《基因工程的原理》PPT课件.ppt

第一节基因工程的原理,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),基因工程的概念,基因工程是指按照人们的愿望，将一种生物的基因在体外剪切，并与特殊的运载工具进行拼接，然后导入另一种生物体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。定向的改造生物的遗传性状。,DNA重组技术或基因拼接技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切拼接导入表达,定向的改造了生物的性状,_的培育成功，宣告了基因工程的诞生。,双重抗性大肠杆菌,转基因抗虫棉,抗虫棉,普通棉,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要哪些工具呢？,普通棉花抗虫棉,一、基因手术刀：限制性内切酶,二、基因缝纫针：DNA连接酶,三、基因运输车：载体,探究1：基因工程的基本工具是什么？,（1）识别特定的脱氧核苷酸序列（回文序列）；（2）并在特异性位点把双链DNA分子“切割”开。,主要从原核生物中分离纯化,一、基因手术刀：限制性内切酶,1、来源：,2、功能：,3、酶切结果：,形成黏性末端。,4、作用实质：,特定部位的磷酸二酯键（酶切位点）断开,EcoR,黏性末端,黏性末端,识别特定的脱氧核苷酸序列的特点：中轴线两侧的碱基反向对称重复排列的回文序列。,切割的位点：G、A之间断裂的化学键是：磷酸二酯键,限制性内切酶对DNA分子的切割,DNA,Hind,Hind切割位点,A,B,限制酶作用是A处还是B处？,A处,思考：,某DNA分子被限制性内切酶切后形成1个DNA片段，有1000个碱基对，该DNA分子若被限制性内切酶切后形成2个DNA片段，分别有600个碱基对和400个碱基对，若该DNA分子同时被限制性内切酶和切割后形成2种DNA片段，分别有600个碱基对和200个碱基对。问：该DNA分子有何特点？限制性内切酶有几个酶切位点？限制性内切酶有几个酶切位点？,该DNA为环状,1个,2个,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,G,AATTC,CTTAA,G,G,AATTC,CTTAA,G,G,CTTAA,AATTC,G,双链断开,不同来源的DNA片段结合,1、种类：,磷酸二酯键,二、基因缝纫针：DNA连接酶,2、作用部位：,3、作用条件：,两个DNA分子末端的碱基互补配对。,4、功能：,将两个DNA分子“缝合”起来，恢复被限制性内切酶切开了的磷酸二酯键。,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,EcoliDNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,二、基因缝纫针：DNA连接酶,二、基因缝纫针：DNA连接酶,连接酶的部位：,磷酸二酯键，不是氢键,重组DNA,二、基因缝纫针：DNA连接酶,DNA连接酶与DNA聚合酶比较,形成磷酸二酯键,单个脱氧核苷酸,DNA片断,需要,不需要,（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；（2）具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；（3）具有某些标记基因，便于进筛选运载体是否进入受体细胞。（如荧光蛋白基因、抗四环素基因、抗氨苄青霉素基因）（4）对受体细胞无害,质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等,三、基因运输车：载体,2、载体必须具备的条件：,1、常用的载体有：,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有限制性内切酶切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,习题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论,既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因,+：存活,：死亡,1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,课堂巩固,2、DNA连接酶催化的反应是()ADNA复制时母链与子链之间形成氢键B黏性末端碱基之间形成氢键C两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接DA、B、C都不正确,3、作为基因的运输工具载体，必须具备的条件及理由是()A、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选,4、质粒是基因工程最常见的载体，它的主要特点是()能自主复制不能自主复制结构很小是蛋白质是环状RNA是环状DNA能“友好”地“借居”A、B、CD,5、在受体细胞中能检测出目的基因是因为()A、目的基因上有标记B、质粒具有某些标记基因C、重组质粒能够复制D以上都不正确,（1）识别_的脱氧核苷酸序列；（2）并在_把双链DNA分子“切割”开。切开的化学键为_，形成_。,主要从_生物中分离纯化,一、基因手术刀：_,1、来源：,2、功能：,二、基因缝纫针：_,1、功能：,恢复被限制性内切酶切开了的_。,2、DNA连接酶与DNA聚合酶比较有何异同？,三、基因运输车：_,2、载体必须具备的条件？,1、常用的载体有：_,温故知新,原核,特定,回文,特异性位点,磷酸二酯键,限制性内切酶,DNA连接酶,载体,磷酸二酯键,质粒,黏性末端,下图为DNA分子的切割和连接过程。,(1)EcoRI是一种酶，其识别序列是，切割位点是与之间的键。切割结果产生的DNA片段末端形式为。(2)不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是，此酶的作用是在与之间形成键，而起“缝合”作用的。,限制性内切,GAATTC,鸟嘌呤脱氧核苷酸,腺嘌呤脱氧核苷酸,磷酸二酯,黏性末端,DNA连接酶,鸟嘌呤脱氧核苷酸,腺嘌呤脱氧核苷酸,磷酸二酯,一、目的基因的获得,二、重组载体的构建,三、重组载体的导入和筛选,探究2：基因工程的一般程序是怎样的？,四、目的基因的表达和鉴定,1、目的基因：,基本操作步骤,一、目的基因的获得,在基因操作中使用的外源基因。它是编码蛋白质的结构基因，如胰岛素基因、干扰素基因。,2、获得目的基因的方法：,（1）直接分离法,（2）人工合成法,a.鸟枪法,b.反转录法,c.化学合成法,（3）其他方法：,从基因文库获得、PCR扩增,分离程序：用限制性内切酶将完整的DNA分子切成适当长度的片段，然后通过检测的方法挑选出所需要的基因。,a.鸟枪法(散弹射击法）,核酸探针：是用放射性同位素或其它标记物标记的核酸单链，具有非常特意的核苷酸序列，能与DNA互补链结合，可用于特定的基因检测。,检测方法：应用核酸探针,扩增：用PCR仪扩增,b.反转录法,c.化学合成法,质粒,目的基因,限制酶,二、重组载体的构建,基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,二、重组载体的构建,二、重组载体的构建,基因表达载体的组成：,b、目的基因,a、启动子,c、终止子,d、标记基因,e、复制原点,1、1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。(1)此图表示的是采取_合成基因的方法获取_基因的过程。(2)图中DNA是以为_模板，形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的目的基因。(3)图中代表，它往往含基因，以便对目的基因的检测。,人工,目的,信使RNA,重组DNA分子,标记,转化,目的基因导入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,三、重组载体的导入和筛选,2+,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:（1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。（3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,农杆菌介转化法（导入植物体细胞）,花粉管通道法（导入植物受精卵）,显微注射法（导入动物受精卵）,筛选出获得目的基因的重组细胞,通过转化，有的细胞可能导入了重组载体，利用选择性培养基就可以把它们筛选出来。,1、基因表达,基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。,基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。,四、目的基因的表达和鉴定,基因工程成功的标志：,目的基因表达，进而产生相应的性状,检查是否成功,四、目的基因的表达和鉴定,从苏云金芽苞杆菌中提取抗虫基因,从土壤农杆菌中提取带有选择性标记的质粒,同一种限制酶处理,抗虫基因与质粒结合形成重组质粒,将重组质粒导入土壤农杆菌(农杆菌转化法导入),筛选,将土壤农杆菌与棉花细胞混合培养,侵染,重组质粒将抗虫基因导入棉花细胞并整合到棉花的DNA上,植物组织培养,获得抗虫棉,抗虫棉的培育流程图,基因工程的基本原理概念图,下图为利用生物技术获得动物乳腺反应器和抗虫棉的过程，据图回答：,在基因工程中，A表示，如果直接从苏云金杆菌中获得抗虫基因，过程使用的酶区别于其他酶的特点是，B表示。在研究过程中，研究人员首先从相关基因组中获取了目的基因，并采用技术对目的基因进行了扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了重组载体。在重组载体的构建过程中需要的工具酶。,目的基因,识别特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割DNA分子,重组DNA,PCR,限制性内切酶、DNA连接酶,基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括哪些部分?。将目的基因导入受体细胞的过程中，在过程中一般是采用方法，在过程中一般采用方法，受体细胞一般是。由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法及结果是什么?。要确定目的的基因（抗虫基因）导入棉花细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体水平上的鉴定过程：。,目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分,农杆菌转化法,显微注射技术,受精卵,进行抗原抗体杂交如果出现杂交带，表明奶牛中出现了抗原蛋白；不出现杂交带，表明奶牛中未出现抗原蛋白,让害虫吞食棉花叶，观察害虫是否具有抗虫性状,1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基