（有机化学专业论文）生物荧光分析试剂cy5的合成及薯蓣皂素酶解法提取工艺的研究.pdf

y6 1 0 3 2 5 生物荧光分析试剂c y 5 的合成 及薯蓣皂素酶解法提取工艺的研究 佟玲 摘要1 生物荧光分析试剂菁染料( c y a n i n ed y e ，c y ) 系列是不同杂环核通 过甲川链连接起来的一类不饱和杂环化合物，其应用广泛。它可作为光增感剂应 用于卤化银照相中，扩大卤化银微粒的感光范围，并且提高感光度。还可用作光 激活的抗病毒剂、抗癌剂等。在光信息存储技术中作为记录介质，具有诸多优点 和广阔的应用前景。最主要的是应用于生物分析中作为荧光探针，在蛋白质及核 酸检测、毒物分析、临床医疗、疾病诊断等方面得到了广泛应用。 本论文首先综述了c y 系列试剂在生物荧光分析中作为分子灯标和在蛋白质 组学中的应用原理，在分子灯标中，c y 系列作为荧光基团标记在一段寡聚核苷酸 序列的一端，在另一端标记荧光淬灭基团，当在原性状态下呈环一茎结构，荧光 基团和淬灭基团相互靠近，发生荧光共振能量转移而无荧光，当核苷酸与靶基因 特异性结合后会发出荧光可用来检测。而在蛋白质组学中，c y 系列与蛋白质结合， 通过一定的分离手段分离后，利用荧光可检测，从而研究蛋白质组的一系列性质。 接下来列举了一系列的具体实例，阐述了c y 系列在生物分析中的广泛应用。此 外还对c y 系列试剂在其他领域的应用作了简单的介绍。最后，鉴于菁染料的广 泛用途和应用前景，我们以c y 5 为例探讨生物荧光分析试剂c y 系列的合成研究。 我们从最基本的原料对氨基苯磺酸开始，经过重氮化反应，哼i 哚环的成环反应， 亲核取代反应，缩合反应等五步反应得到了制备c y 5 的两个原料：1 一乙基一2 ，3 ， 3 一三甲基吲哚一5 一磺酸盐和1 一( 一羧戊基) 一2 ，3 ，3 一三甲基吲哚一5 一磺酸盐。并利用 缩合剂b 一苯胺基丙烯醛缩苯胺盐酸盐对二者进行了初步的交联，得到了一些进 行c y 5 合成的重要条件。 2 薯蓣皂素( 薯蓣皂甙元) 是甾体激素药物和甾体避孕药物的前体化合物， 在医药生产中具有十分重要的应用价值，人们称其为医药工业的“黄金”0 薯蓣 皂素一般以皂甙的形式存在于薯蓣属植物之中，通常是以野生薯蓣属植物黄姜 ( 盾叶薯蓣) 的根茎等为原料，经直接酸水解法获得皂素。由于市场对皂素需求 量很大，人们大量采挖野生薯蓣属植物，造成野生资源将近枯竭。因此，以人工 栽培的黄姜为原料生产皂素的方法正逐步得到推广。但是，人工栽培黄姜中有效 成分的含量较低，使其生产成本增高。黄姜根茎中存在的大量淀粉使皂甙被“包 裹”与“屏蔽”起来，对皂甙水解产生干扰，因此直接酸水解法生产皂素的收率 较低。 为了使人工栽培黄姜为原料生产薯蓣皂素的收率得以提高，本文的第二部分 采用正交实验的方法研究了以人工栽培黄姜为原料利用酶解法的提取工艺，最终 得到最佳工艺为：1 5 0 9 黄姜在3 5 0 m l 水、3 o m l 淀粉酶、4 0 下酶解1 2 小时。 水解后再用石油醚提取薯蓣皂素，收率可达2 3 7 ，与直接酸水解法的得率1 8 4 相比有较大幅度的提高，这将为实际生产提供有价值的指导。 关键词：荧光探针菁染料c y 5薯蓣皂素 正交实验 s y n t h e s i sf o rb i o l o g i c a lf l u o r e s c e n c ea n a l y s i sr e a g e n to f c y 5a n de x t r a c t i n gd i o s g e n i nf r o md i o s c o r e az i n g i b e r e n s i s w i t he n z y m a t i ch y d r o l y s i s t o n gl i n g a b s t r a c tc y a n i n ed y eh a sa w i d e l ya p p l i c a t i o n ，a n d i tc a nb e u s e da s p h o t o s e n s i t i z e r so nt a k i n gp h o t o s i ta l s oi su s e da sp h o t o s e n s i t i z e da n t i - v i r u sr e a g e n t a n da n t i c a r c i n o g e i no p t i c a ls t o r a g et e c h n i q u e s ，i ts e r v e sa sr e c o r d i n gm e d i u ma n d h a sb r o a da p p l i c a t i o n sa n dm a n ya d v a n t a g e s c y a n i n ed y ea l s oc a na c ta s an e w i n f o r m a t i o nr e c o r d i n gm e d i u mu s e di nc d ra n dt a k ea d v a n t a g e so fc l o s es t o r e d e n s i t ya n db i gc a p a c i t y i t st h em o s ti m p o r t a n ta p p l i c a t i o ni st h a ti tc a nb eu s e da sa f l u o r e s c e n tp r o b e i th a sb e e nv e r yi m p o r t a n ts i t u a t i o n so np r o t e i na n dn u c l e i ca c i d a s s a y , p o i s o na n a l y s i sa n dc l i n i c a lm e d i c a ld i a g n o s e i nt h i sp a p e r , w ei n t r o d u c et h ep r i n c i p l eo fc ys e r i e sr e a g e n t su s e da sm o l e c u l a r b e a c o na n di np r o t e o m ea tf i r s t m o l e c u l a rb e a c o n sc o n t a i naf u o r e s c e n c eq u e n c h e r a n daf l u o r o p h o r er e p o r t e r w h e nt h e ya r ei no r i g i n a l s t a t e ，t h eq u e n c h e ra n dt h e r e p o r t e ra r ec l o s et om a k ef l u o r e s c e n c ed i s a p p e a r w h e nt h e yh y b r i d i z ew i t ha i mg e n e ， t h ef l u o r e s c e n c ea p p e a r s ，a n dc a nb ed e t e c t e d i np r o t e o m i c s ，c ys e r i e sa r el i n k e dw i t h p r o t e i n ，a n d m a k et h e p r o t e i n s h o wf l u o r e s c e n c e w ec a nd e t e c t p r o t e i nb y f l u o r i m e t r i cd e t e c t o ra f t e rs e p e r a f i o n t h e n ，w ei l l u s t r a t eas e r i e so fe x a m p l e sa n d i n t r o d u c et h ea p p l i c a t i o no fc ys e r i e sr e a g e n t si no t h e rf i e l d a tl a s t ，。w ep r e s e n tt h e s y n t h e s i sf o rb i o l o g i c a lf l u o r e s c e n c ea n a l y s i sr e a g e n to fc y 5 w eh a v eg o tt w or a w m a t e r i a l sf o rs y n t h e s i z i n gc y 5 ，1 - e t h y l 一2 ，3 ，3 - t r i m e t h y l i n d o l e n i n i m n 一5 一s u l f o n a t ea n d 1 一( - c a r b o x y p e n t y n y l ) 一2 ，3 ，3 - t r i m e t h y l i n d o l e n i n i u m - 5 一s u l f o n a t e w e a l s ou s e d m a l o n a l d e h y d ed i a n i lh y d r o c h l o r i d et ol i n kt h et w om a t e r i a l s a n dg o ts o m ei m p o r t a n t c o n d i t i o n sf o rs y n t h e s i z i n gc y 5 d i o s g e n i ni s t h e p r i m e ro fm a n yd r u g sa n dh a sa ni m p o r t a n t s i t u a t i o ni n p h a r m a c e u t i c a la p p l i c a t i o n s m o s to fd i o s g e n i ne x i s ti nd i o s c o r e a c o m m o n l y , w eg e t d i o s g e n i nf r o mt h er h i z o m eo fd i o s c o r e ab yt h ew a yo fd i r e c t i v el a y d r o l y s i s b e c a u s e o ft h er a p i d l yi n c r e a s i n go fd e m a n d i n gf o rd i s g e n i n ，t h ew i l ds o u r c e so fd i o s c a r e ai s f a c e do nd r y i n gu p t h en e wm e t h o do fg e t t i n gd i o s g e n i nf r o mt h ea r t i f i c i a ld i o s c a r e a i sb e c o m i n gp o p u l a r b u ti nt h ea r t i f i c i a ld i o s c a r e a ，t h ec o n t e n to fd i s g e n i ni sl o w e r , a n dt h ed i s g e n i ni se n c a p s u l a t e db yt h ea m o u n to f a m y l u mi nt h ep l a n t i no r d e rt oi m p r o v ey i e l do fd i s g e n i nf r o ma r t i c i a ld i o s c a l e a ，w eu s e dt h e o r t h o g o n a lt e s tt os t u d yt h em e t h o df o rg e t t i n gd i s g e n i nf r o ma r t i c i a ld i o s c a l e aw i t h e n z y m a t i ch y d r o l y s i s t h eo p t i m a le x t r a c t i n gc o n d i t i o n sa l e 15 0 9d i o s c o r e a ，3 5 0 m l w a t e r , 3 0 m la m y l a s e ，w i t hz y m o l y s i s i n ga t4 0 f o r1 2 h 。t h ey i e l do fd i s g e n i ni s 2 3 7 i ti sh i 砖e rt h a nt h a to fd i r e c t i v eh y d r o l y s i s ( i 8 4 徇s oo u rr e s e a r c hm a y u e g i v eav a l u a b l eg u i d i n gf o ri n d u s t r yp r o c e s s e s k e y w o r d s ：c y a n i n ed y e ，f l u o r e s c e n tp r o b e ，c y 5 ，d i o s g e n i n ，o r t h o g o n a lt e s t 第一部分生物荧光分析试剂c y 5 的合成研究 第一章生物荧光分析试剂c y 系列的研究进展 第一节引言 随着生物技术和荧光标示技术的飞速发展，对优良荧光试剂的需求也越来越 高。近红外染料是近几年来日益引起人们重视的一类荧光试剂，它们的吸收及发 射光谱区位于5 0 0 1 2 0 0 n m 处，背景干扰小，灵敏度高e l l 。c y 系列以外的大部分 的荧光标记试剂易溶于有机溶剂，水溶性小。因此找到一种近红外的水溶性染料 对于生物技术的发展有着极端重要的作用。水溶性生物荧光分析试剂c y 系列( 结 构见图1 ) 的出现无疑是生物技术发展的一个重要的转折点。 图1 c y 系列结构通式 c v 系列属于吲哚类菁染料，是由两端的吲哚环通过共轭甲川链连接在一起 的。n 值代表共轭甲川链上所含碳碳双键的数目，n 值越大，则共轭甲川链越长。 当n = l 时，甲川链中含有三个碳原子，称为三甲川菁染料，n = 2 时，为五甲川菁 染料，n = 3 时，为七甲川菁染料，依次类推。通过n 及r l ，r 2 , r 3 ，r 4 的改变即 可形成各种对称与不对称的水溶性荧光分析试剂。 吲哚菁染料分子是一个大的n 共轭体系( 染料的第一结构特征) ，光照以后分 子中的电子能量增加，由基态跃迁至单线激发态1 2 1 ，当电子由单线激发态回落至 基态时，会以光的形式释放能量，因此，该类化合物具有荧光。不同的吲哚普染 料具有不同的光谱吸收位置，共轭体系越大，分子的最大吸收波长越长，如吲哚 三甲川菁染料最大吸收波长在5 0 0 7 0 0 n m 之间，而五甲川瞢染料则在6 0 0 7 0 0 n m 之间，因此，吲哚菁染料可通过改变其共轭骨架中的甲川链的长短来调节 分子的最大吸收波长，很容易合成得到近红外吲哚菁染料。一般甲川链上每增加 一个双键可使染料分子的最大吸收波长红移1 0 0 n m 2 。 随着科学技术的进步，尤其是价格低廉的半导体二极管技术在荧光检测领域 中的应用，使荧光标示法得到了飞速发展，已逐步代替具有放射性危害的同位素 标记法，成为分子生物学和生命科学发展史上的一个里程碑。激光荧光分析检测 的灵敏度可以接近或达到极限单原子或单分子。荧光分析试剂提供了比传统的同 位素辐射更实用、更安全的d n a 片段标记方法，可实现测序的实时、在线、计 算机处理等。利用荧光探针可测定r n a 和d n a ；研究d n a 碱基损伤的修复； 辨别蛋白质分析中氨基的状态，蛋白质分子的活性区，可检测p m o l 级的蛋白质； 区分不同构象的核酸以及研究药物的化学反应活性【3 1 。荧光免疫分析采用时间分 辨技术可用于许多蛋白质、激素、病毒、抗原及d n a 杂交体的分析。激光诱导 荧光光谱在活细胞、活体体液、d n a 碱基序列和细菌病原体的鉴定、恶性肿瘤的 早期诊断和治疗中起到了重要的作用。 目前在d n a 芯片、分子灯标中应用的荧光染料主要是荧光素类、罗丹明类 和菁染料等。荧光索和罗丹明类染料荧光较强，但稳定性差，尤其是当它们与单 链d n a 作用后，荧光效率降低，最高可降低8 5 。吲哚类菁染料是菁染料中的 主要品种之一，他们的特点是摩尔消光系数大，与生物基质结合后荧光增强，易 合成得到在近红外及红外区有吸收的荧光染料。因绝大多数生物基质在近红外区 无吸收，用近红外染料进行表征可避免生物基质、玻璃器皿等产生的荧光背景干 扰，使检测灵敏度大大提高，因此，近红外荧光染料是荧光探针的一个重要发展 方向【4 ，目前使用的绝大多数近红外荧光探针是吲哚菁染料。郑洪等 5 】合成的七次 甲基吲哚菁染料( h m c ) 在酸性条件下与牛血清蛋白作用在近红外区呈现明显的减 色效应，由此可用来测定痕量蛋白质。 生物芯片技术是近年来发展起来的一项重要技术，通过它能得到大量的有关 生命方面的信息。分析和解释这些信息，将在结构与功能之间架起桥梁，推进生 命科学的迅速发展。荧光染料标示技术也在其中起到越来越重要的作用。吲哚菁 染料，如c y 3 ，c y 3 5 ，c y 5 ，c y 5 5 等【6 1 ，不仅是生物芯片常用的荧光标示剂，同 时也是分子灯标常用的荧光染料。应用激光作为激发光源的共聚焦扫描装置，具 有极高的分辨能力，可以定量测读结果，并可以获得极高的灵敏度和定位功能， 将使荧光标示技术有更加广阔的应用前景。 第二节c y 系列在荧光分析中作为分子灯标的作用机理 随着基因工程技术应用的目趋广泛，如何快速、简便、准确地检测出基因序 列变得日益重要。目前，一种新型的基因检测探针一分子灯标( m o l e c u l a r b e a c o n ) 诞生了。它是在d n a 杂交技术和荧光共振能量转移原理的基础上开发出来的7 1 ， 可以实现对基因序列的精确识别，准确到一个核苷酸的水平，操作简单安全，检 测方便迅速，可用于多种场合的基因检测，应用前景十分广阔。分子灯标是个 用荧光标记的环茎型寡聚核苷酸序列。环上的寡聚核苷酸序列是分子灯标的基因 识别部分，它能与靶基因的一段单链d n a 或r n a 在聚合酶的存在下自发地进 行杂交。茎部是一段长4 1 2 对碱基互补的发夹结构( h a i r p i n ) 。在分子灯标的5 和3 端通过连接臂( 1 i n k e r ) 连接荧光基团和淬灭基团。在原性状态下的分子灯标 是呈环一茎结构的。荧光基团和淬灭基团相互靠近并发生作用，荧光基团所激发的 能量根据荧光共振能量转移原理( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t p 】 转移到淬灭基团上，并以热能的形式散发出去，从而无荧光现象。但是当环部的 探针序列与靶分子结构基因的核苷酸序列完全互补配对时，二者便形成稳定的杂 交二聚体，原来茎部的发夹结构被破坏( 如图2 ) 分于灯桥 d n a 靶赫i 捌杂交= 浆体 图2 杂交二聚体形成原理图 分子灯标两端的荧光基团与淬灭基团分开，于是淬灭基团不能通过f r e t 转 移荧光基团所激发的能量，荧光基团便发出了荧光。检测时只要放在探测器下经 激发便可得到结果。由于未杂交分子灯标的荧光基团与淬灭基团相近，不发射荧 光，故而观察前不用进行分离。 m u s u n d ib 等【9 1 应用分子灯标，采用l d r s p f r e t 连用技术用于检测d n a ，目的 是试图找到一种能够不需要通过基因分离和放大可以在线检测大量基因中致癌基 因的突变点的新方法。其具体原理如图3 所示。 在图3 中，两个特异性等位基因前体分别在他们的3 和5 末端用荧光试剂 标记，每一个都在侧面连接一个单突变碱基并将等位基因固定在目标模板上，每 一个前体的侧面还有一个补充的有一定序列的臂。若d n a 能够完全与模板结合， 则热稳定的d n a 连接酶能够连接在两个相邻的前体上，则能够形成发生荧光共振 能量转移的分子灯标。反之，被标记的前体则不能发生荧光共振能量转移。该检 测温度要求控制在7 5 。 a n d r e wt s o u r k a s 等采用二重荧光共振能量转移分子灯标也能比较容易的 检测活体细胞中的基因表达。具体过程如图4 所示。 a 供体和受体分子探针杂化在同一个核酸分子的邻近区域，从而引发了荧光 共振能量转移。通过检测荧光共振能量转移，能够检测并区分已标记的探针和降 l d r - s p f r e ta s s a y 圈3 。l d r - s p f r e t 检测原理图 解的探针及非特昴性结合的探针。图4 中的q ，d ，a 分别代表淬灭剂，供体荧光 试荆和受体荧光试剂。b 是个示例图，供体和受体分子搽钟分别摭记到含有1 9 个躐基及饕长五个碱基静搽针中，著与a 造静靶基因杂住，中闯鸯翘个碱基静分 离间隔，画线部分表示特异憾结合的3 8 个碱基序列。 a 转 e x o n 7 图4 分子灯标检测基因表达原理图 4 第三节c y 系列作为荧光分析试剂在蛋白质组学中的作用机理 人类基因缀诗划( h g p ) 在2 0 0 3 年全黧竞戏，这是太类科学淡震史土熬一 个麓要里程碑。国予生物基鞠组表达的类戮及表达程发存在严格调控的时空特髯 性，m r n a 的表达水平常不能代表细胞内鬣自质的数鼹，近年来人们发现蛋白质 问亦存在类似于m r n a 分子内的剪切、拼接，并证明其基本元件“i n t e i n ”广泛 存凌予多耱蛋囱壤中”“。大_ 鬟= 蛋白囊茏箕怒重要调整爨自蒺魏纯学修镑( 蟊耱蘩 化、磷酸化) 、翦切加工( 如酶原降解、结构域拼接) ，不但可以改变其立体结构， 而且是实施其功能的重要结构基础。此外，对基因组的研究不能描述细胞活动或 季亍饺功能等的动力学过程。所有这些必须依赣予对其镦终雏功能蛋白送行分板。 懑此，蛋白蔟缒学的兴起将憝人类发展史上叉一个重要的里程碑。 蛋白质组即“p r o t e o m e ”有3 种不同的含义：一种基因组、一种生物或一 种细胞组织在精确控制其环竣条件下，特定时刻所表达的全套蛋白质 1 2 - 1 4 】。它与 鏊嚣缰不竭，反浚了疆究傣系肉豹羲态代滏变位过程。与以往静经懿蛋鑫囊诧擎 研究相比，它的研究对象不褥是单一或少数僵白质，而鼹着限于全筒性和整体性， 需臻研究体系内所有蛋白质组份的物理、化学、生物举性质与功能，包括表达变 化鞠瓤译后趣工等各方露的大规模信息”。蛋白质组学是指利用生化方法对所有 蛋白质进行大藏模酶磺究，镪括对基因产貔静功麓分辑，如大魏模豹爨自质鉴定、 定掇、定位、修饰、功能、结构、调节和活性的研究，甚至包括利用酵母双杂交 等技术对其相互作用的研究，而对单纯的撩因或m r n a 多不属于蛋臼质组学的研 究藏霾h 6 1 。磺炎爨自曩缝学懿主要技术蔻双囊凝获亳溶技零( t w o d i m e n s i o n a lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，2 d e ) ，其在分离蛋白质混合样品，眈较差异方面有不可替代的作 用，它是目前唯一可在一块胶上同时分离成千上万个龋自质组分的方法，与质谱 ( m a s ss p e c t r o m e t r y ，m s ) 联用可查明爨照质混合物中驰组分。蛋囱质的分离技 术商撮多耪：( 1 ) 双向凝胶电泳旧( 2 d e ) 的基本霖瑾燕：宅泳第一穗为等电聚焦， 即根据蛋白质的等电点不同而分离。猩此方法中引入了固相p h 梯度技术 ( i m m o b i l i z e dp t - ig r a d i e n t ，i p g ) 18 1 ，可以实现等电点仅有0 0 0 1 p h 单位差别的 蛋嶷凌懿分亵，耠瓣臻疫稳定，聚焦雍磷，精确疫褰；无霹羧漂移及躐瞧蛋是丢失 现缘；蛋白质上样量大，可提高低含量成分的分辨率效果。第二相为s d s p a g e a ( 2 ) 离效液相色谱( h p l c ) 眇2 0 】： 该技术可使单一蛋白质得到高灵敏度的层析分 孝露。瞧对予蛋黩竣组研究，其存在明显的不足；如不能避行蛋白质的菱异表达分 橱；对分予量太，l 、麓蛋白溪仍不麓分离等。僵多维联弼液携色谱有较离鹊灵敏麓， 蛋白质样品不需露变性处理可直接分离，并可实现自动上样、自动收集、自动在 线分析，不嚣黉对分离结莱避幸亍染色等颓琐处理。鬻糟于膜蛋自及低辜度蛋自袋 的分离。( 3 ) 麓辩凝胶电泳 2 u 用来检测虽臼质在两种样品中的表达情况。对两种样 龋中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2 d e ，荧光显微镜观察，如果阎 一令斑点显示爨秘荧光，波明一静蛋岛缀懑霹在疆个撵瑟中表达；蛊羲慕一个巍患 只显示一种荧光，该蛋白磺只在相应的样品中表达。“) 毛细管电泳( c e ) 技术，主 鼹包括毛细管区带电泳( c z e ) 、毛细管等电聚焦( c i e f ) 和筛板一s d s 毛细管电泳。 c z e 主要依据不同蛋白质的电赫质量比麓异实现劈离。c i e f 依据缀自质等电点不 瓣杰毛缨瞽两形藏p h 梯淡| 孬分离。簿校s d s c e 猿掇s d s 一蛋骞缓复台秘在瓣状 骨架中迁移率不同而分离。c h i f u y ut o r i u m i 等| 2 2 l 农文章中提到，二维聚丙烯酰 胺凝胶电泳常常用于蛋白质组学的研究。由于蛋白质在二维聚丙烯酰胺电泳中的 敝感牲，因此，蛋白囊中食有氨基的纯会物熬荧光衍生物静逐激发展起来，毽怒 粕于衍生过稷中氨基盼失去藏者是形成衍生物巯永健的增加，随之而来的蛋自艨 沉淀经常发生。为了适应这种未刺激或者受刺激的蛋囱质衍生的需要，在该文中 掇如了一种亲水的，特异性荧光物质：7 - 氟一2 ，1 ，3 - 笨并二唑硫酸铵。但是接下 采又涉及妥生残需生秘静分篱，采臻豢蠢荧光捡溺，籀生蛋童屡离耩豹滚褪色漤， 并与质谱连用。通过这一理沦，作者在给小鼠皮下淀入地塞米松厝两天检测到五 个上调的蛋白和三个下调的强自。在二维荧光差异凝胶电泳中，c y 系列可以作为 骚是质的标漶试剂，实现多样本曩时检测，萎 除了不囤撑本检测祭 譬不同掰弓瀵； 静误差。a m e r s h a m 公司生产静诧类电泳即可实现三样本同时检测，将三稀蛋自疆 样本分别用c y 2 ，c y 3 和c y 5 标记，然后混合到同一块凝胶板上，不同激发波长下 激发，在激发的嗣时实现检测，用t y p h o o no m 9 4 0 0 多功能成像系统进行扫描成像， 大大挺褰逶量，麓纯分橇遗疆并较大减少了实验操俘时润。 第四节c y 系列在生物荧光分析中的应用实例 4 ，1 e y 系剜在诊装疾疯中豹应爰 用荧光分析试剂作为搛针检查疾病筑织与正常组躐中表达基因的差异是其臌 用于疾病检测的主要方面，可以根据检测结果在基因水平上研究疾病发生的机理 及痰瘸作照枫剃。孙丽洲等 2 3 1 用c y 3 一d u t p 标记无嚣黔盘缀织m r n a ，c y 5 一d u t p 栋 记妊商癌骆焱维织m r n a ，发溉妊娠商盎藤综台症患者骆盘滋葬细臆存在显著静壤 亡现象，从而姆致妊高症发病。周亦武等【2 4 j 从脑组织提取m r n a ，应用a r p s r p 一1 0 基因芯片研究脑创伤组织与对照脑组织凋亡蛋白和应激反应蛋白相关基因特异憾 嫠雾，藏剖巍缀织援c y 5 一d u t p 稼记，正露缝织弱c y 3 一d u t p 耘记，找出了羹因浚 6 达承平发生改变的基因，对于脑损伤的磷究其有袄檄酶意义。舔巅等【2 5 1 分剐愆 c y 5 ，c y 3 标记从心肌中抽提的r n r n a 经逆转录后物质，获得e d n a 探针，与基因浓 达谱芯片杂交，结果用扫描仪进行扫描并用软件进行分析统计，表明糖尿病小鼠 ，腿中s 骤萤爨镁酸会残酶瓣表达零乎骥震上调。说甓其在糖蒙瘸经心魏痣发痪 机制中有明显作用。朱海红等f 2 6 1 用基因微矩阵技术研究胸腺肽a1 作用于入外腐 血l 淋巴细胞后，细胞内与抗感染相关的倍号转导分子的基因表达谱变化，c y 3 和 c y 5 分男标记对照组和试验缀葑骞e d n a ，与信号转导表达谱基因微嫩阵杂交后激光 季叠接、图像分季嚣。筛选窭1 0 静与感染鸯关鹣基蠢。刘浚羧等【2 7 l 应爱簇强芯片技术， 用c y 5 标记重癜乙型肝炎( f h b ) 源e d n a ，用c y 3 标记无症状h b s a g 携带者( a s c ) 来 源e d n a ，研究相关基因差异的表达，得到与慢性重症肝炎有关的揍因。谭志军等 i 2 鄙剃鼹基强芯片技术分掇 事与不馋漤已终转移骧艨瘸缎织中豁差爨袭达基因。褥 4 0 0 0 个人类全氏基因的p e r 产物点样子将殊处理后的玻片上制备基因芯片。嗣逆 转泶的方法，分别将两种荧光物质c y 3 一d u t p 和c y 5 一d u t p 标记正常胰腺组织和胰 腺瘰组织m r n a ，以制备e d n a 探针，并与芯片杂交。以s c a n a r r a y 3 0 0 0 荧光扫搦 仪羟搓芯片上掰葶孛荧毙绩号，获得懿荧光售号蚕像蠲谤箨李晁分辑，撬蘩了其舂亵 达差异的5 6 个基因。黄燕簿 2 9 】利用正常肼组织和肝癌组织的m r n a ，通过逆转录 方法，将c y 3 和c y 5 二种荧光试剂分别标记到2 种组织的e d n a 上，制备成e d n a 探 针，共与包含4 0 9 6 条各静人类基因匏d n a 表达谱芯片遴行杂交及扫搂，重复11 次 实验，通过计舞孝凡数据处理翔定基霞是否程上述2 释缀织中存在表达差异，从蕊 撩定参与肿瘤发生的基因。其中1 条差异袭达基因为c u t a 的高度同源基因，该熬 因可能参与重众属离子在体内的代谢。范保星等1 3o j 利用冠状病毒全毖困组芯片梭 溺s a r s 患者囊、褒秘痰标本中豹冠浚瘸毒核酸，袁s a r s 薅毒孩黢豹诊瑟提供线 索。他们采用的方法是提取s a r s 患者血、便和痰样本中的冠状病毒r n a ，经全基 因组随机反转慕和p e r 扩增标记成c y 荧光探针，与s a r s 病毒全基因组芯片进行杂 交，同时题 本羚培莠的病毒r n a 和从健康人分离魄自缨您兹r n a 分剐镦阳性和鞠 靛对照，杂交籍髂芯片霜a x o n 4 1 0 0 a 扫摇仪扫描和分褫。结果发聪s a r $ 患者的3 种标本中都能枪测到冠状瘸壕核酸的存程，与整个病毒基因组比较，大都为一必 不连续的片断。其中痰和便标本中的基因谱较为相似，并且发现编码s 1 蛋白的核 黢在多豢痰强硬标本孛是连续粪冬。餐窭终论：冠竣瘸枣全基因组芯片裁够硷测爨 s a r s 患者血、便和痰标本中的冠状病毒核酸，同时能够监测不同样本中该病毒全 熬因组变化的特点，初步显示该芯片用于临床检测的可行性。张莉棹 3 l 】利用基因 袭达谱芯片技术寻找血警癌增生期到消退期之闼差异袭这豹基因，锶步擐索囊镣 瘸增生与蛊然消遥的分子梳制。方法是将4 0 9 6 条e d n a 用点样仪患在特制玻片上 制各成表达谱芯片；将同一觑管瘤患儿的增生期和消退期瘸体组织的m r n a 逆转录 为e d n a ，分别标记c y 3 和c y 5 两种荧光试剂，铡备成e d n a 探针，与表达谱芯片 杂交，通过计舆机扫描、数据处理筛选出差男表达的基因。圆此认为，血管瘸的 发生可能是细胞增嫩和凋亡比例失调所致。梅长林等【强l 应用基因芯片技术研究多 囊弩与王e 拳疑组织慕困表达谱熬差异，毙较焚表达水平的不同，为多囊肾病发病 机制的研究提供线索。他们按一步法抽提多囊肾组织和正常对照肾组织的总r n a 并楚佬m r n a ；将4 0 9 6 耱人类基毽p c r 产耱蠲c a r t e s i a n p i x s y s7 5 0 0 点撵饺按徽 矩阵排列制成基因芯片；将等量的多囊肾组织和正常肾组织m r n a 分别逆转录合成 以c y 5 和c y 3 标涎靛e d n a 链做探到，混合后与上述鏊蠢芯片杂交。嗣s c a n a r r a y 5 0 0 0 扫描仪扫描葛片荧光信号图像，用软件进行数字化处理和分析后比较两种组 织基戳表达谱的差异。醴明这些基因可能参与了多囊肾病发生及发展过程，从而 为下一步研究发病娥制提供了更多的靶基因。宋挂芹等脚谰免疫相关基因芯片寻 找多技性硬化病表达差异的免疫相关基因。将4 8 4 条免疫相关基因的d o u b l e ( 双 点) d d n a 产物按激簸蓐搂捌点榉予玻片土，致正霉及患者羚周蛊，分离淤巴缨慰， 提取总r n a ，用r t p c r 逆转录成c d n a 。标记e d n a 探针，分别用c y 3 一d u t p 、c y 5 一d u t p 标记正常入犟拜多发缝硬纯病恚蠢e d n a 。将蒸戮蕊片帮杂交深钟交性后杂交、浚于。 用s c a n a r r a y4 0 0 0 扫描芯片，g e n p i x p r o3 0 软件分析，实验结果显示正常人与 多发性硬化患者免疫褶关基因的表达有显著差异，不同发病阶蔽免疫稻关蓥霞表 达有差异；以细胞免疫搬关基因变化为主，体液免疫相关基因亦有异常表达。周 鹤同等口4 i 通过研究人肾癌组织和患者肾癌旁正常组织中差异表达的基闵，寻找肾 瘿耀关基疆潋鼹予诊断积治疗。她魍以包含8 0 0 0 个e d n a 基因表达谱芯片研究l 组肾癌组织样本的基因表达谱。按一步法抽提肾癞和对照组癌旁正常组织的总 r n a 势缝他m r n a ；将等量的对黧缝缓秘弩癌缝织m r n a 分翳遂转袋台或e y 荧光分 子掺入的e d n a 链做探针，混合厢杂交上述基因芯片。经严格洗片后用s c a n a r r a y 3 0 0 0 掴描仪 薯描芯片荧光信号胬像，计算分析后篦较2 种缀缓中差异表达的基葭。 结果共筛选如差异表达基因9 5 条，其中未知基因4 4 条。结果 亚明基因芯片在筛 选肾癌相关港因的改变中其有快速、高通量、灵敏的特点，肾癌在细胞代谢、信 号转秉、蛋囊台戒憝相关基因方嚣寿冀常表达。崔卷黎等【3 5 姆 究正豢与糖尿瘸鹭 病大鼠肾脏的基因表达谱，大规模分析糖尿瘸时基因表达水平的变化。方法题( 1 ) 实验大鼠分为两錾，一缝为正常对慧缀，男一缀为糖藤密臀瘸盔；( 2 ) 跌鹭皮震中 抽提m r n a ，缀反转泶分别用c y 3 、c y 5 荧光标记，获得两组动物柬源的e d n a 探针； ( 3 ) e d n a 探针与b i o d o o r 基因袭达谱芯片杂交，缩梁由季j 描仪= 三 擒并稽软件进行 分孝厅统计。找到有差异的表达基因，说明利用基因芯片技术结合实验动物模型能 大疆模、赢遥鬃遗研究糖屎瘸静基蠢表达谱，耪多筛选 叠疾病程关麓嚣，对逶一 步阐明疾病在熬因水平上的发病机制有十分重要的作用。汪运山等【3 6 】用8 4 6 4 祭 人e d n a 制成表达谱芯片；利用胃和胃癌组织m r n a ，邋过逆转录方法将c y 3 和c y 5 两耱荧光试剂分弱振记到两缀c d n 矗上；测愆这穗e 弧a 探针与表遮灌芯片迸葶亍杂 交筒扫描，通过计算枫分析翔定基因是磷程上述组织中存在差异表达。结果显示 在1 9 7 条与生长发育相关的基因中，存在差异表达的共1 0 条，上调的8 条 ( o ，0 9 5 ) ，下调的2 条( 0 0 2 4 ) 。应用这种方法识别出的基因对胃癌的诊断期 治疗吴骞重要翁潜在徐僮。绦斌等瑟7 1 探讨久精连蛋自( f n ) 基因在藤羧癌发皇移转 移中的作用。应用博道4 0 9 6 型e d n a 基因芯片和原位杂交技术检测1 8 例胰腺癌标 本、8 例慢性胰腺炎组织f n 基因表达。结果显示f n 基因在1 8 例胰腺癌基因芯片 捻测中表达显骧增高( c y 5 c y 3 2 0 ，p o 0 1 ) ，转有嚣壤淋巴结转移时增赢更翔 明驻；在馒懿胰腺炎中的袭达与正常缀缓冼较羞露无显著往( c y 5 c y 3 o 0 5 ) ，与原值杂交结果棚同。得出结论：基因芯片技术能够为胰腺癌的相关熬 因分析提供特舜和可靠的数据；人胰腺组织中f n 基因袋达升高可能与胰腺癌的发 ，圭鞠转移有关。范德嚣l 等d s l 逡焉基嚣芯持技零繇究餐痰瘩转移稷美基因表遮，镌 们提取具有不同转移特性的督肉瘤细胞总r n a ，反转潦制各杂交探针，应用基豳 芯片筛选与骨肉瘤转移相关的基因。杂交信号用s c a n a r r a y3 0 0 0 扫描，结果用 i m a g e n e3 ，0 软件分事厅。对潦位及转移嚣肉癌细悲基因表达谱分孝厅，发现两耪肿 痛细脆中存在麓舜表达基因，其中有都癣基医、转移楗关蛋自基困、细胞瘸鬻爨 白基因等，与肿瘤发生发展密切相关。因此说基因芯片技术对肿瘸转移机制研究 有重要意义。陈刚等【3 9 比较正常大鼠和糖尿病性心肌瘸大鼠心肌缀织中基因表达 匏差异，搽讨耱稼病性心蔑逶簇兹发薅提割。蘧髓在囊磐枣鬣彝糖袋薅蛙心飘瘸夸 鼠的心肌组织中抽提m r n a ，经逆转录分别用c y 3 和c y 5 标记，获褥两组动物来源 的e d n a 探针，与基因表达谬芯片杂交，结果由扫描仪掴描并用软件进行分析统计。 氧化应激相关纂因和毙量代谢楣关基因熬表达水平青锈最的改变，表明氧化应激 鞫能量代谢障碍在糖尿病毽心觏瘸发瘸穰制中超重要作麓。 4 2 c y 系列在研究中药作用机制中的皮用 中药是中国传统医学的精华，由于作用机制的复杂和效果的奇特直是药物 纯擎磺究豹重点。逶遂痤瑶生耪荧光分掇试裁可疆在定程度土撵示中药瑟搏矮 桃理，对于中翁的广泛应用具有重要的指导意义。王忠等【4 唧分别从假手术组、局 灶性脑缺血组、黄芩苷治疗组s d 大鼠的脯组织中抽提总r n a ，c y 3 ，c y 5 荧光标记， 爱转录分裂合艘c d n a 掇针质，与含有4 0 9 6 蘩大鼠基因鲍b i o s t a r 基嚣表达谱芯片杂 交，a x o n g e n e p i4 0 0 0 b 扫播仪扫疆， g e n e p i x p r o3 0 软件分辑表达信号，醑究黄 9 芩苻对局灶性脑缺血大鼠脑组织基因表达谱的影响，探索了黄芩苷治疗脑缺血的 药理作用机制。王军等1 4 l 】了解局灶硬化性肾小球肾炎( f g s ) 模型小鼠的细胞因 子表达遘，以及复方穰雪擎对其缀蓬毽子躅络懿表达调控谗爱。邋造夸惑蓬羚豫 一次性注射阿霉索，诱导成f g s 肾炎模型，以复方积雪革制荆灌胃治疗，提取肾缎 织总r n a ，通过反转录掺入荧光素c y 3 一d u t p ，c y 5 一d u t p ，与细胞因子撼因芯片杂交， 芯凳扫描著进行图像分析。缝暴表哽复方积霉草具有挽紧纤维化俸髑，其作用效 藏可麓是多种绷臆因子共麓调控静结果。托短等p 那利愆基因芯片技术，扶基戮水 平解释抗肿瘤胤管生成中草药的有效组分t 3 的分子机制。方法是( 1 ) 采用两种细胞 系：人胃癌b g c 8 2 3 细胞和m 镣内皮细胞( e c ) ，每种细臌分两组，一缀为对照，另 一缓为零3 药甥艇激缀；( 2 ) 撼疆缨嶷慧戆a ，经复转录翊蘩c d n a ，对照缀麓c y 3 标澎， 药物刺激组用c y 5 荧光标记，获得a d n a 探针；( 3 ) c d n a 探针与b i o d o o r 基因表达谱芯 片杂交，结果由扫描仪扫描并用i m ag e n e 3 o a 件进行分析统计。发现了具有袭 达蒺异的基因，证明了剥用旗因芯片技术可从基因水平解释中药豹 乍恩机制，为 掰蓊懿开发提供理论依据。 4 3 c y 系列在研究激素及细菌作用机理中的应用 陈向芳等【4 3 】利用基因袭达谱芯片研究t 淋巴细胞株( h u t 7 8 ) 在褪黑素作用餍 受疫穗关基嚣表达懿差要瞧。采曩c y 5 ； i c y 3 嚣魏不嚣瓣荧光染鼗邋遭递转录及波 将干预组和对照组的h u t 7 8 细胞的m r n a 分掰标记成两种探针，并与载有一组靶基因 的基因表达谱芯片迸行杂交，通过扫描荧光强度，计算机软件分析，寻找经褪黑 索作屠后表达蠢差异的基因。得出结论：褪黑素激活的人淋巴细臌，是通过对一 整基嚣豹灞控褥发挥免疫谲节作焉豹。蘩望等1 4 4 1 为磷潮瓣瘩相关豢棱营酸，并实 现其在抗肿瘤反义核酸“瘸泰得”作用机理研究方面的初步应用，制备了包含近 4 5 0 种肿瘤相关菠因特异寡核苻酸探针的躲核昔酸芯片，建立了相威的质控标准。 “癌泰褥”瓣瑟矮体襞染h e p g 2 黪癌绍鼹，提取缨藏蒽r n a 反转蒙劳蠲荧光橱记 c d n a ，用制备的寡核苷酸芯片检测肝癌细胞h a p g 2 的肿瘤相关基因表达水平，用软 件分析获得其麓异基因表达谱，用c y 3 $ i j c y 5 进行校正，初步检测到了“癌泰得” 的抗肿瘤作用可能的相关蒸闲，为进一步鲢分子作用椒理的探讨奠定基础。结暴 袭臻，翎备静辩瘸稿关芯片敏感凄离、黪舅性赢、耋囊往均较好，可用于硷溺耱 瘸相关基因的袭达谱，为临床诊断和基础研究提供了披术平台。王华等h 副以基因 袭达谱芯片对t y 2 1 a 免疫前臌小鼠肠细胞( 包括肠粘麒上皮细胞和肠上皮间淋巴细 藏) 蒸毽表达瓣差异牲进行磷究毙较。褥4 9 0 条经蘩懿滚减杂交浚簿逡爨懿与小黢 t y 2 1 a 免疫相关的e d n a 制备戚表达谱芯片；利用免疫前后小鼠肠细胞的m r n a 通过逆 转渌方法，将c y 3 $ c y 5 两种荧光分别标记列两种组织的c d n a ，制备成c d n