（物理化学专业论文）十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学dna生物传感器的研究.pdf

青岛科技大学研究生学位论文 十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物 传感器的研究 摘要 本论文主要内容为十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物传感器的 研究。 十八酸和十八醇既作为化学功能修饰剂也作为电极成型粘合剂，在适当温度 条件下与石墨粉均匀混合制备基底十八酸碳糊电极( s c p e ) 和十八醇碳糊电极 ( o a c p e ) 。在活化剂e d c 和n h s 存在下，单链d n a 探针( s s d n a ) 共价键 合固定在s a c p e 上形成s s d n a 修饰电极( s s d n a s a c p e ) ：在活化剂e d c 存在下，s s d n a 和d s d n a 可以共价健合固定在o a c p e 上分别形成s s d n a 修饰 电极( s s d n a o m c p e ) 和d s d n a 修饰电极( d s d n a o a c p e ) 。s s d n a s a c p e 和s s d n a o a c p e 在含有互补单链d n a ( e d n a ) 的缓冲溶液中识别杂交分别 形成双链修饰电极d s d n a s a c p e 和d s d 咐0 c p e 。分别用甲苯胺蓝( t b ) 和亚甲基蓝( m b ) 为电活性指示剂对s c p e 、s s d n a s a c p e 、d s d n s a c p e 和o a c p e 、s s d n a o a c p e 、d s d n a o a c p e 进行表征，结果表明：l ，在活 化剂存在下，s s d n a 在两种基底电极上都能牢固健合固定；2 ，电极表面修饰上 的s s d n a 能高效可靠地与靶序列识别杂交；3 ，杂交形成的d s d n s c p e 经碱 液变性洗脱后可再次用束杂交；4 ，直接固定d s d n a 制备的d s d n a o a c p e 与杂 交而成的d s d n a o a c p e 电极特性相同。用上述电化学d n a 传感器识别转基因 植物c a m v 3 5 s 启动予基因片段和n o s 终止子基因片段，结果令人满意。 论文还用电化学法研究了m b 与d n t p ( d a t p 、d t t p 、d g t p 和d c t p ) 之 间的相互作用，并对其机理进行了初步探讨。实验和计算结果表明，在b r 缓冲 溶液中，m b 和d n t p 在静电力作用下形成m b d n t p 复合物，结合比为l ：1 ；m b 与上述四种脱氧核苷三磷酸的结合常数分别为1 3 x 1 07 ，1 1 1 07 ，9 6 1 0 5 和 1 8 】0 7 。 关键词电化学d n a 生物传感器；十八酸；十八醇；碳糊电极；伏安法 十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物传感器的研究 s t u d i e so fe l e c t r o c h e m i c a ld n ab 1 0 s e n s o r b a s e d0 ns t e a r i ca c i da n d0 c t a d e c y l a l c o h o l m o d i f i e dc a r b o np a s t ee l e c t r o d e a bs t r a c t t h ec e n t r a lc o n t e n to f t h i sp a p e rw a st h es t u d i e so f e l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o r s b a s e do ns t e a r i ca c i do ro c t a d e c y l a l c o h o lm o d i f i e dc a r b o np a s t ee l e c t r o d e s t h ec a r b o np o w d e ra n dt h es t e a r i ca c i do ro c t a d e e y l a l c o h o l ，w h i c hf u n c t i o n e da s b i n d e ra n dc h e m i c a lm o d i f i c a t i o nr e a g e n t sa sw e l l ，w e r em i x e da ts u i t a b l et e m p e r a t u r e a n dp r e s s u r et on b r i c a t et h eb a s a ls t e a r i ca c i dm o d i f i e de l e c t r o d e ( s a c p e ) o r o c t a d e c y l a l c o h o lm o d i f i e de l e c t r o d e ( o a c p e ) s i n g l e s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) c o u l d b ei m m o b i l i z e dc o v a l e n t l yo nt h es n r f a c eo fs a c p et of a b r i c a t es s d n am o d i f i e d e l e c t r o d e ( s s d n a s a c p e ) i nt h ep r e s e n c eo f1 一e t h y l - 3 一( 3 一d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a - r b o d i i m i d e ( e d c ) a n dn h y d r o x y o s u c c i n i m i d e ( n h s ) s s d n ao rd s d n ac o u l db e i m m o b i l i z e dc o v a l e n t l yo nt h es u r f a c eo fo m c p e t of a b r i c a t es s d n a o a c p eo r d s d n a o a c p ei nt h ep r e s e n c eo fe d c a f t e rb e i n gi m m e r s e di n t ot h ep h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n sc o n t a i n i n gc o m p l e m e n t a r ys s d n a ( c d n a ) ，s s d n a s a c p ea n d s s d n a o a c p ew o u l db e c o m ed s d n a s ；a c p ea n dd s d n a o a c p er e s p e c t i v e l y t h r o u g hr e c o g n i t i o na n dh y b r i d i z a t i o n t h ep r o p e r t i e so fs a c p e ，s s d n a s a c p e ， d s d n a s a c p e ，o a c p e ，s s d n a o a c p ea n dd s d n a o a c p ew e r e ：c h a r a c t e r i z e d w i t h v o l t a n m a e t r yb yu s i n gt o l u i d i n eb l u e o rm e t h y l e n eb l u ea se l e c t r o a c t i v e i n d i c a t o r s ，r e s p e e t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：f i r s t l y , i nt h ep r e s e n c eo f a c t i v ea g e n t ， t h ep r o b e sw e r ei m m o b i l i z e de f f i c i e n t l ya n ds t e a d i l yo nb o t ho ft h et w ok i n d so fb a s a l e l e c t r o d e s ；s e c o n d l y , t h e p r o b e so nt h ee l e c t r o d ec o u l dr e c o g n i z et h et a r g e td n a ( c d n a ) e f f e c t i v e l y ；t h i r d l y , d s d n m s a c p ea n dd s d n a o a c p e ，w h i c h w e r e p r e p a r e db yh y b r i d i z i n g ，w o u l db e c o m ei n t os s d n a s a c p ea n ds s d n a o a c p e a f t e rb e i n gw a s h e dw i t ho 5m o l ln a o h ，r e s p e c t i v e l y ；f o u r t h l y , t h ee l e c t r o c h e m i c a l p r o p e r t i e so ft h et w ok i n d so fd s d n a o a c p e ，w h i c hw e r ep m p a r e dr e s p e c t i v e l yb y h y b r i d i z i n go fs s d n ai m m o b i l i z e do no a c p ea n di m m o b i l i z i n g d s d n ao n t o 青岛科技大学研究生论文 o a c p ed i r e c t l y , w e r en l es a m e b a s e do nt h i s e l e c t r o c h e m i c a ld n a h y b r i d i z a t i o n b i o s e n s o r sw e r ef a b r i c a t e d t h eb i o s e n s o r sw e r es u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o n o fc a m v3 5 s a n dn o sg e n e f r a g m e n t o f2 0 - b a s e o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm ba n dd n t p ( d a t p , d t t p , d g t pa n dd c t p ) w a ss t u d i e d w i t ht h et e c h n o l o g yo fv o l t a m m e t r y , t h er e s u ri n d i c a t e dt h a tm bc o u l dc o m b i n e d n t pt of o r mn e we l e c t r o c h e m i c a l l yn o n - a c t i v ec o m p l e x e s ，m b - d n t p , i nt h eb r b u f f e rs o l u t i o n t h e b i n d i n g c o n s t a n t so fm bw i t ht h ef o u rk i n d s o f d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e s w e r e1 3 1 0 7 ，1 1 x 1 0 7 ，9 , 6 x 1 0 8a n d l 8 x 1 0 7 ， r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o r ；s t e a r i ca c i d ；o c t a d e c y l a l c o h o l ； c a r b o np a s t ee l e c t r o d e ；v o l t a m m e t r y 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 1 1 脱氧核糖核酸( d n a ) 的基本结构、功能和研究意义 d n a 是多聚脱氧核苷酸，是遗传信息的承担者，具有储存和传递信息的功能， 绝大多数生物体的遗传信息储存在d n a 中，d n a 的复制是遗传的分子基础。 d n a 分子的一级结构是核苷酸通过37 ，5 。磷酸二酯键连接成没有支链的直 线形或环形。1 9 5 3 年，w a t s o n 和c r i c k 提出了d n a 双螺旋模型的二级结构，即 其分子由两条多脱氧核糖核酸链组成，链的内侧是碱基，两条链以反平行方向盘 绕同一条轴形成右旋的双螺旋结构，两条链上的碱基是匹配的，称为碱基互补， 腺嘌呤( a ) 和胸腺嘧啶( t ) 以两个氢键连接，鸟嘌呤( g ) 与胞嘧啶( c ) 以 三个氢键连接。在d n a 中，互补碱基的含量相等j 。 随着科技的发展，特别是生命科学领域的长足进步，对d n a 详细结构的分 析检测不但对基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗具有深远意义【2 j ，而且在药 物筛选、临床医学、法学鉴定【3 l 、环境监测【4 j 等方面也被广泛应用。此外，因为 外源d n a 与受体细胞基因组间的重组，使受体缅胞获得新的遗传信息为育种工 作提供了新途径【5 l ，所以近年来转基因动植物产品得到迅猛发展，对其进行定性、 定量检测也同益成为生产与生活的迫切需要【6 】。 1 2d n a 生物传感器 d n a 生物传感器一般由d n a 探针和能把d n a 杂交信转换为可测量信号的 换能器两部分组成。目前所使用的d n a 探针大多为人工合成的短链d n a ，其长 度从十几个碱基到上千个碱基不等。一般是使用己被公认的可识别出靶序列所需 的最短序列。从换能器的不同d n a 生物传感器可分为三大类，其类别、典型检测 手段及报道过实例见表卜l 。 人们希望研制出一种高准确度、易自动化、快速、简便又廉价的仪器来进行 d n a 检测，d n a 生物传感器可能使这种愿望变成现实【2 】，其中电化学d n a 生物 传感器更是被寄予厚望f l 。 十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物传感器的研究 质量敏感型 表面声波 石英晶体微天平 对因杂交引起的表面质量变化敏感 7 。8 能检测多项混合物中的质量变化 电化学敏感型电压、电流、电导 荔嘉震薏警梨雯蓑翥鎏舞量篓篓酱 ；二； 光学敏感型 发光法，椭圆光度法 假布儒斯物角反射法霎霎装茎芋豢藿i 蓬：；翟爹发光，z ，一，灵敏度高，稳定性和重现性差 。 1 3 电化学d n a 生物传感器 1 3 1 基本原理 大多数电化学d n a 生物传感器由个固定d n a 探针的电极和用于检测的电 活性杂交指示剂两部分组成o ”，1 6 】。在适当的温度、p h 值、离子强度等适当条件 下，利用两条互补的s s d n a 单链问的特异性相互作用( 互补碱基间形成氢键连 接) ，使电极表面上已知序列的d n a 片段( 探针) 与溶液中的待测靶基因片段杂 交，通过杂交前后电活性指示剂电化学响应信号的变化进行测定。 也有的测定前在探针或靶基因上预标定上电活性物质 1 7 】，通过分析杂交前后 电活性物质电信号的变化进行测定。 基于d n a 中的鸟嘌呤和腺嘌呤在碳电极的电化学窗口内有活性【1 8 1 ，有些电 化学d n a 生物传感器不采用另加的电活性指示剂【l ”。 1 3 2 传感器制备 1 3 2 1 基底电极选择 2 青岛科技大学研究生学位论文 制备最常见的电化学d n a 生物传感器( 以下文中如无特殊说明皆指此类传 感器) 的第一步是把d n a 探针固定在基底电极上，所以基底电极的性质决定了 固定的方式、难易程度和效果。几十年来，多种电极曾被人们用来基底，它们的 性质得到多方面的研究。此外，新的基底电极材料和制备方法也是科学工作者近 几年来研究的热点。总的来说，主要有以下几种。 1 3 2 1 t l 碳质电极 碳质电极因其电化学窗口宽、种类多样、廉价等优点长期以来备受电化学工 作者的青睐，它又大致可以细分为以下几种。 1 3 2 1 1 1 玻碳电极( g c e ) 玻碳电极曾被广泛用于电化学d n a 生物传感器制备。m i l l a n 等、p a n g 掣2 。1 和k a r a 等【2 2 】分别于1 9 9 3 年、1 9 9 6 年和2 0 0 2 年把s s d n a 固定在玻碳电极上制备 传感器，得到满意效果。为提供共价键合固定d n a 所需化学功能团，玻碳电极表 面使用前往往先被氧化。 1 3 2 1 1 2 石墨电极 和玻碳电极类似，石墨电极在固定d n a 探针前往往先被预处理以获得必要的 化学功能团。如孙星炎等f 矧、方禹之等【2 4 】和徐春等口5 1 采用电化学氧化或电化学氧 化与化学氧化相结合使石墨电极表面生成羧基；在另外一些文献中1 2 ”j ，科学工 作者进一步处理氧化了的石墨电极表面，通过硅烷化等手段导入一n h z 。也有人直 接在机械抛光处理后的石墨电极表面吸附固定d n a 探针【2 引，近年来已不常见。 1 3 2 1 1 3 碳糊电极 所谓碳糊电极，即利用导电性的石墨粉与憎水性的粘合剂混合制成糊状物， 然后将其涂在电极棒上或填充入电极管中制成的一类电极【3 0 】。按照制备时进行化 学修饰与否，又可分为普通石蜡碳糊电极( c p e ) 与化学修饰碳糊电极( c m c p e ) 。 其中后者因其制备简单、表丽易于更新、电位适用范围宽、选择性好、灵敏度高、 成本低等优点而备受电化学分析家青睐。 c p e 被用来制备电化学d n a 生物传感器比较常见于吸附法固定d n a 探针。 有文献【3 卜3 5 1 报道说在电极上首先施加+ 1 7v 电压预处理1r a i n ，然后把活化后 十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物传感器的研究 的电极置于含探针的缓冲溶液中于+ o 5v 电压下可以富集固定d n a 。然而，因 为d n a 高度亲水疏油，用来制备c p e 所用的粘合剂为石蜡油，电极表面不应该 能够富集高度水合的d n a ，所以庞代文等【3 l 认为以c p e 为基底的电化学基因传 感器违背了基本的化学原理。 也有人采取在抛光好的c p e 表面先修饰上化学功能剂然后再固定d n a 探 针。如h u 等p 6 j 表明在c p e 表面涂敷一层致密的十六烷基三甲基溴化胺可以改变 电极性能用来固定d n a 。还有一种情况是制作碳糊电极时预先把d n a 探针混在 石墨粉和粘合剂中。已见报道的有g u 等田l 用此方法制备了s s d n a 和d s d n a 修 饰电极。此外，还有w a n g 等 3 8 把石墨粉、固定于微硅钛球上的探针和矿物油混 合制成电极进行了d n a 杂交研究。 c m c p e 不但具有普通c p e 的所有优点，而且其电化学功能有很强的可塑性。 不同的化学修饰剂可以赋予其多种多样的功能，以满足实际需要。1 9 9 4 年，m i l l a n 等瞄9 】把石墨粉、十八胺( 或十八酸) 和矿物油混合后制成了十八酸和十八胺修饰 基底碳糊电极，共价键合上s s d n a 作探针，成功检测了f 5 0 8 基因片段。 1 3 2 1 2 金电极 基于分子自组作用，巯基化合物可在金电极表面形成高度有序的单分子层， 因此，采用金电极作基底制备电化学d n a 生物传感器固定探针时大多是利用a u s 键的这种特性。实际应用中有两条途径可被用来选择，一是在d n a 片段一端修 饰上巯基 4 0 4 4 3 】，二是把巯基化合物先固定在金基底电极上【4 4 叫8 l 。还有报道根据 a u s 键特性利用纳米金先吸附巯基化d n a 然后富集在玻碳电极表面制各传感器 1 4 9 1 。此外，金电极也可以作为吸附固定d n a 探针的基底电极【5 5 2 1 。 1 3 2 1 3 其它电极及新材料 新电极种类的深入研究、新材料的不断开发及新制备方法的进一步探索为电 化学d n a 生物传感器研究注入了源源不断的活力。近年来将铂电极用于电化学 d n a 生物传感器的研究也已见报道【5 卦。n a p i e r 等【5 4 】用尼龙和硝化纤维聚合物修 饰的锡掺杂的钢氧化物电极来测定d n a 上鸟嘌呤的电催化氧化。一种能靠电场 作用浓缩富集d n a 的合成碳塑料电极被成功用于分子诊断d n a 生物传感器上 【5 5 】。刘志红。”等将巯基修饰的s s d n a 探针通过自组装技术固定于以光刻溅射技 术制作的石英金片上制备核酸传感器探头。近来也有报道称利用电沉积膜技术可 4 青岛科技大学研究生学位论文 以把d n a 直接固定在超微电极上制备杂交传感器【5 7 】。此外半导体电极也日益引 起人们的兴趣。 经典的伏安传感器使用汞电极( 静汞，悬汞，汞膜) ，它有氢超电位大、易 于许多金属形成汞齐等优点。然而，毒性和在正电位下不能应用限制了汞电极的 发展。此外，热变性和质子化的s s d n a 分子能强烈地吸附于汞电极”，这种d n a 疏水性碱基与汞电极疏水性表面间的强烈作用使电极表面的探针无法与靶序列 杂交巧鲥，更是限制了汞电极在电化学d n a 生物传感器制备中的应用。 1 3 2 2 探针固定 d n a 探针在基底电极上的固定是电化学d n a 生物传感器制备中的第一步也 是关键的一步，固定量、稳定性和固定后探针的活性直接影响传感器的灵敏性。 为了把d n a 牢固地连接在电极表面，往往需要借助有效的物理或化学方法。需 要指出的是，基底电极的性质基本上决定了可以进行固定的方式并影响固定传感 器性能。就目前已有的报道来看，大概有以下几种固定方法。 1 3 2 2 1 吸附法 吸附固定可以分为直接涂敷法和恒电位法。几乎各种电极都有报道被用来作 为吸附固定d n a 的基底。据文献d 卜3 5 1 报道，较高恒电位下活化后的碳糊电极在 + o 5v 电压下可以富集固定d n a 。h a s h i m o t o 等将抛光处理后的平面热解石墨电 极直接放入1 0 0 的含有d n a 探针的n a c l 溶液中3 0m i n ，d n a 即被吸附在电 极表面。庞代文等【5 卜5 2 1 将d n a 溶液均匀铺在处理好的金电极表面制备d n a 修饰 电极。也有文章用两步吸附法固定d n a 。如周家宏等哺们先在裸金电极上吸附聚 赖氨酸，然后再将电极浸入d n a 水溶液中制得d n a 修饰电极；庞代文等”“在涂 敷d s d n a 前把金电极浸于2 ，2 一二硫二乙醇( d t d e ) 水溶液中先得到d t d e 修饰电极。 吸附法简单易行快速廉价，但，一是吸附的d n a 在杂交过程中有可能脱附， 二是吸附过程中易造成d n a 结构的扭曲致使靶基因因不能接近而无法正确杂交， 所以吸附法没有成为制备d n a 电化学生物传感器的主要方法。 1 3 2 2 2 共价键合法 共价键合法一般分两步进行。首先是电极预处理，以引入活性键合基团并活 十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物传感器的研究 化，然后进行有机合成，通过共价键合反应把探针分子修饰到电极表面。因为碳 质电极表面易于形成( 或修饰) 各种理想的功能团，所以共价键合法多采用碳质 电极作基底。玻碳和石墨电极表面的预处理往往需要氧化，例如通过高锰酸钾湿 法氧化、氧等离子体处理和电化学处理等方法获得羧基。d n a 在电极表面的共价 键合固定多需要在含有活化剂的体系中进行。 m i l l a n 等【3 9 1 在石墨粉和矿物油中添加十八酸( 或十八胺) 制备表面具有 c o o h ( 或一n h 。) 的基底碳糊电极，在水溶性的乙基一3 ( 3 - 二甲基丙基) 碳二亚 胺盐酸盐( e d c ) 存在下，通过十八胺的氨基与s s d n a 的5 末端的磷酸基形成 磷酸酰胺键，把s s d n a 固定到电极上；或在e d c 和n 一羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 存在下，通过十八酸与s s d n a 上的d g 残基结合，将s s d n a 固定到电极上。他 们还发现，在氧化的玻碳电极表面，以e d c 和n h s 作偶联活化剂，变性的小牛 胸腺d n a 和多聚脱氧鸟苷酸多聚核糖胞苷酸 p o l y ( d g ) p o l y ( d c ) 片段通过与活化 的电极表面0 酰基异脲形成磷酰胺键共价结合在电极表面，而未变性的小牛胸腺 d n a 和多聚脱氧腺营酸多聚核糖胸腺苷酸 p o l y ( d a ) p o l y ( d t ) 则不能结合上去 2 “ 6 1 1 。 庞代文等瞳将预处理过的玻碳电极在1 0m o l 几k m n o 。：2m o l lh ：s o a 浸 2 5m i n ，然后转移到2 0m m o l l 磷酸缓冲溶液中( 其中含有5m m o l le d c 和8 m m o l ln h s ) 1 5m i n ，接着置入s s d a n 的磷酸缓冲溶液中过夜，2 5 下整个 过程无蒸发固定探针。 方禹之等瞳43 将自制的石墨电极在含2 5 k 。c r 。0 ，和1 0 h n o 。的溶液中恒 电位+ 1 5v 氧化3 0s ，电极清洗后浸入含1 1 0 。m o l l e d c 和1 x 1 0 “m o l l n h s 的o 1 2m o l l 磷酸缓冲溶液中加热活化，然后把1 0p l1 1 0 1m g m l s s d n a 的t e 溶液滴在电极表面，真空干燥。4 保存。 刘盛辉等瞳6 1 将清洗好的石墨电极用混酸氧化5h ，然后室温下用四氢化锂铝 的乙醚溶液还原1h ，经常摇动溶液，使石墨电极表面的含氧基团全部转化为羟 基。接着用乙醚把电极洗净置入含5 ( v 厂v ) 3 - 氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶 液中进行硅烷化，以导入_ n h ：最后把5 0 此含有0 1m o l le d c 和0 1 l s s d n a 的o 1m o l l 咪唑缓冲液滴在电极表面，红外灯烘干，保存在t e 缓冲液 中备用。 孙星炎等瞳引先在石墨电极表面导入一n h 。基，然后在2 0m l1 0m o l l 咪 唑缓冲液中加入2 0 0m l1 0 1 0 1 m o l le d c 和1 0 0m l1m g m ls s d n a 并 6 青岛科技大学研究生学位论文 置入电极，在4 2 下搅拌2h ，取出电极后分别用2 s s c 和含有0 1 s d s 的 2 s s c 缓冲液清洗，真空干燥。 程琼和彭图治哺2 1 将浸蜡石墨电极浸入体积分数为2 5 的k ：c r 2 0 ，和1 0 h n o s 溶液中，恒电位+ 1 5v 氧化3 0s ，清洗后浸入含l 1 0 。m o l l e d c 和 l 1 0 1 m o l l n h s 的磷酸盐缓冲液中，于6 0 下活化1 0m i n 。将1 0 此1 1 0 m o l ls s d n a 的磷酸盐缓冲液滴到电极表面，晾干，洗净备用。 y a n g 等哺副将玻璃表面经氨丙基三乙氧基硅烷处理，一方面其水解产物与 玻璃表面的硅醇基形成牢固的硅氧烷键，同时也产生氨基功能化表面，再与双功 能试剂如戊二醛或对硝基苯氯甲酸酯及马来酐反应，通过分子两端的功能基团分 别与基质和d n a 末端的衍生基团作用，在室温下成功固定57 n h 。一d n a 及5 一s h d n a 。 共价键合法制各的d n a 修饰电极，修饰层稳定，易于分子杂交，但表面活 性位点少，表面合成是异相反应，因而固定的d n a 量少，响应信号较小。 1 3 2 2 3 自组装法 自组装法多以金电极为基底。 m a e d a 等1 利用d n a 的5 末端磷酸基与2 一羟乙基二硫化物的羟基反应生 成磷酸酯键，再通过巯基将d n a 修饰到金电极上去：h a s h i m o t o 等n ”采用了类 似的办法制成d n a 修饰电极，研究发现该d n a 探针表面修饰层稳定，杂交反应 完全可逆，并有特异性。 刘志红等渤1 采用金膜石英片为基底电极，用h 。s o 。：h ：o ：( 3 ：1 ) 处理，将己结 合了巯基的s s d n a 自组上去。他们研究证明裸金电极吸附的响应值仅有自组装方 式的3 9 5 ，且二硫键的成否不影响自组装反应。 m a r u ，r a m a 等哺53 也把机械处理成镜面的金电极在0 5m o l lh 。s o 。溶液从0 至1 7v 扫至稳定理想状态，然后放入含有已修饰c 。h 。：s h 的s s d n a 磷酸缓冲溶 液( 1 0 m o l l ) 中，2 5 下放置4h 。取出后纯水洗净，放入含lm m o l l e d t a 的t r i s 。h c i 缓冲液中4 保存。 x u 等哺们把1 聚氨基葡糖溶液均匀涂在表面新鲜的铂电极上，晾干后浸入 0 1m o l l n a o h 溶液保持3 0r a i n 以固化自组装膜，然后空气中晾干，置入s s d n a 的t e 溶液中，室温下搅拌2h ，最后用0 1 s d s 磷酸缓冲液洗去末固定d n a 。 k o b a y a s h i 等泊7 1 把巯基修饰的s s d n a 自组装到金电极上后，在5m m o l l 铁 十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物传感器的研究 氰化物亚铁氰化物溶液中用循环伏安法以1 0 0m v s 的扫速扫描电极以加固结 合。 利用分子自组装作用制备的传感器电极表面d n a 探针有序排列，且稳定性 好，有利于杂交，但诸如一s h 修饰的d n a 难以合成，且需要分离提纯，操作繁 琐，代价昂贵；修饰后的d n a 体积增大，增加在电极表面自组装的难度m 踟。 1 3 2 2 4 组合法 组合法即两种或两种以上的固定方法结合起来，比如自组装法和共价键合法 结合、自组装法与吸附法结合等。 庞代文哺等将金电极表面磨成镜面后超声波清洗，然后把它浸入含1 硫辛 酸的丙酮溶液中2 4h ，再置入1 0 0 水中煮去未被吸附的硫辛酸。用以上处理 好的电极先放入5m m o l l e d c 和8m m o l l n h s 的磷酸缓冲溶液中1 5s ，接着 移入s s d n a 水溶液中2 5 下过夜。 孙星炎等陌8 3 把金电极表面处理好后在l ：l 的h n o 。、丙酮和去离子水中分 别超声清洗2s ，接着把电极浸入氨乙基硫醇( 趔2 一c 2 j - 1 4 ：s h ) 的h c i c 。h s o 溶 液中，室温下1 0h 后取出风干。固定s s d n a 时，上述处理好的电极浸入含0 1m o l l e d c 和0 1m g m ls s d n a 的缓冲液中，2 5 下放3h 。 赵元弟等h 53 将金电极在浓h n o 。中煮5m i n ，取出后用水反复冲洗，再用丙 酮和水分别超声冲洗5m i n ，然后在1m o l lh 。s o 。中扫描至稳定循环伏安图。将 表征后的电极再次用丙酮和水洗净，立即浸入含4 0p m o l l 二巯基乙醇的溶液中 6h ，清洗后转入含i m g m l e d c 和1m g m ld n a 的2 一( n 一吗啡啉) 乙磺酸缓 冲溶液中浸泡2 4h 固定d n a 。 庞代文等1 将巯基乙醇、半胱胺和巯基丙酸三种具有不同官能团的硫化物 自组装单层用于d n a 的固定，发现巯基乙醇修饰单层固定d n a 的效果最佳。 以上四例即自组装法和共价键合法结合，下面是自组装法与吸附法结合的几 例。 林祥钦等m ，7 03 利用纳米金庞大的表面积和生物共容性，用电沉积法将纳米 金固载到玻碳电极上，采用2 一氨乙基硫醇做吸附剂，制得s s d 咐a ，n g a e t g c e 电极。 b a r d 等f 1 2j 先将4 一巯基丁基膦酸在纯乙醇中固定到硅晶片的会膜上，然后再 与a 1 ”反应，形成一层包含a l “的膜，再通过a l ”与d n a 阳j 静电作用固定s s d n a a 青岛科技大学研究生学位论文 周剑章等3 将处理过的金电极电极浸入1 的聚二烯丙基二甲基胺氯化物 ( p d d a ) 溶液中进行p d d a 分子自组装，再浸入d n a 溶液于4 下固定d n a 分子。他们用s t m 实验表明自组装膜具有一定的有序性，随之固定的d n a 也顺 着该结构吸附。 组合法虽然较麻烦，但因能整合各种方法的优点而引起电化学工作者的兴 趣。 1 3 2 2 5 电聚合法 利用导电聚合物前体在电极表面的电聚合形成的聚合物膜把d n a 探针固定 在电极表面的方法叫电聚合法。 g a m i e r 等7 2 1 以聚( 3 - 乙酸吡咯) ( 3 - n 一羟基邻苯二甲酰亚胺吡咯) 为前 体共聚物，将带有胺基的含有1 4 个碱基的d n a 或低聚核苷酸( o d a ) 嫁接到电 极表面。 1 3 2 2 6l b 膜法 k r u l l 等m 3 报道过s s d n a 的端基衍生上c 。烷基后可以通过l b 膜技术固定 到电极表面上。 1 3 2 2 7 生物素一亲和素法 f a n g 等7 43 利用生物素一亲和素之间特殊的相互作用将生物素标记s s d n a 分 子固定到修饰有亲和素的固体表面。 1 3 2 3 电活性指示剂 之所以能够用电化学的手段对d n a 进行研究基于两个方面的原因：一是d n a 分子本身具有电活性( 由其碱基引起) 7 5 ，早期的研究多基于此，如p a l e c e k 等”6 7 7 研究d n a 的示波极谱行为，b o u b l i k o v a 等明引用吸附溶出伏安法检测了质粒样 品中环状双螺旋d n a ，陆宗鹏等盯钔、张家玲等旧3 分别就d n a 的变性及损伤和 氨性缓冲液中d n a 的极谱行为进行了研究，他们的研究多集中在汞电极；二是 d n a 两单链间具有特异性结合的特性，通过此特异性结合，能引起d n a 本身或 相应指示剂电化学活性的改变，从而引起可测定信号发生变化。 9 十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物传感器的研究 i 3 2 3 i 电活性指示剂类型 按照文献 9 】，电活性杂交指示剂可分为内部和外部两类。所谓内部电活性指 示剂即利用d n a 分子中碱基或其他修饰基团的电活性进行检测。众所周知，虽 然d n a 链的脱氧核糖和磷酸骨架均是电化学非活性，但鸟嘌呤和腺嘌呤在碳电 极的电化学窗口内有活性嵋1 。w a n g 等用肌营代替d n a 探针中的鸟嘌呤来消除 探针中乌嘌岭的氧化峰，然后利用探针与靶序列杂交后出现的鸟嘌呤的氧化峰进 行检测。方禹之等【8 0 1 在靶序列d n a 的末端衍生二茂铁基团，通过检测二茂铁电化 学信号的有无来表征杂交与否。 内部指示剂在灵敏度及选择性上有一定的优势，但其探针的合成较繁琐，因 而在电化学d n a 生物传感器中没有占据主导地位。 由于d n a 电化学传感器在应用过程中，通常杂交反应本身并不能产生电化 学信号的变化，或信号变化微弱难于检测，于是引入外部杂交指示剂，即指那些 与d n a 单双链以不同方式结合的电活性物质。在起作用时，它们与d n a 发生电 子交换，d n a 通过远程电子传递使指示剂与电极发生电子交换而完成电化学反 应。目前有报道的主要有以下几类( 见表1 2 ) 。 1 3 2 3 2 电活性指示剂与d n a 的结合模式 d n a 与各种小分子和金属配合物等的相互作用方式通常有共价键合和非共 价键合两种。由于对参与杂交的指示剂要求其与d n a 相互作用的可逆性要好， 以便产生较明显的电化学信号的变化，通常选择与d n a 形成非共价键的物质作 为杂交指示剂。就目前研究者所采用的杂交指示剂与d n a 的作用方式而言，基 本上可以分为以下几类。 i 3 2 3 2 1 静电作用 指示剂分子与d n a 分子的带负电荷的核糖磷酸基骨架之间通过静电作用而 结合。张贵珠等【8 6 】对巯嘌呤金属配合物与小牛胸腺d n a 的作用方式进行了探讨， 发现两者结合以静电作用为主。杨周生等 8 7 】研究了邻二氮菲- c d ”与d n a 的相互 作用，证明作用方式为静电结合。m a d s o i 等 s s l g d 循环伏安( c v ) 法和电致化学发 光( e c l ) 法研究了o s ( b p y ) 3 2 + 与d n a 的相互作用，证明两者的作用形式以静电结 合为主。细胞色素c 是一种带正电的蛋白质，也可作为电活性杂交指示剂峭。 1 0 青岛科技大学研究生学位论文 表卜2 电活性杂交指示剂 t a b l e1 - 2e l e c t r o a c t i v ei n d i c a t o r so f h y b r i d i z a t i o n 常用金属离子：c o 、o s 、f e 、r u 、p t 照藁：联糍篓掣辫。20m,31。,5 1 04 4 - 4 5 咪唑并 4 ，一f 1 ，一邻菲咯啉、，_ 二甲；+ 。i 。：。：i ：j 二 8 1 8 4 基2 ，2 - 联吡啶、二氮杂芴酮缩聚苯二 一 双苯并咪唑类( 如h o e c h s t3 3 2 5 8 ) 、亚甲 分子的几何形状是影响3 2 ，4 0 ，4 1 基蓝、甲苯胺蓝。红四氮唑、乙锭类、 与d n a 结合的最主要冈4 4 ，6 2 ，8 5 中性红，纺锤素 素 道诺霉素、阿霉素、色霉素、芥子霉素， 蒽环抗生素，四环类抗生素，阿的霉素 电流密度较小：作为杂交 指示剂的同时可解释药2 4 ，2 9 ，8 5 物的药理学作用 1 3 2 3 2 2 嵌插结合 嵌插结合是指指示剂分子嵌入d n a 分子双螺旋的碱基对之间的大沟槽与 d n a 相互作用而结合，结合的作用力来自芳环的离域n 体系与碱基的n 体系间形 成n n 相互作用及疏水相互作用。此外，嵌入分子也有可能与d n a 分子骨架上 的磷酸基团之间存在静电引力结合。王素芬等 8 5 】研究发现双苯并咪唑( b b i d ) 与天然鱼精d n a 的结合为插入方式。h a s h i m o t o 等【n i l e - - 十多种不同类型的染 料、抗体、抗菌素、金属配合物及其他分子作为嵌入剂的性质作了研究。杨频等 9 0 l 对对d n a 具有识别和断裂功能的金属插入剂的研究进行了总结。袁谷等一”于 金属配合物类 染料类 药物小分子类 十八酸和十八醇修饰碳糊电极电化学d n a 生物传感器的研究 2 0 0 3 年对d n a 识别分子的设计及应用所作的综述中也对作为嵌入剂的分子作出 描述。 1 3 2 3 2 3 小沟结合 指示剂与d n a 以小沟沟槽作用结合和嵌插结合类似，其区别在于它们并不 嵌入d s d n a 的碱基之间，而是与d n a 分子扭曲区的小沟相结合。因s s d n a 不 具备这种小沟结构，所以这类指示剂对单双链d n a 有极好的选择性。 h o e c h s t 3 3 2 5 8 为经典的小沟结合分子【4 “。 1 3 2 3 2 4 联合作用 通常指示剂与d n a 分子的作用方式是是非单一的，面是几种作用方式共同 起作用的结果。李来生等【9 2 j 研究了t b ( p h e n ) 2 c 1 3 h 2 0 c h 3 c h 2 0 h 与小牛胸腺d n a 的作用方式，发现两者之间既存在嵌插结合，又存在静电结合作用。中性红( n r ) 与小牛胸腺d n a 的作用方式在p h = 7 时以嵌插结合为主，在p h = 6 时以静电结合 为主f ”1 。多米菌b ( p b l 与d n a 的作用既表现为嵌插同时也存在静电结合【州。l i 等1 9 5 ) 研究发现阿霉素与d n a 的作用方式为以嵌插结合为主，静电结合作用为辅。 1 3 3 电化学d n a 传感器应用 电化学d n a 传感器目前已广泛应用于d n a 损伤研究、环境污染监控、l 临床 医学检测、基因疾病诊断、药物筛选和药理分析等诸多领域。特别需要提出的是， 电化学d n a 传感器和p c r 基因扩增技术的有机结