（微生物学专业论文）利用重组毕赤酵母发酵生产s腺苷甲硫氨酸工艺的研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声b ) 1 所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：最舌蛹埔 时问： 加6 年6 r 月7 日 椭张雪多嘏硝撇名嘶嗡 签名日期：工6 年占月7 日 签名日期z b 机年6 月宁日 利用蕈组毕赤酵母发酵生产s - 隙苷甲硫氨酸t 艺的研究 摘要 腺苷甲硫氨酸，又称腺苷蛋氨酸，英文名为s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ，简称s a m ， 是甲硫氨酸的活性形式，广泛存在于动物、植物和微生物体内，也是人体内的一种 重要生理活性物质。近年来临床研究表明s a m 能治疗多种疾病，尤其对治疗肝内 胆汁郁积、改善肝功能有良好的效果。s a m 的相关药物目i ； 国内还没有生产，完全 依靠进口，因此近年来成为国内的研究热点。 s a m 可以由化学合成、体外酶促合成或经微生物发酵三种途径得到，而通过微 生物发酵，再从中提取精制s a m 是目前其工业化生产的主要途径。本研究通过在毕 赤酵母g s i1 5 中导入s a m 合成酶基因及敲除胱硫醚合成酶基因c b s 两条途径，对 该菌株进行了改造，得到一株高产菌株b i b 2 0 0 1 ，在摇瓶上产量由o 0 4 9 t , 提高到 2 0 3 9 l ，比出发菌株提高了5 1 倍。 首先通过摇瓶发酵对菌株b i b 2 0 0 1 的发酵条件进行了初步的摸索。然后对该菌 株的发酵工艺作进一步的研究，在5 l 发酵罐上对溶氧、p h 、搅拌转速、通气量等 发酵参数及补料工艺进行了系统的研究和优化，确定了合适的发酵工艺，s a m 平均 产量达到1 5 9 ，i 。最后在5 l 工艺基础上将发酵规模扩大到2 0 l ，并对工艺作了相关 改进，稳定工艺后s a m 产量达到2 2 9 ，l 左右。 本论文还对s a m 的提取纯化工艺作了一定的研究，确定了初步的提取纯化工 艺为：先用乙酸乙酯结合硫酸提取，再用弱酸性阳离子交换树脂纯化，用甲醇结晶 后，再与对甲苯磺酸反应，生成s a m 硫酸对甲苯磺酸双盐，再用丙酮将该稳定盐 沉淀下来，收集沉淀冻干得到s a m 纯品。采用该工艺获得产品的纯度为8 8 ，回 收率在4 0 左右。 关键词：s 腺苷甲硫氨酸；毕赤酵母；发酵工艺；流加补料：提取；纯化 牛中农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t s - a d e n o s y l - l - m e t h i o n i n e ( s a m ) ，a l li m p o r t a n t m e t a b o l i ci n t e r m e d i a t ei nt h e m e t a b o l i cf l u xo fs u l p h u ri si n v o l v e di nm a n ym e t a b o l i cp a t h w a y s s a mh a sm u c h p h y s i o l o g i c a le f f e c t i o n , a n dh a s c l i n i c a lp o t e n t i a l ar e c o m b i n a n ts t r a i nb i b 2 0 0 1 ，w h i c hk n o c k i n gi ns - a d e n o s y l m e t h i o n i n es y n t h a s e a n dk n o c k i n go u tc y s t a m h i o n i n e 3 - s y n t h a f r o mp i c h i ap a s t o r i sg s l l 5 ，c a np r o d u c e h i g hl e v e lo f s a m t h e r ea r et h r e ew a y st op r o d u c es a m ，i n c l u d i n gc h e m i c a ls y n t h e s i s ，m i c r o b i a l f e r m e n t a t i o na n de n z y m a t i cs y n t h e s i s ，a n dm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o ni st h em a i nw a y t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，s u c ha sp h ，m e d i u mc a p a c i t y , c o n c e n t r a t i o no f m e t h a n o la n dl - m e t , t h a te f f e c tt h er e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i sg r o w t ha n dt h es a m y i e l di ns h a k ef l a s kw e r es t u d i e d t h ec u l t u r ec o n d i t i o n so ft h er e c o m b i n a n tp i c h i a p a s t o r i si nf e r m e n t o r ( 5 la n d2 0 l ) w e r eo p t i m i z e d , i n c l u d i n gt h ep r e s c r i p t i o no fc u l t u r a l m e d i u m , p h ，d i s s o l v e do x y g e n ，a g i t a t i o ns p e e d ，a e r a t i o n ，f e e d i n gs t r a t e g yo fg l y c e r o l ， m e t h a n o la n dl - m e ti nd i f f e r e n ts t a g e s a n dt h es a mp r o d u c t i o no ft h er e c o m b i n a n t p i c h i ap a s t o r i sr e a c h e d1 5 9 l ( 5 l ) a n d2 2 9 l ( 2 0 l ) a f t e rf e r m e n t a t i o nf o r5d a y su n d e r t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sr e s p e c t i v e l y t h e s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o np r o c e s so fs a m w a sa l s oe s t a b l i s h e d f i r s t l y , s a m w a sc r u d e l yc r y s t a l l i z e di nm e t h n o la f t e re x t r a c t i o nw i t l la c e t i ce t h e r ( c o m b i n e dw i t l l s u l f u r i ca c i d ) a n dp u r i f i c a t i o nb yc a t i o n - e x c h a n g er e s i n ；s e c o n d l y , t h eo b t a i n e ds a m s u l f o n i ca c i ds a l tr e a c t e dw i t h1 5 p - t o l u e n e s u l f o n a t e m e t h a n o ls o l u t i o nt og e n e r a t et h e s a md o u b l es a l t ；t h i r d l y , t h es a md o u b l es a l tw a sp r e c i p i t a t e db ya c e t o n e ，c o l l e c t e da n d f r e e z e - d r i e dt oa c q u i r et h ep u r i f i e dp r o d u c t t h er e c o v e r yr a t ea n dp u r i t yo fs a mr e a c h e d 4 0 a n d8 8 r e s p o c t i v e l y k e yw o r d s ：s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ；r e c o m b i n a n t p i c h i ap a s t o r i s ；f e r m e n t a t i o n ； f e d b a t c hc u l t u r e ；s e p a r a t i o n ；p u r i f i c a t i o n 6 利用事组毕赤酵母发酵生产s 腺苷甲硫氨酸- 艺的研究 o d l m l r p m c b s a o x b s m p t m l m u t 缩略语( a b b r e v i a t i o n s ) s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e m e t h i o n i n e b a s ep a i r k i i o b a s e s d i s s o l v e do x y g e n d a y h o u r m i n u t e s e c o n d h i g hp e r f o r m a n c e s 腺苷甲硫氨酸 甲硫氨酸 碱基对 千碱基对 溶解氧 天 小时 分钟 秒 高效液相色谱 l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 。 o p t i c a ld e n s i t y l i t e r m i l l i l i t e r r o t a t ep e rm i n u t e 光密度 升 毫升 转每分 c y s t a t h i o n i n e - ps y n t h a s e 胱硫醚合成酶 a i c o h o l0 x i d a s e b a s a ls a l 缸m e d i u m 7 乙醇氧化酶 基础盐培养基 微量元素溶液 甲醇利用慢型 f 砉| 眦 帅 蛐 d h - 皇 。 吼 利用单组毕赤酵母发酵生产s 腺苷甲硫氰酸t 艺的研究 第一章文献综述 l 腺苷甲硫氨酸( s a m ) 1 1 引言 腺苷甲硫氨酸，又称腺苷蛋氨酸，英文名为s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ，常用缩略语 为s a m ，s a m e 或a d o m e t ，是甲硫氨酸的活性形式。 s a m 于1 9 5 1 年为c a n t o n i 所发现，广泛存在于动物( c a n t o n i ，1 9 5 1 ) 、植物( m a t h u r e ta 1 ，1 9 9 2 ) 和微生物体内，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与了4 0 多种 生化反应。在生物体内，它的生物合成是由腺苷甲硫氨酸合成酶 ( s a d e n o s y l i n e t h i o n i n es y n t h e t a s e ) 【e c 2 5 1 6 】催化甲硫氨酸( m e t ) 和a t p 反应 完成，即来自于a t p 的腺苷部分攻击m e t 的硫原子，生成高能量、硫活泼的有机锍 化合物( 如图1 1 ) 。 s a m 是与人体中脂肪、蛋白质、糖类等的代谢有关的重要生理活性物质，作为 中间代谢物，广泛存在于各种生物体内，参与多种生化反应，生物体中具有生物活 性的为( ) 型腺苷甲硫氨酸( 余志良等，2 0 0 3 ) 。近年来临床研究表明s a m 能治疗 胆汁淤积、纤维性肌痛、偏头痛、阿尔茨海默氏病、癫痫、多发性硬化、帕金森氏 病、亚急性脊髓变性以及h i v 引起的神经性并发症( c h a v e z ，2 0 0 0 ) ，尤其对各种 原因引起的肝功能异常有良好疗效( m a t o e t a l ，1 9 9 4 ) s a m 可以由化学合成、体外酶促合成或微生物发酵三种途径得到。化学法合成 由于产率低，反应底物l 高半胱氨酸价格昂贵，反应产物又为s a m 的消旋物等明显 缺点，已很少使用( m a t oe ta 1 ，1 9 8 7 ) 。体外酶法合成尽管产物纯度高，但成本也高， 一般只用于合成同位素标记的s a m ( r e e da n dp a t t e r s o n , 1 9 8 6 ) 。而通过微生物发酵， 再从中提取精制s a m 是目静其工业化生产的主要途径。目前已见于文献报道的通过 微生物发酵生产s a m 的最高产量为1 0 8 9 l ( s h i o z a k ie ta 1 。1 9 8 6 ) 。 1 2s a m 的结构及代谢途径 s a m 是甲硫氨酸的活性形式，其结构及合成如图1 1 所示。 9 华中农业大学硕十学位论文 增j p s m 合成量 腺寄甲硫氟酸 图1 1s a m 的结构及合成 f i g 1 1t h e s t r u c t u r ea n ds y n t h e s i so f s a m 由其化学结构可以看出，它是一种氨基酸衍生物，是l 甲硫氨酸残基通过s c 键与嘌呤核苷相连。分子式c 1 5 h 2 2 n 6 0 5 s ，分子量为3 9 9 。在s a m 分子中有四个可解 离基团，嘌呤环上的氨基( p k a = 3 4 ) 、甲硫氨酸残基上的羧基( p k a = 1 8 ) 、氨基 ( p l e a 习8 ) 和锍基( p k a = 1 2 5 ) 其中锍基具有很强的极性，带有永久的正电荷 ( f a r o o q u ie ta 1 ，1 9 8 3 ) 。s a m 的等电点为7 2 4 。s a m 的重要生理功能在很大程度 上在于其分子结构中含有一个活性甲基和一个高能硫原子。s a m 盐为白色结晶或结 晶性粉末，易溶于水，微溶于甲醇、乙醇，在乙醚、丁酮中不溶。 s a m 是体内重要的代谢中间体，具有转甲基、转硫、转氨丙基等作用，是半胱 氨酸、牛磺酸、谷光甘肽、辅酶a 等重要物质的前体。s a m 作为体内一种主要的 甲基供体可向多种分子提供甲基。例如儿茶酚胺和其他生物胺、脂肪酸、神经递质、 核酸、多糖、蛋白及膜磷脂等。s a m 去甲基后生成腺苷同型半胱氨酸，经过转硫 途径生成同型半胱氨酸，随后分解代谢生成体内关键的抗氧化及解毒物质半胱 氨酸。再生成另一种关键的抗氧化及解毒物质谷胱甘肽。s a m 还可以通过脱羧 提供氨丙基用于多胺的生物合成。s a m 在体内的代谢途径如图1 2 所示。 1 0 利用誊组毕赤酵母发酵生产s 腺苷甲硫氨酸t 艺的研究 e x u a c e l l u l a r g t d t h l c j r e 哆d n 喀瑚t t - w 雒 i 、佣， h o m o c $ s l a n e “+ s - a d e n 啷4 c y s t o m o ! l c y s t a t h i o n i n v 一唧t 慨 f c y s a ) c y s 谢t h i o m n e ；l t r a n s t d f i w a t i m tp a l h w a y ：i o y s t t m t o g l u t a t h t o n e 图1 2s a m 在体内的代谢 f i g 1 2 t h e s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s mo f s a m s a m 转出甲基后形成s 腺苷同型半胱氨酸( s a d e n o s y l h o m o c y s t i n e , s a h ) ，s a h 水解释出腺苷变为同型半胱氨酸( h o m o c y s t i n e ，h c y s ) 。同型半胱氨酸可以接受 n s - c h 3 f h 4 提供的甲基再生成蛋氨酸，形成一个循环过程，称为蛋氨酸循环 ( m e t h i o n i n ec y c l e ) 。此循环的生理意义在于蛋氨酸分子中甲基可间接通过n s c h 3 f t h 电 由其它非必需氨基酸提供，以防蛋氨酸的大量消耗。 作为甲基供体，s a m 参与合成大量代谢物具有：n c h 3 键，如甲胍基醋酸或称 肌酸( c r e a t i n e ) 、胆酸( c h o l i n e ) 、n 甲基然酰胺( n - m e t h y lk n i c o t i n a m i d e ) 、肾上腺素 ( a d r e n a l i n e ) 、生物碱( a l k a l o i d s ) 、蛋白质及核酸等；s c h 3 键，如蛋氨酸；o c h 3 键， 如木质素、果胶、酚类等；c c h 3 键，如c 2 r 麦角甾醇、胸腺嘧啶、核苷、抗生素类、 蛋白质、核酸及多糖等。生物分子的甲基化可以使分子的形态及物性改变、导致特 殊功能如解毒、对转录和翻译起调控作用等。由于甲基化反应的广泛性，可以说， s a m 是细胞内参加反应仅次于a t p 的一种重要辅酶，细胞内s a m 浓度的微小改变， 便会对细胞的生长、分化和功能产生重大影响。 生物体内的s a m 是在在细胞的细胞质内合成。哺乳动物的肝脏是主要的s a m 合 成和降解场所，每天摄入蛋氨酸的5 0 用于s a m 合成，其中3 0 富集于肝脏细胞的 线粒体中，8 5 的甲基化反应发生在肝脏内。随着年龄的增加，肝脏内合成s a m 的 一 如，+蛀d吼 华中农业大学硕士学位论文 能力会降低；s a m 的合成需要叶酸和维生素b 1 2 的参与，维生素的缺乏也会导致神经 系统中s a m 的缺乏。一般食物中几乎不含s a m ，即使食用高蛋白含量的食物，也不 会明显增加体内的s a m 水平。 基因工程技术的发展和细胞代谢途径研究的进展，使得利用代谢工程有目的地 改造细菌细胞成为可能。s a m 在细胞内的代谢是甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、 g s h 等含硫化合物代谢的一部分。它们之问的主要代谢关系见图1 3 。 图1 3s a m 的合成和代谢途径 f i g 1 3s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i cp a t h w a y sf o rs a m 图1 3 所示为s 腺苷蛋氨酸的合成和代谢途径：( i ) 蛋氨酸和a t p 在蛋氨酸腺苷 转移酶的催化下生成s a m ；( 2 ) 转甲基反应；( 3 ) s 腺苷高半胱氨酸水解酶催化s 腺苷 高半胱氨酸可逆水解生成高半胱氨酸和腺苷；( 4 ) 胱硫醚d 合成酶催化高半胱氨酸和 丝氨酸反应生成胱硫醚；( 5 ) 胱硫醚在y 胱硫醚酶的催化下生成半胱氨酸；( 6 ) y 谷 氨酰半胱氨酸合成酶催化谷氨酸和半胱氨酸生成y 谷氨酰半胱氨酸，为合成g s h ( 谷胱甘肽) 的速率限制步骤；( 7 ) g s h 合成酶催化y 谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸反应生 成g s h ：( 8 ) 蛋氨酸合成酶在正常浓度的叶酸和维生素b 1 2 的条件下催化高半胱氨酸重 生蛋氨酸；( 9 ) 甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶在甜菜碱存在的条件下从高半胱氨酸重 生蛋氨酸；( 1 0 ) s a m 脱羧酶催化s a m 羧基的脱除，使脱羧s a m 进入聚胺合成途径。 有研究表明，半胱氨酸是调节硫同化作用酶系的主要调控因子；研究同时显示 利用荤组毕赤酵母发酵生产s 腺苷甲碗氰瞳t 艺的研究 c y s 4 ( 编码胱硫醚p 一合成酶) 突变株在以甲硫氨酸为硫源时，细胞内s a m 含量高于同 样培养条件下的其它菌株( h a n s e n a n dj o h a l l q e s e n ，2 0 0 0 ) 。因此，要提高细胞内s a m 含量，有两条可能的途径：一是强化表达s a m 合成酶，增强s a m 合成酶活力，增加 s a m 的合成；另一是敲除胱硫醚b 合成酶基因，阻断s a m 和甲硫氨酸在细胞内转化 为半胱氨酸的途径，增j j i s a m 的累积。 1 3s a m 的药理及应用 开始时，临床研究集中在s a m 抗抑郁作用方面，随后逐渐发现其对许多疾病具 有治疗作用。 1 3 1 肝病 大量临床研究证明，s a m 对各种原因引起的肝功能异常有良好疗效。到目前为 止，s a m 临床研究包括各种原因引起的慢性肝炎、原发胆汁性肝硬化、药物性胆 汁淤积、妊娠性胆汁淤积等。给酒精性肝硬化患者使用s a m 后，肝脏中谷胱甘肽含 量升高，血浆半胱氨酸、甲硫氨酸水平下降，组织切片表明在组织水平有明显改善。 s a m 也对药物性胆汁淤积( 如雌激素、扑热息痛等) 、妊娠性胆汁淤积、慢性肝病 性胆汁淤积有效，患者血清转氨酶、总胆酸、胆汁胆固醇饱和指数恢复正常。并可 缓解胆汁淤积造成的瘙痒、疲劳等症状。s a m 可使慢性铅中毒患者临床症状，生化 指标明显改善；对g i l b e r t s 综合症( 一种家族性胆红素代谢缺陷) 亦有一定疗效， 用药者非结合胆红素及总胆红素含量降低，尿液中d 葡萄糖二酸含量升高。 1 3 2 抑郁症 临床研究中，采用h a m i l t o n 抑郁量表( h r s d ) 以及其它的抑郁量表对给药l i 后 迟滞抑郁、躯体症状、睡眠、自杀及体重等因子进行评分来评估该药的抗抑郁作用。 口服或注射给药第四天，评分值就显著下降，第二周已较起始时下降了5 2 。s a m 疗效与中、低剂量三环类抗抑郁药相当。而与其它抗抑郁药不同，s a m 抗抑郁作用 无剂量相关性，起效快，几乎无不良反应，耐受性好。临床中还发现，s a m 与标准抗 抑郁药，如米安巴林、氯丙咪嗪、丙咪嗪、去甲基咪嗪等联合用药比单独用药起效 快。 1 3 3 关节炎 目前已有约2 2 ，0 0 0 多名关节炎患者接受了s a m 治疗，通常在服药2 周后症状就得 华中农业大学硕 学位论文 到改善。一项双盲试验结果表明，s a m 与酮洛芬疗效相当，两者联合用药能增强和 延长酮洛芬的作用。研究还表明，1 0 0 m g 的s a m 与7 5 0 m g 萘普生，2 0 m g 炎痛息康， 1 5 0 m g 消炎痛，1 , 2 0 0 m g 布洛芬作用相当。s a m 与非类固醇类抗炎药相比，既不抑 制前列腺素合成，也不会损伤胃肠道。 1 3 4 纤维性肌痛、偏头痛 原发纤维性肌痛是一种慢性非关节性风湿病，症状为全身多处疼痛、僵直，通 常还伴有抑郁症、疑病症、偏执狂等。肌注s a m ( 2 0 0m g d ) 2 1 天后，患者疼痛感位 点数量减少，根据h a m i l t o n 抑郁量表进行的评分值降低；另一项s 舢“口服临床研究 表明，患者服药后疼痛、不良情绪、躯体僵直等症状得到改善。 给1 2 4 位偏头痛患者注射s a m ( 4 0 0m g d ) 3 0 天后，剧烈头痛患者数量减少，头痛 持续时间缩短，止痛药用量降低，患者情绪明显改善。 1 3 5 其它 给阿尔茨海默病患者静注s a m ( 2 0 0m g d ) ，连续1 5 天后，其活动、注意力、情 绪显著改善，但认知功能的改善不明显。给癫痫患者静注s a m ( 2 0 0m g d ) 8 1 4 天 后，患者情绪、警觉性、活动明显改善。研究者认为，s a m 的这些作用与其抗抑 郁作用密切关联。目f i i f s a m 在中枢神经系统疾病方面的临床研究还涉及到脑缺血及 爱滋病并发症之一的骨髓病等。给未出现肝硬化的酗酒病人肌注s a m ( 2 0 0m g d ) 3 0 天，与对照组相比，给药组血清中t 谷氨酰转肽酶“g t ) 、转氨酶含量降低，疲劳、 厌食、失眠、焦虑、抑郁等症状得到缓解。研究者认为这可能与s a m 抗肝病、抗 抑郁作用有关。 近来研究表明，s a m 对肿瘤坏死因子吨( t nf a ) 的表达与分泌也有抑制作用。 t n f n 是一种多向炎性细胞因子，在肝脏受损的过程中起重要作用。在脂多糖诱导 t n f 吨过量表达的大鼠模型中，s a m 能明显降低血清t n f 吨的含量。进一步研究表 明，s a m 能降低t n f - a 的释放以及稳定态t n f 旺m r n a 的含量。 研究还发现，血浆中同型半胱氨酸的升高是血管疾病的危险信号，且冠状动脉 疾病患者血浆腺苷蛋氨酸含量低于正常水平。给健康志愿者口服腺苷蛋氨酸肠溶片 以后，受试者血浆5 甲基四氢叶酸( 5 m t h f ) 水平升高，5 - m t h f 能使同型半胱氨酸 重新甲基化生成甲硫氨酸，增强同型半胱氨酸的代谢，可用于预防血管疾病。 1 4 利用荤组毕赤酵母发酵生产s - 腺苷甲硫氨酸工艺的研究 1 3 6 应用 s a m 作为既有治疗疾病药物作用，又有食品营养强化作用的天然物质，颇有应 用前景。早在7 0 年代末，s a m 作为临床处方药就己出现在欧洲医药市场上。当时是 用作治疗关节炎的抗炎止痛药物。国外抗炎药物品种极多，而s a m 并未占有什么优 势。8 0 年代中期，s a m 在欧洲被推荐为抗忧郁症的精神病药物。1 9 9 0 年在美国通过 了f d a 的随机双盲法验证。1 9 9 9 年，美国f d a 正式批准其上市，迅速成为畅销的 营养保健品之一，年销售额超过十亿美元。近年来，国外临床己转向对肝脏疾患的 治疗。s a m 在人体内是由肝脏细胞合成的，而肝脏又是s a m 发挥其生物学作用的主 要场所。在肝细胞功能有障碍时，必然会损伤到s a m 的生物合成和代谢作用，因此， s a m 应该是肝病治疗的理想药物。据报道，s a m 不仅有利于各种急、慢性肝病的治 疗，而且对实验性动物早期肝癌也有预防作用。 s a m 有着巨大的国际市场需求。据国际卫生组织有关的报告：目静，全球每年 用在治疗肝病和帕金森氏等病的s a m 大约需要4 5 0 5 0 0 吨左右。s a m 在国内的市场 也非常广阔。我国是肝炎流行的大国，而我国目静尚无一种能真正改善肝细胞代谢 的生化药物。此外，我国人群中还有相当比例的关节炎患者，随着生活节奏的加快 和工作压力的增加，抑郁症患者也明显增多。据估算，我国s a m 的年用量应在9 0 1 0 0 吨左右。 s a m 作为生化试剂，在国内早己有商品供应，但其价格昂贵无法用于临床。据 s i g m a 2 0 0 5 年的报价，每1 0 0 m g s a m 大约7 5 美元。而国外临床口服的常规剂量是 2 0 0 - 4 0 0 m g ，每日三次，每5 0 0 m g 市场价为7 7 元人民币。因此，s a m f 螽床推广应用的 关键是，首先必需解决大量而价廉的s a m 生产工艺。上个世纪八十年代起，我国就 开始的研究，但因发酵水平低、分离纯化成本过高，至今未能工业化。1 9 9 0 年代已 有国外厂家向我国申请了腺苷蛋氨酸某些盐类的专利。国内开发高产价廉的s a m 生 产工艺显得极为迫切。 目前，s a m 在国内的应用主要是用于医疗用途，最常见的为药品“思美泰”，其 有效成份为s a m 的稳定性盐腺苷l 甲硫氨酸- l ，4 丁烷二硫酸，为意大利 b i o r e s e a r c h 公司和德国基诺药厂生产，有口服肠溶制剂和针粉剂两种。 华中农业大学硕士学位论文 1 4s a m 的稳定性及稳定性盐 1 4 is 舢的失活机理 s 腺苷甲硫氨酸在生产和应用过程中最关键的问题是稳定性差、易发生失活反 应这在很大程度上限制了它在临床上的应用。因此，人们对其失活机理进行了研 究，结果表明s a m 的失活反应可按照以下3 种不同的机理进行。 首先，s a m 分子在常温及生理p h ，由于高能锍离子的存在，使相连的c 原子活 化，容易受到亲核进攻，硫碳键极易断裂，会发生各种降解及硫原子上的手性异构 反应( m a t o se ta 1 ，1 9 8 7 ；h o f f m a n , 1 9 8 6 ) 。 除了甲基化反应，s a m 分子还可能由于水解而失去腺嘌呤，或者通过各种复杂 的途径生成5 脱氧- 5 一( 甲硫) 腺苷( 5 一d c o x y - 5 ( m e t h y l t h i o ) a d e n o s i n e ，m t a ) 和高丝 氨酸( h o m o s e r i n e ) ，而且还会瞬时的消旋丧失在锍原子上的手性。d el ah a b a 等 曾指出在s a m 的硫原子上有两种构象( r 和s 型) ，只有一种能被生物合成和利用( d e l ah a b ac ta 1 ，1 9 5 9 ) ，这种构象由c o r n f o r t h 等确定为：( s ，s ) 型s a m ( c o m f o r t hc t a 1 ，1 9 7 7 ) 。s t o l o w i t z 及m i n e h 使用n m r 分析发现从酵母提取的s a m 中的2 0 以( rs ) 型s a m 存在( s t o l o w i t ze ta 1 ，1 9 8 1 ) ，也证明了消旋过程的发生。s a m 在胞内发生 的各种反应如图1 4 所示。 奄榭 i t k 套嘲 f r 研洲 图1 4s a m 的手性及化学不稳定性 f i g1 4c h i r a la n dc h e m i c a li n s t a b i l i t yo fs a m 1 6 蕊舞 时 l笋 利用蕈组毕赤酵母发酵生产s 腺苷甲硫氯酸t 艺的研究 此外，s a m 进行水解，生成腺嘌呤( a d e n i n e ) 和s - 戊糖甲硫氨酸 ( s p e n t o s y l m e t h i o n i n e ) 。s a m 水解为腺嘌呤的机理复杂，但某些方面己被阐明。 b o r c h a r d t 对s a m 碱性水解机理进行研究时发现，s a m 及相关的锍核苷对引起糖苷 键快速断裂的碱性条件极其敏感。糖苷键的断裂起源于一个异常的消除反应。邻近 锍中心的碳原子( 5 位置) 上质子去除，随之消除反应发生，结果糖苷键断裂，形成4 、 5 双键。b o r e h a r d t 认为，糖苷键的断裂可作为消除反应的协同反应发生，或者通过 形成能快速分解释放出醛的半缩醛中间体发生。此外，利用实验中观察到的s 肖a n m ( s - a r i s t e r o m y e i n y l 1 m e t h i o n i n e i o d i d e ，s a m 的一种碳环类似物) 对碱性条件稳定的现 象，可进一步证明这个消除机理( b o r c h a r d tr t ，1 9 7 9 ) 。这个消除机理与s c h l e n k 和 d a i n k o 的关于s a m 在氚水中碱性水解的报道相一致( s c h l e n ke ta 1 ，1 9 6 2 ) 。 人们在研究s a m 失活机理时发现，由于s a m 有多个可解离基团( z a p p i aa n dr o s a 。 1 9 8 8 ；f a r o o q u ie ta 1 ，1 9 8 3 ) ，其失活反应受p h 值影响很大。水解成腺嘌呤的反应可 在p h 6 时强烈抑制，在p h 4 5 或更低时完全消除。由于含有离子化的2 ( 或3 ) o h ， 与其它不含离子化2 ( 或3 ) o h 的分子如3 脱氧s a m 相比，s a m 以相当低的速度 水解，并且糖营键的断裂非线性依赖于o h 的浓度。裂解反应以相对商的速率持续 进行，直到p h 降为1 5 。由于其羧基的p k a ，如其它大多氨基酸一样，处于1 8 2 2 之 间，因此，该反应不受抑制，直到p h 接近或小于2 。h o f f m a n 发现，当p h 下降至羧 基的p k a 以下时，裂解常数k h 大幅度下降。消旋反应表现出较低的p h 依赖性，在 p h 7 5 1 5 范围内，消旋反应速率没有明显变化。在p n l 5 时消旋反应是唯一以显著 速度发生的失活反应，这样就可以不受其它反应的干扰而进行消旋反应的动力学分 析( w uc ta 1 ，1 9 8 3 ；n o f f m a n , 1 9 8 6 ) 另外，温度、湿度对s a m 的失活反应也有影响。h o f f m a n 在用s 腺苷高半胱 氨酸( a d o h c y ) 和c h 3 i 化学合成s a m 时发现，在1 6 c 、含水量 5 的合成体系中， 消旋反应比3 7 的水溶液中慢( h o f f m a n ，1 9 8 6 ) 1 4 2s a m 的稳定性盐 由于s a m 分子的极端不稳定性，即使在常温下也易发生消旋和分解反应，这不 但对分离过程中操作温度、p h 值甚至操作时问提出了严格的要求，还要求制备成 s a m 的稳定性盐产品，才具有商业应用价值。 1 7 华中农业大学硕上学位论文 s a m 硫酸盐和s a m 盐酸盐在干燥、低温条件下，稳定性仍较差，因此只能被用 于一般生化研究。1 9 7 4 年，s a m 对苯磺酸硫酸盐研制成功。1 9 7 6 年，s a m 对甲苯磺 酸硫酸盐被研制成功并进入临床试验。随后又研制出了其它s a m 盐类以及口服肠溶 制剂和粉针剂，目前，临床上使用的s a m 盐主要是s a m 对甲苯磺酸硫酸盐，其稳 定性得到了较大的提高，但仍不太理想。几种腺苷蛋氨酸盐的稳定性的比较如表1 1 所示 表1 1 在4 5 1 2 下腺苷蛋氨酸盐的稳定性比较 t a b l e1 1t h e s t a b i l i t yo fd i f f e r e n tk i n d so fs a ms a l ta t4 5 s a m 盐的稳定性关键取决于分子中的阴离子的性质。提高阴离子的立体障碍可 增加其稳定性( b a r b a t og ，e ta 1 ，1 9 8 9 ；z a p p i a , e ta 1 ，1 9 8 8 ) 大分子量的阴离子通过 静电作用与s a m 结合，利用其空白j 位阻限制s a m 氨基酸链的自由旋转，从而使得 s a m 的稳定性得到提高( m o r a n aa ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。b a r b a t o 在考察p h 对s a m 失活 反应的作用时就曾发现，当p h 上升时，微观结合常数k b 下降，即依赖于s a m 带电状 态的大阴离子与配体间的静电作用减弱，s a m 稳定性下降( b a r b a t og e ta 1 1 9 8 9 ) 。 在此理论基础上，先后研制出了一系列新型的多聚阴离子形式的稳定性s a m 盐 ( m o r a n a a ，e t a l ，2 0 0 0 ；z a p p i a , e t a l ，1 9 8 8 ) 按照其溶解性，可分为两大类：水 溶性聚阴离子s a m 盐和脂溶性多阴离子s a m 盐。 人们基于对其失活机理的认识，提出了s a m 稳定化的理论，并成功研制了一系 列新型稳定性s a m 盐： 1 9 9 2 年美国专利5 ，1 2 8 ，2 4 9 发明了适合口服的s a m 稳定性盐，其通式为 s a m n r ( o ) m ( s 0 3 h ) p ，式中m = 0 或l 。当p = 2 时，n = 1 5 ；当p = l 时，n = 3 。r 是8 到l o 碳 原子烷烃且含有烷基、苯基烷基或羧烷基。 1 8 利用蕈组毕赤酵母发酵生产s - 腺苷甲硫氨酸丁艺的研究 1 9 9 1 年美国专利4 ，9 0 0 a 0 6 发明了特别适合非肠道吸收的稳定性盐，总分子式为 s a m n ( c h 2 ) 。( s 0 3 h h ，n = l 一2 ，m = 3 - 1 2 。 1 9 9 1 年美国专利5 ，0 7 3 ，5 4 6 发明了带有现酰基化的牛磺酸衍生物的亲脂性s a m 盐。 1 9 8 3 年美国专利4 ，3 6 9 ，1 7 7 申请的s a m 的稳定性物质是酸类( 例如盐酸、硫酸、 磷酸) 和水溶性的二价或三价金属盐( 例如氯化钙、氯化铁) 。 1 9 8 0 年美国专利2 ，2 4 2 ，5 0 5 申请保护的盐是s a m 的硫酸骸苷硫化物，如：单硫酸 或双硫酸的核糖核苷或脱氧核糖核苷的衍生物。 1 9 8 0 年美国专利发明了s a m 的多阴离子稳定性盐、多磷酸盐、聚乙稀碘酸的硫 酸盐或磷酸盐，聚乙烯盐、聚乙稀磺酸盐。 1 5s a m 的生产方法 1 5 1 化学合成生产s a m 化学合成生产s a m 的方法主要有两条途径：一是利用5 甲硫腺苷和d l 2 氨基 - 4 溴丁基酸化学合成消旋的s a m ( b a d d i l e ya n dj a m i e s o n ，1 9 5 4 ) ，只有5 0 生物活 性；二是通过s 腺苷l 高胱氨酸甲基化合成s a m ，产物中也含有2 0 3 0 ( s ) 型异 构体( j o s erm a t o se ta 1 ，1 9 8 7 ) 。由于化学合成产物中异构体多、分离提纯困难及 s a m 分子的不稳定特性，化学合成法生产s a m 的工业化前景不大。 1 5 2 酶法合成生产s 剐 利用哺乳动物或微生物( 酵母、大肠杆菌) 来源的s a m 合成酶可以催化a t p 和蛋氨 酸合成s a m ( g r o s se ta 1 ，1 9 8 3 ；j e o n g h o ，e ta 1 ，1 9 9 6 ) ，酶经固定化后比较稳定，蛋 氨酸转化率高，生产规模可以达到5 1 0m m o l ，产品9 0 以上为生物活性的( s ，s ) 构 型。但生物细胞中s a m 合成酶浓度较低、分离提取困难及a t p 的原位供给代价高昂 成为酶法大规模生产s a m 的的限制因素。酶法合成目前还只适合于制备供科学研究 使用的放射性标记的s a m 分子。 1 5 3 生物转化法生产s a m 目前的工业规模生产中，发酵法是生产s a m 的主要方法。在前体蛋氨酸存在时， 可以通过培养微生物细胞如：s a c c h a r o m y c e 墨c a n d i d a , h a n s e m d a , m y c o t o r u l a , p i c h i a , d e b a r y o m y c e s , r h o d o t o r u l a , t o r u l o p s i s , k l o e c k e r a , c r y p t o c o c c u s , h a n s e n i a s p o r a , 1 9 华中农业大学硕十学位论文 s p o r o b o l o m y c e s , l i p o m y c e s , t r i c l z o s p o r o n , t o r u l a , a s p e r l l u s , p e n i c i l l i u m , r h i z o p u s , m u c o r 等来获得s a m ( k a w a h a r ae ta 1 ，1 9 8 0 ) 。其中，酿酒酵母属微生物 c e r e v i s i a e ) 具有较高的过量积累s a m 的能力，是最常用的微生物。 酵母细胞利用外加的蛋氨酸为前体可以合成过量的s a m ( s c h l e n ke ta 1 ，1 9 6 5 ) ， 产量约为5 0 1 m a o l g 干细胞。通过基因工程引入乙硫氨酸抗性基因( s h i o m i e ta 1 ，1 9 9 2 ) 或采用高产菌株s s a k e ( s h i o z a k ic ta 1 ，1 9 8 4 ) ，s a m 产量可达9 e e l 发酵液，蛋氨酸的 转化率一般比较低，只有1 5 3 0 。酵母细胞生产的s a m 中，产物的8 0 具有生物 活性，而且生产中除蛋氨酸转化率较低外，从过程操作和产量的角度考虑，工业规 模生产没有大的问题。 为了提高s a m 产量，除了外加蛋氨酸外，对培养基组成进行了许多研究，如加 入一种不含硫原子的氨基酸( j a p a n e s eu n e x a m e d p a t e n tp u b l i c a t i o nn o 2 8 2 9 6 1 9 8 3 ) 氨基乙酸或丙胺酸( j a p a n e s eu n e x a m e dp a t e n tp u b l i c a t i o n n