（微生物学专业论文）磁性细菌分离仪的开发与应用.pdf

中南大学硕士学位论文摘要 摘要 磁小体是一种理想的新型磁性纳米材料，可以广泛应用在磁性材 料、生物医学工程、环境保护等各领域。磁小体一般在趋磁细菌胞内 排列成磁链，因此趋磁细菌得到了趋磁性，基于这种特性，可以使用 磁分离方法分离纯化趋磁细菌。本课题组首次发现氧化亚铁硫杆菌 ( a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ) 胞内可以合成磁性颗粒。但是类似氧 化亚铁硫杆菌这种磁性细菌的趋磁性非常微弱，分离强磁性菌有一定 的困难。本文对磁性细菌的磁分离进行了研究，设计开发了一种有效 的磁性细菌分离仪，并应用分离仪分离得到磁敏感氧化亚铁硫杆菌， 还探索了其培养条件和批量培养。 本文在磁分离理论计算的基础上设计开发出一种磁性细菌分离 仪，经过特殊设计的磁极头可以产生利于磁分离的梯度分布强磁场。 利用氧化亚铁硫杆菌为样品进行了磁分离实验：分离得到的强磁菌平 均每个细胞含有4 颗磁性颗粒，8 4 21 的细胞含有磁性颗粒，多数 细胞含有2 5 颗，而弱磁菌平均每个细胞含有2 颗磁性颗粒，6 5 7 9 的细胞含有磁性颗粒，多数细胞只含有l 颗；在人工磁场中，强磁 菌的趋磁性明显强于弱磁菌。结果表明磁分离仪可以有效地分离磁性 细菌。磁分离仪的最优操作条件是：电磁铁通2 a 电流，以单位时间 流量8 8 4m l h ，分离浓度1 0 8 m l 1 的细胞悬液。 本文应用磁性细菌分离仪多次分离磁敏感氧化亚铁硫杆菌，得到 了趋磁性比较强的菌株，然后对得到的菌株的生长影响因素进行了研 究。通过正交实验得到磁敏感氧化亚铁硫杆菌的最佳培养条件为：温 度t _ 3 5 ；2 5 0 m l 摇瓶培养时，摇床转速为1 5 0 r p m ；初始p h = 2 5 ； 9 k 培养基初始f e s 0 4 浓度为4 4 7 9 m 。 本文通过补加f e 2 + 的方式，实现了磁敏感氧化亚铁硫杆菌的实验 室规模( 2 l ) 批量培养，初始培养体积为1l ，终体积为2l ，最佳 条件为发酵4 0h 时，一次补入浓度5 的补料，最终菌体浓度比不补 料对照提高了6 0 6 9 ；相同条件一次补入9 k 培养基全料，菌浓度相 比只补入f e 2 + 提高了6 0 1 ，比不补料提高了7 0 3 4 。原子力显微镜 观察表明发酵得到的菌体有明显的磁信号，即胞内含有磁性颗粒。 关键词磁性细菌分离仪，磁敏感氧化亚铁硫杆菌，分离条件，培养 方法 中南大学硕士学位论文a b s t r a c t a bs t r a c t t h em a g n e t o s o m ei sa ni d e a lk i n do fb i o n a n o 。m a g n e t i cm a t e r i a l m a g n e t o t a c t i cb a c t e r i ac o u l dm i g r a t ea l o n gt h em a g n e t i cf i e l dl i n e s ， w h i c hw a sd u et ot h a tt h e yc o u l ds y n t h e s i z ei n t r a - c e l l u l a rm a g n e t o s o m e s s ot h em a g n e t o t a c t i cb a c t e r i ac o u l db es e p a r a t e de a s i l yb ym a g n e t i c s e p a r a t i o n t h e r e s e a r c hi nt h i s g r o u p d i s c o v e r e dt h ef a c t t h a t a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sc o u l ds y n t h e s i z ei n t r a c e l l u l a rm a g n e t i c p a r t i c l e s b u tt h em a g n e t o t a x i so fa c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sw a ss o w e a kt h a ts t r o n gm a g n e t i cc e l l sc o u l dh a r d l yb es e p a r a t e df r o mc e l l s s u s p e n s i o n i nt h i sp a p e rw er e s e a r c h e dt h em a g n e t i cs e p a r a t i o no f m a g n e t i cb a c t e r i a b a s e do nt h em a g n e t i cs e p a r a t i o nt h e o r yw ed e s i g n e d a n dd e v e l o p e dak i n do fm a g n e t i cb a c t e r i as e p a r a t o r a st h es a m p l e a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sw a ss e p a r a t e db yt h i sm a g n e t i cs e p a r a t o r , a n dt h eo p t i m a lo p e r a t i o nc o n d i t i o nw a ss t u d i e d as t r a i no fs t r o n g m a g n e t i c a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sw a si s o l a t e d b ym a g n e t i c s e p a r a t i o n ，a n dt h ec u l t u r ec o n d i t i o no fi tw a sr e s e a r c h e di n c l u d i n gt h e i n f l u e n c eo fm a g n e t i cf i e l da n do p t i m a lc o n d i t i o no fm a x i m u mc u l t u r e d e n s i t y i na d d i t i o n ，m a g n e t i ca c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sc o u l db e b a t c hc u l t u r e di nt h el a b o r a t o r yf i r s tt i m eb yf e d b a t c hf e r m e n t a t i o n w ed e v e l o p e dak i n do fm a g n e t i cb a c t e r i as e p a r a t o r , w h i c hc o u l d c r e a t eh i g hg r a d i e n tm a g n e t i cf i e l d a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sw a s i n v e s t i g a t e da sa ne x a m p l e s t r o n gm a g n e t i ca n dw e a km a g n e t i cc e l l s w e r es e p a r a t e da n dc o l l e c t e d o na v e r a g e ，t h en u m b e ro ft h em a g n e t i c p a r t i c l e sp r e s e n t e di nt h es t r o n gm a g n e t i cc e l l sw a sm o r et h a nt h a to f t h e w e a km a g n e t i cc e l l s 8 4 21 o ft h es t r o n gm a g n e t i cc e l l sc o n t a i n e d4 10 m a g n e t i cp a r t i c l e s b yc o m p a r i s o no n l y6 5 7 9 o ft h ew e a km a g n e t i c c e l l sc o n t a i n e d1 - 3 m a g n e t i cp a r t i c l e s m o r e o v e r , s e m i s o l i d p l a t e m a g n e t o p h o r e s i ss h o w e dt h a tt h em a g n e t o t a x i so fs t r o n gm a g n e t i cc e l l s w a ss t r o n g e rt h a nt h ew e a km a g n e t i cc e l l s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h e m a g n e t i cs e p a r a t o rc o u l db eu s e dt oi s o l a t et h em a g n e t i cb a c t e r i a w h e n t h em a g n e t i cf l u xd e n s i t yo fo u t l e taa n dbr e a c h e d12 2 0 m ta n d9 0 0 m t a n dt h es u s p e n s i o nf l o ww i t ht h ec e l l sd e n s i t yo f10 8 m l 。1w a sc o n t r o l l e d i 中南大学硕士学位论文 a b 汀r a c t b yaa p p l y i n gar a t eo f8 8 4 m l h ，t h es e p a r a t i o ne f f i c i e n c ya c h i e v e d m a x i m u mi nt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s 胎s e p a r a t e da c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n su s i n g t h em a g n e t i c s e p a r a t o ra n do p t i m i z e d t h ec u l t u r ec o n d i t i o n so fa c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n sb yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s w bf o u n dt h a ta c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n sg r e wb e s ta ti n i t i a lp h v a l u eo f2 0 ，3 5 。ca n d15 0 r p mw h e n a d d e d4 4 7 叽f e s 0 4i n t o2 0 0 m lc u l t u r e dm e d i u m w eb a t c hc u l t u r e dac i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n si nt h el a b o r a t o r yb y f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n i nt h es h a k e f l a s kf e r m e n t a t i o n t h ef i n a lv o l u m e o fl i q u i dw a s2l a f t e r4 0hi nt h ef e r m e n t a t i o nf e 计( 5 ) w a sa d d e di n t h ef e r m e n t a t i o nl i q u i d t h em a xc e l ld e n s i t yc o u l d r e a c h2 3 3 1 0 7 m l c o m p a r e dw i t hc o n t r o le x p e r i m e n t si ti n c r e a s e db y6 0 6 9 a tt h es a m e c o n d i t i o n t h e c o m p l e t i o n9 kc u l t u r em e d i u mw a sa d d e di n t h e f e r m e n t a t i o n1 i q u i d t h em a xc e l ld e n s i t yc o u l dr e a c h2 4 7 10 7 m l c o m p a r e dw i t hc o n t r o le x p e r i m e n t si ti n c r e a s e db v7 0 3 4 a n da t o m f o r c em i c r o s c o p ya n dm a g n e t i cf o r c em i c r o s c o p ys h o w e dt h a tc e l l si nt h e f e r m e n t a t i o nw e r em a g n e t i c k e yw o r d sm a g n e t i cb a c t e r i as e p a r a t o r , m a g n e t i ca c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ，s e p a r a t i o nc o n d i t i o n ，c u l t u r a lm e t h o d 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 生物磁分离技术 第一章绪论弟一早三百下匕 磁选【l 】是一种简单而实用的物料处理方法，磁分离技术是选矿等领域中重要 的物料分离方法。随着科学技术的进步，磁分离技术已经从最初的选矿领域开始 进入其它多种学科领域，特别是在生物技术方面发挥着越来越重要的作用。以磁 力为驱动力的生物磁分离技术【2 】，是利用生物质组分或元素在磁场中磁敏感性的 差异，借助外加磁场将物质通过磁场处理，从而达到强化分离过程的一种技术， 具有高效率、高通量、对生物影响小等优点，如今已广泛应用于环保、医药、食 品及分析等领域。 1 1 1 磁分离原理 由于应用领域和研究对象不同，磁性分离对磁性分离装置的要求也不尽相 同，但是主要原理基本一致。载流体中的磁性颗粒运动主要受两种力的影响【3 】， 一种是作用在磁性颗粒上的磁场力，另一种是磁性颗粒所受到的粘滞阻力。因此 磁性颗粒的分离特征是由分离装置的磁场性质、磁性颗粒的性质和流体的性质共 同决定的，分离磁场强度和梯度高、磁性颗粒粒径大、磁性强或流体粘度小的体 系相对比较容易实现分离。但是目前生物领域应用的磁性颗粒主要是粒径小、磁 性弱的体系，受到现有经济和技术条件限制，不能通过仅仅提高磁场强度而实现 其完全的磁性分离。因此，通过加入聚磁介质或者特殊设计的磁极提高磁场梯度 成为解决这一问题的有效途径。 基于以上原理，一些专利文献已经针对生物领域的应用设计开发出各式各样 的磁分离装置，如微芯片磁泳分离【4 】、连续免疫磁性分离器( c i m s ) 1 5 j 和自由流 动磁泳装置( f f m ) 6 1 等。这些装置已经成功的应用于细胞分离、免疫检测技术 和分析规模的亲和分离等很多领域。 1 1 2 生物磁分离方法 ( 一) 高梯度磁分离技术 高梯度磁分离技术的研究在上世纪4 0 年代便已经开始，并逐步应用于采矿、 化工、污水处理及环境保护等领域【7 l o 其原理为：产生磁场的磁极形状与磁场梯 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 度有重要关系，形状比较钝、曲率比较小的磁极产生的磁场分布呈束状分布，只 能形成比较小的梯度；形状比较尖锐、曲率比较大的磁极产生的磁场分布呈放射 状分布，可以形成比较大的梯度。 基于以上原理，高梯度磁分离装置一般采用曲率比较大或具有尖锐形状的可 磁化金属填料，如钢毛、细钢丝、金属球等。在外加磁场中，填料被磁化，因此 填料周围可以产生很高的局部磁场梯度，流经载流体中的目标磁性粒子被磁场捕 捉，达到了纯化料液的目的。为了使填料再生，可以去掉外加磁场，然后利用清 洗液将捕捉的磁性粒子清洗下来，其原理如图1 1 所示。 进料臂2 箱 悬浮液 磁过滤芯 可醒电磁场磁锻 饮磁性填料 于盅收箱及消液 图1 - 1 高梯度磁分离装置示意图阻1 郑必胜【8 】等使用图1 。1 所示装置，系统的研究了高梯度分离过程中的分离特 性，磁场强度对磁分离效率起决定作用，磁性颗粒的磁性和粒径也对磁分离效率 有着直接影响，利用这种磁分离装置可以直接过滤处理含有铁、铜、铬等金属氧 化物的废水。 高梯度磁分离设备主要由铁磁性可磁化填料产生磁场梯度，常见的可磁化填 料一般是铁磁性非晶质合金物质、海绵状金属材料、不锈钢钢毛等【9 】。磁分离效 果取决于填料的磁性和填充度。一般说来，填料的磁性越强，磁分离装置的分离 效果就越好，对于同一种填料来说，填料粒度越细，填充度越高，磁分离效果就 越好，但随着填充度的提高，流体阻力也增大，在实践中要根据分离要求综合考 虑填充度，实践证明通常在5 1 5 的范围内可以达到比较好的分离效果【1 0 1 。 高梯度磁分离技术已经成功应用于废水处理过程中。被大肠杆菌等微生物严 重污染的河水，使用高梯度磁分离器高效处理一次以后，就能达到饮用水国家标 准i l l 】。此外，通过加入“磁种i r l ”，使用高梯度磁分离技术还可以高效地去除废 水中可溶性的物质，从而降低废水的c o d 和b o d ，尤其是在处理污染的河水时， 可以极大的降低河水的浊度和色值【1 2 l 。高梯度磁分离也可应用于细胞分离。 2 中南大学硕士学位论文第一章绪论 o w e n 1 3 1 使用高梯度磁分离设备从细胞悬液中分离顺磁性血红细胞，分离率可达 9 0 以上。 ( 二) 磁稳定流化床技术 磁场流化床( m a g n e t i c a l l yf l u i d i z e db e d ，m f b ) 是将外加磁场加入到普通的流 固相流化床中，采用磁敏性颗粒作为床层介质的处理系统，是使用电磁技术控制 传统流化床技术的分离方法，是一种高效率的新型流态化技术【1 4 ，1 5 1 6 1 。一般在 磁稳定流化床外施加匀强磁场，使床层中填充的磁性粒子等介质在外加磁场作用 下发生定向排列，粒子的随机运动被限制在小范围之内，减小介质返混程度。磁 稳定流化床同固定化床类似，具有稳定的床层，但同时又具有流化床的一些特性， 如流动性，实现了固体粒子与流体之间逆向接触，为简化操作条件、提高分离效 率建立了基础。刀。 m f b 床层磁场可以分为两种方式：轴向和径向【1 8 】，如图1 2 所示。目前应 用磁场流化床一般采用轴向磁场，径向磁场应用比较少见，这主要是在径向磁场 中颗粒由于受到流体中各种力的作用而产生旋转趋势。因此，相比较轴向磁场， 径向磁场要到达稳定操作状态所需要的磁场比较大。但是轴向磁场也有缺点，其 中颗粒轴向聚集成链容易引起床层在流动方向上造成很大空隙，导致床层分布不 均。相比之下，径向磁场使介质颗粒在径向排列成链，避免了上述轴向磁场的缺 点，在一定磁场强度范围之内，径向磁场可有效避免形成流体短路。采用径向或 者轴向，需要综合考虑经济技术条件和分离效果需求。 s ss ：l e 兰萎至茎量重量| i 耄 ： 匡兰萎享至茎茎茎j | 耄 n 仁墓嚣爿i 8 t t 图1 - 2 径向和轴向磁场流化床操作状态示意图 磁分离介质对磁稳定流化床的分离效率有显著影响。磁稳定流化床要求床层 填充的介质对所加磁场有响应，同时还要求物理化学性质稳定、较大的比表面积、 可化学修饰和可重生利用等特点。介质填充方法有两种：一种方法是在床层中完 全填充磁敏性物质，如裸露的铁、镍、钴金属小球【1 9 1 ，另一种是混合填充磁敏 性物质和非磁敏性物质【2 0 2 。而填充所用的磁敏性物质一般是微米级以上的磁 性载体材料，通常结构是核壳式2 2 t2 3 2 4 1 ，即由铁、钴、镍等金属及其氧化物组 成核，高分子无机物质组成壳层。 磁稳流化床技术优点是分离效率高、操作条件温和、对生物物质影响小、可 3 _咐川川咖 -一吖”， -q：=q -掉 中南大学硕士学位论文第一章绪论 以集成分离等，其可以广泛应用于细胞或蛋白质的分离过程中。b u m s 2 5 】等使用 辛巴蓝修饰的磁性载体，在磁稳定流化床中形成亲和磁色谱，从而吸附纯化人体 血清白蛋白；z h a n g 2 6 】等用磁稳流化床技术从大肠杆菌中提取重组蛋白，其收率 高达9 7 6 ，纯化因子为5 7 。 ( 三) 磁泳技术 磁泳是指磁性颗粒在外加磁场作用下在粘性介质中运动【2 7 2 & 2 9 】，其原理及 装置与电泳非常相似。电泳和磁泳的本质区别在于：电泳中带电颗粒为单极粒子， 在匀强电场中还是会受到电场力，可以使用匀强电场驱动目标粒子；但是磁泳中 磁性颗粒为偶极粒子，在匀强磁场中受力为零，所以磁泳必须采用梯度磁场。分 离过程中，通常在载流体流动通道的垂直方向上置非匀强磁场，在流动过程中， 由于流体中不同磁性的粒子所受的外磁场力不同，因此粒子在分离通道中运动产 生不同的轨迹或停留在不同位置，从而实现分离。磁泳技术操作方便，不存在焦 耳热，是一种高效率的磁分离方法。 基于磁泳技术原理，最常见的方法是磁性分流薄层分级系统【3 0 】( s p l i tf l o w t h i nf a c t i o n a t i o n ，s p l i t t ) ，其是为分离对于磁场有响应性的大分子、微粒或者 胶体而建立起来的新型分离纯化技术，其典型装置如图1 3 所示。 图1 - 3 磁性分流薄层分级示意图h 分离设备呈细长通道形状，置于磁场中。载体流体和样品流体分别经入n a 和b 进入磁性分离通道。当目标粒子被载流体携带通过分离通道时，磁性粒子会 在外磁场的作用力下在分离通道的径向上产生迁移。具有较低流速的粒子会由出 口b 流出，而具有较高流速的粒子向着磁场方向泳动而由出t l a 流出。f u h t 3 2 j 等应 用这一技术测定了不同离子标记的红细胞的磁化率。 另外还有各种各样基于磁泳技术的磁分离方法，刘新星等使用液体磁泳装置 团j 和半固体平板磁泳【3 4 】可以有效的分离得到强磁性的氧化亚铁硫杆菌； z b o r o w s k i 3 5 ，3 6 , 3 7 1 等使用四级磁场流动分离装置( q m s ) 3 8 1 分离纯化磁性微粒标 4 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 记的外周淋巴细胞，效果明显。 1 1 3 生物磁分离应用 磁性分离技术在生物学方面的应用始于上世纪7 0 年代中后期，目前已经在分 子生物学、免疫学、细胞生物学、生物工程学、微生物学、生物化学和生物医学 等领域取得了令人瞩目的科研成果。 利用磁分离技术可以方便地进行细胞分离和分类。单克隆抗体m a b 可以固 定在磁性载体表面，然后与目标细胞表面抗原a g 结合，就可以通过磁分离技术 使之分离。利用磁性细菌载体分离生物细胞的步骤如下所示【3 9 】： ( 1 ) 用修饰剂使趋磁性细菌表面膜活化 i 吒+ 修饰剂 霸一颤 乜f 蛙f l 细蒴 , r i 化的趋磁性细湾 ( 2 ) 使用选定抗体标识目标分离细胞 + 泌 待分离细胞 特定抗体 杯i l l 细胞 ( 3 ) 目标分离细胞与活化的磁性细菌相互作用而生成磁载体细胞 + j 舌f 匕目- f 1 3 磁州觋纲目坦 ( 4 ) 利用高梯度磁分离技术分离磁载体细胞 目标分离细胞与活化的磁细胞之间共价结合在一起的，因此必须选用适当的 抗体。抗体把活化的磁细胞和目标细胞结合在一起，一般通过分子设计来达到合 适的分子结构。 m o l d a y 4 0 】等是磁性载体技术分离细胞体系的最早建立者，他使用荧光染料 标记了含羧基磁性聚合物颗粒，再经过碳二亚胺活化，在颗粒表面偶联抗体，成 功分离了人红细胞和b 淋巴细胞。随着技术的发展，载体磁分离技术在微生物、 5 中南大学硕士学位论文第一章绪论 酶、核酸等分离领域得到了广泛应用【4 1 4 2 1 。 另外磁分离技术在免疫检测【4 3 1 、靶向给药1 、废水处理等多领域有重要应 用。宋慧平【4 5 】等人利用生物磁分离技术处理含铬废水，铬分离率达9 9 8 ，符合 国家污水综合排放标准。多领域的成功应用促使生物磁分离技术发展成为- - l - 多 学科交叉的热门学科。 1 2 趋磁细菌 趋磁细菌( m a g n e t o t a c t i cb a c t e r i a ，m t b ) 是指一类能在外加磁场中作定向运动 的革兰氏阴性微生物 4 6 1 ，其胞内可以产生磁铁矿晶体磁小体( m a g n e t o s o m e ， m s ) 。趋磁细菌胞内产生的磁小体颗粒是一种良好的天然磁性纳米生物材料，由 于其优良的性能而在众多领域具有巨大的潜在应用价值。日本学者m a t u s u n a g a 4 7 】 早在上世纪9 0 年代就预测趋磁细菌生成的磁性颗粒在将来会是高新技术产业应 用中的一种新型的生物材料。近年来，随着分子生物学技术等学科的迅速发展， 对趋磁微生物的形态学、遗传学、生物学特性、发酵条件和磁小体的磁学特性及 磁小体形成相关基因等的研究也迅速发展起来。 1 2 1 趋磁细菌的分布 上世纪7 0 年代b l a k e m o r e 在盐泽泥浆沉积物中首先发现了对地球磁场具有 磁响应行为的细菌，并将其命名为趋磁细菌。之后又有学者发现多种类似微生物， 证明了趋磁细菌广泛分布在自然界中，不管是南半球【4 8 】还是北半球【4 9 】，甚至赤 道【5 0 】等不同地理位置的内陆水域【5 l ，5 2 1 、河流【4 8 1 、湖洲5 3 5 4 1 、海域【4 9 ，5 5 ，5 印等沉 积物以及湿润的土壤【5 7 5 8 5 明中都发现了趋磁细菌的存在【6 0 l ，但多数只是在上述 区域的厌氧环境或微好氧环境中有分布。 到目前为止国内外学者己发现的趋磁细菌按形态可分为球菌，弧菌，杆菌， 螺旋菌、卵状菌和多细胞聚集掣6 1 6 2 】，见图1 4 。 6 中南大学硕士学位论文第一章绪论 图卜4 各种形态的趋磁细茵电镜照片 趋磁细菌普遍存在于全世界各地区的水环境里，不过南北半球的趋磁细菌一 般具有相反的趋磁性。在世界各地的淡水和海水环境中都曾发现过趋磁细菌。 f l i e s 【6 3 】等报道在富含有机物的湖泊底泥中一般存在各种球状的趋磁细菌，实验室 静止的底泥样品中，趋磁细菌群落在孵育期发生了剧烈的更替，最终占统治地位 的是一种趋磁球菌。在海洋环境中现今发现的趋磁细菌都来自近海地区，但有的 研究声称在3 0 0 0 m 以下的海底存在大量的趋磁细菌m 山5 1 。除了少数从含水量丰 富的泥土中发现趋磁细菌以外，大量的趋磁细菌都在水环境或底泥中具有严格的 垂直化学分层现象。发现趋磁细菌的水环境多种多样，最特殊的是酸性矿坑水和 温泉。通过观察显微镜下菌悬液在磁场下有规律泳动特性可以很容易地从泥或水 样中发现趋磁细菌。环境中复杂的垂直化学梯度对趋磁细菌的存在与分布具有很 大影响。大多数趋磁细菌都是典型的梯度生物，它们需要从邻近的氧化剂和还原 剂的反应界面获取能量，也就是说它们需要分布在这个界面附近【6 6 | ，如淡水环 境中的水沉积物界面附近【6 7 1 。这个环境条件很难在实验室条件下重建，因此就 很难得到纯培养的趋磁细菌。 1 2 2 趋磁细菌的分离 虽然趋磁细菌在自然界普遍存在，但是由于其要求的生长营养条件非常苛 刻，对其纯化培养和特性研究造成相当大的障碍。因此使得对趋磁细菌的研究一 度处于低迷状态。但是近年来，随着分子生物学技术等生物新技术的迅猛发展， 使得对于趋磁细菌的各方面研究也开始加速。 第一株纯培养趋磁细菌m a g n e t o s p i r i l l u mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1t 6 8 j 是 中南大学硕士学位论文第一章绪论 b l a k e m o r e 等从淡水沼泽的沉积物的富集物中分离培养得到的，并且验证该菌株 为微好氧菌，不能使用固体培养培养，只能使用密封的小血清瓶进行培养，期间 只有在最开始含有微量氧气的情况下才能产生磁小体【6 9 】。 经过多国学者的长期研究，到目前为止得到的纯培养趋磁细菌有m m a g n e t o a t c t i cm s 一1 1 6 0 1 、m s 一2 【7 0 1 、磁螺菌m s m 1 、3 、4 、6 、7 、81 7 1 】、m a g n 口幻s p i r i l l u m s p a m b 1t 5 1 1 、 m g 1 t 7 2 1 、m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s p m s r - 1 7 3 】： m a g n e t o c o c c u sm c 1 t 川、m c 2 1 7 5 、m c 3 1 7 6 1 ；m a g n t i cv i b ，i om v - 1 4 9 】和m v - 2 4 9 1 、 m v - 4 7 7 1 ，厌氧硫酸盐还原趋磁细菌r s 1 1 7 8 】等二十余株。其中有球菌3 株，弧菌 或弧螺菌4 株，螺旋菌1 1 株。除了r s 1 属于6 变形菌纲外，其它得到纯培养趋 磁细菌皆属于a 变形菌纲。 国内学者也从全国各地不同的地理环境中分离得到了多种趋磁细菌。范国昌 等从古黄土中分离得到了一株磁杆菌h m b 1 【7 9 】；卫扬保等从武昌东湖中分离得 到纯培养的一株趋磁细菌w d 1t 8 0 l ；吴小玲等从淡水环境中分离纯化得到了一株 趋磁螺旋细菌n m c 1 【8 u ；高梅影等从武汉印染厂废水淤泥中分离到了趋磁细菌 y n 1 【8 2 】；高峻等从黄海底泥中分离得到一株好氧趋磁细菌y s c 1 t 8 3 1 。 1 2 3 趋磁细菌的批量培养 磁小体拥有磁性纳米颗粒的独特磁学性能，相对于用化学方法制成的磁性颗 粒，其具有很多优点。趋磁细菌和磁小体在生物技术中有广阔的应用前景，但是 其应用的前提是：可以以较低的成本得到大量的趋磁细菌和磁小体。但是m t b 多数生长条件要求苛刻，极大地限制了其商业应用。趋磁细菌对氧气敏感，迄今 研究的趋磁细菌都是专性微好氧、专性或兼性厌氧微生物。如果在好氧或完全厌 氧条件下，m s 1 生长缓慢甚至不生长，均不会合成磁小体，磁小体合成必须要 有分子态的氧存在。它们主要分布在沉积物或水体的化学变化层环境中( o a t z ) ， 可能是依赖复杂的垂直化学和氧化还原梯度来生存的，在实验室条件下模拟这种 梯度变化非常困难。 近年来，人们对m t b 的批量培养做了大量工作，最初的研究主要是针对 m a g n e t o s p i r i l l u ms p ，使用1 0 l 发酵罐，得到1 0 0 0 l 发酵液，平均磁小体产量达 到1 4 5 m g l ，日均磁小体产量为1 8 5 m g l t 8 5 1 。有学者建立了一种可控氧发酵 罐，可长期维持低溶解氧状态，用于m g r y p h i s w a l d e n s e 的发酵，日平均磁小体 产量为6 3 m g l t 跖l 。相对来说，m g r y p h i s w a l d e n s e 表现出较高的氧耐受性，在很 宽的范围内，其生长不受溶氧浓度影响。菌株m s r 1 的菌体发酵密度达到7 2 4 ( 4 2 l 发酵罐，6 0 h 培养时间) ，细胞产量达2 1 7 9 l ，磁小体产量为4 1 7 1 6 7 m g l ，这是目前最高的报道，比先前的报道高了近3 倒8 7 l 。国内姜伟等用趋 g 中南大学硕士学位论文第一章绪论 磁螺菌m s r - 1 作为模式菌，采用深层发酵培养技术，获得大量菌体，对磁小体 的应用开发具有重要意义【船】。对趋磁细菌培养条件的研究必然成为未来的热点 领域，只有在趋磁细菌的发酵方面有重要突破，才能使趋磁细菌真正广泛应用于 生物技术领域。 1 2 4 趋磁细菌的磁学检测 趋磁细菌胞内磁小体排列成链状，成为高灵敏度的磁感应器，使趋磁细菌具 有了独特的磁学性质。磁小体链的磁矩足够大就可以克服细菌的随机热运动，从 而产生趋磁效应。可得m b o k b t ：m 是细胞磁矩，b 是地磁场感应强度，k 是玻 尔兹曼常数，t 是温度。由此可计算出2 0 摄氏度时产生趋磁效应的最小磁矩： 七b t1 3 8 xl o 嘲2 9 3 小晌2 百22 5 10 6 = 0 。1 6x1 0 一1 5 单位体积饱和磁化强度m s = 0 4 8 * 1 0 6 j m - 3 t - l ，一个细胞的磁矩是i 1 个磁小 体磁矩之和，半径为2 0 n m ，能够产生趋磁效应最少的磁小体个数： 一：三生： 望：! 鱼兰! 竺二! 一，n 一! ! _ _ - _ - _ _ - - _ 一= = _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ 一一 li m i n m x v o - 4 8 1 0 6 2 0 1 0 一9 ) 3 “ j 即至少含有1 1 个磁小体组成的链才能使菌体在地磁场中定向分布。通过 l a n g e v i n 方程计算得：在地磁场中，当m b d k b t = 1 0 时，9 0 的m t b 被定向。 最初，研究磁矩是用t e m 观察，之后出现了基于光散射和双折射的光学显微镜 观察菌体运动，第三种方法是直接用磁强计测量。据报道，m a g n e t o b a c t e r i u m 矫 顽磁力h c = 2 6 8 m t 8 9 1 ，每个细胞的磁矩m - - ( 0 2 2 - - 2 4 ) * 1 0 1 5 a m 2 【8 9 ，9 0 l ，比 理论最小值大5 0 左右。 大多数趋磁细菌的趋磁性可以直接用光学显微镜观察到，但是具体磁学性质 的检测依赖各种检测方法的更新：通常使用能谱分析和穆斯堡尔谱线研究以得到 磁性颗粒的元素组成和比例，以此推断是否是磁小体；高峻等使用核磁共振确定 海洋趋磁细菌y s c 1 胞内含有磁性材料，并使用交变梯度磁强计测量其磁滞回 线，测得其每个茵体的平均磁矩为：3 0 6 1 0 e m u 9 1 】；z h a 0 1 9 2 】等在普通分光光 度计上加装一个简单的双向磁场装置，利用趋磁细菌在水平和垂直磁场中不同的 定位效果产生的吸光度差异，可以简单有效的定量分析趋磁细菌中磁小体的含 量。 原子力显微镜是一种可用来探测包括绝缘体在内的固体材料表面结构的新 型分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原 9 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂 一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得 微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化， 就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面结构信息。原子力显微 镜使用磁性探针即可检测磁性材料的磁性质。a l b r e c h t 等使用原子力显微镜和磁 力显微镜有效的检测了生物纳米磁性材料的形貌和磁性质【9 3 】。 1 3 磁小体 趋磁细菌之所以在磁场中会表现出趋磁性，是因为细菌胞内含有排列成链的 磁小体( m a g n e t o s o m e s ，m s ) 。m s 的粒度一般在2 0 1 0 0 n m 之间，其多数组成 成分是f e 3 0 4 ，少数是f e 3 s 4 。有时在含有f e 3 s 4 的m s 中也会出现非磁性的f e s ， 一般认为f e s 为f e 3 s 4 的前体【9 引，但尚未出现有力证据。m s 颗粒外面一般包被 着一层含蛋白的磷脂双分子层膜，如果使用表面活性剂处理，则m s 会发生聚集 现象，因为表面活性剂能够破坏m s 表面的双分子层。 1 3 1 趋磁细菌中的磁小体 磁小体形态有多种结晶型，如平截六棱柱体、八面立方体、子弹状等，并且 其大小和形状通常具有种和菌株的特异性，而且其粒度也分布在单磁畴晶体稳定 范围内。趋磁细菌中磁小体一般排列成单链，由于磁小体之间的磁相互作用使得 这些磁小体的磁力矩在平行方向上定向，这就使磁小体链变成了永久的双磁极， 而且磁小体自然剩磁接近于饱和。磁小体链的形态除了最稳定的直链状外，还存 在簇状、环状、散布、弧状等形式( 图1 5 ) 。磁小体和磁小体链具有形态多样性， 但是在一种或者一株趋磁细菌中它们一般保持一致。即使同一株菌在不同条件下 培养得到的磁小体的形态变化也非常d d 9 5 1 。 图1 5 磁小体链的不同形态a ：簇状：b ：弧状：c ：环状 研究f e 3 0 4 型磁小体颗粒时发现，其磁小体无机相被生物质膜包被，由此形 成膜囊泡结构阴1 ( 见图1 - 6 ) 。g o b r y t 9 6 1 等人对磁螺菌m s 1 的磁小体质膜进行研 1 0 中南大学硕士学位论文第一章绪论 究时发现磁小体膜的主要成分是磷脂和脂肪酸，还含有一部分蛋白质，磁小体膜 是脂质双分子层结构，不论化学成分还是结构都与细菌胞体其它内膜非常类似， 其脂类主要包括三部分：中性脂类和游离脂肪酸、糖脂和硫脂、磷酸脂。它们分 别占总脂的质量百分比是8 、3 0 和6 2 ，这其中的磷酸脂的主要组成是磷脂 酞丝氨酸与磷脂酞乙醇胺。磁小体膜组成结构和其它内膜的相似性可能说明磁小 体膜的来源是细胞膜。已有证据证明磁小体囊泡是在磁小体之前形成的，因为如 果趋磁细菌培养基缺乏铁源，那么就能发现细胞中存在空的囊泡或未完全成熟的 较小磁小体，说明可能先形成磁小体囊泡，再在囊泡内发生生物严格控制的矿化 反应，最终形成成熟的磁小体。 图1 - 6 磁小体外包被的膜a ：胞内的磁小体；b ：提取出的磁小体；c ：a d s 处理过的磁小体 1 3 2 浸矿细菌中磁小体 浸矿细菌生长在金属矿山酸性矿坑水( a c i dm i n ed r a i n a g e ，a m d ) 中，其生长 环境中有大量的f e r n s 元素，很多浸矿微生物与趋磁细菌有一些相似点( 见表 1 1 ) ，通过研究发现一些浸矿细菌胞内也会生成磁性颗粒，这种现象对生物矿 化的研究有非常重要的意义。 表1 1 趋磁细菌与浸矿细菌( 以氧化亚铁硫杆菌为例) 的相似性比较m 1 中南大学硕士学位论文第一章绪论 刘新星等在云南某金属矿山酸性矿坑水中分离纯化得到了一株氧化亚铁硫 杆菌y n 3 3 3 1 ，其可以在胞内产生磁性颗粒，因此使胞体具有了微弱的趋磁性。 其研究结果表明：y n 3 在以f e s 0 4 为能源生长时，其胞内能产生黑色电子致密颗 粒，推断其为磁性颗粒，每个细胞里面产生2 5 颗磁性颗粒，这些磁性颗粒不像 传统的趋磁细菌的磁小体一样组装成链，而是散布在细胞内；而在缺乏亚铁环境 中，只使用硫培养或加入f e c l 3 的硫培养都不会形成磁性颗粒。y n 一3 中生成的磁 性颗粒形态基本呈球状，只由f e 和。两种元素构成，因此推测其组成是f e 3 0 4 ， 粒度分布在6 0 n m 9 0 n m 之间，形状粒度都比较均匀，证明氧化亚铁硫杆菌中磁性 颗粒的形成受到一套比较严格的机制来调控。g a o 等从银山铜矿矿坑水中分离 纯化得到一株嗜铁钩端螺旋菌y s k ，通过透射电镜观察发现其胞内也可以产生磁 性颗粒，并成功分离纯化得到了磁性颗粒，能谱分析其同样由f e 和0 两种元素 构成i 卯j ( 如图1 7 ) 。 图1 - 7 从嗜铁钧端螺旋菌胞内提取的磁性颗粒及其能谱图p ” 1 3 3 磁小体的应用 生物合成的磁小体拥有磁性纳米颗粒的优良特性，相对于化学方法合成的磁 性纳米颗粒，生物磁小体有很多明显优点。磁小体晶体粒度分布在很窄的范围内， 形貌比较统一，化学合成则很难生成如此的单晶磁性颗粒。磁小体的生物合成是 受基因控制的，因此能生成一些化学合成难以合成的晶体态。与化学合成相比， 生物合成的磁小体无毒性，被质膜，不团聚，在生物技术、生物医学、生物材料 等领域有非常广阔的应用前景。 磁小体最大