转录水平检测甲胎蛋白.ppt

分子生物学第四次讨论,LOREMIPSUMDOLOR,甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP)(GenBank登录号:NM_001134.1)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从转录水平检测AFP的表达情况。实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。,讨论题目,甲胎蛋白是人胚胎期血清中的主要蛋白成分。甲胎蛋白是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，在胎儿13周AFP含量占血浆蛋白总量的1/3，胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失。在妊娠30周达最高峰，以后逐渐下降，出生时血浆中浓度为高峰期的1%左右，约40mg/L，在周岁时接近成人水平。正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升，如在成人血清中含量过高，则提示有肝癌的可能。,甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）,1、掌握RTPCR技术、northern印记杂交的原理和方法2、了解实验的操作方法和步骤3、判断基因在转录水平的表达情况,实验目的,使用细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成cDNA，PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术，测定AFPmRNA的表达。逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板经反转录酶或随机引物的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段检测基因表达。,实验方法及原理,1、提取mRNA2、反转录DNA链3、PCR扩增4、凝胶电泳5、结果显示,实验技术路线,1、若有AFP基因表达，则在与其反转录cDNA链分子量平行处应有检测信号。2、若AFP基因未表达，则在与其反转录cDNA链分子量平行处没有检测信号。,结果分析,Northern印迹杂交是指将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上，然后利用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小的过程。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblot。,Northern印记杂交实验原理,1、若出现明显杂交带，则表明细胞组织内有AFP基因的表达，则会有患肝癌的风险。2、若没有出现明显杂交带，则表明细胞组织内基因未表达。,结果分析,Northern印迹杂交技术检测mRNA表达水平的敏感性较PCR技术低，但其特异性强，假阳性率低，因此被认为是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。,Northern印记杂交与PCR方法的比较,诊断原发性肝癌。检测AFP的含量是诊断原发性肝癌的重要手段之一，由于肝癌的癌细胞能合成或分泌较多的AFP释放入血的缘故。正因为如此，医生们就把检测人体血液中的AFP作为诊断肝癌的重要依据，并把AFP称为“肝癌标志物”。检测AFP是诊断肝癌的一种简便、灵敏、快捷的方法，现认为它在发现早期肝癌方面有独一无二的价值，用AFP诊断肝癌的“专一性”仅次于病理学检查。血清AFP升高，还可出现于畸胎瘤、睾丸和卵巢肿瘤等。急性肝炎和肝硬化的鉴别诊断肝细胞再生时期，AFP在血液中呈阳性，急、慢性肝炎、肝硬化时会有肝细胞再生，因而AFP在血液中的浓度升高。一般急性肝病，可随病情好转AFP含量下降或正常，肝硬化可呈下降或持续低水平，肝癌则逐渐上升。,应用（临床意义）,先天性疾病的诊断先天性疾病的诊断：检测羊水中AFP含量的意义已引起注意，Rendle用放射免疫法检测，发现无脑儿羊水中含量显着升高。正常妊娠1216周羊水AFP含量为21.11.2mg/L，以后逐月下降，足月时为0.50.2mg/L。无脑儿患者在妊娠2631周为95.719.3mg/L，32-38周为25.75.9mg/L。先天性肾病及脊柱裂也有类似报道。因此用放免法检测羊水中AFP含量，有助于某些先天性