（预防兽医学专业论文）猪源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及其致病性研究.pdf

中文摘要 松鼠葡萄球菌属于凝固酶阴性葡萄球菌，广泛存在于自然界中，同时是人类一个重要的病 原，主要引起人类的心内膜炎、腹膜炎、败血症、尿道感染、盆腔炎症以及手术中的伤口感染 等。然而到目前为止很少有松鼠葡萄球菌引起动物疾病的报道。河北某猪场爆发仔猪渗出性皮 炎，在其中一例渗出性皮炎病例的心包液中分离到了一株葡萄球菌。通过生化鉴定和分子水平 上的i t s - p c r 鉴定，此菌株是松鼠葡萄球菌，用特异性引物扩增脱皮毒素我们发现基因组上含 有脱皮毒素c 基因，通过r t - p c r 也扩增到了脱皮毒素c ，证明其发生了转录。通过口服饲喂 和肌肉注射l 1 0 1 0 c f u 分离菌株对新生仔猪进行攻毒，成功复制了仔猪渗出性皮炎，这一点 说明动物口服病原可能是感染的一个重要途径此外从攻毒实验仔猪的心包液中分离到的葡萄 球菌经生化鉴定和i t s - p c r 证实也是松鼠葡萄球菌，并检测到了脱皮毒素c ，这一切都验证了 分离菌株确实是此次仔猪渗出性皮炎的病原。根据c l s l 推荐的药敏纸片法，对分离菌株进行 药敏实验确定了敏感的抗菌药物，并且通过消毒定量实验找出了此分离菌株的敏感消毒药物及 其工作浓度，为疾病防制措施的制定提供了实验依据。 当用大于l 1 0 s c f u 的分离菌株对小鼠进行攻毒，小鼠在2 4 小时以内全部死亡；用低剂 量5 1 07 c f u 对小鼠攻毒，并分别对攻毒后第l ，2 ，3 天的小鼠脏器进行细菌计数发现小鼠脏 器第1 天的细菌数量最多；此外用l 1 0 1 0 c f u 肌肉注射对新生仔猪攻毒，仔猪在1 2 小时内全 部死亡，而且没有出现渗出性皮炎的症状。以上三点我们可以得出分离菌株对小鼠和新生仔猪 具致死性的，且引起动物快速死亡的原因是分离菌株引起的败血症。 关键词：松鼠葡萄球菌，渗出性皮炎，败血症； a b s t r a c t s t a p h y i o c o c e u ss c i u r ii so n es p e c i e so f c o a g u l a s e - n e g a t i v es t a p h y l o c o c c i , w h i c hi sc o n s i d e r e do n eo f t h em o s ta n c e s t r a la n dd i s p e r s e ds t a p h y i o c o c c a ls p e c i e s a n di ti sa l li m p o r t a n tp a t h o g e no fh u m a n r e s p o n s i b l ef o re n d o c a r d i t i s , p e r i t o n i t i s ，s e p t i cs h o c k , u r i n a r yt r a c ti n f e c t i o n , p e l v i ci n f l a m m a t o r y d i s e a s ea n dw o u n di n f o c t i o m b u tl i t t l ei n f o r m a t i o ni sk n o w nr e g a r d i n gt h ep a t h o g e n i c i t yo fs s c i u r it o a n i m a l s e x u d a t i v ee p i d e r m i t i so c c u r r e di nt h es u c k l i n gp i g l e t so nac o n v e n t i o n a lp i gf a r mi nh e b e i p r o v i n c e , as t r a i no fs t a p 时l o c o c c u sw a si s o l a t e di nt h ep u r ec u l t u r ef r o mt h ep e r i c a r d i a lf l u i do fa m o r i b u n dp i g l e ta n dw a si d e n t i f i e db yb i o c h e m i c a lt r a i t sa n da l s ob ya n a l y s i so f2 3 sr i b o s o m a ld n a u s i n gi n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e rp c i lt h i si s o l a t ew a sam e m b e ro fs s e i u r i u s i n gs p e c i f i cp r i m e r s f o ra m p l i f i c a t i o no ft h ee x f o l i a t v et o x i n s , w ef o u n dt h ei s o l a t ec a r r i e dt h ee x h - ci ni t sg e n o m e ，a n di t w a sa p p r o v e dt h a te x h - cw a st r a n s c r i b e dv i ar t - p c r i n o c u l a t i o no fn e w b o r np i g l e t sw i t h1 1 0 ”c f uo f t h ei s o l a t eb yo r a lf e e d i n gs u c c e s s f u l l yr e p r u d u c o de ei np i g l e t s ，w h i c hs u g g e s t e dt h mt h e o r a li n t a k eo f t h ep a t h o g e nb yt h ea n i m a l si so n eo f t h em a j o rr o u t e so fe x p o s u r e i na d d i t i o n , t h es t r a i n i s o l a t e df r o mt h ep e r i c a r d i a lf l u i do f t h ee x p e r i m e n t a lp i g l e bw a sa l s os s c i u r ii d e n t i f i e db yb i o c h e m i c a l t r a i t sa n di t s - p c ra n de x h - cw a sa l s od e t e c t e db yp c 兄t h er e s u l t sv a l i d a t et h a tt h ei s o l a t ew a st h e p a t h o g e no fe e t h e s ef m d i n g sp r i o r i t i z e ds s e i o r ia si m p o r t a n tz o o n o t i ca g e n t s , w h i c hm a yh a v e r a m i f i c a t i o n sf o rh a m a nm e d i c i n e d i s cd i f f u s i o nm e t h o dw a sc a r r i e do u t 器r e c o m m e n d e db yt h ec l s i t od e t e r m i n ew h i c ha n t i m i c r o b i a li ss e n s i t i v et 0t h es t r a i n t h ew o r k i n gc o n c e n t r a t i o no f d i s i n f e c t a n t st o t h ei s o l a t ew a sd e t e r m i n e db yi nv i t r ot e s t i n gd i s i n f e c t a n t s i tp r o v i d e st h es o l i de v i d e n c e st oe s t a b l i s ha s e r i e so f e f f e c f i v e l yp r e v e n t i v ea n dt h e r a p e u t i cm e a s u r ep u td o w nt h ee ei nt h i sf a r m m o s to ft h em i c er e c e i v i n gt h ed o s eo fg r e a t e rt h a n1 i o s c f u m o n s ev i ai p i n j e c t i o nd i e d w i t h i n2 4h o u r s ；t h em i c er e c e i v i n gt h ed o s eo f5 1 0 c f u m o u s ev i ai p i n j e e t i o nw a se v i s c e r a t e d i m m e d i a t e l ya f t e re u t h a n a s i a , a n dt h ea m o n n to fb a c t e r i u mi nt h ev i s c e r aa t2 4 l l4 8 1 1 , 7 2 hp o s t i n o c u l a t i o nw a sc a l c u l a t e d , i ti sa t2 4 hp o s ti n o c u l a t i o nt h a tt h ea m o u n to f b a c t e r i u mi st h eb i g g e s t ；i n a d d i t i o n , t h en e w l yb o mp i g l e t sr e c e i v i n g1 1 0 6 c f u h e a dv i ai j l l d i e dw i t h i n1 2h o u r sa n dt h e r ei sn o a n ys i g no f e e t h ei s o l a t ei sf a t a lt ot h em o u s ea n dp i g e l e t sa n dt h er e a s o nf o rs u d d e nd e a t hm a yb e s e p t i cs h o c k k e yw o r d s ：s t a p h y l o c o c c u ss c i u r i ，e x u d a t i v ee p i d e m i t i s , s e p t i cs h o c k ； 缩略词表 缩略诃英文全称中文全称 b p b a s e p a i r 碱基对 c f u c o l o n yf o r m a t i o nu n i t 菌落形成单位 c l s ic l i n i c a la n dl a b o r a t o r ys t m d a r d si n s t i t u t e 临床实验室标准化研究所 c n s c o a g u l a s en e g a t i v es t a p h y l o c o c c u s 凝固酶阴性葡萄球菌 e d n a c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a d e p c d i e t h y lp y r o e a r b o n a t e 焦碳酸- - - - 7 _ , 酯 d d h 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d n t p d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 三磷酸脱氧核糖核苷 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙啶 e d t ad i s o d i u me t h y l e n e d i a m i n et e t r aa c e t a t e 乙二胺四乙酸二钠 e te x f o l i a t i v et o x i n s 脱皮毒素 hh o u r小时 i t s p c ri n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e rp c r 内转录间隔区聚合酶链式反应 ll i t e r升 m ha g a rm u e l l e rh i n t o na g a r水解酪蛋白琼脂培养基 n a gm i l l i g r a m 毫克 p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 m i nm i n u t e分钟 m l m i l l i l i t e r毫升 r n ar i b o n u c l e i e a c i d核糖核酸 r n a s e l 鼬l 雏ei n h i b i t er n a 酶抑制剂 r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e辕| 裔缺 r t - p c rr e v e r s et t a n s e d b e d - p c r反转录聚合酶链式反应 s s e i u r i s t a p h ，r l o e o e e u sa c i u r i 松鼠葡萄球菌 s h y i e u s s t a p h y l o c o c c u sh y i e l l s 猪葡萄球菌 s a u r e t l s s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 金黄色葡萄球菌 s d s s o d i u md o d e e y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 p l m c i r o g r a m 微升 i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：璐、世。西 时间：晰石月，2 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：。z 也面时间：由。7 年彳月1 2 日 导师签名： 1 唾咖嵋 时间：莎椰7 年么月f 1 日 1 1病原学 第一章综述 猪葡萄球菌一直被报道为引起仔猪渗出性皮炎的病原( w e g e n e ra n ds k o v - j e n s e n , 1 9 9 2 ) ，但 是在最近有文章报道产色葡萄球菌也能引起仔猪渗出性皮炎，从正常猪的皮肤上分离到的产色 葡萄球菌通过多重p c r 发现此菌株含有脱皮毒素b ，因此作者通过实验室感染s p f 仔猪，引起 了实验猪皮肤油状物渗出、结痂、脱皮等临床症状，成功的复制了仔猪渗出性皮炎( a n d r e s e ne t a 1 。2 0 0 5 ) ，但是此菌株只是从健康猪皮肤上分离到，虽然从分子和蛋白水平上证明了此菌株含 有脱皮毒素，这些只能说明其有感染仔猪并引起渗出性皮炎的可能性，并不能说明产色葡萄球 菌是渗出性皮炎的病原。因此除了猪葡萄球菌以外到现在为止还没有其他种的葡萄球菌是仔猪 渗出性皮炎病原的报道。本研究发现了一株可以引起仔猪渗出性皮炎的高致病性松鼠葡萄球菌， 此菌株可以自然感染和实验室感染仔猪并引起发渗出性皮炎 松鼠葡萄球菌在1 9 7 6 年第一次被k l o o s 和他的同事发现，为圆形或卵圆形的革兰氏阳性球菌， 但是当其衰老、死亡或被白细胞吞噬后常为阴性，在绵羊血琼脂上培养2 4 h 形成3 4 m m 瓷白色、 不溶血的菌落。s h y i c u s 无鞭毛，不形成芽孢和荚膜，常呈葡萄串状排列，但在脓汁、乳汁或液 体培养基中则呈双球状或短链状，有时易被误认为链球菌。其宿主分布范围广，不但可以存在于 很多动物的皮肤上，而且也能从水、土壤，家具等上分离得到，能这样广泛的存在于自然界中主 要归功于它强大的生存能力，其可将无机氮作为其能量的唯一来源。一般都认为松鼠葡萄球菌是 嗫齿类动物、有袋动物、偶蹄动物、奇蹄动物、鲸、等正常菌群，但是有报道说明也能从很多家 养动物上分离到如狗、猪、羊、等动物上分离到松鼠葡萄球菌( c o u t oe ta 1 。2 0 0 0 ) ，此外还可以从 人身上分离到，可占到分离到的凝固酶阴性葡萄球菌中的0 7 9 4 3 0 ( s t e p a n o v i ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 松鼠葡萄球菌凝固酶阴性，氧化酶阳性、耐新生霉素、对多粘菌素敏感( s t e p a n o v i ce ta 1 。 2 0 0 5 ；d a k i ce ta 1 ，2 0 0 5 ) ，这三点可区别猪葡萄球菌。生化反应并不恒定，常常由于菌株及其培 养条件不同会有些许差异，但是应用i t s - p c r 则可以很好的区分2 9 种葡萄球菌，核糖体r n a 基因有很多拷贝，而在两个核耱体r n a 基因之间有很多d n a 序列，而这些序列的大小并不一 致，因此扩增这些片断，则会形成大小不同、数量不等的d n a 片断组合，根据条带组合的不 同，来判断是哪个种的细菌，准确率可达到9 5 9 5 ( c o u t oe t a l 。2 0 0 1 ) 。松鼠葡萄球菌是属于凝 固酶阴性葡萄球菌( c n s ) 中的一种，大部分的松鼠葡萄球菌菌株是无致病性的，但是有些菌 株能引起人的心内膜炎、盆腔炎、尿道炎症、败血症、伤r l 感染( s h i t t u e t a l 。2 0 0 4 ；s t e p a n o v i ce t a 1 ，2 0 0 3 a ；h o d ie ta 1 ，2 0 0 1 ；哪l e te ta 1 ，2 0 0 0 ) 本菌对不良环境有较强的抵抗力，并能在环境中存话很长时间，该菌能在猪舍装置和地面 存活数周，在感染猪舍的空气中浓度可达2 5 x 1 0 4 m 3 这表明空气传播是可能的( w e g e n e r ， 1 9 9 2 ) 在7 0 x 2 条件下经l 小时方能杀死；加热8 0 0 3 0 分钟才能将之杀死；煮沸时则立即死亡 在干燥的脓汁和血液中可生存数月；反复冷冻3 0 次仍能存活 本菌极易对抗菌素产生耐药性，随着抗菌药物在养猪生产的大量使用，葡萄球菌的耐药也 越来越严重，耐药松鼠葡萄球菌菌株的出现也越来越多耐药菌株的产生是使用亚治疗量抗生 中国农业大学硕士学位论文第一章综述 素药物最受关注的一面。研究表明，动物机体长期反复接触到亚治疗剂量的抗生素药物后，其 体内敏感菌株受到选择性的抑制，从而使耐药菌大量繁殖；此外，编码抗药性基因的r 质粒在 菌株间横向转移使很多细菌由单重耐药发展到多重耐药耐药性细菌的产生使得一些常用药物 的疗效下降甚至失去疗效，如青霉素类、四环素类、氨基糖甙类、磺胺类等药物在畜禽中已大 量产生抗药性，临床效果越来越差。随着兽用抗菌药物应用范围和种类的日益扩大，细菌耐药 性的产生已经呈现激增趋势，将来很可能出现对主要抗生素耐药的“超级细菌”。 耐甲氧西林的松鼠葡萄球菌指：松鼠葡萄球菌对所有e 一内酰胺类抗生素耐药；对绝大多数 氨基糖甙类、大环内脂类、氟奎诺酮类耐药；除了万古霉素之外，其他的抗生素都不耐药。其 原因主要为以下几种。1 染色体介导的耐药在细菌中存在5 种青霉素结合蛋白( p b p ，p e n i c i l l i n b m d i n gp r o m i n1 , 2 ，3 ，3 ，4 ) ，这些是细胞壁生长必不可少的物质，青霉素可以与之结合从而阻止 细菌细胞壁合成而抑制和杀死细菌。但是如果细菌基因组中含有m e c a 基因，则会表达与青霉 素亲和力低的p b p h ，青霉素的结合率变低，所以对细菌细胞壁的合成影响减小，从而导致细 菌的耐药2 质粒在松鼠葡萄球菌的多重耐药中起着重要的作用，主要是r 质粒介导的。此质 粒可编码b 内酰胺酶( b l a z ) ，其作用可水解9 内酰胺环，从而引起细菌对青霉素类、头孢菌 素等耐药。除以上两种耐药机制外，还有产生灭活酶如磷酸转移酶、核苷转移酶等等各种氨基 糖甙类钝化酶，使得抗生素不能与细菌的核糖体结合，从而导致细菌对四环素、卡那霉素、氨 苄青霉素、链霉素产生耐药性。其他作用机理还有改变药物作用靶位或者降低抗生素的渗透性 并增加对抗生素的泵出来达到耐药( 俞美红，2 0 0 4 ) 。 松鼠葡萄球菌的基因组可以通过获得t e t ( k ) 、t e t ( l ) 这两个外排泵基因可对四环素类药物产生 耐药斜o ，) ，t e t ( l ) 可编码泵出蛋白，此蛋白可将进入细菌细胞内的四环素类药物泵出体外，减 少抗生素对其核糖体蛋白的作用从而获得耐药。此外t c 删) ，t e “o ) 这两个四环素耐药基因可编码 保护核穗体保护蛋白，使得四环素类药物不能与核糖体结合而使其免遭四环素类药物的作用从而 产生耐药( g r t h u y s , k l a a s d h a e n e , 2 0 0 5 ；吕萍, 2 0 0 6 ) 。 松鼠葡萄球菌对氟奎诺酮类抗生素的耐药机理为以下两点：1 靶位2 拓扑异构酶的改i e f q s 作用于细菌拓扑异构酶，型拓扑异构酶在原核细胞d n a 复制过程中引入负超螺旋结构，使复 制叉移动时不因强力太大而不能前进f q s 拮抗了拓扑异构酶，干扰了细菌d n a 复制、修复和 重组，从而达到杀菌目的细菌拓扑异构酶包括两种结构上相关的酶：d n a 促旋酶和拓扑异 构酶若两种酶发生变异，则产生对f q s 的耐药2 药物的主动外排：存在于细菌细胞膜上的 一些耐药基因编码的多重耐药外排泵，可以将药物选择或非选择性排出细胞外。此种主动外捧系 统亢进，使细胞内药物浓度降低，导致细菌的多重耐药性。就目前已知的主动外排系统，依据能量 型和结构的不同可分成两种：其一，与a t p 结合并利用a t p 水解释放的自由能来转运细胞毒物质的 膜转运系统即：a t p 结合盒族( a t p 2 b i n d i n g c a s s e t t e ，a b c ) ) 其二，利用电化学质子梯度来外捧 药物的转运系统，细菌主要采用的方式有三类：主要易化家族) ，由1 2 或1 4 跨膜片段构成， 耐药结节分化族；小多药耐药族( 吕萍，2 0 0 0 虽然林可霉素类、链阳菌素b 类与大环内脂类的化学结果不周，但是他们却有相同的耐药机 制和抗菌机制，因此将三者统称为m l s b 类抗菌药物当细菌含有红霉素甲基化酶( e r m a 、e n n b 、 e r m c 等) 时，就可以使药物的靶位改变以及将进入细菌体内的抗生物外捧，从而导致细菌对m l s b 类抗菌药物耐药( 吕萍, 2 0 0 6 ；，a a r e s 廿u pa n dj e n s a n , 2 0 0 2 ) 2 中国农业大学硕士学位论文第一章综述 1 。2 流行病学 所有主要养猪国家都报道了e e ，并在某些地区发病率增高( w e g e n e ra n ds k o v - j e n s e n , 1 9 9 2 ) 。这种增高反映了养猪生产向大规模化发展，断奶提前，动物密度增加。该病可发生于各 种年龄的猪，但主要侵害如1 0 日龄的乳猪。其次为刚断奶的仔猪。大猪虽然也有发生，但数 量较少，一般是在各种诱因的作用下才能发生，如患其他疾病而使机体的抵抗力降低，饲养管 理条件不良，环境污染严重，和病猪长时间同圈饲养等。该病在一些猪群的各窝小猪中可呈低 发病率的散发性发生，也可在另一些猪群引起所有各窝小猪流行性发病。这说明免疫力在个体 和群体发病过程中都有重要作用。然而与e e 有关的免疫力的重要性还没有完全搞清楚。 该病通常在无免疫力猪群引进了带菌动物后发生，并常常连续感染几窝由没有免疫力的母 猪所生的小猪。感染群中的所有各窝小猪被感染，其死亡率可达7 0 。疾病暴发通常可自行限 制并持续2 3 个月，但当没有免疫力的母猪被放入被感染的猪舍或接触感染动物时，可能会持 续存在并反复发生。暴发可能从断奶小猪开始，这是因为将无免疫力的小猪和有免疫力的带菌 小猪混养的结果，然后疾病在刚产的仔猪群中传开。 病猪虽然是本病重要的传染源，但葡萄球菌在自然界分布极其广泛，空气、尘埃、污水及 土壤等都有存在，同时也是猪体表面的常在菌，各种葡萄球菌经常可从健康猪鼻粘膜、结膜、 耳朵或鼻、口部皮肤以及后备母猪和经产母猪的阴道中分离到。因此，本病虽可经接触传播， 但更多是在皮肤、粘膜有损伤，抵抗力降低的情况下，病原体经汗腺、毛囊和受损的部位而侵 入皮肤，从而引起毛囊炎、粉刺、疖，痈、蜂窝织炎，渗出性坏死性皮炎和脓肿等。本病一年 四季均可发生，但以潮湿的夏秋季节较为多发。 1 3 发病机理 最早的眼观变化为皮肤变红，同时伴有细菌在皮肤表面增殖，并在表皮的角质细胞之间生 长和形成小菌落。炎症、角质层明显增生和中性粒细胞没润使表皮增厚，随后皮肤糜烂表皮 生发层变得不规则并深深地伸入到真皮中当皮肤上的细菌超过1 0 s c m 2 时仔猪发生临床症状 ( a l l a k e re la 1 ，1 9 8 8 ) 由于松鼠葡萄球菌是凝固酶阴性葡萄球菌c n s 中一个种，c n s 大部分都是无致病性的，存在 与人体或动物的表皮或黏膜上，但当皮肤或黏膜受损时，则进入机体引起感染，在异物表面形成 生物膜，生物膜的形成分两步：首先分泌多糖黏附素和蛋白黏附素，并借助组织中的纤维连接蛋 白、纤维蛋白原、胶原，透明连接蛋白等增加黏附作用，接着在异物表面增值，形成多层的细胞 簇集在异物表面，并分泌特殊的黏液包围菌体( c h r i s w f y o ne i f f a n dg e o r gp e t e r , 2 0 0 2 ) 此外动物 的吞噬细胞调理素系统是抗感染的第一道防线。许多葡萄球菌菌株携带有保护自己不受吞噬的关 键物质：蛋白质a ，存在于多数猪葡萄球菌菌株的细胞壁中，可与免疫球蛋白f c 端结合，来减弱 调理作用( t a k e u c h ie t c ，1 9 9 0 ) ；此外，葡萄球菌都含有过氧化物酶，过氧化氢酶可保护细菌不被吞 噬细胞杀死所有这些特性都有利于克服仔猪最初的免疫反应 脱皮毒素是引起仔猪渗出性皮炎的最重要毒素，将分离于1 0 个国家的2 1 8 株猪源和4 4 株 其他动物源的猪葡萄球菌用多重p c r 检测是否含有脱皮毒素基因，然后用免疫印迹进一步核实 3 中国农业大学硕七学位论文第一章综述 曼i 鼍! 曼皇! ! ! 曼曼曼! 曼! ! ! ! 曼皇曼曼蔓曼皇! 曼! 曼曼曼! 曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼皇! ! 曼曼曼曼皇! ! 曼曼! ! ! 曼! ! 曼! 曼! 曼曼曼曼曼曼曼蔓兰曼! 曼一 结果，发现不论分离与健康猪还是发病猪的猪葡萄球菌可能携带脱皮毒素，但是从渗出性皮炎 所分离到的猪葡萄球菌携带的脱皮毒素的比例要比健康猪分离到的菌株要高很多，说明脱皮毒 素是引起仔猪渗出性皮炎的最主要毒素，因此携带了脱皮毒素的菌株就有可能引起猪的渗出性 皮炎( a n d r e s e n , 2 0 0 5 ) 。脱皮毒素为细菌的分泌型外毒素，因此含有此毒素的细菌培养物上清液 中存在脱皮毒素，将上清液或者经过纯化的上清液给仔猪局部皮下注射，可以产生临床上渗出 性皮炎所见的皮肤病变( a n d r e s e ne ta 1 ，1 9 9 3 ；w e g e n e re ta 1 ，1 9 9 3 ) ，因此进一步说明了脱皮毒素 是引起渗出性皮炎的最主要毒素。现在发现的脱皮毒素有六种，分别为s h e t a ，s h e t b ，e x h a ， e x h b ，e x h c ，e x h d ，大小均约为3 0 k i x a n d r e s e r i ，2 0 0 5 ；a n d r e s e n , 1 9 9 8 ) ，另外比对现在发现的 金黄色葡萄球菌和猪葡萄球菌的脱皮毒素基因序列以及蛋白质氨基酸序列发现，他们之间具有 高度的同源性，作用也类似，均可使表皮发生脱落、油性渗出( a n d r e s e na n da h r e n s 。2 0 0 4 ) 。但 是不同源的脱皮毒素作用的宿主也不相同，例如金黄色葡萄球菌源脱皮毒素只能与1 日龄小鸡 的受体g m 4 样糖脂类物质结合却不能结合哺乳小鼠和成年鸡的受体( t a n a b ee ta 1 。1 9 9 5 ) ，此外 金黄色葡萄球菌源的脱皮毒素能特异性的分解人和小鼠的d e s m o g e n 1 ，而猪葡萄球菌源的脱皮 毒素只能特异性分解猪的d e s m o g e n - 1 ，而不能分解小鼠的( f u d a b ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。脱皮毒素先与受 体g m 4 样糖脂类物质结合，然后特异性的分解d e s m o g e n - 1 ，而d e s m o g e n - i 是连接细胞之间的 一个重要蛋白，当其被分解后细胞则会分离，从而使表皮细胞分离，特别是使上部的棘细胞层 中的细胞分离，从而使细菌在表皮内迅速扩散。皮肤脱落伴有大量皮脂分泌物和浆液渗出物。 含有脱皮毒素的细菌在皮肤里大量存在，并可从局部淋巴结和流出的血液中分离到。该病致死 有可能是由于脱水，也可能是败血症导致的。渗出性皮炎与人的葡萄球菌性鳞片状皮肤病具有 许多相同之处，那是由金黄色葡萄球菌感染新生几皮肤引起的。这种感染是由能产生表皮脱落 毒素的s a u r e u s 菌株引起，可导致局部或全身性的表皮脱落，并排出大量皮脂性分泌物 1 4 临床症状 此病的主要临床症状为皮肤的渗出性化脓性炎症。由于细菌侵入机体的途径、菌量、毒力 和机体的免疫力强弱不一，所以临床上表现的症状也有所不同。根据i 临床上症状出现的快慢， 本病常有急性型与亚急性型之分。 急性型多发生于乳猪和断奶不久的仔猪，发病突然，通常在感染后4 6 天发病。病初，首 先出现于眼周、耳、鼻吻、唇，并扩延到四肢、胸腹下部和肛门周围的无毛或少毛部，出现红 斑，或角化层的灶状糜烂，继而发生3 4 毫米淡黄色小水泡，并在被毛基部蓄积黄褐色渗出液， 靠近毛囊口处发生环绕有充血带的小丘疹，病变通常在3 5 天扩展到全身各处，其颜色很快变 化并富含脂质。当水泡破裂后，其内的渗出液与皮屑、皮脂及污垢等混合此时，病猪全身体 表被覆特征性、厚层黄褐色油脂样恶臭渗出物；当这些物质干燥后，则形成微棕色鳞片状结痂， 其下面的皮肤显示鲜明的红斑患猪的皮肤温度增高，被毛粗乱，渗出物直连到睫毛上可出 现口腔溃疡，蹄球部的角质脱落食欲不振和脱水是本病的基本特征发病严重的小猪体重迅 速减轻并会在7 4 h 内死亡；如仔猪活存4 5 天，渗出物即干燥，则形成深裂纹的黑褐色结痂 剥去结痂可露出鲜肉样表面，但被毛发尚遗存患病仔猪食欲减退，饮欲增加，并迅速消瘦， 生长发育明显受阻急性病例一般经3 0 4 0 天可康复。但在机体抵抗力降低病情加重时，病变 4 中国农业大学硕士学位论文第一覃综述 常常深侵，扩及皮下则常伴发局部性化脓性淋巴结炎的发生；有些患猪还呈现溃疡性口炎；四 肢发生严重的渗出性表皮炎时，常可累及蹄部，此时可在蹄底部发现溃疡。死亡常由于并发脱 水、蛋白质和电解质丧失及恶病质所致。病猪不呈现搔痒，发热也不常见。 亚急性型发病较缓慢，病变常局限于鼻吻、耳、四肢及背部。受损皮肤显著增厚，形成灰 褐色形状不整的红斑和结痂；当病变全身化时，常伴有苔藓化和有明显鳞屑脱落。此型死亡率 低，但康复缓慢，生长停滞( p e p p e ra n dt a y l o r , 1 9 7 7 ) 。 另外，本病也发生于架子猪、育成猪或母猪( 多见于乳房部) ，但病变轻微，通常在病猪的 耳壳及背部见有污秽不洁的渗出性黑褐色结痂；病情较重、病变发展时，则见结痂的皮肤扩大 和脱落，形成红斑和溃疡；当继发感染后，常形成脓皮病而使病情加重。 1 5 病理变化 早期病变包括皮肤变红和出现清亮的渗出物。轻刮腹部的皮肤即可剥离。早期病变常出现 于口、眼、耳周围及腹部。较晚的病例由于泥土和粪便粘在感染皮肤上而使得患猪覆盖一层厚 的、棕色、油腻并有臭味的痂。在恢复期，皮肤变干并结痂可持续数天到数周，因患急性e e 而死亡的猪尸体脱水并消瘦。外周淋巴结通常水肿和肿大。剖检肾脏时，常在肾的髓质切面中 可见大量灰白色或黄白色的尿酸盐结晶，在肾盂中常有粘液或结晶物质聚集，并可能出现肾炎。 镜检，本病的早期病变为浅表毛囊炎，炎症可扩展到毛囊上面的皮肤，形成脓疮性皮炎。此时 在皮肤表面见有厚层覆痂，后者由过度和不全角化物、嗜中性白细胞、浆液及革兰氏阳性球菌 集落所组成。棘细胞层的细胞发生空泡交性和海棉样变( a n d r e s e ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。表皮和毛囊外根 鞘见有海绵样微小脓疱形成，常在毛囊角化物和毛干的表面发现细菌集落，但深部毛囊则罕见 表皮增生，表皮突伸长，基底细胞分裂现象增多真皮水肿，毛细血管强度扩张充血，血管周 围有嗜中性白细胞、偶见嗜酸性白细胞浸润。病变严重时，表皮可发生糜烂与溃疡，并可侵及 真皮，导致弥漫性化脓性皮炎 亚急性病变，渗出现象轻微而表皮增生显著，可形成不规则的假癌瘤样增生及过度不全角 化，真皮有明显的单核细胞及血管周围炎性细胞浸润。毛囊上皮增生，毛乳头部见有菌块。 1 6 诊断 通常以据l 临床症状即可对幼仔猪做出诊断病猪不发热，无搔痒，病变全身化，其外观和 在同一窝小猪中严重程度不同，这些都是该病的特征还可通过组织学和细菌学的方法加以确 诊。也可能需要使用常规的细菌学方法，通常是采取化脓的皮肤、组织或脓性渗出物等做涂片， 革兰氏染色后，用显微镜观察，并依据细菌的形态，排列和染色特性等进行确诊另外，还可 做细菌分离和血清学检查等 由于来自猪的猪葡萄球菌在嗜菌型、血清型和d n a 指纹型方面具有多型性( a n d r e s e ne ta 1 ， 1 9 9 3 ) 由于发病猪中同时有不同型的s h y i c u s ，从而使诊断变得复杂w e g e n e r 发现从每个病 猪的皮肤上任选分离出的l o 株s h y i c u s 中，平均包含1 9 种不同的噬菌体型和2 3 种不同的抗 生素型。从动物肝、脾中分离到的菌株的多样性则稍低一些由于诊断实验室中缺少简便方法 5 中国农业大学硕七学位论文第一章综述 来区分毒力型和非毒力型菌株，所以各型s h y i c u s 都应被看做潜在的毒力型菌株。此外本研究 发现了松鼠葡萄球菌也能引起仔猪渗出性皮炎，因此，要选用对所有各型都有效的抗菌药物。 同样地，自家疫苗应从存在于病猪体内所有各种菌型来制备。 当病变轻微，或局限于咬伤所造成的损伤口周围，经过治疗后诊断就不太容易了。这种情 况下，无并发症病例可以通过分离到病原及对抗生素的反应来确定，但是该菌也可能存在于由 一些原发性因素引起的损伤处。 易与e e 混淆的其它皮肤病变有腊痘( 局部损伤，很少致死) ，疥癣( 搔痒，可找到螨) ， 癣( 扩散性的表层病变，可分离到真菌) ，玫瑰糖疹( 环状扩散，不致死，病变部不含脂质) ， 缺锌( 断奶猪，对称的干燥病变) ，增生性皮肤病( 在l a n d r a c e 猪中遗传，致死性肺炎) 以及 局部创伤( 如小猪的面部咬伤和膝部擦伤，大猪木箱碰伤) 。这种细菌还能在其它病理条件下如 小猪关节炎和母猪膀胱炎甚至健康猪的皮肤上分离到。 1 7 治疗与预防 1 7 1 治疗 疾病早治疗效果好，严重感染的动物则可能不见效。全身性治疗可降低皮肤病变的程度， 使之仅发生浅层的病变，并促进愈合过程。由于中国现在抗生素的滥用，耐药非常普遍，经常 是多重耐药，因此，治疗本病时最好先从病猪体分离到病原，然后做药敏实验，找出针对该菌 的敏感药物进行治疗没有条件培养细菌时，也可先选用一些对本菌敏感的药物，边治疗边观 察，及时进行调整，如联合使用三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺或林可霉素和壮观霉素在体外对葡萄 球菌有良好的抑制作用在抗菌治疗时应给予体液替代品或至少保障供给患畜清洁饮水。并用 抗生素或皮肤抗感染药对病损的局部应先进行外科式的处理。通常先用消毒过的刀剪清除掉 损伤表面的异物、尽量清除创面上存有的脓汁和细小的异物等。外科处理完之后，再用对细菌 敏感的药物进行治疗，通常是将这些抗生素制成膏剂进行涂布，如青霉素软膏、红霉素软膏等， 也可涂布龙胆紫。对于局部的皮肤损伤，一般只做外伤处理即可，但对范围较大或全身性皮肤 损伤，在进行局部处置的同时，还应辅以补液，调节酸碱平衡等全身性疗法。治疗必须持续5 天以上，发病小猪可能恢复较慢，而且会导致其发育缓慢。 1 7 2 预防 由于葡萄球菌是一种常在菌，广泛存在于自然界和猪体的表面，因此，要彻底根除本病几 乎是不可能的，但通过积极的预防则能控制或减少本病的发生。为了控制本病的发生，首先要 切断主要的传染源，对病猪不但要早发现，早隔离和及时治疗，而且对病猪污染的环境和用具 等进行彻底的消毒，同时对与病猪有接触的猪要进行预防性治疗 其次要加强饲养管理，提高猪体的抵抗力，防止常存在于环境中的病原菌乘虚而入特别 应注意防止皮肤的外伤，修齐初生小猪的牙齿防止咬伤，保证围栏表面不粗糙，采用干燥，柔 软的畜床，比如软木锯屑或切碎的稻草，要及时清除带有刺或尖的物品，以免猪与之接触而发 6 中国农业大学硕+ 学位论文第一章综述 生损伤；当发现皮肤有损伤时，应及时用碘酊或酒精等消毒液进行处置，防止感染的发生。另 外，猪的圈舍及运动场地等也应经常清扫，保持清洁，定期消毒，尽量减少环境中残存的致病 菌。母猪进入产房应先清洗、消毒，然后放进清洁、消毒过或熏蒸的圈舍 用分离于发病场的菌株制成自体菌苗来免疫产前的母猪，可能会保护新引进的母猪所产的 小猪。抗体能有效地中和表皮脱落毒素对皮肤的侵害。该毒素可能是惟一的保护性抗原；但在 生产条件下尚未得到证明。所以自体疫苗应该用菌体和含有表皮脱落毒素的培养上清液来制造。 1 8 国内外研究进展 1 9 9 8 年a n d r e s e nl o 调查了从渗出性皮炎仔猪分离到的猪葡萄球菌脱皮毒素的分型和分 布，次年又建立了用间接e l i s a 方法检测猪葡萄球菌的三种脱皮毒素，接着在2 0 0 4 年克隆了 猪葡萄球菌编码脱皮毒素a ，b ，c , d 的基因并对序列进行了分析，同时建立了检测这四种脱皮毒 素的多重p c r 方法，2 0 0 5 年报道了由致病性产色葡萄球菌引起的渗出性皮炎，同年调查了不 同国家猪葡萄球菌脱皮毒素的携带情况；a a r e s t r u pf m 在2 0 0 2 年对从渗出性皮炎病猪分离到的 猪葡萄球菌进行了抗菌药物的使用和耐药情况趋势的调查。n i s h i f u j ik 等人2 0 0 5 年为了研究渗 出性皮炎发生的机理，克隆了猪的桥粒芯蛋白一1 ，发现从渗出性病猪上分离到的猪葡萄球菌产 生的脱皮毒素能分解桥粒芯蛋白一1 ，证实了猪葡萄球菌引起猪脱皮的机制。n o f r a r i a s m 在2 0 0 6 年检测了猪自然感染渗出性皮炎时，外周血白细胞水平和一些细胞因子的变化。国内的研究主 要集中在渗出性皮炎病原的分离鉴定和防治，而在发病机制、致病机理和分子生物学方面的研 究做的较少但是现在却没有松鼠葡萄球菌引起猪的疾病的报道，本研究报道了松鼠葡萄球菌 引起猪渗出性皮炎。 1 9 研究的目的和意义 渗出性皮炎因其i 临床症状而被认识已经1 5 0 多年了，随着养殖业不断的发展，集约化程度 越来越高，断奶提早，所有主要养猪国家都报道了渗出性皮炎，并在某些国家和地区发病率增 高。该病在在一些猪群的各窝小猪中一般都呈低发病率的散发性发生，但是由于在国内的养殖 环境差，猪场很少有专门的兽医技术人员，且饲养管理水平很低，疾病的发生越来越复杂，且 病原呈现多因子化，此病的发生也越来越普遍，流行范围也在扩大随着渗出性皮炎的发病率 不断呈增高趋势，病死率也在升高，给猪场造成的损失也越来越大，怎样防治此病在猪场的流 行越来越受到人们的重视。本研究通过对此病的病原学一系列研究如分离鉴定、药敏实验、消 毒实验等，制定了一套由松鼠葡萄球菌引起的仔猪渗出性皮炎的综合防治措施，并成功控制了 此病的流行本研究为以后渗出性皮炎病原学研究以及其他细菌病的病原学研究提供了一个可 借鉴的方法 猪葡萄球菌一直被认为是仔猪渗出性皮炎的病原，至今为止还没有其他种的葡萄球菌引起 仔猪渗出性皮炎的报道本研究在河