（物理化学专业论文）生物活性分子的sers光谱研究.pdf

摘要 自表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e r s ) 效应于2 0 世 纪7 0 年代中期被发现以来，基于s e r s 效应的光谱技术已发展成为一种可以用来 研究表面吸附过程和界面作用机理的十分重要而有效的谱学方法。近年来，s e r s 光谱技术已经广泛应用于多个领域，如生命科学、材料科学、催化化学与环境化 学等研究领域。而利用基于纳米粒子的s e r s 光谱技术来研究生物活性分子的方 法则结合了s e r s 光谱和纳米粒子的诸多优点，可以大大推进了s e r s 光谱技术在 涉及生物分子研究领域应用的广度与深度。因此，合成性质优良的纳米溶胶及制 备具有良好s e r s 效应活性的基底，以及在此基础上研究与金属溶胶作用的生物 分子的结构与性质及分子与会属表面之间的结合状态与作用机理，对于我们深入 理解生物分子结构与其功能问的关系具有十分重要的意义。 为此，本论文主要丌展了以下几个方面的研究工作： ( 1 ) 简要地概述了拉曼光谱和s e r s 光谱的基本原理、特点及其应用概况。此 外，也简要介绍了金属纳米材料及其在s e r s 光谱研究中的应用情况。 ( 2 ) 选用以硫畔嘌呤，多巴胺为代表的生物分子作为研究对象，采用合适的 方法将其自组装到银电极表面，利用s e r s 光谱技术进行了表征与分析。研究结 果表明：分子吸附基团的s e r s 谱峰随外界物理化学环境改变而发生的变化可以 作为推断分子在电极表面吸附构型转变的依据。 ( 3 ) 采用化学还原法分别合成了金，银以及金银核壳三种溶胶。利用紫外可 见光谱，透射电镜等手段对其进行了表征。以表面硅烷化的导电玻璃( i t o ) 作为 成膜基底，以纳米粒子有序组装膜作为s e r s 增强基底，对表征天青蛋白吸附作 用的s e r s 光谱进行了研究。 关键词：表面增强拉曼散射，自组装单分子膜，电极电位，p h 值，金属纳米粒 子，硫唑嘌呤，多巴胺，天青蛋白 a b s t r a c t s u r f a c ee n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) e f f e c tw a sd i s c o v e r e di nt h em i d 一19 7 0 sa n d w a s d e v e l o p e dr a p i d l ya sav e r yi m p o r t a n ta n de f f e c t i v es p e c t r o s c o p i ct o o lf o rc h a r a c t e r i z a t i o na n d a n a l y s i sw i t hm o l e c u l a ra d s o r p t i o no nv a r i o u ss u b s t r a t e sa sw e l la st h em o l e c u l a ri n t e r a c t i o n m e c h a n i s m i nr e c e n ty e a r s ，t h es e r st e c h n i q u eh a sb e e nw i d e l yu s e di nm a n yr e s e a r c hf i e l d s ， s u c ha sl i f es c i e n c e ，m a t e r i a l ss c i e n c e ，c a t a l y s i s ，a n de n v i r o n m e n t a lc h e m i s t r y u t i l i z a t i o no ft h e s e r st e c h n i q u eb a s e do nn a n o - p a r t i c l e sf o rs t u d y i n gt h eb i o m o l e c u l e sc a ni n c o r p o r a t e v e r y e f f e c t i v e l yb o t ht h ea d v a n t a g e so fs e r ss p e c t r o s c o p ya n dt h o s eo fn a n o p a r t i c l e s i tc a ng r e a t l y b r o a d e na n dg od e e pi n t ot h ea p p l i c a t i o n so fs e r st e c h n i q u ei nt h er e s e a r c hf i e l dc o n c e r n i n g b i o m o l e c u l e s t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yt os y n t h e s i z ep r o p e r t y - g o o dn a n o m a t e r i a l sa n dp r e p a r e g r e a ts e r s - a c t i v i t i v es u b s t r a t e s t h e nw ec a l ls t u s ye f f e c t i v e l yt h es t r u c t u r e sa n dp r o p e r t i e so f b i o m o l e c u l e sa d s o r b e do nt h e m ， a n df u r t h e r m o r er e v e a lt h em e c h a n i s ma b o u tm o l e c u l a r i n t e r a c t i o na c c o m p a n y i n gt h ef o r m a t i o no ft h ea d s o r b e ds p e c i e s f o rt h i sp u r p o s e ，o u rr e s e a r c hw o r ki n c l u d e st h ef o l l o w i n ga s p e c t s ： ( 1 ) t h ee l e m e n t a r yp r i n c i p l e sa n df e a t u r e so fr a m a na n ds e r sw e r es u m m a r i z e d ，a n dt h e a p p l i c a t i o n si nt h er e s e a r c ho f b i o m o l e c u l e sw e r ea l s op r e s e n t e dp r i m a r i l y ( 2 ) a z a t h i o p r i n ea n dd o p a m i n ew e r es e l e c t e da st h er e p r e s e n t a t i v eb i o l o g i c a lm o l e c u l e sf o r o u rr e s e a r c h b yu s i n gt h ea p p r o p r i a t em o l e c u l a rs e l f - a s s e m b l ym e t h o d ，a z a t h i o p r i n eo rd o p a m i n e m o l e c u l e sc a nb ea s s e m b l e do n t ot h es i l v e re l e c t r o d es u r f a c e s ，a n dt h e nt h es e r ss p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u ew a su s e dt oc h a r a c t e r i z et h e i ra d s o r p t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es e r ss p e c t r ao f m o l e c u l a ra d s o r p t i o nc h a n g ew i t ht h ep h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r sa n dc o n d i t i o n s f u r t h e r m o r e ， t h em o l e c u l a ra d s o r p t i o nc o n f o r m a t i o n sw e r ea l s oi n f e r r e df r o mt h e s es e r ss p e c t r a ( 3 ) s y n t h e s e so fg o l d ，s i l v e ra n dg o l d - s i l v e rc o r e - s h e l ln a n o p a r t i c l e sw e r ec h a r a c t e r i z e db y u va n dt e m t e c h n i q u e s c o n d u c t i v eg l a s s ( i t o ) w a ss e l e c t e da st h es u b s t r a t ef o ra s s e m b l yo f t h e s en a n o p a r t i c l e s t h eo r d e r e dn a n o p a r t i c l ea s s e m b l ys y s t e mw e r eu s e da sa ns e r ss u b s t r a t et o s t u d yt h eb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e ，a z u r i n k e y w o r d s ：s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，e l e c t r o d ep o t e n t i a l ， p hv a l u e ，m e t a ln a n o p a r t i c l e s ，a z a t h i o p r i n e ，d o p a m i n e , a z u r i n 上海师范人学硕十学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声 明并表示了谢意。 作者签名：叉p - 2 同期：知细茸5 凡沥日 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后 遵守此规定。 作者签名： 导师签名： 甲已乡 。嘭庑， 同期：洳惜s 凤泌日 同期：刀口净期咖 5 7 上海师范大学硕十学位论文 第一章绪论 1 1 拉曼光谱与表面增强拉曼散射( s e r s ) 光谱 1 1 1 拉曼散射的基本原理及特点 当频率为u o 的单色光辐射到样品上时，有些入射光将会被散射，如图1 1 所示，在被散射的光线中除了那些和入射光辐射频率相同的辐射( 弹性散射辐射 - r a y l e i g h 散射) 外，也存在着与入射光频率不相同的辐射( 非弹性散射一r 锄a l l 散射) 被观测到。拉曼散射现象可以用光子与物质分子的碰撞来解释。频率为 的单色光照射到物体上时，光子与物质的分子发生非弹性碰撞，碰撞的过程伴 随着能量的转移，结果不仅光子的方向发生改变，而且光子的能量即频率也发 生了变化。从能量变化的角度来看拉曼散射其实是入射光子和物质分子的振动 和转动能量交换的过程。从量子能级图上我们可以更清楚地理解拉曼散射的过 程，如图1 1 所示，处于基态e o 的分子受入射光子h t j o 的激发跃迁到一个受激 虚态，虚态能级不稳定，所以分子很快又跃迁回到基念能级，此过程对应弹性 碰撞，跃迁辐射出频率为h u o 的瑞利散射光。另外，处于虚态能级的分子还可 以回到激发念e l ，此过程对应光子与物质分子之间的非弹性碰撞，跃迁辐射出 频率为h o m m ) 的拉曼散射光，该频率的拉曼散射光被称作斯托克斯线( s t o k e s r a y ) 。同样，处于激发态的e l 的分子受入射光子的激发也可以跃迁到一个受 激虚态，受激虚态不稳定，分子很快的辐射跃迁到初始能态e l ，辐射出频率为 瑞利光，或者跃迁到基态能级，辐射出频率为h ( u 舢m ) 的拉曼散射光，此拉 曼散射光被称作反斯托克斯线( a n t i s t o k e s r a y ) 。可以看出，斯托克斯线对应于光 子能量损失过程，而反斯托克斯线则对应光子获得能量的过程。斯托克斯与反 斯托克斯同瑞利线之间的能量差e 分别是h u m 和h u m ，其数值相等，都等于 分子振动能级( 或转动能级) 的能量差。所以在拉曼光谱中，斯托克斯线和反 斯托克斯线总是对称的分布在瑞利线的两侧，它们与瑞利线的频率差称作拉曼 位移，通常用波数( c m 。1 ) 表示。拉曼光谱提供了物质分子振动和转动能级结构的 信息。关于r a m a n 散射理论的细节描述参见文献【l 】。 上海师范人学硕十学位论文 v i r t u a ls t a t e g r o u n ds t a t e ji jl h u o h o oh ( o o + 0 o - o m ) h v oh o o f 1 l i 1f1f 一 印 l s t o k e s r a y l e i g h s c a t t e r i n g s c a t t e r i n g a n t i s t o k e s s c a t t e r i n g f i g 1 1s c h e m a t i cd i a g r a mf o rr a m a na n dr a y l e i g hs c a t t e r i n gp r o c e s s 拉曼光谱是一种采用光子作为探针来揭示分子结构信息却不会引起分子损 伤的分析技术。从拉曼光谱的实验数据能够得到关于分子结构、表面过程及界面 反应等大量丰富的信息，从而使得拉曼光谱成为一种重要的化学和生物分析技 术。拉曼光谱测定可在室温、低温和高温等不同条件下进行，其显著的优点是可 实现对气、液、固三相进行原位和定量分析。 当激发光的波长接近或位于散射分子的电子吸收光谱带内时，某些拉曼谱带 的强度将大大增强，这种现象称为共振拉曼效应( r e s o n a n c er a m a ne f f e c t ) ，它是 电子态跃迁与振动态相耦合作用的结果。通常，共振拉曼光谱的强度与常规拉曼 相比要强4 5 倍。与常规拉曼光谱相比，共振拉曼光谱灵敏度相对要高，试样的 检测限就降低很多。这一点对生物大分子检测很重要，因为它不但可以增强分子 的拉曼信号，而且可以选择性地加强分子结构中具有吸收光的部分的振动模式。 这些能够吸收光的部分一般便是分子中有着明显生物学特征的部分，如，化学反 应活性中心。利用共振拉曼光谱带与激发线的关系能够获得有关分子振动和电子 运动间相互作用的信息。共振拉曼光谱特别适合于研究生物大分子，如，蓝铜蛋 白，因为通过共振效应可以获得与大分子发色团相关的振动信息。这种选择性对 于研究电子跃迁和发生共振增强的振动之间的理论关系尤为重要。但是，共振过 程中的电子跃迁激发很容易产生很强的荧光，这成为共振拉曼光谱应用的一个局 限性【2 】o 2 上海师范大学硕士学位论文 1 1 2s e l l s 现象及机理 一般而言，因为拉曼信号非常弱，所以，利用常规拉曼光谱很难达到低的检 测限。但是，最近2 0 年拉曼技术在很多领域的应用还是在不断地扩大。对于拉曼 光谱的这种新产生的兴趣是因为对于吸附在特殊金属表面的分子能够使其得到 巨大的拉曼增强。2 0 世纪7 0 年代中期，在通过氧化还原电化学粗糙化处理的银电 极上吸附的吡啶单分子膜上发现，其拉曼散射信号得到异常地增强【3 1 。这种拉曼 信号的增强起初被归因于电极表面的粗糙化而产生的高表面密度，后来被确定认 为是拉曼散射信号的表面增强的结果i n s e r s 效应。与常规拉曼相比，从吸附分 子观测到的拉曼散射信号的增强因子要强几百力倍。这种巨大的拉曼散射增强效 应开启了拉曼光谱技术在痕量分析，化学分析，环境监测和生物医学等方面应用 的新的可能性。自首次观测到s e r s 效应之后，便有了对其更为广泛的基础和理 论研究。 虽然已经有大量基础研究致力于获得更好的增强机理的解释，但是，我们 对s e r s 的理解还是不完全的。目前，有几个理论模型能够解释与s e r s 效应 有关的各种实验现象。光散射的经典理论提供了对s e r s 过程的定性理解。一 束入射光射到一个偶极振动频率下能散射光的颗粒上便可诱导出一个振动偶极 子，i x 4 1 。该偶极矩一般包含许多不同谐波频率分量。每个分量可以由下面的公 式表示： g ( t ) = p mc o s ( 2 7 m t ) 其中，1 ) 表示偶极振动( 如散射) 频率，p m 表示对于给定频率中最大诱 导偶极距。对于电磁场e i 不是很大时，诱导偶极距可以近似表示为： p ( t ) = p e i n 。( t ) 其中，p 是分子的极化率。极化率是一种张量，可以定性地描述为由于外 场的存在而使得分子轨道变形的难易程度。 拉曼强度被认为与诱导极化率“的平方成比例，可以得出有两种可能的增 强机理。增强效应能够影响：( 1 ) 分子极化率，如分子效应；( 2 ) 分子所在的电 场，如场效应。同时可能发生一些其他增强过程。所以，理论模型主要包含两 种类型的增强机理：( 1 ) 电磁效应，有时也称为场效应。它是由于在金属表面 所出现的电磁共振而产生的效应；( 2 ) 化学效应，也被称为分子效应。在这种 3 上海师范人学硕十学位论文 情况下，分子极化率将受到分子与金属表面间相互作用的影响。 现已广泛检测到有关s e r s 效应的某些机制，如电磁相互作用的贡献，并 被充分地合理理解。其他一些过程，如化学效应的贡献，则了解相对较少而成 为目前大量研究的课题。关于s e r s 理论模型的更多细节请见文献【5 ，6 】。 1 1 3 拉曼光谱及s e r s 光谱的应用概况 p e t e rc s t a i r 7 】总结了拉曼光谱在以下三方面的创新：荧光干扰的避免、化 学计量法对数据进行解释的应用以及利用拉曼光谱进行遥测技术。而仪器的快速 发展使得拉曼光谱在生物化学方面的应用越来越多，如组织、d n a 、蛋白质等 的研究【8 】。拉曼成为一种选择的原因主要包括：对小的结构变化灵敏性高、无损 采样功能、最少的样品制备、在使用显微分光镜情况下可以保证有较好的空间分 辨率的拉曼光谱【9 】。 类似于其他振动光谱技术，s e r s 光谱可以被视为一种复合的指纹光谱。从 s e r s 光谱中通常能够确定不同的化学键强度是如何随吸附量的改变而发生的变 化情况，或者在吸附分子和金属表面是否有新的化学键产生。因为在盒属表面的 电场是各向异性的，所以，从s e r s 光谱中能够推断吸附分子对于余属表面的吸 附取向。因为s e r s 有选择性地探测与表面接触的分子，所以，在有大量溶剂， 如水存在条件下，能够得到吸附物的s e r s 光谱。所有这些优点使得拉曼广泛应 用于各领域的表面科学，如电化学【1 0 1 、催化1 、生物物理化掣12 1 、聚合物化 学【13 1 、分析化学【m 】。目前，s e r s 应用最多的一个领域是电化学吸附。电化学吸 附涉及普遍而又复杂的界面现象，仅用常规电化学技术不能对电化学吸附过程进 行详尽的分析。相对而言，s e r s 技术不仅能够较为直观地推断表面吸附物种， 还能够对电化学吸附过程作较深入的研究。s e r s 光谱在催化方面的应用可以通 过e r t l 和p e t t i n g e r d 、组在银催化剂表面的测试来阐明，该小组报导道s e r s 来自在 a g ( 11 1 ) 、a g ( 11 0 ) 、平面a g ( 11 0 ) 面的表面和表面下的含氧物质【”】。而在真实 的技术条件下，s e r s 钡j 试不仅仅在银上【1 6 】。 最近几年，对于s e r s 在生物方面的应用研究越来越多，尤其是在药物分子 与d n a 作用以及酶、蛋白质与底物作用等方面引起了研究工作者的极大兴趣。 将生物分子选择吸附在生物相容性较好的金属上，从而得到一系列有用信息，如 4 上海师范人学硕十学位论文 对生物分子在金属上的吸附行为的研究将有助于药物的研制开发。此外，也有很 多专门的关于s e r s 应用的综述【1 7 , 1 8 1 。s e r s 在研究生物分子方面有其独特的优 点：它作为一种振动光谱，与电子光谱相比，如荧光光谱，其采集光谱的速度更 快；由于s e r s 分析物必须接近或在贵金属的表面，这就增加了分子激发态非辐 射能量转移的途径，因此，能够大大猝灭背景荧光；s e r s 是一种近场效应，只 有接近或在表面的分子才能被检测到，所以，s e r s 是表面研究、痕量分析、生 物分子间相互作用等研究的很好工具；s e r s 光谱测试不受水的影响，所以，s e r s 可以很好的用于生物环境中的研究【1 9 之1 1 。 在许多情况下，在用传统的方法测试得到的光谱罩感兴趣的部分往往被其他 的如非活性部分的信息而掩盖掉，在一个大的样品室内采集很小范围内拉曼信号 就显得很重要。针尖增强拉曼光谱( t e r s ) 2 2 】将拉曼光谱与原子力显微镜( a f m ) 或扫描隧道显微镜( s t m ) 相结合，则可以从单分子上获得可靠的拉曼信号。国 内厦门大学的田中群小组【2 3 】利用自行研制的以电化学刻蚀的金作为针尖的t e r s 来检测吸附在单晶面上的物种，得到了大大增强的t e r s 信号。t e r s 技术的出现 再次扩大了拉曼光谱的应用范围，促进了各领域科学技术的发展，也显示了s e r s 光谱研究将处在一个新的重要发展时期。 1 2 金属纳米材料及其在s e r s 光谱研究中的应用 1 2 1 纳米材料简介 纳米材料( n a n om a t e r i a l ) ，是指微观结构单元的尺寸介于1 啪1 0 0 n m 之i 可 的材料。物质在这个尺寸范围内性能很容易发生突变，出现特殊性能。此类材 料的尺度已与光的波长相近，再加上它具有大表面的特殊效应，使得纳米材料 通常具有特殊性能，如表面效应、体积效应、量子尺寸效应、介电限域效应等。 通常，纳米材料与该物质在宏观状态时所具有的性质不一样。故而，使得纳米 材料具有高表面活性、超顺磁性、强氧化性、吸收光谱表现明显地位移等特性。 此外，纳米材料还具有特殊的光学特性、催化特性、光催化特性、光电化特性、 化学反应特性、化学反应动力学特性、物理机械特性。在2 0 世纪8 0 年代，金 属纳米材料被研发出来，随后，纳米半导体薄膜、纳米瓷性材料、纳米生物医 上海师范大学硕士学位论文 学材料等相继问世。其中，纳米材料在生物医学上的应用对现今的生物医学的 发展起到了至关重要的推动作用。目前，在具体应用方面主要有量子点的荧光 效应，磁性纳米材料的磁效应以及纳米材料的吸附作用等。 纳米技术是2 0 世纪以来全球都在讨论的热门话题，其涉及面特别广，纳米 材料只是其中的一部分，但它却是纳米技术发展的基础。它是一种用数以千计 的分子或原子来制造新型材料或微型器件的科学技术。 1 2 2 金属纳米材料的l s p r 特性 等离子体( p l a s m o n s ) 是由失去部分电子的原子和原子电离后产生的电子 组成的离子化的但是总体显电中性气态物质。它一般被认为是与气，液，固类 似的普遍存在于宇宙当中的第四念。表面等离子体( s u r f a c ep l a s m o n s ，s p s ) 是一 种电磁表面波，它在表面处场强最大，在垂直于界面方向是指数衰减场，它能 够被电子也能被光波激发。1 9 0 2 年，w o o d 在光学实验中首次发现了表面等离 子体激元共振现象。1 9 4 1 年，f a n o 等人根据会属和空气界面上表面电磁波的激 发解释了这一现象。r i t c h i e 发现当高能电子通过金属薄膜时，不仅在等离子体 激元频率处有能量损失，在更低频率处也有能量损失峰，他认为这与金属薄膜 的界面有关。1 9 5 9 年，p o w e l l 和s w a n 通过实验证实了r i t c h i e 的理论。1 9 6 0 年，s t r e n 和f a r r e l 研究了此种模式产生共振的条件并第一次提出了表面等离子 体激元的概念。在纳米技术成熟之后，表面等离子体受到了人们极大的关注， 成为目前研究的热点。它已经被应用于包括生物化学传感，光电子器件集成等 多个领域。 局域表面等离子体( l o c a l i z e ds u r f a c ep l a s m o n ，l s p ) 是限制在纳米颗粒表 面的等离子体。所有金属都会有其固有的等离子振荡频率，如果入射光的频率 与金属的振动频率相一致则能产生共振，这就叫做金属中的等离子共振。局域 表面等离子体共振( l o c a l i z e ds u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，l s p r ) 局限于金属纳米 颗粒，有时也包括金属簇和会属纳米结构上的传导电子共振现象【2 4 1 。在一有共 振现象发生的入射波长下，局域表面等离子体由电场激发将引起强烈的光散射、 剧烈的表面等离子体吸收带的出现以及局域电磁场的增强。最大吸收波长及表 面等离子吸收带的强度能反映金属( 金，银或铂) 类型特色，并且对纳米结构 6 上海师范大学硕十学位论文 的尺寸、分布和形状以及其周边环境相当敏感。这些特性使得基于l s p r 的传 感器研究得到了很大的关注。同时也说明我们可以通过控制金属纳米颗粒的物 理、化学性质来对l s p r 性质进行调控。 1 2 3s e r s 基底的制备及应用现状 总体来说，应用于s e r s 研究的活性基底可以分为四大类：金属电极，金 属溶胶及以固体为衬底的金属膜、固体衬底上纳米粒子有序组装体系。 金属电极作为基底在s e r s 研究的早期是最为重要的角色之一，通常采用 电化学粗糙化方法制得。在对其进行电化学粗糙化处理前先要对其进行机械抛 光，尽量除去表面的缺陷位，再通过清洗除去杂质，以得到纳米尺寸的表面光 滑度，最后通过氧化还原过程得到表面粗糙化程度较为均一的电极。 相对来说，金属溶胶是应用比较多的一类s e r s 基底，因为它具有容易制 备、光学性质好、高表面面积等特点。用化学还原法制备的金、银溶胶是比较 经典的s e r s 基底，因为金纳米颗粒的性质比较稳定，具有独特的光学、电、 磁特性，而银在可见近红外区有广泛的等离子体共振。研究发现，溶胶粒子的 尺寸和形状都对s e r s 研究有着很大的影响，很多研究小组都在尝试制备出稳 定性和重现性更好的溶胶来用于s e r s 研究。国外，c a f i a m a r e s 小组【2 5 】用四种 不同的方法：柠檬酸三钠化学还原法、盐酸羟胺化学还原法、激光消融法及激 光原位光还原法分别制备了银溶胶，并比较了它们在s e r s 光谱中的应用效果、 它们的稳定性及其它界面特征等。d a i z yp h i l i p 2 6 】合成出了a u a g 纳米棒，并对 其s e r s 光谱活性进行了表征的研究。他的小组【2 7 】用朱槿绿色合成金和银纳米 颗粒，这是一种简单、低成本、高稳定性且具有稳定的重现性的合成方法。国 内，吉林大学的宁小华小组【2 8 】制备出了形貌可控的金银合金纳米粒子。厦门大 学的田中群小组【2 9 】合成出了金和钯包金纳米立方体。 从应用角度出发，制备出高增强性、表面干净和高重现性的s e r s 基底是 有必要的。以固体为衬底的金属膜中的金、银膜是s e r s 研究中应用比较早的 基底。通常在金属、玻璃等表面上用化学还劂3 0 1 、真空蒸钭3 1 1 、电化学粗糙化 3 2 1 等方法获得。而固体衬底上自组装纳米粒子得到的s e r s 基底具有基底规整， 结构可控等优点。作为一种将纳米颗粒附着到固体表面上的方法，通常需要选 7 上海师范人学硕士学位论文 择一种分子来将纳米颗粒联结到固体表面上，对于玻璃表面，3 一巯丙基三甲氧 基硅烷( 3 m p t m s ) 或者3 氨基三甲氧基硅烷( 3 a p t m s ) 禾i 用其硅烷醇基的绑定 能力吸附到玻璃表面，巯基或者氨基连接到纳米颗粒上【3 3 】。这样形成有纳米粒 子附着的表面就可以成功应用于s e r s 光谱测试。这种在固体衬底上通过耦联 分子将纳米颗粒有序组装制得的基底有望成为一种效果相对比较好的s e r s 活 性基底。 本质上来讲，通过丌发可再生的高灵敏度和选择性的s e r s 活性基底将使 得s e r s 可能成为一种充满活力和吸引力的探测复杂体，如，蛋白质、病毒、 甚至是整个细胞的光谱技术【3 4 。3 6 】。任斌小组【3 7 1 通过电化学吸附碘离子，然后进 行电化学氧化制备出用于细胞膜s e r s 研究的清洁基底。但是，自从s e r s 效 应被发现以来，作为一种常规的分析技术的应用并没有得到科学家们的充分的 探讨和认识，很大程度上就是因为缺少获取清洁和可再生s e r s 活性基底的有 效方法。在s e r s 活性基底研究方面研究依然亟待得到进一步发展。 1 3 本论文研究内容及研究意义 1 3 1 本论文的研究内容 本论文选择了以硫唑嘌呤( a z a t h i o p r i n e ，a z a ) 、多巴胺( d o p a m i n e ，d a ) 及 天青蛋i 刍( a z u r i n e ，a z ) - - - 种生物分子作为代表进行s e r s 光谱研究。 ( 一) a z a 在银电极表面吸附的s e r s 光谱表征：将a z a 在粗糙化银电极 上进行自组装修饰，制备出a z a 修饰粗糙化电极体系，利用s e r s 光谱技术对 该体系进行表征，得到其s e r s 光谱信息，并通过对a z a 在银电极上的s e r s 光谱随酸碱性条件改变而发生的变化进行探讨，分析其内在机制。 ( 二) d a 在银电极表面吸附的s e r s 光谱表征：将d a 在粗糙化银电极上进 行自组装修饰，制备出d a 修饰粗糙化电极体系，利用s e r s 技术对该体系进 行表征，得到其s e r s 光谱信息，并通过对d a 在银电极上的s e r s 光谱随酸 碱性及电位条件改变而发生的变化进行探讨，分析其内在机制。 ( 三) 基于金属纳米粒子的新型s e r s 活性基底的制备：分别制备出稳定 性较好、尺寸可控、s e r s 活性好的a u ，a g 及a u a g 核壳三种溶胶，并用 上海师范人学硕士学位论文 t e m 及u v 对所制得的溶胶粒子进行表征。以i t o 为衬底，通过硅烷化试剂 3 - m p t m s 的偶联作用，将纳米粒子固定到i t o 衬底上，实现了纳米粒子在i t o 上的有序组装。 ( 四) a z 吸附在金属溶胶粒子及其有序组装膜表面的s e r s 光谱研究：获 取了a z 的常规拉曼图谱，并对其特征峰进行了归属。将a z 与所制取的三 种溶胶分别作用，得到了相应的s e r s 光谱信息。在有序阵列的金属纳米基 底上自组装上a z ，得到其s e r s 光谱信息。通过s e r s 光谱的分析，了解a z 分子在这些体系表面吸附作用的机制。 1 3 2 本论文的研究意义 在分子水平上开展关于生物分子行为及其新陈代谢的研究已成为医学、药 物学、微生物学等领域的研究重点。了解细胞中所发生的生物化学过程对于医 学诊断、新药设计及新型生物技术等显得尤为重要。目前，已有各种研究手段 对包括蛋白质等生物大分子在内的生物分子的稳定结构及相关功能进行研究。 但是，对于生物分子的微观机制研究尚不令人满意。由于拉曼光谱能够在分子 水平上提供有关生物分子结构及其物理化学过程等丰富信息，使得它已成为生 物光谱学中一种有力的研究工具。采用能直接获得分子结构信息的原位s e r s 技术来研究生物分子的吸附作用、自组装膜表面生物分子吸附固定与分子间相 互作用及相关过程的微观机制等问题具有十分重要的科学意义。 本论文研究工作其意义主要体现如下： ( 一) 通过a z a 分子的s e r s 光谱特征谱峰的归属推测其是以直立方式作用 到银电极表面。改变吸附在银表面的a z a 自组装膜表面的缓冲溶液p h 值条件， 在p h 值小于5 时，峰的强度随着p h 的增高而增强，在p h 值为高于5 之后， 特征峰的强度又逐渐减弱。据此，我们提出a z a 的吸附模型，在酸性和碱性下， 分子是倾斜作用于银表面的，而在接近中性条件下，分子垂直作用于银表面。 ( 二) 在电化学条件下，随着负电位的负移，吸附的d a 分子在银表面由直 立吸附逐渐转变为相对于银表面倾斜作用直至在1 3 v 从表面脱附。吸附变化同 样依赖于p h 值，在酸性条件下，主要以d a 分子的芳香环与银表面发生作用 而以一种近乎平躺的方式作用，中性条件下，分子以其o 原子与银表面作用为 9 上海师范大学硕士学位论文 主，分子垂直作用于电极表面，碱性条件下，分子以其去质子化状态近乎平躺 作用于银表面。由于分子吸附状态的改变而引起额外的s e r s 增强是由电荷转 移及电磁增强机制共同作用。 ( 三) 在i t o 玻璃上实现金属纳米粒子的有序组装，成功制取新型s e r s 活 性基底。以期此新型s e r s 活性基底能够服务于今后生物分子的光谱电化学研 究。 ( 四) 对a z 的常规拉曼光谱的特征峰进行了归属。将a z 与所制取的三种 溶胶分别作用，得到了相应的s e r s 光谱信息。在有序阵列的金属纳米基底上 自组装上a z ，得到其s e r s 光谱信息。通过s e r s 光谱的分析，了解a z 分子 在这些体系表面吸附作用的机制。探索将天青蛋白吸附在有序组装不同会属纳 米粒子的i t o 上：新型金膜、银膜、金银核壳膜基底及三明治结构( 溶胶纳米粒 子有序组装膜天青蛋白分子溶胶纳米粒子有序组装膜) 上的s e r s 光谱，寻求 一种有序可控的、有较强s e r s 信号的能够保持天青蛋白仍具有生物活性的组 装界面。以期为天青蛋白后续电化学研究寻求新方法。 i o 第二章溶液酸碱性对硫唑嘌呤自组装膜结构影响的 s e l l s 光谱研究 2 1 引言 硫畔嘌呤( a z a t h i o p r i n e ，a z a ) 属黄嘌呤衍生物，是临床应用的抗癌药物【蚓。 现主要用作免疫抑制剂，治疗血小板减少性紫癜、红斑狼疮和器官移植等口，用 于肾脏移植免疫抑制时，它能阻止关于肾脏排斥机理的t 和b 细胞增殖，但是， 要控制用量，用为它具有高毒性 , i 0 1 。由于其血液毒性、肝脏损害、胃肠道紊乱以 及流行性感冒样症状等不良反应的发生率较高。因而其合理使用在临床上倍受关 注【i 。a z a 其分子结构式如图2i 所示。a z a 有四种可能的构象h ，如图2 2 所 示。理论计算表明( d ) 的结构虽为稳定。 自组装技术因为其潜在的应用而备受关注，如提高吸附力、缓释过程、材料 的生物相容性的增强、分子电子学应n t , ”。在理想的有机分子和各种固体基底 之问通过化学吸附而形成的自组装膜为制备可调控的表面性质好的有机膜提供 了一个好的方法【帕棚。吸附物能够与相邻分子以氢键，范德华力等力作用，从而 形成自组装分子网结构”。自组装膜的表征能够提供关于化学界面上的细节信息 及在表面上发生的变化【4 9 i 。拉曼光谱是检测分子振动结构的一种重要工具。s e r s 已经被确定为一种有效的表面检测手段，如提供分子吸附在电极表面的位点及结 。 上海师范大学硕士学位论文 构信息、吸附物表面键的性质、电极电位对这些特点的影响【5 0 1 。在许多情况下， 发现在s e r s 光谱中有新的峰出现或者在常规拉曼光谱中出现的特征峰在s e r s 光谱中消失的情况很普遍【5 1 1 。在拉曼和s e r s 光谱中观测到的不同大部分归因于 选择性定则的不同或来自于吸附分子与s e r s 基底之间的作用引起的化学效应。 在各种界面光谱研究手法中，s e r s 已经作为最有效技术之一应用于检测金属表 面的自组装单分子层【5 2 1 。 ( a ) f i g 2 2 p o s s i b l ec o n f o r m a t i o n so fa z a t h i o p r i n em o l e c u l e s 目前，国内对a z a 的研究主要集中在对其进行荧光光谱【3 8 】及电化掣3 9 1 的研 究。随着a z a 的化疗功能得到越来越广的应用，a z a 因其至少拥有7 个潜在的配 位络合点而成为化学研究工作者感兴趣的分子。s e r s 选择性定律允许对吸附物 的分子吸附取向进行测试，并能够获得原位改变条件的光谱信息。所以，我们小 组选择用s e r s 光谱技术对a z a 分子进行测试，本论文在小组之前对a z a 的s e r s 研究基础之上，进一步研究了改变溶液p h 值，对a z a 在银电极上的自组装膜进 行原位测试，对所得s e r s 光谱进行分析，推测了在不同p h 值条件下a z a 在银表 面的吸附行为。 1 2 上海师范大学硕士学位论文 2 2 实验部分 2 2 1 试剂 硫唑嘌呤( a z a ，9 8 ) 购自s i g m a - a l d r i c h 公司，氯化钾( k c l ，9 9 5 ) ，硼 酸( h 3 8 0 3 ，9 9 5 ) ，磷酸( h 3 p 0 4 ，8 5 ) ，冰醋酸( c h 3 c o o h ，9 9 5 ) 和氢氧化 钠( n a o h ，9 9 ) 均购自中国医药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯， 采用p w 超纯水( 1 8 2 m q ) 配制所有的溶液。 2 2 2 银电极的制备及硫唑嘌呤在其表面的自组装 银电极先后分别经过在会相砂纸上和用a 1 2 0 3 抛光液在镜头专用清洁布上打 磨直至光亮看不到划痕，再依次用超纯水和无水乙醇超声清洗几次以除去电极表 面的杂质。银电极粗糙化以1m o l lk c l 水溶液作为电解质，采用o r c 处理【5 3 】， 然后用超纯水轻轻将表面冲洗干净，n 2 吹干。 为了能在电极表面形成a z a 自组装膜，将处理好的银电极在lx 1 0 。4m o l l a z a 水溶液中浸泡2 4 h 后取出，用超纯水淋洗后n 2 吹干。实验过程中所使用的不 同p h 值的溶液是由0 2 5 m o l lh 3 8 0 3 、0 2 5 m o l lh 3 p 0 4 署1 0 2 5 m o l lc h 3 c o o h 配制而成的b r i t t o n & r o b i n s o n ( b & r ) 缓冲原液再经过n a o h 溶液调节而成【5 4 】。 2 2 3 仪器及实验参数 在d i o l r 公司的激光共焦显微拉曼光谱分析系统( s u p e rl a b r a mi i ) 上进行 原位拉曼光谱电化学测试。该系统集成了显微镜( o l y m p u sb x 4 0 ) 显微镜，配有 5 0 倍长焦距物镜，可精确聚焦电极表面采集散射信号；用陷波滤光片( n o t c h f i l t e r ) 滤掉激发线；1 8 0 0 9 m m 全息光栅提供2 c r n 0 的光谱分辨率；液氮冷却型 1 0 2 4 8 0 0 像素c c d 为探测器。采用共聚焦模式测试，光栅前置狭缝为1 0 0l x m ， 针孔光阑孔径为1 0 0 0 9 m ，以提高光谱纵向分辨率。激发光源为h e n e 激光器( 激 发线波长为6 3 2 8 n m ) ，聚焦到金电极表面的光斑直径约为3 9 m 。到达电极表面 的激光功率约为8 m w 。硅片在5 2 0c 1 1 1 。1 处的拉曼峰被用来校准光谱仪。液氮冷 却型c c d 多道探测器的工作温度为1 4 0 k 。在室温( 2 5 0 c ) 条件下采谱。 1 3 上海师范人学硕十学位论文 电化学分析仪为c h i6 0 4 a 型( 美国c h i 公司，上海辰华仪器公司组装) 。 p h s 一3 c 精密p h 计( 上海雷磁仪器厂) ；s k 2 2 0 0 h 超声仪( 上海科导超声仪器有限 公司) 。 2 2 4 拉曼光谱测试 将组装好a z a 的银电极放置在以聚四氟乙烯为材料的光谱电化学原位池中。 分别向原位池中加入不同p h 值的缓冲溶液，在电极表面形成很薄的液层，厚度 约为0 4i l l n l 。光谱积分时间设定为1 5 s ，累加次数选择3 ，进行原位拉曼光谱采集， 测试在室温下进行，换缓冲溶液时，用吸管吸出上一个p h 值的缓冲溶液，