多相非均一态存在，要获得数据准确、重现性好的分析结果，样品前处理过程 是保证测试顺利进行的重要环节，是样品分析成败的关键。为此，探索快速、高效、简 便、易自动化的样品前处理方法已成为当今环境分析的重要研究方向之一，以推动前处 理技术在环境分析中有广泛的应用前景。本文拟采用的前处理方法为匀浆提取法，该方 法简便、快捷并能够保证鱼体及畜禽可食用组织中硝基苯的有效提取。 检测方法主要采用g c m s 联用仪。c - c m s 是一种准确、高效的分析技术，该技术 利用气相色谱的强分离能力使挥发性有机物完全分离，并用质谱对分离出来的组分进行 定性分析和定量分析。因此，该技术的采用能够保证对畜禽鱼类产品中的提取物的有效 分离和定性、定量测定，并能保证方法的准确性和重现性。 。 2 1 实验部分 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 仪器和试剂 仪器：g c 6 8 9 0 m s 5 9 7 3 联用仪( 美国安捷伦公司) ； 高效组织匀浆机( 德国产u l t r a - - t u r r a xt 2 5 b a s i ci k a “w c r k sg e r m a n y ) 电子天平( 上海天平仪器厂f a l 0 0 4 ) ； 索氏提取器( 5 0 0 m l ，沈阳玻璃仪器厂产) ； 恒温水槽( 北京长安科学仪器厂) ； 旋转薄膜蒸发仪( z f q 8 5 a 上海医械专用厂) ； 净化柱( 自制，用2 5 m l 酸式滴定管填加一定量无水硫酸钠和中性氧化铝) 。 试剂：硝基苯、丙酮、石油醚、正己烷等均为分析纯；二次水；无水硫酸钠，分 析纯，用前在高温炉中6 0 0 c 烘干6 小时；中性氧化铝，层析用，1 0 0 - 2 0 0 目，用前在高温炉中6 0 0 c 活化6 小时后使用。 2 1 1 2 标准溶液的配制 硝基苯标准储备液的配制：( 1 ) 精密量取9 9 9 9 的硝基苯试剂8 3 0 - 士- 0 o l p l 于l o o m l 容量瓶中，正己烷定容制( 至) l o o m l ，配制成l o o m p ：_ 。