（微生物学专业论文）大肠杆菌色氨酸高产菌株的构建.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t l i i ll li lli l l llill lilll y 18 0 6 8 9 1 t r y p t o p h a ni s a ni m p o r t a n tn u t r i e n te s s e n t i a la m i n oa c i d ，w h i c hc a l lo n l y s y n t h e s i z e db ym i c r o o r g a n i s m so rp l a n t s l - t r y p t o p h a ni so n eo fe i g h tk i n d so fe s s e n t i a l a m i n oa c i d s ，h u m a n sa n da n i m a l so n l yi n t a k ef r o mf o o d i no r d e rt og e tal - t r y p t o p h a n o v e r p r o d u c i n g s t r a i n st h a tc a nb eu s e di n l a r g e s c a l ep r o d u c t i o n ，w em o d i f y a e s c h e r i c h i ac o l is t r a i nm d - t 1 0 9b ym e a n so f m u t a t i o nb r e e d i n ga n dg e n ec l o n i n g e s c h e r i c h i ac o l im d t 10 9a st h es t a r t i n gs t r a i nw a si n c u b a t e db yn i t r o s o g u a n i d i n e ( n t g ) t r e a t m e n t ，a n ds e v e nt y r o s i n ea u x o t r o p h i cm u t a n t s t r a i n sw e r es c r e e n e d o n eo f w h i c hn a m e de c o l im d - t 1 0 9 - 0 6s h o w e di n c r e a s i n gl - - t r y p t o p h a np r o d u c t i o nb y 1 1 2 3 c o m p a r e dw i t ht h eo r i g i n a ls t r a i n e c o l im d t 1 0 9 0 6e x h i b i t e ds i m i l a rg r o w t h r a t ea st h es t a r t i n gs t r a i na n ds h o w e dg o o dg e n e t i cs t a b i l i t y t of u r t h e ri m p r o v et h em d - t 10 9 0 6m u t a n t ，w ea m p l i f i e di t st r p e d c b ag e n e ，a n d c l o n e di n t oa ne x p r e s s i o nv e c t o rp m d t 10 9c o n t a i n i n gat a cp r o m o t e r , t r a n s f o r m e di n t o e c o l im d t 1 0 9 0 6a n dg o ta ne n g i n e e r i n gs t r a i no f e c o l im d - 仃p 一0 6 a f t e rf l a s ks h a k e f e r m e n t a t i o nt e s t ，t h el t r y p t o p h a np r o d u c t i o no fm d t r p 一0 6w a si n c r e a s e df r o m0 2 0 6g d lt o0 2 38 9 d l ，i n c r e a s e d15 5 t h ea n t h r a n i l a t es y n t h e t a s ea c t i v i t y o ft h e e n g i n e e r i n gs t r a i ni n c r e a s e db y 14 0 ，a n dt r y p t o p h a ns y n t h e t a s ea c t i v i t yi n c r e a s e d 1 6 6 t oa d d r e s sd i s s o l v e do x y g e nl i m i t a t i o nt h a t i s u s u a l l yp r e s e n ti nh i g h d e n s i t y f e r m e n t a t i o n ，t h ev i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ng e n e ( v g b ) w a sc l o n e di n t oe n g i n e e r i n gs t r a i n m d t 印0 6 a c c o r d i n gt op u b l i s h e dg e n b a n kv g bg e n e a n di t si n d u c i b l ep r o m o t e r s e q u e n c ei n f o r m a t i o n ，a n dm o d i f i e da c c o r d i n gt ot h ee c o l ic o d o nu s a g eb i a s s y n t h e t i c m o d i f i c a t i o nv g bf r a g m e n tw a sc l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp m d t r p ，t r a n s f o r m e d i n t oe c o l im d t r p 一0 6 ，a n dg e te n g i n e e r e ds t r a i ne c o l im d - t r p t h ev g bg e n ew a s h y p o x i ai n d u c e de x p r e s s i o ni ns h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o nu s i n g2 5 0m lf l a s kw i t h6 0 m l a n d10 0 m ll i q u i dv o l u m ec o n d i t i o n s a sar e s u l t ，b a c t e r i ac o n c e n t r a t i o no f e c o l im d - 仃p i n c r e a s e db y2 1 a n d1 6 ，c o m p a r e dw i t he c o l im d - t 印0 6 ，w h i l et r y p t o p h a n p r o d u c t i o ni n c r e a s e db y16 4 a n d21 r e s p e c t i v e l y v h be x p r e s s i o nw a s d e t e c t e db y s d s p a g e k e yw o r d s ：l t r y p t o p h a n ；n t gm u t a g e n e s i s ；t r p e d c b ag e n e ；v i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n ； i i i 福建师范人学左j n 桢硕七学位论文 h y p o x i ai n d u c i b l 0 - l 中文文摘 中文文摘 色氨酸学名d 一吲哚基丙氨酸( p i n d o l y l a l a n i n e ) ，首先于1 8 2 5 年被发现，1 8 9 2 年 由n e u m e i s t e r 定名为色氨酸( t r y p t o p h m n ) ，1 9 0 2 年由h o k i n s t 从酪蛋白中分离获得。 色氨酸( t r y p t o p h a n ，t r p ) 是一种重要的营养必需氨基酸，只能由微生物或植物合成。 l 色氨酸是8 种必须氨基酸之一，人和动物只能从食物中摄取。l 广色氨酸及其代谢 产物对机体的广泛作用，在生物体内，l 一色氨酸代谢转化可生成5 羟色胺、吲哚乙 酸、尼克酸、褪黑素、色素、生物碱、辅酶、植物激素等生理活性物质，且色氨酸 代谢失调还会引起糖尿病和神经错乱，因此在医学上被用作氨基酸注射液和复合氨 基酸制剂。l 广色氨酸已经广泛应用于癞皮病治疗、精神分裂症治疗、营养氨基酸片 等方面。l 色氨酸是人体必需氨基酸之一，需从膳食中摄取。l 广色氨酸在人及动物 的体内代谢过程中有着重要的作用，被喻为第二氨基酸，在食品及饲料添加剂中应 用广泛。由于植物蛋白中比较缺乏色氨酸，在饲料中添加适量氨基酸还可提高植物 蛋白的利用率。我国农业部己将l 色氨酸确认为六种饲料添加氨基酸之一，l 色氨 酸也被誉为继赖氨酸及蛋氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。 早期色氨酸生产方法主要为化学合成法及蛋白质水解法。随着发酵行业的发 展，酶法、前体转化法等逐渐替代化学合成法及蛋白水解法。目前主要的生产方法 是微生物直接发酵法。该法以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价物质为原料，通过优良的微 生物菌种在合适的条件下发酵来累积色氨酸。此法的核心问题在于选育优良的菌 株。传统上常通过诱变来选育色氨酸高产菌株，如筛选与色氨酸同属芳香族的苯丙 氨酸及酪氨酸缺陷型菌株，或抗代谢反馈抑制突变株等。由于微生物代谢流中，芳 香族氨基酸代谢途径本身较弱，且代谢调控机制复杂，传统的诱变育种方法往往只 能对其中一两个调控节点作用，难以对整个代谢流造成很大的影响。随着各种基因 操作技术的发展，在对微生物代谢途径进行分析的情况下，在基因水平上对代谢流 进行合理调控成为微生物法产色氨酸研究的热门方向。代谢工程以区别于传统的单 基因表达( 第一代基因工程) 和基因定向突变( 第二代基因工程) ，有目的地对细胞生化 反应的代谢网络进行修饰的，在多基因水平上设计修饰细胞固有的代谢途径和遗传 性状，并赋予细胞更为优越甚至崭新的产物表达。代谢工程在提高宿主细胞原有代 谢物的产量、产生新物质、扩展和构建新代谢途径、生产代谢产物如氨基酸、抗生 素、维生素以及降解环境污染物等诸多方面显示出广阔的应用前景。 目前发酵行业通常采用高密度发酵培养来获得单位体积发酵液的高产出。高密 v 福建师范人学左祖桢硕十学位论文 度培养是通过增加工程菌的给养实现的，但靠简单的培养基的加富并不能实现高密 度培养。其中受到多方面因素的影响，包括培养基成份的抑制作用、代谢副产物的 抑制作用、供氧的限制等。溶氧( d o ) 是高密度发酵生产中影响工程菌生长的重要因 素之一。菌体在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给非常 重要。随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之下降，细胞生长减 慢。在高密度发酵的后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参 数均不能满足对氧的供给，结果外源蛋白表达量很低，直接导致目的产物产量的降 低。在大规模细胞培养或高密度发酵如补料分批培养和固定化细胞系统中，供氧的 问题一直尤为突出。如何在发酵过程中提高工程菌在高密度条件下对氧的利用，对 于提高基因工程菌的培养密度及产物收率具有重要意义。 透明颤菌血红蛋i 刍( v i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n ，v h b ) 是由透明颤菌于微氧条件下 合成的胞内可溶物质，由透明颤菌血红蛋白基因( v i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ng e n e ，v g b ) 表达而成，能从分子水平上提高重组菌对氧气的利用率，促进贫氧条件下的细胞生 长和产物合成。自1 9 8 8 年k h o s l a 和b a i l e y 成功解决了透明颤菌血红蛋白( v h l o ) 在 重组大肠杆菌中的外源表达以来，它已越来越多地应用到微生物发酵工业的许多领 域，并取得了显著效果。 本实验以大肠杆菌m d t 1 0 9 为出发菌株，经过n t g 诱变，筛选到一株酪氨酸 营养缺陷性菌株e c o l im d - t 1 0 9 0 6 ，经摇瓶发酵产酸检测，突变株产酸量较出发菌 提高了1 1 2 3 ，生长速率未受到影响，且遗传稳定性良好。进一步对e c o l i m d t 1 0 9 0 6 株进行改造，p c r 扩增t r p e d c b a 基因群，克隆到表达载体p m d t 1 0 9 ， 构建成p m d t r p 质粒，电转化导入到e c o l im d t 1 0 9 0 6 ，获得工程菌株e c o l i m d t r p 0 6 。经摇瓶发酵检测，m d t r p 0 6 的l 色氨酸产量较m d t 1 0 9 0 6 提高1 5 5 。 工程菌邻氨基苯甲酸合成酶活性提高1 4 0 ，色氨酸合成酶活性提高1 6 6 。为解决 高密度发酵过程中通常存在的溶氧限制问题，将透明颤菌血红蛋白基因( v g b ) 弓l x i 程菌m d t r p 0 6 中。根据g e n b a n k 公布的v 曲基因及其低氧诱导启动子的序列信息， 并按照大肠杆菌偏好密码子进行修饰，人工合成修饰后的v g b 片段，通过酶切连接 将其克隆到表达质粒p m d 仃p ，电转化导入m d t r p 0 6 ，获得工程菌m d 卸，经低 氧诱导摇瓶发酵验证，在2 5 0m l 三角瓶中3 0m 1 装液量情况下，由于溶氧充足，v g b 未启动表达，工程菌m d v g b 与出发菌株生长及产酸情况基本一致；在6 0 m l 及1 0 0 m l 摇瓶条件下，溶氧不足，v g b 丌始启动表达，提高工程菌从低溶氧培养基中摄取氧 、。1，l 中文文摘 的能力，促进工程菌的生长、产酸，相比出发菌株菌浓分别提高了2 1 和1 6 ，色 氨酸产量则提高了1 6 4 和2 1 ；而在1 5 0 r a l 摇瓶中，由于溶氧严重不足，无法满 足细胞生长需要，工程菌及出发菌株都基本不生长。这一结果表明v g b 及其低氧诱 导启动子在工程菌中得到正确表达。 v i i 。，吣j 目录 目录 摘要 a b s t r a c t i i i 中文文摘。 目录。 绪论。 1 r 。 1 色氨酸理化性质1 2 色氨酸应用1 2 1 医学应用 2 2 食品工业应用2 2 3 饲料添加剂2 3 色氨酸生产方法2 3 1 蛋白质水解及化学合成法2 3 2 酶法一3 - 3 3 微生物前体转化法一3 3 4 直接发酵法一4 - 4 代谢工程在色氨酸生产菌株构建中的应用4 5 色氨酸合成途径及代谢调控机制一6 6 高密度发酵及透明颤菌血红蛋白的应用一7 7 透明颤菌血红蛋白及其研究应用进展一8 7 1 透明颤菌血红蛋白简介一8 7 2v h b 的结构与特性一9 一 7 3v h b 的作用机制1 0 一 8 本课题研究内容及意义一1 1 - 8 1 本课题研究目的和意义1 1 - 8 2 本课题研究内容1 2 第一章l 色氨酸高产菌株的选育1 3 1 1 前言1 3 1 2 实验材料1 3 一 1 2 1 菌种1 3 一 i x 福建师范大学左卒n 桢硕+ 学位论文 1 2 2 主要仪器。 1 2 3 培养基1 4 1 2 4 相关溶液1 5 1 3 实验方法1 5 1 3 1 诱变处理1 5 1 3 2 中间培养1 5 1 3 3 淘汰野生型( 青霉素法) 1 5 1 3 4 营养缺陷型的检出1 6 1 3 5 缺陷型菌株摇瓶发酵1 6 1 3 6 色氨酸含量测定1 6 1 4 结果与分析1 7 1 4 1 致死率计算。 1 4 2 酪氨酸营养缺陷型菌株的筛选1 8 1 4 3 色氨酸标准曲线的绘制 1 5 4 、结。2 0 第2 章t r p e - a 基因的克隆表达 一：1 3 - 2 1 前言 。一2 3 2 2 实验材料 - 2 3 - 2 3 实验方法2 3 2 3 2 质粒d n a 的小量制备2 4 2 3 3 引物设计与合成2 4 2 3 4p c r 扩增t r p e d c b a 基因 2 3 5t r p e d c b a 基因片段回收 - 2 5 - 一：! ! ；- 2 3 6t r p e d c b a 片段与p m d t 1 0 9 质粒的酶切连接2 6 2 3 7 工程质粒的电击转化2 7 2 3 8 转化菌株的验证2 7 2 3 9 阳性克隆子的摇瓶发酵2 8 2 4 结果与分析2 9 2 4 1t r p e d c b a 基因的扩增2 9 2 4 2 重组质粒p m d t r p 的构建2 9 x 时1_n】 - i l 目录 2 4 3 工程菌m d - t r p - 0 6 细胞总蛋白电泳3 0 2 4 4 邻氨基苯甲酸合成酶活性分析一3 1 2 4 5 色氨酸合成酶活性分析3 1 2 4 6m d - t r p - 0 6 摇瓶发酵一3 2 2 5 小结 3 2 第三章透明颤菌血红蛋白在工程菌中表达及功能研究3 5 3 1 前言。- 3 5 - 3 2 实验材料3 “ 3 2 3 主要试剂3 6 3 3 实验方法一3 6 3 2 1d n a 克隆操作3 6 3 2 2 工程菌的发酵培养3 6 3 2 4 细胞总蛋白s d s p a g e - 3 6 - 3 2 5 色氨酸含量测定- 3 6 3 2 5 表达载体p b r - t r p - v g b 的构建- 3 6 3 2 结果与分析一3 8 3 2 1v g b 基因的完整表达框的建立- 3 8 3 2 2 表达载体p m d - t r p v g b 的验证- 4 0 一 3 2 3v g b 基因序列测定一4 0 3 2 4v g b 基因诱导表达- 4 0 3 2 5v g b 基因的表达对菌体生长及产酸能力影响一4 1 3 3 讨论一4 2 总结与展望4 3 参考文献4 5 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果5 1 致谢。5 3 t 。人简历5 5 x i ；，、一 。h 绪论 绪论 1 色氨酸理化性质 色氨酸学名p 一吲哚基丙氨酸( p - i n d o l y l a l a n i n e ) ，首先于1 8 2 5 年被发现，1 8 9 2 年 由n e u m e i s t e r 定名为色氨酸( t r y p t o p h a n ) ，1 9 0 2 年由h o k i n s t 从酪蛋白中分离获得。 刚2 一：i = = = 旷 n h 图1 1 色氨酸结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao ft r y p t o p h a n 色氨酸有三种异构体：l 型、d 型及消旋体d l 型1 1 。消旋体是白色晶体，微 溶于水，在碱性溶液中稳定，被强酸分解。左旋体是片状晶体，无味，熔点2 8 9 ( 分解) ，深于水和热乙醇，不溶于氯仿，在碱性溶液中稳定。右旋体是白色晶体， 有特殊甜味，在2 8 1 2 8 2 溶解，并会分解，溶于水、热乙醇和氢氧化碱溶液。 色氨酸( t r y p t o p h a n ，t r p ) 是种重要的营养必需氨基酸，只能由微生物或植物 合成。l 色氨酸是8 种必须氨基酸之一，人和动物只能从食物中摄取。d 色氨酸主 要存在于微生物和绿色植物中，动物中含量较少，在人体内几乎不发生代谢作用， 也无毒性【2 】。 2 色氨酸应用 2 1 医学应用 l 色氨酸及其代谢产物对机体的广泛作用，在生物体内，【广色氨酸代谢转化可 生成5 羟色胺、吲哚乙酸、尼克酸、褪黑素、色素、生物碱、辅酶、植物激素等生 理活性物质，且色氨酸代谢失调还会引起糖尿病和神经错乱，因此在医学上被用作 氨基酸注射液和复合氨基酸制剂。l 一色氨酸已经广泛应用于癞皮病治疗、精神分 裂症治疗、营养氨基酸片等方面【3 4 】。 l 色氨酸的转化产物5 羟色胺( 5 h t ) 是人体重要物质，有研究者发现严重抑郁 症患者通常都有脑内5 - h t 功能不足的现象，补充色氨酸后，脑内5 h t 含量升高， 可明显缓解抑郁患者病情5 ，6 ，7 1 。 此外，5 一羟色胺还可以促进睡眠和精神稳定，已广泛的应用于健康食品和安 神药物。l 色氨酸本身也对脑代谢起作用，可用作催眠剂。l 色氨酸及其转化产 福建师范火学左祖桢硕十学位论文 物褪黑素和5 一羟色胺还具有抗生育的作用，可以被用于计划生育 8 , 9 1 。 2 2 食品工业应用 l 色氨酸是人体必需氨基酸之一，需从膳食中摄取。l 色氨酸在人及动物的体 内代谢过程中有着重要的作用，被喻为第二氨基酸，在食品及饲料添加剂中应用广 泛。l - 色氨酸能与金属离子螯合，因而具有抗氧化作用，常在奶粉中添加以防止奶 粉变质。此外，【广色氨酸还被用作鱼类保鲜剂，因其可阻止氧化作用的发生，消毒、 防止发霉等【1 0 】。l 色氨酸与其他同样具有抗氧化作用的氨基酸共同作用，如a l a - t r p 二肽等，其防腐作用有时会更显著。 2 3 饲料添加剂 由于植物蛋白中比较缺乏色氨酸，在饲料中添加适量氨基酸还可提高植物蛋白 的利用率。我国农业部已将l - 色氨酸确认为六种饲料添加氨基酸之一，l 色氨酸也 被誉为继赖氨酸及蛋氨酸之后的第三大饲料添加氨基耐1 1 】。色氨酸的代谢产物5 羟色胺( 5 h t ) 在动物体内有抗高密度等作用，还能促进丫球蛋白的产生，增强机体 抗病能力等。此外，色氨酸还能减轻动物的应激反应，减少攻击性行为的发生【1 2 】。 在代谢方面，色氨酸在动物体内可转化为尼克酰胺，尼克酰胺可促进禽畜生长；色 氨酸还可影响动物体内脂肪代谢，减少动物肝脏中脂肪的含量。 由于目前色氨酸生产成本偏高，色氨酸在饲料添加方面的应用仍受限制，目前 只在仔猪饲料中使用。 色氨酸作为一种必须氨基酸及其在动物体内的重要作用，具有广阔的发展及应 用前景。但长久以来，色氨酸的生产一直都存在着成本高，工艺复杂等问题，目前 国内尚无法进行工业化生产。 3 色氨酸生产方法 3 1 蛋白质水解及化学合成法 早期色氨酸生产方法主要为化学合成法及蛋白质水解法。蛋白质水解法以毛 发、血粉、废蚕丝等为原料，通过酸、碱或酶水解成氨基酸混合物，再分离纯化得 到各种氨基酸。化学合成法就是利用有机合成和化学工程相结合的技术，主要以吲 哚及苯肼为原料的合成生产制备氨基酸的方法。化学合成法须经多步骤合成，且得 到的产物是d l 消旋体色氨酸，需经进一步拆分才能得到l 色氨酸才能应用于医药 (， 弋 i 绪论 及食品行业。因此在工业上生产应用并不广泛。 3 2 酶法 酶法是利用微生物中l 色氨酸生物合成酶系的催化功能来催化吲哚和d l - 丝氨 酸等底物来生产l 色氨酸的方法。该法用到的酶系包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、 丝氨酸消旋酶等。根据提供酶的微生物种类，可以分为双菌酶法和单菌酶法两种类 型。双菌酶法是利用分别来自不同的两种菌的色氨酸合成酶( t s ) 、丝氨酸消旋酶 ( s r ) ，催化吲哚和d l 丝氨酸转化生成l 色氨酸。这种方法将不同菌种的酶结合在 一起，实现了酶的优势互补，提高了底物的转化率。m a k i g u c h i 等利用e c o l i 色氨 酸合成酶和p s e u d o m o n a sp u t i d a 的丝氨酸消旋酶，以吲哚和d l 丝氨酸为底物， 2 0 0 l 反应罐反应2 4 h ，l 色氨酸产量达ll0 9 l ；单菌酶法是利用一种茵提供色氨酸 合成所需酶类酶促转化色氨酸。w o n 舀b a n g 等利用大肠杆菌b 1 0 的色氨酸酶系转 化吲哚和d l 丝氨酸， 3 7 c 反应6 0 h ，色氨酸产量达至1 4 1 4 9 l t m 】。 酶法以化工合成的前体物为原料，既有成本低廉的优势，又具有产物浓度高、 收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易等优点，目前工业上较常用。 3 3 微生物前体转化法 前体转化法以葡萄糖等碳源培养微生物，同时添加邻氨基苯甲酸、吲哚、l 丝 氨酸等合成色氨酸所需的前体物，利用微生物的色氨酸合成酶系转化前体来合成l 色氨酸。这种方法在色氨酸工业生产中较早得到应用。日本的昭和电工公司采用以 邻氨基苯甲酸为前体物，利用h a n s e n u l a ( 汉逊氏酵母) 或b a c i l l u s ( 芽孢杆菌) 菌种将 其转化为色氨酸。该方法需解除底物对色氨酸合成途径中相关酶的反馈抑制，使这 些酶得到大量合成，才能得到高浓度的色氨酸。并且，该方法中所添加的前体物大 多对微生物生长有害，不宜一次性添加过多，一般采用流加或分批补料等方法。1 9 7 2 年，n a k a z a w a 等 1 5 1 以雷氏变形杆菌菌体作为色氨酸酶源，以乙酸铵、丙酮酸钠和 吲哚为底物，3 7 发酵4 8 h 可积累l 广色氨酸2 3 l 。1 9 9 0 年，i s h i w a t a 等利用大肠 杆菌色氨酸合成酶高产菌株催化l 丝氨酸，通过间歇补加吲哚培养2 4h ，l - 色氨酸 产量达到1 1 0 l 。 微生物前体转化法存在以下不足，发酵液中前体物浓度不能过高，否则将对色 氨酸合成相关酶的合成造成反馈抑制，其次，高浓度的前体物往往导致转化率的下 降；另外，前体物通常价格比较昂贵，不利于成本的控制。 福建师范人学左祖帧硕十学位论文 3 4 直接发酵法 该法以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价物质为原料，通过优良的微生物菌种在合适的 条件下发酵来累积色氨酸。此法的核心问题在于选育优良的菌株。传统上常通过诱 变来选育色氨酸高产菌株，如筛选与色氨酸同属芳香族的苯丙氨酸及酪氨酸缺陷型 菌株，或抗代谢反馈抑制突变株等。 1 9 8 4 年，s h i i o 等b 6 在前人的基础上以黄色短杆菌诱变株为出发菌株，以亚硝 基胍( m f 、n g ) 为诱变剂，最终得到一株酪氨酸缺陷性、对氟苯丙氨酸( 4 f p ) 、5 氟色 氨酸( 5 - f t ) 及重氯丝氨酸( a s a s e r ) 抗性突变株a 1 0 0 ，最终色氨酸累积量达到1 0 3 9 l 。 在此基础上，进一步诱变得到磺胺胍( s g ) 抗性株s - 2 2 5 ，其产酸率达到1 9 9 l 1 7 1 。 1 9 8 7 年，k u r a h a s h i 等 1 8 , 1 9 以枯草芽孢杆菌a j l l 7 0 8 为出发菌株，以n t g 为诱 变剂得到吲哚霉素( i m ) 、5 氟色氨酸( 5 f t ) 抗性突变株a j l l 9 7 9 ，进一步诱变得到重 氮丝氨酸( a z a s e r ) 、6 重氮5 氧l 正亮氨酸( d o n ) 及肉桂酸( c i n ) 抗性突变株a j l 1 9 8 2 ，摇瓶发酵【广色氨酸累计达到1 3 6g l ，于1 0 0 k l 罐上发酵8 2h 后l 色氨酸 累积量达到2 1 5 l 。 1 9 9 7 年，陈宁掣2 0 1 以谷氨酸棒杆菌a s l 5 4 2 为出发菌株，经d e s 及紫外，得 到苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型及对抗氟苯丙氨酸( p f p ) 、5 氟色氨酸( 5 f t ) 、6 氟色氨酸( 6 f t ) 抑制突变株t i i 6 ，最终色氨酸产量达到1 0 0 1 l 。 2 0 0 1 年，王健等【2 1 】以谷氨酸棒杆菌酪氨酸、苯丙氨酸双缺陷株t x 5 3 2 为出发 菌株，经硫酸- 7 , 酯( d e s ) 多次诱变处理，选育出一株l 广色氨酸产生菌t q 2 2 2 3 ( p h e + t y r + 5 - m t r + 5 f t r + s g r + c i n r ) ，3 0l 发酵罐分批发酵6 4 h 色氨酸得率为 7 2 8 l 。 2 0 0 7 年，陈俊峰等【2 2 】从土壤分离产l 色氨酸的谷氨酸棒杆菌，经n t g 和紫外 诱变，得到一株苯丙氨酸和酪氨酸双缺陷型及多种l - 色氨酸结构类似物的抗性突变 株( p h e - + t y r - + 5 f t r + 5 m t 什4 f p 什s g r ) ，摇瓶发酵9 6 h 可积累l 色氨酸1 0 8 2g l 。 4 代谢工程在色氨酸生产菌株构建中的应用 由于微生物代谢流中，芳香族氨基酸代谢途径本身较弱，且代谢调控机制复杂， 传统的诱变育种方法往往只能对其中一两个调控节点作用，难以对整个代谢流造成 很大的影响。随着各种基因操作技术的发展，在对微生物代谢途径进行分析的情况 下，在基因水平上对代谢流进行合理调控成为微生物法产色氨酸研究的热门方向。 。、叭、 | _ 绪论 这种涉及多种基因的基因工程称为代谢工程，又称途径工程【2 3 1 。代谢工程以区别于 传统的单基因表达( 第一代基因工程) 和基因定向突变( 第二代基因工程) ，有目的地对 细胞生化反应的代谢网络进行修饰的，在多基因水平上设计修饰细胞固有的代谢途 径和遗传性状，并赋予细胞更为优越甚至崭新的产物表达。代谢工程在提高宿主细 胞原有代谢物的产量、产生新物质、扩展和构建新代谢途径、生产代谢产物如氨基 酸、抗生素、维生素以及降解环境污染物等诸多方面显示出广阔的应用前景。通过 代谢工程增加色氨酸产量主要有以下几条思路： ( 1 ) 切断代谢支路 以大肠杆菌为例，芳香族代谢流在分支酸点出现分支，一条由分支酸合成预苯 酸，最终流向酪氨酸及l 苯丙氨酸，另一条经邻氨基苯甲酸合成l 色氨酸。切断 预苯酸支路不仅可节约碳源，使分支酸更多的流向l 广色氨酸合成方向，还可解除酪 氨酸及苯丙氨酸对合成途径中3 脱氧d 邛可拉伯庚酮糖酸7 磷酸( d a h p ) 合成酶( d s ) 的反馈抑制，有利于色氨酸的累积。 ( 2 ) 解除l 色氨酸自身反馈抑制 具体做法是选育抗l 色氨酸结构类似物突变株。色氨酸的结构类似物有：5 甲 基色氨酸( 5 一m t ) 、5 氟色氨酸( 5 f t ) 、色氨酸氧肟酸盐( t r p h x ) 、6 一氟色氨酸( 6 - f t ) 、 6 甲基色氨酸( 6 m d 、4 甲基色氨酸( 4 m t ) 并i j n j i 哚霉素( i m ) 等。这些物质由于结构与 色氨酸类似而被邻氨基苯甲酸合成酶( a s ) 酶误认并与其调节部位结合。选育这些的 抗性突变株就可解除色氨酸对a s 酶的反馈调节，从而使色氨酸得以积累。o s a m u k u r a h a s h i 等利用n t g 处理枯草芽孢杆菌得到5 f t 和i m 的抗性突变株a j i1 7 0 9 ， 在含1 3 葡萄糖培养基中培养1 2 0 h r ，色氨酸累积量达到9 0 9 l 。该菌株色氨酸特 异途径的酶比活明显高于亲株【2 4 1 。 ( 3 ) 增加前体物 通过基因克隆技术，增加色氨酸代谢途径中相关酶合成基因的拷贝数，增强合 成途径中限速酶及关键酶的合成，可有效提高色氨酸的累积量。h e r s h f i d d 等色氨 酸操纵子克隆进c o l e l 质粒，在将其转入大肠杆菌中，当质粒拷贝数增加2 0 3 0 时， 转化菌株色氨酸合成酶活性增加1 5 0 倍。k a t s u m a t a 等人将携带d s 酶及t s 酶基因 的质粒p c d t r p l 5 7 转化到谷氨酸棒状杆菌k y 9 1 8 2 ( p h e ) 中，得到 k y 9 1 8 2 p c d t r p l 5 7 ，色氨酸产量为1 1 l 。将色氨酸合成相关基因克隆到质粒 p d t s 9 9 0 1 上，导入到色氨酸生产菌b p s 1 3 中，色氨酸产量由2 0 1 l 提高到 福建师范人学左祖桢硕十学位论文 3 5 2 9 l 。 5 色氨酸合成途径及代谢调控机制 大肠杆菌的色氨酸生物合成途径及其调控机制如图1 所示。主要包括中心代谢 途径、共同途径和分支途径3 个部分，共同途径从3 脱氧2 邛可拉伯庚酮糖7 磷酸 ( d a h p ) 经莽草酸生成分支酸( c h a ) ，分支途径由分支酸经邻氨基苯甲酸生成色氨 酸。共同途径中，d a h p 合成酶( d s ) 催化4 磷酸赤藓糖( e 4 p ) 和磷酸烯醇式丙酮酸 ( p e p ) 缩合生成d a h p 的反应是莽草酸途径的限速步骤，酶的合成受到转录水平的 调控【2 5 , 2 6 】。d s 有三种同功酶，分别由a r o g 、a r o f 和a r o h 编码，酶的活性则分别受 p h e 、t y r 、卸反馈抑制，l 。苯丙氨酸和l 酪氨酸的协同反馈抑制，l 色氨酸能增强 这种抑制作用( 当三种氨基酸并存时，最大抑制作用接近9 0 ) 【2 7 】。 一二：一：= ：麓。= 生。暮奠 ：；o o 蜘f 瓣埔毒 l ： m 口琊 l i ：错哟啪b 徊r 矗啪擘 ia m o ) ；s 加柚竹韬埒 ! _ 幽 y 谐o i 脚蝴 ( 口，诞 j 孙暾蝴铆 k 婀日4 9 l 。伯ir。ka 魄 a “- u j p s p 矗妒昝l 轴时 ；：l d 棚) o 雌p 卜毒”。 o 辨o 卜啪 o h 嚣 i 一k t 辫h 卜t , j a d p s 1 u t r 一 扩肿葛a n t a ，错r o 1 卜翻| 筹爿 卜q 。剥毒卜一，l毒 i r l 慧”倒0 v m l a 钾， 4 衲一 ， 洋。m 1 埘埔协 纠帅静n 砒o _ 爹簪玉捌滞警” r - l 州 h 力o i 7 ll 、叫2 棚 ， o ” 啪槲 p 的鲥m 耐榭骈 甜、t 拊h p l l a 嘞 钠磅纠g y e 口，国 l 辨9 甜“a 锄 缸辨t 揪d 甜e f l 霄q 翟警。- t r p 三 n 一一一一 图1 大肠杆菌色氨酸生物合成途径及其调控【2 8 】 f i g 1 s y n t h e s i sa n dr e g u l a t i o no ft r y p t o p h a ni ne s c h e r i c h i ac o i l 在大肠杆菌中，从分支酸到色氨酸合成的分支途径是由色氨酸操纵子来完成 、小、， 淼 婶 壤 删恻 獬l - 、 嚏 绪论 的。目前大肠杆菌色氨酸操纵子的结构及其阻遏系统和弱化机制已经研究的比较清 楚。y a n o f s k y 等公布了大肠杆菌色氨酸操纵子的d n a 序列，操纵子有多于7 k b 的 核苷酸，其中6 8 0 0 b p 为五个结构基因( e 、d 、c 、b 、a ) ，分别编码邻氨基苯甲酸 合成酶( a s ) 、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶( p r t ) 、磷酸核糖邻氨基苯甲酸同分异构 酶、吲哚甘油磷酸合成酶和色氨酸合成酶2 9 却1 。其中，t r p e 、t r p d 编码的邻氨基苯 甲酸合成酶( a s ) 是色氨酸生物合成的关键酶，酶的合成受转录阻遏调控，酶的活性 受反馈抑制调控。操纵子结构基因的上游还存在启动基因( p ) 、操纵基因( o ) 和一个 由1