（植物学专业论文）新型全细胞催化剂在麻疯树生物柴油中的应用.pdf

新型全细胞催化剂在麻疯树生物柴油中的应用 植物学专业 研究生王小行指导教师陈放 生物催化剂是生物柴油转酯反应研究中重要的研究对象，目前新酶种的 发现和全细胞催化剂的开发是这个领域中的研究热点。麻疯树 ( j a t r o p h ac u r c a s ) 是重要的植物油脂资源，对生物柴油的开发具有重要价值， 为此本文研究了麻疯树油脂代谢的重要代谢酶一脂肪酶，通过粉状毕赤酵 母表达系统初步开发了该酶的全细胞催化剂，并且研究了该催化剂对麻疯树 油脂的催化效率，为麻疯树资源的深层次开发奠定了基础。 本文通过基于生物信息学的基因克隆方法首次克隆了麻疯树脂肪酶 ( j c l i e 3 ) ，通过r a c e 实验获得了该基因全长序列，基因长1 5 8 2 b p ，其最长 读框编码3 5 6 个氨基酸蛋白质，在大肠杆菌中表达实验表明，麻疯树脂酶具 有活性0 8 u m l ，同时运用生物信息学手段对j c l i p 3 基因核酸以及蛋白质序 列做出了分析，预测了蛋白质的活性中心，并且发现蛋白质在“龃”结构上 与毛霉脂酶存在较大差异。 本文首次构建了粉状毕赤酵母的表达系统，确定了转化系统的整合载体 结构，感受态制备方案以及电击转化的参数，最终证明该表达系统在2 0 天 的连续培养中不会丢失，并且将麻疯树脂酶基因在该酵母中成功地表达，通 过r t - p c r 、蛋白质电泳以及酶活测定等实验证明了麻疯树脂酶能够在该酵 母正确表达出具有活性的蛋白质。 在生物柴油制备研究中，我们比较了本文全细胞催化荆和不同公司的固 定化脂肪酶对麻疯树油脂和大豆油脂的作用效果，结果表明麻疯树油脂中油 酸甲酯和亚油酸甲酯含量相当且较多，而棕榈酸甲酯和亚麻酸甲酯略少。麻 疯树脂酶全细胞催化剂对麻疯树油脂的催化能力要比对大豆油的强，虽然如 此，全细胞催化剂对麻疯树油脂的作用效果略逊于其它固定化酶的效果。 关键词麻疯树；生物柴油；脂肪酶；基因克隆；活性中心；粉状毕赤 酵母；表达系统；全细胞催化剂 2 an o v e lw h o l e - c e ii b i o c a t a i y s isu s i n g i n p r o d u c t i o no fb i o d i 8 s e i o fj a t r o p h ac u f c a s m a j o rb o t a n y g r a d u a t e ds t u d e n t x i a o x i n gw a n g t u t o rc h e nf a n g b i o c a t a l y s i si st h em a j o rr e s e a r c hf i e l di nt h et r a n s e s t e r i f i c a t i o no f b i o d i e s e l d i s c o v e r y i n gn e wl i p a s ea n dd e v e l o p i n gt h ew h o l e c e l lb i o c a t a l y s i sm a yb et h e k e yp r o b l e m si nb i o c a t a l y s i so fb i o d i e s e l j a t r o p h ac u r c a si s 柚i m p o r t a n tl i p i d s r e s o u r s eo fp l a n t , w h i c hi sv a l u a b l ei i ib i o d i e s e l i nt h i sp a p e rt h el i p a s eo f 1 c u r c a sw a sc l o n e da n dw a se x p r e s s e di np i c h i af a r i n o s at om a k ean o v e lw h o l e c e l lb i o c a t a l y s i s t h ee f f e c to ft h eb i o c a t a l y s i sw a st h e ns t u d i e d t h i sw i l lp r o v i d e a p r a c t i c a lp e r f o r m a n c ef o r t h ee x p l o i t a t i o no f j a t r o p h a t h el i p a s eo f c u r c a $ ( j c u e 3 ) w a sc l o n e df o rt h ef i r s tt i m eb yg e n ec l o n i n g m e t h o d sb a s e do nb i o i n f o r m a t i c s t h ef u l l - l e n g t he d n aw a so b t a i n e db yr a c e e x p e r i m e n t ，w h i c hw a s1 5 8 2 b pa n de n c o d e d3 5 6 a ap r o t e i ni ni t sf u l l e s to r e t h e g e n ew a se x p r e s s e di ne c o l it oc h a r a c t e r i z et h ef u n c t i o n t h ee n z y m ea c t i v i t y w a s0 8 u m li nec o l i t h eb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tj c l i p p r o t e i nh a d st h es a m ea c t i v i t yc e n t r ea st h a to f r h i z o m u c o rm i e h e i ，b u ta d i f f e r e n t l i ds t r u c t u r ef r o mt h ek n o w ns t r u c t u r e i nt h i sp a p e rt h ee x p r e s s i o ns y s t e mo fp c h af a r i n o s aw a sf i r s tc o n s t r u c t e d t h es t r u c t u r eo fi n t e g r a t i o nv e c t o r , m e t h o do fp r e p a r a t i o no fc o m p e t e n tc e l l sa n d p a r a m e t e r so fe l e c t r o p o r a t i o nw a sd e t e r m i n e d a n dt h eg e n e t i cs t a b i l i t yo ft h i s s y s t e m w a st e s t e da n dr e s u l t ss h o w e dt h a ti tc o u l db es t a b l ei n2 0d a y s c o n t i n u o u sc u l t u r e t h ej c l i p 3g e n ew a st h e ne x p r e s s e di nt h i ss y s t e m t h e r e s u l t so fr t - p c r ，p r o t e i ne x p r e s s i o na n a l y s i sa n dd e t e r m i n a t i o no fe n z y m e 3 a c t i v i t vs h o w e dt h a tt h eg e n ew a sa b l et oe x p r e s sp r o p e r l yi nt h i ss y s t e m i nt h er e s e a r c ho fb i o d i e s c lo f j a t r o p h at h ee f f e c to fw h o l ec e l lb i o c a t a l y s i st o l i p i d so fj a 抑o p h na n ds o yb e a nw a sc o m p a r e dt o t h a to fi m m o b i l el i p a s eo f d i f f e r e n tc o m p a n i e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee f f e c to fw h o l ec e l lb i o c a t a l y s i s i nt h i sp a p e rh a dab e t t e re f f i c i e n c yi nt r a n s e s t e r i f i c a t i o no fl i p i df r o mj a t r o p h a t h a l lt h a to fs o yb e a n ， 关键词j a t r o p h ac u r c a s ，b i o d i e s e l ，l i p a s e ，g e n ec l o n i n g , a c t i v i t yc e n t e r , p i c h i a f a r i n o s e ，e x p r e s s i o ns y s t e m ，w h o l e - c e l lb i o c a t a l y s i s 4 第一章麻疯树脂酶全长基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 脂酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) 是催化甘油三脂水解反应的水解酶类，在动物，7 植物，真菌以及细菌中普遍存在，不同生物的脂酶在蛋白质分子量，底物或 键特异性以及催化效率等方面均有所不同，但是它们与酯酶( e s t e r a s e ) 具有很 大差异，主要表现在脂酶的催化活性只有在油水界面才能被激活【1 】。脂酶底 物具有多样性，比如天然油脂分子，合成非天然油脂，油脂的对映体等，因 此脂酶广泛应用于油脂工业，饲料添加和酶制剂工业。目前脂酶从能够利用 油脂细菌和真菌中分离和纯化，比如米黑根毛霉( r h i z o m u c o rm i e h e i ) 2 1 ，假 丝酵母( c a n d i d as p ) 3 1 ，而且这些脂酶都通过固定化酶技术应用于生物柴油的 生物催化研究中，而植物源的脂酶国内外研究比较少，主要由于植物脂酶比 较难分离纯化，加之脂酶之间序列具有很大的差异，因此加大了植物来源的 脂酶研究难度。 麻疯树( j a t r o p h ac u r c a s ) 隶属于大戟科，麻疯树属，主要分布于热带和亚 热带地区，在我国广泛分布于云南、四川、广西，广东、海南等地，其种子 含油量达到3 0 以上，麻疯树油脂肪酸组成和菜籽油非常相似，是生物柴油 的理想原料f 4 j 。本文首次克隆了麻疯树的脂酶基因并鉴定了该基因功能，旨 在将麻疯树脂酶应用于麻疯树油脂的生物催化反应，以增加生物催化的特异 性，从而更有效地利用麻疯树油脂资源。 1 材料与方法 1 j 实验材料 1 1 1 菌种和载体 大肠杆菌t o p l 0 、b l 2 1 ( d e 3 ) ，由本实验室保存 p m d l 8 - - t v e c t o r ( d 5 0 4 ) ，购自宝( t a k a r a ) 生物工程有限公司 1 1 2 酶制剂 e c o r l 和n o d ，购自宝( t a k a r a ) 生物工程有限公司 1 1 。3 试剂盒 5 t r i z o l 试剂购白i n v i t r o g e n 公司 s t a r t t mr a c e ，a d v a n t a g e2p c rk i t 试剂盒，购自c l o n t e c h 公司 r t - p c rk i t ，e x t a q t mp c rk i t ，t a 克隆试剂盒，购自宝生物工程有限 公司 小量胶回收试剂盒，购自v - g e n e 生物工程有限公司。 1 1 4 常用培养基和缓冲液 l b 培养基 p b s 磷酸缓冲液 电泳缓冲液 1 2 实验方法 1 2 1 麻疯树的组培 轻轻去掉麻疯树种子外面的黑色硬壳，保留完整的种子；用洗衣粉等强 去污剂将种子洗净，用清水浸泡放四度冰箱过夜春化；将种子在无菌水中清 洗后，先用7 5 酒精消毒一分钟，无菌水洗，再0 1 升汞消毒十分钟，无 菌水清沈数遍，最后取出放在平板上的无菌滤纸上；轻轻剥离出里面的胚； 将胚芽插入m s 培养基中；组培室光照培养数日嘲。 1 2 2 麻疯树总r n a 分离 以下操作除注明室温操作外均为4 操作。 a 破碎细胞取0 1 94 叶期新鲜叶片到用液氮预冷的研钵中，加入液 氮，用研棒研磨直至将细胞碾成粉末状。注意，在碾碎的过程中要始终保持 研钵中有液氮，以防止r n a 降解。 b 将粉末状细胞装入处理过的1 5 m l e p 管中，加入l m l t r i z o l 用枪 反复吹打，混匀，盖上e p 管盖。室温下静置5 分钟，以利于t r i z o l 进一 步处理细胞。 c 加入0 2 m l 氯仿到e p 管中，盖上管盖，用手拿住e p 管反复摇动1 5 秒后，于室温下静置2 3 分钟后，1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 5 分钟。 d 取出，吸上清到一新1 5m l e p 管中，注意不要吸入蛋白质。加入0 5 m l 异丙醇。将e p 管轻轻颠倒2 ，3 次后。于2 0 沉淀1 小时以上。1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 分钟。 c 去上清，加入l m l 7 5 7 醇，将e p 管轻轻颠倒2 ，3 次后于8 , 0 0 0 r p m 离心5 分钟。倒掉乙醇，将1 5m l e p 管倒扣于滤纸上5 1 0 分钟凉干。 f 最后用2 0 5 0 u ld e p c - t r e a t e dw a t e r 溶解后，放入液氮或2 0 c 保存。 分别取0 5 肛l ，舢l ，弘lr n a 在含o 1 , g m l 溴乙锭的1 2 甲醛变性 凝胶中电泳3 0 分钟到1 5 小时，电压5 7 v c m 。 1 2 3 麻疯树脂酶全长基因f s t 引物设计 将拟南芥脂酶基因提交至无冗余数据库和e s t 数据库进行相似性搜索， 获得l i p a s e 基因的全长基因和未注释的e s t 序列，分析序列读框并将其翻 译成氨基酸序列，使用v e c t o rn t i1 0 0 软件和p r i m e rp r e m i e r 5 0 进行设 计引物，引物长度以2 5 b p 为宜，回文序列长度不超过6 b p ，重复序列不超过 4 b p ，茎环结构长度不超过3 b p 。1 m 值在5 0 c 6 5 c ，g c 含量在4 0 6 0 之间。扩增长度在4 0 0 b p 5 0 0 b p 之间。 1 2 4 麻疯树脂酶全长基因e s t 扩增 按1 2 2 的方法提取麻疯树总r n a 。 将麻疯树总r n a 于7 0 c 水浴变性2 分钟，立即于冰上5 分钟，然后使 用p r o m e g a 公司的反转录体系如下： g o l db u f f e r 7 4 “l d n t p1 0 m m o l l 0 1 舡l o l i g o ( d t ) 1 5 1 缸l r r n a s i nr i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r 0 7 5 z l a m v r t ( 2 0 2 5 u p l ) 0 5 “l 加入2 0 * l 麻疯树总r n a ，于3 7 c 反转录4 0 分钟，完成后放置在9 5 c 水浴中5 分钟终止反应。取2 斯l 作为模板，按照如下体系进行第一轮的梯 度p c r 扩增。 去离子水 3 2 # l 1 0 p c r 缓冲液靴l m g c t2 4 , l d n l l pm i x ( 1 0m m o l l ) 4 “l 7 l i p 5 l ( 2 0 m m o l l ) 1 , l l i p 3 一l ( 2 0 # m o l l ) h l t a qd n a 聚合酶( 5 u m l ) 0 斯l 取m l 第一轮梯度p c r 扩增产物作为模板，使用内侧巢式引物按照如下 体系进行第二轮梯度p c r 扩增。 去离子水3 3 跏l 1 0 x p c r 缓冲液跏l m g c l 2舡l d n t pm i x ( 1 0r e t o o l l ) 4 “l l i p 5 - 2p r i m e r ( 2 0 z m o l l ) 1 “l l i p 3 - 1p r i m e r ( 2 0 l m o l l ) 1 “l t a qd n a 聚合酶( 5u # l )0 舡l 取鼽l 于1 0 琼脂糖凝胶中电泳，并在紫外分析仪下观察。 将大量p c r 产物在1 o 琼脂糖凝胶中按5 v e r a 电场强度进行电泳。当 片段充分分离开以后，用医用手术刀片将电泳条带切下，分别装在e p 管中， 称重按照胶回收试剂盒操作说明回收片段。回收完毕后，取铋l 于1 o 琼 脂塘凝胶中电泳检测。 使用p m d l 8 - tv e c t o r 将p c r 片段1 a 克隆，通过蓝白斑筛选重组子， 验证后交寄测序。 1 2 5 麻疯树脂酶全长基因c d n a 3 r a c e 扩增3 端未知序列 按1 2 2 的方法提取麻疯树总r n a 并检测。 在e s t 序列基础上使用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件设计3 r a c e 引物l i p 3 r 。 按t a k a r a 的r n a p c r k i t ( a m v ) v e r 3 0k i t 操作说明书加入以下体系： 麻疯树总r n a 9 5 u l 1 0 r tb u f f e r 2 “l m g c l 2 4 , l 于7 0 水浴2 分钟后，立即冰浴5 分钟，加入以下成分： d n t pm i x ( 1 0m m o l l ) 2 l l o d a a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 1 , l 8 o l i g o ( t i t ) - a d a p t o rp r i m e r m l r n a s ei n h i b i t o r0 5 a l 共2 q “l 反转录体系于4 2 水浴温育1 5 小时。完成后放置在9 9 c 水浴 中5 分钟终止反应。取5 b t l 作为模板，按照如下体系进行第一轮的梯度p c r 扩增。 去离子水2 7 靴l l o x p c r 缓冲液靴l m g c l2 5 a l d n t pm i x ( t 0r e t o o l l ) 4 “l l 5 1p r i m e r ( 2 0 m m o l l ) 1 “l m 1 3p r i m e r 2 “l t a qd n a 聚合酶( 5u 【l ) o 靴l 以第一轮p c r 产物稀释1 0 倍，再取5 a l 为模板，以l i p 5 - 2 ，m 1 3 为引 物进行第二轮梯度p c r 扩增。同时再以i j p 5 2 ，l i p 3 1 为引物，作为c k + 。 去离子水2 7 舡l 1 0 p c r 缓冲液靴l m g c l2 耻l ， d n t pm 白, 0 0r e t o o l l ) 4 a l l i p 5 2p r i m e r ( 2 0 【m o t l ) l “l m 1 3p r i m e r 2 “l t a qd n a 聚合酶( 5u 肛l ) 0 舡l 以第二轮p c r 产物为模板，先将其稀释1 0 倍，再取5 a l 为模板，以 3 ，r a c e 引物进行第三轮梯度p c r 扩增。 去离子水2 7 靴l 1 0 x p c r 缓冲液靴l m g c i2 5 “l d n t pm i x ( 1 0m m o v l ) 4 “l l i p 3 r ( 2 0 ”t o o l l ) h l m 1 3 缸l 9 t a qd n a 聚合酶( s u “l ) o 舡l 混匀后，9 5 ，4 0 秒；退火温度从4 8 6 2 ；7 2 ，2 分钟反应2 5 个循 环。反应结束后各取瓢l 在1 0 琼脂糖凝胶中电泳，并在紫外分析仪下观 察。 回收r a c e 样品电泳中所有条带，通过t a 克隆将片段克隆到p m d l 8 - t v e c t o r 载体中，p c r 检测重组子，并交寄测序。 1 2 6 麻疯树脂酶全长基因c d n a 5 r a c e 引物设计 g s p 引物设计要求引物长度在2 3 2 8 b p 之间，g c 含量5 0 7 0 ，t m 6 5 ，同时对于e s t 序列最好尽量靠近5 端，有利于扩增5 未知序列。 使用p r i m e rp r e m i e r 5 0 软件设计引物。 1 2 7 麻疯树脂酶全长基因c d n a 5 r a c e 扩增5 端未知序列 按1 2 2 的方法提取麻疯树总r n a 并检测。 按s m a r t t mr a c ee d n a a m p l i f i c a t i o nk i t 操作说明书加入以下体系： 麻疯树总r n a ( 4 5 0 n s u l ) 1 瓤l 5 一c d sp r i m e rh l s m a r ti i a o l i 童o“l d t t ( 2 0 m m ) “l 加入无r n a s e 的去离子水1 跏l ，加入少量无r n a s e 的矿物油。于7 2 c 水浴2 分钟后，立即冰浴5 分钟，加入以下成分： 5 f i r s t - s t r a n db u f f e r 2 a l d n t pm i x ( 1 0m m o l l ) 1 “l p o w e r s c r i p t ”r e v e r s et r a n s c r i p t a s e 1 “l 共1 叩l 反转录体系于4 2 c 水浴温育1 5 小时。转录完成后，加入1 0 0 # l t r i c i n e e d t a 缓冲液。于7 2 水浴温育7 分钟。 按照表格1 1 加入反应体系。 按照以下参数进行t o u c h d o w np c r 1 9 4 ，3 0 秒；6 8 ，1 分钟；7 2 ，3 秒；5 c y c l e s 2 9 4 ，3 0 秒；6 6 ，1 分钟；7 2 ，3 秒；5 c y c l e s 3 9 4 ，3 0 秒；6 4 ，1 分钟；7 2 ，3 秒；2 5 c y c l e s 1 0 4 7 2 ，1 0 分钟 各取靴l 在1 o 琼脂糖凝胶中电泳，并在紫外分析仪下观察。 表1 1 麻疯树脂酶全长基因5 r a c e 反应体系 为e s t 序列的特异引物 回收r a c e 样品电泳中所有条带，通过t a 克隆将片段克隆到p m d l 8 t v e c t o r 载体中，p c r 检测重组子，并交寄测序。 1 2 8 麻疯树脂酶全长基因全长c d n a 序列拼接 使用v e c t o rn t i1 0 0 软件对麻疯树脂酶全长基因e s t ，c d n a3 端序列 和5 端序列的测序结果进行拼接，同时对拼接结果中比对不一致的位点加以 更正。将完整的序列进行复制生成序列文件。 1 2 9 麻疯树脂酶全长基因o r f 的验证 使用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件设计引物，要求引物扩增长度应包括全部编 码框的序列。之后用所设计的引物对本章1 2 7 的反转录产物进行p c r 扩增， 体系如表3 的特异片段一栏。取5 9 l 扩增产物电泳检测。t a 克隆特异扩增 的o r f 片段，交寄测序。 将测序结果与拼接序列比较看是否存在差异。 1 2 1 0 麻疯树脂酶全长基因内部e c o r i 酶切住点的消除 使用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件设计引物，应用引入突变的连接p c r 的方 法消除l 2 9 验证过的麻疯树脂酶全长基因o r f 内部的e c o rl 酶切位点。t a 克隆e c o ri 位点消除的o r f 片段，交寄测序。 1 2 1 l 重组表达质粒的构建 将1 2 1 0 去除e c o r i 酶切位点的地上p 基因全长o r f 用e c o r l 和n o t i 双酶切，回收片段并与用e c o ri 和n o ti 双酶切的p e t 2 8 a ( + ) 载体连接，转 化大肠杆菌t o p l 0 ，筛选重组质粒p e t 2 8 a ( + ) 1 i p a s e ，交寄测序。 1 2 1 2 在大肠杆菌中的诱导表达 将重组质粒p e t 2 8 a ( + ) - l i p a s e 转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，筛选表达菌株 b l - p e t 2 8 a ( + ) - l i p a s e ，表达菌生长至o d 6 0 0 值在o 4 加6 时，经l m m o l l i p t g 诱导表达，表达产物通过s d s p a g e 电泳分析。 1 2 1 3 表达产物的活性测定 将诱导表达3 小时的发酵液1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 分钟，收集菌体，超声波 破碎，1 2 ，0 0 0 i p m 离心1 5 分钟，取上清液，参考文献【6 1 ，以三丁酸甘油酯为 底物，采用浊度比色法检测酶活。酶活为在2 5 ( 2 ，p h 7 0 时，每分钟水解甘 油三酸脂并释放1 m m o i 脂肪酸所需要的酶量为1 个单位。 2 结果与分析 2 ，1 麻疯树脂酶j c l i p 基因e s t 验证 我们首先通过n c b i 搜索引擎( e n t r c z ) 获得拟南齐，水稻的l i p a s e 全长基 因，然后用这两条序列对核酸数据库和e s t 序列数据库的进行相似性搜索， 根据得分和序列长度筛选获得1 8 条e s t 序列，将获得的e s t 序列根据 b l a s t 结果翻译成蛋白质序列，虽然这些蛋白质序列不是完整的，但是通 过多序列比对发现它们基本包含了l i p a s e 基因的保守区域，比对结果如图 1 1 。我们选择了3 个保守区域设计简并引物，如图1 1 。 为降低引物简并度，增加简并p c r 特异性，在根据序列同源性设计简 并引物同时，参考了物种的亲缘关系，在所选序列中我们根据物种分类地位， 选择了与麻疯树同属于e u r o s i d si 总目中的g l y c i n em a x 、m a l u ss i e b o l d i i 、 p o u l u sb a l s a m i f e r 的核酸多序列比对作为降低引物简并度的参考，针对简并 引物简并度较高的区域舍去没有出现或出现少的碱基，结果见表1 2 。 麻疯树总r n a 提取结果如图1 2 ，我们使用所设计的简并引物对麻疯树 图1 1 不同物种来源的l i p a s e 基因多序列比对a a n 3 1 8 8 5 ：a r a b i d o p s i s t h a l i a n m c a d 3 2 6 9 6 ：t r i t i c u ma e s t i v u m ；x p 4 7 9 4 4 2 ：o r y z as a t i v a ：c d 8 2 4 9 3 2 ：b r a s s i c an a p u s ： c f 8 0 5 9 0 1 ：g l y c i n em “；c n 9 1 5 6 8 5 ：m a l u ss i e b o l d i i ；c n 5 5 0 3 9 4 ：p o u l u sb a l s a m 澹，； c a l 2 1 7 5 4 ：s a c c h a r u m o f f t c i n a r u m ：c f 4 3 6 2 2 2 ：a u i u mc e p a ：a j 5 5 9 9 2 6 ：a n t i r r h i n u m m a j u s ：b q 8 7 3 7 1 3 ：l a c t u c as a t i v a ；b m 0 6 5 1 0 0 ：c a p s i c u ma n n u u m ；c k 8 伽： s o l a n u mt u b e r o s u m ：c o f f 7 6 9 8 1 ：g o s s y p i u mr a i m o n d i i ；c f 5 1 5 3 5 3 ：m t i sv i n f e r a 租线 标注位置为简并引物的位置。 表1 2 依据多序列比对获得的简并引物 简并引物经过修改的简并引物 编号保守序列位置 序列简并度 序列简并度 g a y l r r n t w ig a y l t r t w y u p 5 - 1d l ( y f i l ) w k q 1 5 0 - 1 5 5 1 9 23 2 t g g a a rc at g g a a r c a g c w l a y 州g c 鼬1 # 娃c a n l i p s - 2( a s ) y ( h n ) n t ( t 1 ) 1 7 5 1 8 0 3 8 43 2 a a y a c rw ya a y a c ra c c kw g gy t gc k w g gy t o h p 3 - 1 m f f c m p r2 3 3 2 3 9y e cr a a n g t 2 5 6y c ca a a t g t8 c 盯 c a t n o k ：y t o r c jn ：ga t 盯c ；w ：t o r a ；h ：c ，t o r a ；融a o r g ；m ：c o r a ；k ：t o r g 反转录产物进行2 轮梯度p c r ，实验结果表明第一轮的梯度p c r 没有获得 预期2 6 0 b p 左右的片断，但是通过第二轮巢式的梯度p c r 我们在不同温度 下均获得了预期大小的扩增片段，约1 9 0 b p ，结果如图1 2 b 。 图1 2j c l i p 基因简并r t - p c r 结果( a ) 麻疯树总r n a 结果：( b ) 简并r t - p c r 结果，箭头所示为扩增的e s t 序列，l a n 7 ：c k ；l a n l - 6 ：分别为不同退火温度6 2 c ，5 9 ， 5 6 ，5 3 ，5 0 ，4 7 ：m 为m a r k e r 。 2 2 麻疯树脂酶j c l i p 基因e d n a 3 r a c e 以获得的1 9 0 b pe s t 序列设计r a c eg s p 引物进行e d n a 扩增，根据多 序列比对推算3 r a c e 片断在8 0 0 b p 左右，将8 0 0 b p 附近的条带回收测序， 最终确定箭头所示片段为j c l i p 基因3 端序列，梯度p c r 结果表明目的条 带不是扩增效果最好的条带，但是在较高退火温度时，条带的特异性相对加 强，如图1 3 a 。 图1 3 , c l i p 基因r a c e 实验结果( a ) 3 r a c e 结果，箭 头所示为目标条带，l a n 9 ：c k ；l a n l 一8 ：分别为不同退火 温度6 2 ，6 0 ，5 8 ，5 6 ，5 4 c ，5 2 ，5 0 ，4 8 ： m 为m a r k e r 。( b ) 5 r a c e 结果 2 3 麻疯树脂酶j c l i p 基因c d n a 5 r a c e 使用p r i m e rp r e m i e r5 0 设计的g s p 引物长度2 6 b p ，t m 值6 8 ，g c 含 量5 5 ，无重复序列，引物符合试剂盒操作说明要求。利用此引物进行的 5 r a c e 电泳如图1 3 b ，5 r a c e 的扩增条带较3 r a c e 单一，经测序确定 为j c l i p 基因5 端序列。 2 4 麻疯树脂酶j c l i p 基因全长c d n a 拼接以及编码框验证 将j c l i p 基因c d n a 末端序列和e s t 序列拼接成完整序列，序列全长 1 5 8 2 b p ，将其最长读框翻译成蛋白质，蛋白质全长3 5 6 个氨基酸，同其他植 物的l i p a s e 序列进行蛋白质序列比对，结果表明麻疯树l i p a s e 蛋白质与拟南 芥l i p a s e 相似性达7 1 6 ，与大麦l i p a s e 的相似性达6 9 i ，与水稻l i p a s e 的相似性达6 1 5 ，与同属于e u r o s i d sl 总目的g l y c i n em a x 、m a l u ss i e b o l d i i 、 p o u l u sb a l s a m i f e r 三个物种的l i p a s e 部分片断相似性分别高达8 0 9 、8 2 6 、8 5 6 ，说明i i p a s e 基因在植物中具有很高的保守性，如图1 4 。 图l _ 麻疯树全长l i p a s e 基因同拟南芥，大麦和水稻的多序列比对a a n 3 1 8 8 5 ： a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；c a d 3 2 6 9 6 ：t r i t i c u ma e s t i v u r a ；x p 4 7 9 4 4 2 ：o r y z as a t i v a ； t r a n s l a t i o no fj c l i p - c d n a ：j a t r o p h ac u r c a $ t r a n s l a t i o no fc f 8 0 5 9 0 1 ：g l y c i n ei i , l a x ； t r a n s l a t i o no fc n 9 1 5 6 8 5 ：m a l u ss 出b o l d i i , t r a n s l a t i o no fc n 5 5 0 3 9 4 ：p o u u sb a l s a m i # r 2 5 麻疯拇f j c l i p 基因在大肠杆菌中表达 根据j c l i p 基因e d n a 序列设计引物，如下l i p o r f 55 鱼色塑 肖t g c g g c a c g g a a g g c g t l l 3 ，l i p o r f 一35 q 鱼q 鱼c t a a a c a c g g t r a c c r c c a = i 3 。见图1 5 我们成功地将眦，p 基因全长o r f 构建到了 p e t 2 8 a ( + ) 载体中，并且表达了该基因。通过i p t g 诱导，离心，取菌体裂解 后上清样进行s d s p a g e 蛋白质电泳分析，表明j c l i p 在大肠杆菌中表达的 融合蛋白在约4 6 k d 左右的位置上有明显的条带，而对照在同一位置上基本 无条带，如图1 6 。该表达产物为n 端带有6 x h i s 结构的脂肪酶成熟肽融合 蛋白，因而分子量比原蛋白的分子量大。 图1 5 表达质粒p e t 2 8 a ( + ) - l i p a s e 示意图 r o m o t e 2 6 麻疯树j c l i p 基因在大肠杆菌中表达产物酶活的测定 表达菌株b l - p e t 2 8 a ( + ) - l i p a s e 诱导表达的表达蛋白一部分形成包涵体， 一部分以可溶蛋白存在。取裂解后上清液测酶活，活力为0 8 u m l 左右，而 对照( b l 2 1 ) 菌株没有酶活。尽管酶活力偏低，但足以说明脂肪酶基因得以成 功克隆，并有所表达。 3 讨论 3 1 通过e s t 进行基因克隆的策略 随着人类基因组计划的阶段性成果全序列物理图谱绘制完成，各个 图1 6 麻疯扫fj c l i p 基因在大肠杆西中的表达 箭头所示为j c l i p 基因表达条带，l a n 4 为对照；l a n l ，2 ，3 , 5 ，6 为样品 生物的基因组计划相继完成，大量e s t 序列不仅可以作为测序标记，而且也 可以为今后人们克隆基因提供基础，由本实验室完成麻疯树眦，尸基因e s t 测序，为今后该种的功能基因组学发展提供了良好的起始数据。 基因资源一向是一种稀缺资源，由于以往人们克隆基因手段的限制，比 如同源克隆，文库筛选等，这些方法都只能对已知的基因或蛋白质的同源物 进行克隆，所以在克隆之前需要大量的生化实验，细胞学实验或遗传学实验 证据，才可能做到，而对未知的基因就无能为力了。随着基因组计划的发展， 基因克隆手段也朝着大规模和高通量的方向发展，序列表达标签( e s t ) 就 是其中之一，它可以应用于新基因的发现，基因组绘图以及鉴定基因组编码 区等研究中，它源于c d n a ，是在对c d n a 随机大规模测序时获得的，因此 是很好的基因克隆起始材料。基于大规模高通量的理念，在对一个物种或一 个特殊时期的组织的e s t 首先进行大量测序，然后通过生物信息学方法，比 如b l a s t n ，b u 峪t x 以及g e n b a n k ，s w i s s p r o t 等网上数据库，对这些e s t 作出分析，将这些e s t 分门别类，形成u n i e s t ，并赋予有同源物或者相似 物的序列相应的功能注释；其次构建数据库，再对数据库中的数据进行进一 步的分析，例如按序列可能起的细胞功能进行分类或按不同逆境胁迫相关基 因分类，这样从整体把握这个生物或者组织的基因表达调控；最后确定感兴 趣的基因，比如说信号转导，转录因子等，从数据库中调出e s t ，设计相应 1 7 引物进行r a c e ，得到全长e d n a ，进行后续的功能研究工作，这样的基因 克隆目的性强，甚至可以得到新基因，这样能够很快找到相应的功能鉴定方 图1 7 基于e s t 的全长基因克隆的策略 法。如图1 7 。 本次实验首次克隆了麻疯树脂酶基因，在已知全长基因序列比较少的情 况下，我们运用了e s t 序列数据库的序列，通过相似性搜索获得了较多同源 序列，虽然这些序列没有注释，但是由于它们之间的相似性较高，这样可以 比较精确的确定保守区域的边界，从而获得比较具有代表性的简并引物，同 时在简并引物设计的后期，我们增加了在近源物种水平上的分析，即对与麻 疯树同属于e u r o s i d si 总目的g l y c i n e m a x 、m a l u s s i e b o l d i f 、p o u l u sb a l s a m i f e r 三个物种的e s t 序列进行d n a 序列比对，比对结果发现此三者d n a 序列 之间的相似性超过6 0 0 , ( 数据没有公布) ，我们认为脂酶至少在e u r o s i d si 总目的水平上相当保守，因此我们通过近源物种的多序列比对，针对简并引 物中简并度较高的地方进行了调整，从而增强简并引物在e u r o s i d si 总目水 平上的特异性，最终获得了比较好的效果。 1 8 3 2 应用快速扩增c d n a 末端( r a p i d a m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s ，r a c e ) 方法获得麻疯树j c l i p 全长基因 快速扩增c d n a 末端( r a c e ) 方法主要就是针对以往通过文库筛选以及 序列拼接获得的c d n a 不是全长的缺点发展起来的，其基本原理是基于p c r 技术由已知的部分c d n a 序列来获得完整c d n a 5 和3 端的方法，因此分为 5 r a c e 和3 r a c e ，这个方法从原理上来看非常适合以e s t 为基础的基因 克隆研究。 c d n a 往往都是从3 端反转录而成的，所以一般3 端的序列是比较容易 获得的，而5 端序列获得就相对困难得多，客观上d n a 聚合酶的5 3 端合 成活性使得反转录不可能从5 端进行，从3 端开始的反转录由于受到m r n a 长度以及完整性，反转录酶活性和稳定性等偶然因素的制约，可能致使反转 录不完全，这样，全长c d n a 在反转录物中的丰度就会很低，如果这种反转 录物用于构建文库，文库的质量就会下