（微生物学专业论文）一株产高温蛋白酶菌株的生物学特性研究.pdf

摘要 从吉林省长白山梯云温泉边的土样中分离得到一株产高温蛋白酶的菌株。根据其形 态学特征、生理生化特性及部分长度的1 6 s r d n a 序列的研究，初步鉴定该菌株为芽孢 杆菌属的一个新菌株，命名为b a c i l l u ss p s d 0 5 。 将该菌株分别接种到6 种不同的液体培养基中，发酵后测定其高温蛋白酶酶活，确 定了最佳初始液体产酶培养基，即：干酪素0 5 ，m a n d e l a 盐1 0 ，m a n d e lb 盐1 ， p h 6 0 。 以初始液体产酶培养基为基础，对该菌株进行最佳产高温蛋白酶的条件进行优化， 结果表明最佳产酶条件为：以0 5 干酪素为最佳碳、氮源：培养基的初始p h 值为6 0 ； 接种量为0 5 ；培养温度为3 2 ；培养时间为2 4 h 。 实验表明该菌所产高温蛋白酶的9 2 1 2 都分布在细胞膜上，是一种和细胞结合的 酶。对其提取条件进行研究，结果表明：用6 0 的异丙醇浸提菌体2 h ，离心后菌体再 用5 0 m m o i l 的p b s 振摇提取2 0 h ，为该结合酶的最佳提取方法。 将粗酶液进行了超滤，盐析、透析、s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶层析和冷冻干燥，得到单 一的高温蛋白酶组分。对该酶的性质研究表明，该酶的分子量为6 6 0 0 0 d a 最适反应温 度为6 0 ，最适反应p h 8 0 ；在温度3 0 6 0 ，p h 6 0 11 0 条件下较稳定。 关键词：芽孢杆菌；菌株鉴定；高温蛋白酶；发酵产酶条件；纯化 a b s t r a c t an e wb a c t e r i a ls t r a i nw a si s o l a t e df r o ms o i li nc h a n g b a im o u n t a i nj i l i np r o v i n c ea st h e t h e r m o s t a b l e p r o t e a s ep r o d u c e r s o n t h eb a s i so ft h ep h y l o g e n e t i ca n d p h e n o t y p i c c h a r a c t e r i s t i c s ，t h es t r a i nh o u l db ep l a c e di nt h eg e f l u sb a c i l l u sa san o v e is p e c i e sf o rw h i c h w ep r o p o s et h en a m eb a c i l l u ss p s d 一0 5 而ea c t i v i t yo ft h e r m o s t a b l ep r o t e a s ew a sc o m p a r e db yc u l t u r i n gs d 一0 5i nd i f f e r e n t l i q u i dm e d i u m s t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o n e n tf o rp r o d u c i n gp r o t e a s ew a sd e c i d e d b yc u l t u r i n gs d 一0 5i no p t i m a lm e d i u m ，t h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n g p r o t e a s ea r ed e c i d e da sf o l l o w s ：0 5 c a s e i n ，t h ei n i t i a lp h6 0 ，t h e0 5 i n o c u l a t i o n ，3 2 ， s h a k i n ga t1 3 0 r p ma n dc u l t u r e df o r2 4 h 9 2 1 2 o ft h et h e r m o s t a b l ep r o t e a s ee x i s t e da tt h es u r f a c eo fc e l la n dc o m b i n e dw i t h e e l lm e m b r a n e e x t r a c t i o nm e a n sw a ss t u d i e d t h eo p t i m a le x t r a c t i o nm e a n sw a st h a tt h e e e l i sw a sm a r i n a t e di n6 0 o fi p af o r2 ht h e ns h a k e di n5 0 m m o l lp b sf o r2 0 h a p r o t e a s ef r a c t i o nw a sp u r i f i e db yt h es t e p so fa m m o n i u ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o n ， d i a l y s i s a n ds e p h a d e xg 一1 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y n ep r o t e a s e p u r i f i e df r o m s e p h a d e xg 一1 0 0s h o w e das i n g l eb a n do fp r o t e i nw i t ham o l e c u l a rw e i g h to f6 6 0 0 0 d ab y s d s p a g e t h eo p t i m u ma c t i v i t yo fp r o t e a s ew a so b s e r v e da tt h et e m p e r a t u r eo f6 0 t h e m a x i m a lh y d r o l y s i so fc a s e i nb yt h ep u r i f i e dp r o t e a s ew a so b s e r v e da ta b o u tp h8 0 n e p r o t e a s ei ss t a b l ea tp h 6 0 - 1 1 0a n da tt e m p e r a t u r eb e l o w6 0 k e yw o r d s ：b a c i l l u s ；i s o l a t i o n ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ；t h e r m o s t a b l ep r o t e a s e c h a r a c t e r i s t i e s l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：盐巡：日期：竺2 ：! ：主 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东t v , l j i l l 范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：二圣苎! l 猃指导教师签名 日 期：坦五：乡日 期 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话：挫z ! 丝力 邮编：z 盏立芝7 引言 一、高温菌的简介 高温菌( t h e r m o p h i l e ) 也称嗜热菌或好热菌，根据最适生长温度分为高温菌和超高温 菌。其中某些超高温菌( h y p e r t h a r m o p h i l e ) 口- - f 能是古老地质时期诞生生命形式的残遗，其 高温、高压、低氧的生存环境，与早期地质环境相似。在系统进化树上，高温菌与超高 温菌都处于系统进化树的基部，并且分支较短，说明其进化缓慢，因此人们认为高温菌、 超高温菌可能与原始生命非常接近，并且认为生命起源于高温菌【l i 。因此，研究高温菌 对探索生命起源具有重要意义；同时高温菌在食品工业、发酵工业、石油开采及环境保 护等领域都有广泛的应用，因此，高温菌已经成为近年来科研的重要课题。 对于高温菌生活温度的界定，有2 种界定方法1 2 1 。一种方法是根据微生物所能生存 的极限温度，即将在5 5 1 3 以上环境中能够生长的菌叫高温菌；其中能在5 5 c 以上环境 中生长，又能在3 7 c 环境以及3 7 c 环境以下生长的高温菌称为兼性高温菌；而仅在5 5 以上温度范围内生长的高温菌称专性高温菌1 3 。另一种方法是根据其生活的最适温度， 或其培养温度来定义。即最适生长温度在4 5 1 1 0 的极端温度下的微生物叫高温菌。 通常又把它分为高温菌( 最适生长温度在4 5 c 8 0 c 之间的微生物，又叫中度嗜热菌1 和 超高温菌( 最适生长温度超过8 0 c ) 。 目前发现的高温菌( 高温微生物) 具有如下特点：分类进化级位覆盖3 个域( 真核 生物域、古生菌域和细菌域) ；系统进化地位越低级生长温度越高，如古菌为1 1 3 。c ， 细菌为9 0 ，真菌为6 0 c 6 2 c ；已发现的最适生长温度超过8 0 的高温菌无不 是严格厌氧的【4 1 。 ( 一) 高温菌的分布 在自然界中，嗜热菌通常分布在地热环境和人工高温环境中。地热环境在地球上分 布很广，主要处在地质构造活跃区。大致可分为三种类型：酸性硫磺区。具有丰富的硫、 酸性土壤、酸性温泉、沸泥塘等；淡水温泉和中性、碱性的间歇喷泉；深海火山口。 人工高温环境有堆肥、厩肥、热水器、热污染河流、高温水处理厂等1 5 1 。见诸报道的能 产嗜热蛋白酶的嗜热微生物中，以芽孢杆菌最多。例如b a c i l l u ss p m o 。1 ，b s p e a 1 。 b t h e r m o p r o t e o l y t i c u s ，b 1 i c h e n i f o r m i s 及b c i r c u l a n s ，b s p a k l ，b s p b 1 8 。此 外，在真菌、古细菌、放线菌中也有过报道。例如，s u l f o l o b u ss o l f a t a r i c u s ，t h e r m u s a q u a t i c u s ，t h e r m o r n o n o s p o r a f u s c a ，p s e u d o m o n a ss p m c 6 0 6 q 5 1 。 尽管高温菌能于在高温( 5 5 ) 条件下生长，但它们在地球上分布十分广泛。在中 温甚至低温环境中都能分离到嗜热细菌。戴玄【1 6 j 等对嗜热微生物在不同环境中的分布及 其产蛋白酶的情况进行了调查。研究结果显示从常温环境中存在大量的嗜热细菌。而且 嗜热细菌的数量与日照强度及气温有关，日照强度大、气温高时嗜热细菌的数量也较多。 土样中嗜热细菌产蛋白酶菌株的比例高达3 0 。非高温环境水样中也存在有嗜热细菌， 即使在冬季( - 2 3 ) 低温条件下也能从水体中分离到嗜热细菌，值得注意的是，水样中 嗜热细菌的数量要比土样低1 2 个数量级，这是因为水体温度较低，即使在盛夏季节也 很难超过3 0 v ，不利于嗜热细菌的生长，而土壤浅表盛夏季节的阳光直射下的表层土壤 微环境温度可高达4 0 5 0 c ，甚至更高，在这样的温度条件下，嗜热菌的生长是十分活 跃的。另外，与土样相比，水样中产蛋白酶嗜热细菌菌株比例较低，这是因为土壤环境 中有较多的养分，胞外蛋白酶降解周围环境中蛋白质营养物质有利于细菌的生长，在长 期的进化和自然选择过程中，产胞外蛋白酶的细菌种群数量增加。 ( 二) 高温菌的耐热机制 高温菌一经发现，其耐热性c l n 研究就成为高温菌研究的热点。随着高温菌研究的 不断深入，特别是超高温菌的不断发现，人们对高温菌的有关特性进行了系统的研究， 主要内容如下： 1 嗜热微生物的蛋白质具有较高的热稳定性，有可能是一级结构上多处微小作用 的综合结果。k l i n d a 等【1 7 1 通过对常温下生活的共生梭菌( c l o s t r i d i u ms y m b i o s u m ) 与热球 菌属的激烈热球菌( p y r o c o c c u sf u d o s u s ) 和t h e r m o c o c c u sl i t o r a l i s 的谷氨酸脱氢酶比较分 析，发现常温菌与高温菌酶最大的差异是某几个氨基酸的替换( s u b s t i t u t i o n ) 。这种替换 增加了结构的疏水性和侧链分支。特别是v a l 与i l e 的替换。研究表明对蛋白质核心紧 密包裹( p a c k i n g ) 有助于提高蛋白质的热稳定性。卢柏松等1 1 8 l 比较了嗜热蛋白质与嗜常温 微生物( 最适生长温度 4 0 ) 的蛋白质的同源序列。结果显示：嗜热蛋白组l e u ，p r o ， a r g 和g l u 的含量显著高于嗜常温组，而c y s ，s e r ，t h r ，a s n ，g i n 和a s p 的含量显著 低于嗜常温组。即嗜热微生物蛋白质中有利于提高蛋白质热稳定性的氨基酸含量较高， 而不利于其热稳性的氨基酸含量较低。 2 高温微生物的膜脂可以分为两大类型，即真细菌型膜脂和古细菌型膜脂。真细 菌型膜脂是由甘油和脂肪酸通过酯键结合而成的脂肪酸甘油酯，主要是甘油脂肪酰二酯 【1 9 l 。温度升高，复合脂类中的烷基链彼此间隔扩大，而极性部分作为膜的双层结构却保 持整齐状态液晶态。膜通过自动调节脂组分而维持膜的液晶态以获得更高的熔点。 而且细胞膜中含有异型脂肪酸，稳定型脂肪酸和环烷型脂肪酸，从而使嗜热菌的细胞膜 2 耐受高温【冽。 古细菌型膜脂是由甘油和异戊基醇( c 2 0c 4 0 植烷醇1 通过醚键结合衍生出两类基本 的醚，即植烷醇甘油二醚和四醚，它们的非极性链几乎都固定在c 2 0 和c 4 0 。四醚能形 成大小和脂双分子层相同的单层膜脂，避免了双层膜在高温下易变性分开的情况。在嗜 热古细菌的膜中还存在环己烷型脂肪酸，在高温下这种脂肪酸链的环化能促进二醚磷脂 向四醚脂转变【1 9 , 2 0 l 。 3 最近的研究发现，高温菌和超高温菌( h y p e r t h e r m o p h i l e ) 细胞内所含的某些物质， 对提高酶在高温下的活性具有促进作用【2 1 l o 研究人员从闪烁古生球菌( a r c h ae o g l o b u s f u l g i d u s ) 这种超高温菌中提取出一种被称为1 ，1 - 二甘油磷酸的物质( 1 ，1 - d i g l y c e r y l p h o s p h a t e ) ，简称d g p ，是一种蛋白质稳定剂，可以极大地提高兔肌脱氢酶和面包酵母 乙醇脱氢酶等常温酶类在5 0 高温下的活性。 4 研究结果显示高温菌耐热性与1 6 5r r n a g + c 含量之间明显存在正相关【捌 ( 三) 高温菌的应用 对高温菌的研究不仅具有重要的理论意义，而且还具有广泛的应用前景。对高温菌 应用最著名的例子当属是由t h e r m u sa q u a t i c u s 中分离的d n a 聚合酶【2 3 1 ，它广泛地被应 用于聚合酶链式反应( p c r ) 中d n a 的扩增上。与一般的d n a 聚合酶相比，这种d n a 聚合酶具有更高的热稳定性，从而保证了d n a 链解旋( 9 5 ) 、杂交( 5 4 ) 、d n a 合成 过程可以重复不断的进行，而不需要添加别的酶。除了用作p c r 体系中热稳定性酶外， 近年来高温菌在抗生素、化学原料、燃料的生产、废物处理、石油开采等领域也得到了 广泛的应用。如：k p l a n 及合作者利用p s e u d o m o n a st h e r m o p h i l a 中的一种嗜热需氧菌生 产出了多种b 族维生素；在抗生素的生产中，利用嗜热菌t h e r m o a c t i o n m y c e s 获得的9 种抗生素中，两种热红菌素及热绿链菌素已进行工业化生产并在医药领域得到应用；烟 草经反硝化嗜热菌b a c i l l u ss p 高温厌氧处理后，烟草燃烧只能释放少量的n o 、c o 和 h c n ，对空气净化起到一定的积极作用1 2 4 1 。嗜热链球菌是r r c 法检测牛乳中抗生素的 指示菌，又是酸奶生产特定菌，它与保加利亚杆菌混合培养能产生出芳香适口的酸奶。 利用高温微生物除硫，所需能量少，避免了好煤的流失及对环境的污染，既提高了煤的 质量，又降低了成本t 2 5 l 。嗜热菌在葡萄糖上厌氧生长才能获得乙醇；在氨基酸或肽的培 养基中加入酵母提取物或蛋白胨而获得丙醇、丁醇、戊醇、己醇等。 ( 四) 高温菌的研究现状 自1 9 6 9 年b r o c kt d 分离到高温菌以来，人们就对高温菌进行了一系列的研究。国 内关于高温菌的研究还比较多，他们的研究涉及到很多方面，如菌种的分离、纯化、生 理、生化、特殊的营养需要、耐热机制、基因克隆以及在工农业以及环境方面的应用等。 国内对高温菌的研究起步较晚，到八十年代才有复旦大学、中科院北京微生物研究所和 云南省微生物研究所三家单位较具规模。国内关于高温菌的研究也比较少，多处于些 基本的研究阶段。他们的研究主要涉及到高温菌的分离、纯化、鉴定、菌种保藏、营养 等方面i2 6 1 。 在3 0 多年的时间里，高温菌研究取得了重要进展。己从陆地和海洋温泉及其它高 温生态环境中发现了7 0 个属1 4 0 多种高温菌，其中有真细菌域高温菌，也有古生菌域 高温菌，生长温度在5 0 c 1 1 0 。c 范围内，营养方式多种多样，菌种形态有杆状、球状、 螺旋状等；代谢途径纷繁复杂，有最古老的高温糖酵解途径；一些高温菌产生的酶因具 有良好的高温热稳定性等特有的性质而在许多领域得到应用，产生了巨大的影响，激起 了人们研究开发高温菌及其它极端环境微生物的浓厚兴趣。 二、高温酶的研究进展 一般把最适反应温度在6 0 。c 8 0 。c 之间的酶称为嗜热酶，最适反应温度在8 0 6 c 以 上韵酶称为极端嗜热酶。嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率高和 底物专一性强，而且酶在高温条件下的稳定性极好f 2 7 1 。因而它可以克服中温酶在应用过 程中常常出现的生物学性质不稳定的现象，从而使很多高温化学反应过程得以实现，这 将极大地促进生物技术产业的发展，从而带动技术水平和生活质量的提高。目前，对嗜 热酶的研究还处于初期阶段，但对酶的耐热性机制、稳定性机制及应用前景已有一些文 献报道。 ( 一) 高温酶的特点 1 具有良好的耐热性，用嗜热蛋白酶可减少微生物污染的危险。7 0 以上的温度 足以杀死大多病原菌，且大大减少易造成食品加工过程中易感染菌的数量。由b a c i l l u s s p a k l 产生的p r o t e i 船s e a k i 宅e 6 0 * c 、7 0 时酶活无变化，9 0 时酶活半衰期为1 9 m i n i 勰】； 由n e 加o a c t i n o m y c e ss p e 7 9 产生的嗜热蛋白酶在9 0 。c 1 对，酶活半衰期1 0 m i n 2 9 】；由 t h e l t n u s s p r t 4 1 a 产生的嗜热蛋白酶在7 0 。c 时酶活半衰期2 4 h 1 3 0 l ；来i 刍d e s u l f u r o c o c c u s s y 的蛋白酶在9 5 。c 下培养43h 依然有一半活性【3 1 l ；来i 刍t s t e t t e r i 的胞外蛋白酶在1 0 0 c 下培养2 5 h 有一半活性。 2 可降解低处理液的粘度，高温环境下液体粘度通常会下降，从而使剪切力及抽 运、过滤、离心费用减少。 3 热传导效率与质量传导效率均得到改善。高温下，扩散效率增加且质量传递限 制因子减少【3 2 1 。 4 具有良好的p h 稳定性。例如，由t h e r m o a c t i n o m y c e ss p e 7 9 产生的嗜热蛋白酶， 4 在p h 5 0 1 2 0 范围内，酶活相当稳定；由b a c i l l u ss p b 1 8 产生的嗜热蛋白酶在p h 5 0 1 2 0 范围内，酶活也相当稳定；b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u sh y - 6 9 产生的嗜热蛋白酶在7 0 、 8 0 c ，p h 稳定范围分别为p h 6 0 1 0 0 、p h 6 o 8 。0 1 3 3 l 。 ( - - ) 高温酶的耐热机制 嗜热微生物的代谢过程和特殊的生物学功能，是由在极端条件下的酶和蛋白质的功 能所决定的。除了核酶及脱氧核酶以外，其他酶的化学本质都是蛋白质。酶蛋白的一个 重要性质就是遇热变性并失去催化活性，可是嗜高温酶却能在8 0 以上的条件下发挥功 能。由于嗜高温酶在高温发酵、p c r 技术以及钻井采油等方面具有良好地应用前景与开 发潜力，所以研究它们的结构特点及其耐热机制，寻找或设计新的嗜高温酶是生产与科 研共同关注的热点问题。虽然现在还没有彻底阐明嗜高温酶的耐热机制，但是从目前的 研究结果来看，嗜高温酶的耐热性是由于酶本身稳定的天然结构，包括酶内离子对的最 优化、疏水表面积的最小化、d n a 螺旋稳定性及亚基的装配1 3 4 j 。另外，嗜高温酶的耐 热性还与嗜热菌胞内含有的热稳定因子有关，这些热稳定因子对酶蛋白有保护作用。此 外，钙、锌等金属离子对嗜高温酶也有热稳定作用。 1 嗜高温酶的结构因素m 刈 人们对嗜高温酶和嗜常温酶的氨基酸序列差异进行了大量的研究，发现大多数嗜高 温酶与同源嗜常温酶的氨基酸序列同源性很大，只有某些关键区域少数氨基酸的变化， 但也有些同源酶的氨基酸序列同源性较小。出现大量的氨基酸取代或插入。不管属于哪 种情况，酶蛋白的一级结构都对其本身的抗热性具有重要作用。因为维持蛋白质高级结 构的次级键( 氢键、离子键及疏水键等) 都是由氨基酸序列中的侧链基团参与形成的，故 嗜高温酶的一级结构改变就会引起这些次级键变化或者增加了次级键的数量，从而使酶 分子的结构更稳定，因而也更具耐热性。 增加d n a 螺旋稳定性有利于酶的热稳定性的提高。其中最重要的是在螺旋排列过 程中，使氨基酸残基的构象熵丧失。以c9 分枝氨基酸( 缬氨酸、异亮氨酸及苏氨酸) 使d n a 螺旋产生较大的构象张力，因此，很少出现在嗜高温酶结构中。 加强折叠蛋白稳定作用，如二硫键及氢键也可增加嗜高温酶的稳定性。亚基与其区 域之间的稳定化作用也增加蛋白内在稳定性，与嗜温酶相比，嗜热微生物的酶结构中呈 现较高的次序缔合状态，这意味着低聚物的形成也是增加酶的稳定性的一个因素。 由于酶的热变性是因破坏次级键而引起构象破坏并失去生物活性的过程，故人们试 图通过研究嗜高温酶的构象与次级键来了解其耐热机制。到目前为止，还没有发现嗜高 温酶中有维持构象的特殊键，只是这些键的数量与嗜常温酶不同。嗜高温原生细菌 ( p y r o c o c c u sf u r i o s u sp f ) 的红氧还蛋白和铁氧还蛋白特别耐热，在1 1 8 1 2 5 时才发 生热变性。通过核磁共振与晶体结构图分析表明，嗜高温的红氧还蛋白与已知的嗜常温 红氧还蛋白的晶体结构很相似。由此看来蛋白质的耐热性不是因为总体结构的差别，而 是与其分子表面几个氨基酸的置换有关。与嗜常温的铁氧还蛋白相比，嗜高温铁氧还蛋 白有三股b 折叠而不是二股b 一折叠，还有较短的环，较长的a 螺旋，在肽链两端的氨 基酸之间有特异的离子反应，这些反应有助于防止温度升高引起的肽链末端开链并提高 s 了酶的稳定性。 2 热稳定因子的保护作用【3 5 】 在体外，大多数有机溶剂可降低酶的热稳定性或使酶变性失活，可是甘油、蔗糖及 乙二醇溶液往往可增加酶的热稳定性。在体内，超嗜热古生菌通过代谢过程合成的高浓 度的2 ，3 二磷酸甘油酸可溶性物质对蛋白质、酶及核酸都有保护作用，可防止高热条 件下的变性失活过程。对于d n a 来说，它们还能合成与真核细胞组蛋白密切相关的d n a 结合蛋白。这种蛋白质与d n a 结合后能保护并防止d n a 在高温条件下的解链变性过 程。 超嗜热古生菌中的热网菌属( p y r o d i c t i u m ) 的细菌最高能在1 1 0 ( 3 的条件下生长。在 这种温度条件下，它们能合成占细胞蛋白质总量8 0 的一种蛋白质。这种蛋白质具有两 种酶活性：一种是催化合成a t p 的活性，另一种是具有分子伴侣的活性。当环境温度 达到最高生长温度并接近胞内蛋白质与酶的变性温度时，这种分子伴侣通过重新折叠来 保护其它蛋白质及酶对高热的稳定性。但是在接近热网菌的最适生长温度1 0 5 。c 的1 0 0 时，细胞仅合成少量分子伴侣。说明在一定温度条件下，细菌能主动调节代谢并使合 成分子伴侣的量随着温度的升高而增加。只有在最高生长温度时才能合成大量的分子伴 侣，用于保护蛋白质与酶的活性，从而使自身适应高温环境。 3 金属离子i ”】 c a 2 + 能提高许多热稳定性酶的耐热性。在c a 2 + 存在的条件下，几乎一半以上的碱性 蛋白酶能在6 5 c 的条件下维持1 5r a i n 。嗜高温中性蛋白酶的热稳定性更加依赖于c a “。 从云南西双版纳分离筛选的菌号为h y 一6 9 的耐热菌株产生的含钙中性蛋白酶特别耐 热，最适活性温度为8 5 。c ，且8 0 。c 保温3 h 仍保持6 3 的活性。如用透析法完全除去该 酶中的c a 2 + ，8 0 。c 保温1 0 m i n 就完全丧失活性。嗜热菌蛋白酶( t h e r m o l y s i n ) 也是一种耐 热的含钙中性蛋白酶。它含有4 个c a 2 + ，从酶分子中除去3 个或4 个c a 2 + ，不影响酶的 催化活性，但热稳定性明显降低。尽管还不了解c a 2 + 提高酶抗热性的作用机制，但是推 测c a 2 + 对稳定酶分子的三维结构有重要作用。此外，锌离子与钾离子对某些耐热酶也有 热稳定作用。 4 环境稳定因素f 3 8 删 一些环境因素，如化学交联、固定化及糖基化作用也可以是酶的耐热性增强。如应 用超高压( 5 0 mp 以上) 可使酶结构紧凑，从而使酶产生较高耐热性。 另外，早期对一些嗜热蛋白和常温蛋白的氨基酸组成进行比较研究发现嗜热蛋白中 发生了一些氨基酸替代，常温蛋白中的g l y 、s e r 、l y s 、a s p ，在其嗜热蛋白中一般被替 换成了a l a 、t h r 、a r g 、g l u ，这些替换对蛋白分子的功能和氨基酸残基的相对排布方式 影响i 6 1 4 , ，认为嗜热蛋白的热稳定性可能只需某些微小的变动而无须分子骨架构象大的 变化。 ( 三) 高温酶的获得 1 从嗜热菌生产【4 1 ，4 2 】 6 嗜热菌产生的嗜热酶大多数在高温条件下依然能保持很高的催化活性，尤其是胞外 酶。因而，嗜热菌依然是目前获得嗜热酶最直接和最可靠的来源。 2 构建产嗜热酶的基因工程菌株1 4 3 ”l 嗜热菌是目前获得嗜热酶最直接和最可靠的来源。然而，大多数嗜热菌生长速度较 慢，培养条件严格，因此通过培养野生菌来获得大量嗜热酶极其困难。随着基因工程技术 的发展，人们可以把嗜热菌中的目的基因在中温宿主中表达，这样就能在温和的培养条 件下得到大量的嗜热酶。 目前，克隆嗜热蛋白酶基因主要有两种方案。第一种方案是：从地理热环境( 陆地 温泉和海底温泉) 和其它高温环境( 堆肥、厩肥、高温水处理厂) 中采集样品，然后从中筛 选出能产嗜热蛋白酶的嗜热微生物，最后从嗜热微生物中克隆嗜热蛋自酶基因。从嗜热 微生物中克隆嗜热蛋白酶基因的方法主要有以下几种：鸟枪法。将菌株的总d n a 抽 提出来进行随机酶切，然后与用同样酶处理过的表达载体连接，转化大肠杆菌或枯草杆 菌，最后用加脱脂牛乳的琼脂平板筛选转化子【4 3 1 。基因文库方法。将菌株的总d n a 抽提出来，构建一个基因文库，然后利用杂交法，免疫法等方法进行筛选。杂交法需要 有与所分离的蛋白酶基因具有高度同源性的蛋白酶基因片段。例如，m a c i v c rb l * a l 等以 p c r 扩增产物作为探针进行s o u t h e r n 杂交，从b a c i l l u ss p 中筛选嗜热蛋白酶基因。k w o n s 1 椰l 等利用寡聚核昔酸作为探针筛选嗜热蛋白酶基因。免疫法需要有以高纯度的蛋白酶 作为抗原制备的抗体。p c r 扩增法。制备纯的蛋白酶，测定其n 一端或c 一端序列， 根据氨基酸序列设计引物，然后以菌株总d n a 为模板扩增基因。但是，第一种方案存 在的最大缺陷在于，许多嗜热微生物目前难以在实验室培养，属“不可培养微生物”。 美国r b i 公司针对这一点提出第二种方案：不是从嗜热环境中分离菌株，而是从环境中 收集d n a 样品，进行随机切割，然后与表达载体相连，转化大肠杆菌或枯草杆菌，最 后从中筛选嗜热蛋白酶基因。 3 应用定向分子进化技术获得菌株进行生产m 】 定向分子进化技术的发展为我们获得新型酶提供了新的途径。定向进化始于某一基 因的克隆，后经体外诱变和重组产生大量的突变体。在中温宿主中表达后，再筛选得到 在高温条件下有催化活力的突变体。利用这种方法已得到了热稳定性很高的对硝基苯甲 酰酯酶。另外，利用杂合酶( h y b r i d c n z y m c ) 技术或d n a 改组( d n a s h u f f l i n g ) 技术，把来 自相关基因的片段任意重组，从而产生新的基因库，也有希望获得一些新型嗜热酶，这 些都为现代酶工程技术展现了新前景。 4 利用蛋白质工程改造常温酶得到嗜热酶【4 1 如果已知同源嗜热酶的三维结构或已知类似的、更耐热酶的结构，则用在嗜热酶中 存在的氨基酸取代常温酶的相应氨基酸通常可提高目的酶的耐热性；而如果同源嗜热酶 的结构未知时，则可在结构柔性区构建目的突变。改变蛋白质的表面环和转角是最有前 景的办法，因为表面残基较内部残基更少参与分子间作用，且新引入的氨基酸残基不会 产生空间位阻，已有人成功地用g l y 或a s h 残基取代了左手螺旋的残基。 7 在a 一螺旋中，用a r g 取代l y s 以构建或稳定表面离子键以及减少构象拉力都有利 于蛋白质的稳定；在蛋白质表面构建一金属结合位点也是一成功的方法。 ( 四) 高温酶的应用 嗜高温酶是一种很好的新型催化剂，具有较大商业价值。许多热稳定性好的多聚物 降解酶，如淀粉糖化酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶等在食品、化学、制药、造纸、 纸浆和废水处理等工业中具有广泛地应用。 1 嗜高温蛋白酶 在食品工业上，热稳定的蛋白酶由于在高温条件下的快速催化能力，可广泛地用于 肽食品的生产与加工。此外，蛋白酶表现出很强的溶角蛋白能力，可应用于皮革工业。 热稳定蛋白酶可用于酸性及碱性条件下皮毛的软化过程中。c o o l b e a r 等人证实了蛋白酶 用于清洗超虑膜，在高温( 低粘度) 下，热稳定的蛋白酶可使超滤膜恢复过滤效率。 2 高温淀粉酶 淀粉是由直链淀粉与支链淀粉组成的混合物。直链淀粉是由a 1 ，4 糖苷键缩合而 成的葡萄糖聚合物，而支链淀粉还包含有a 一1 ，6 糖苷键。淀粉酶包括作用于a 一1 ，4 糖苷键的内、外淀粉酶，作用于a 一1 ，6 糖苷键的脱支酶及环糊精糖基转移酶。嗜高温 酶在沸水及很低p h 值条件下仍具活力，能很好地应用于淀粉转化的过程中。例如热稳 定的a 淀粉酶用于淀粉转化的液化操作中，首先热水中的淀粉颗粒涨大胶化，然后由热 稳定的a 一淀粉酶( b a l i l l u sl i c h e n i f o r m i s 或b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ) 使淀粉液化 4 8 1 高温a 淀粉酶和糖化酶在玉米淀粉深加工中也得到了大量使用【4 9 1 。在将玉米淀粉水 解成葡萄糖过程中，高温有利于淀粉溶解于水中从而促进水解。a 一淀粉酶最佳作用温度 范围的8 5 9 4 c ，应用于冷饮加工过程中，使高淀粉冷饮在质量及口感上更适合人们的 需要。高温a 一淀粉酶也广泛用于酒精、啤酒发酵工业的生产。 另外，有高温环糊精糖基转移酶( c g t a s e ) 参与的环糊精的生产极大地降低了环糊 精的生产周期及费用。因为热稳定性好的c g t a s e 可使淀粉直接液化，无需a 一淀粉酶的 前处理，也节省了大量的冷却水。 3 高温木聚糖酶m5 1 l 从嗜热菌t h e r m o t o g a 中分离得到i ，4 一b 一木聚糖内切酶，其最适温度为1 0 5 。c ，用 这种酶处理木浆无需调节浆料的p h 值和温度即可有效地去除原料中的半纤维素，减少 化学漂白剂的用量。同时也节省了老工艺纸浆冷却再回温所用的能源。更为重要的是在 酶处理后，可将溶解在洗涤废水中大量的木质素等物质提取后送到锅炉中燃烧，从而降 低废水的色度及c o d 等，减少了对环境的污染。 4 高温纤维素酶1 5 2 】 在石油开采过程中，利用粘胶混合细砂在岩石床上加压，出现裂缝后，用酶或化学 法使胶水解，来加速石油或气体的流出。由于井下温度很高，常温酶在高温条件下活力 低，为此，人们从嗜热的栖热袍菌t h e r m o t o g as 中分离得到一种纤维素酶，在1 0 0 c 时 仍具有很高的催化活性，从而达到了在井下高温时使胶水解的目的，加速石油活气体的 流出。 另外，嗜热的8 一半乳糖苷酶可用于生产低乳糖食品，改善乳制品的风味和营养。从 嗜热的t h e r m o t o g a 中分离出一种超级嗜热的木糖异构酶，这种酶也能把葡萄糖转化为 果糖，能在高温条件下提高果糖的产量。 ( 五) 高温酶的研究现状 随着近几十年来对嗜热酶的研究日益深入，科研人员发现了大量具有新特性、潜在 应用价值的嗜热酶，并对其耐热机制、实践应用、提取纯化方法等作了深入研究，取得 了显著成果，为今后嗜热酶的改造、产业化提供了理论依据。但也存在诸多问题有待于 进一步完善1 5 羽。 1 通过培养野生嗜热菌而得到的嗜热酶还比较少，多数嗜热酶仍未被发现： 2 基因工程中缺乏有效的以嗜热菌作为表达宿主的基因转移体系( 尤其是古菌) ； 3 与同源常温酶相比，嗜热酶的结构刚性究竟是更强还是更弱仍需进一步证实；嗜 热酶的刚性和柔性对酶稳定性和催化活性的影响也需进一步研究； 4 迄今为止，人们已经对大量嗜热蛋白的热稳定性进行了研究，对嗜热蛋白热稳定 性的机理已经有了越来越多的了解，但仍未找到能解释所有嗜热蛋白热稳定性的普遍机 制，不同嗜热蛋白所采用的耐热策略各不相同，而在各类蛋白中对热稳定起作用的主导 因素也不尽相同，因此，新的研究嗜热酶耐热机制的方法尚需发现。 另外，可用于嗜热酶改造的新方法、新技术仍有待于进一步探索。 由于嗜热蛋白的重要理论价值和应用潜力，关于嗜热蛋白的结构分析，理论研究以 及实际应用研究都已经越来越成为目前的研究热点。 三，高温蛋白酶的研究进展 高温蛋白酶属于蛋白酶的范畴，与其它中温蛋白酶、低温蛋白酶相比，其最显著的 特征是高温热稳定性，并具有耐蛋白质变性剂、耐有机溶剂、半衰期较长等特性。下面 就高温蛋白酶的分类和命名、来源、酶学特性、热稳定机制及其功能和应用等方面的研 究做简要的介绍。 9 ( 一) 高温蛋白酶的分类 高温蛋白酶是最适酶反应温度在5 0 。c 1 0 0 c 之间或更高温度的蛋白酶，在1 9 8 4 年版的国际生物化学联合会酶的命名法一书中，把当时己发现的高温蛋白酶划分为高温 氨肽酶( t h e r m o p h i l i c a m i n o p e p t i d a s e ) ( e c 3 4 1 1 1 2 ) 、二肽水解酶( d i p e p t i d e h y d r o l a s e ) ( e c 3 4 1 3 1 1 ) 、高温真菌蛋白酶( t h e r m o n y c o l i n ) ( e c 3 4 2 1 1 4 ) 和嗜热菌蛋白酶 ( t h e r m o l y s i n ) ( e c 3 4 2 4 4 ) i ”j 。其中，嗜热菌蛋白酶是研究的最为深入的一种高温蛋白酶。 它是一种钙锌蛋白，在8 0 时仍有活性。高温蛋白酶根据其最适活性温度范围，又可进 步分为高温蛋白酶和超高温蛋白酶。前者最适活性温度为5 0 。c 8 0 ，后者的最适活 性温度在8 0 。c 以上，在高压下，有的蛋白酶作用温度可达1 1 0 。c l s s j 。根据高温蛋白酶最 适p h 值的范围，习惯上又把高温蛋白酶划分为高温中性蛋白酶、高温酸性蛋白酶和高 温碱性蛋白酶。 ( 二) 高温蛋白酶的来源 对蛋白酶的研究是从发现动物胃液中消化食物的胃蛋白酶、胰脏中分泌的胰蛋白 酶、糜蛋白酶开始的。此后，在动物和植物组织中、微生物中都发现了蛋白酶。早期动、 植物来源的蛋白酶占了市场的绝大部分比例。但由于动、植物来源的蛋白酶是胞内酶， 提纯难度大，满足不了市场的需求，人们把目光瞄向了微生物。微生物来源的蛋白酶易 于分离纯化，更重要的是微生物易于培养、发酵，所以微生物作为蛋白酶的来源具有更 多的生理生化上的优越性。霉菌、细菌、放线菌甚至病毒都可以产生蛋白酶。微生物产 生蛋白酶的能力与菌株有关，通常一株细菌可分泌一种以上的蛋白酶，如枯草杆菌可产 生枯草菌素、蛋白酶e 等。往往即使是同一菌种，其产生蛋白酶的种类和数量随菌株不 同而有很大差异。由此而产生了微生物蛋白酶的极其多样性。 高温蛋白酶的产生菌主要有嗜热真菌、高温细菌和高温古生菌。嗜热真菌的生长温 度较低，一般在5 5 以下，高温放线菌的生长温度不超过6 5 * c 。真细菌域的高温菌生长 温度在5 0 c 8 0 。c ，超高温菌生长温度为8 0 c 1 1 0 ，古生菌域的超高温菌比真细菌 的超高温菌更耐高温，其产生的蛋白酶往往比真细菌域超高温菌产生的高温蛋白酶更耐 热。 1 嗜热真菌产生的高温蛋白酶 嗜热真菌蛋白酶主要包括嗜热真菌酸性蛋白酶和嗜热真菌碱性蛋白酶。对嗜热真菌 蛋白酶的最初研究是为了探索它们在生物加工处理中的适用性，至于嗜热真菌蛋白酶和 中温真菌蛋白酶在生理生化特征上的异同点则研究的较少。由于容易获得真菌培养液的 过滤液，所以对分泌到培养液中的胞外酶研究的较多，而胞内酶则少得多。对嗜热真菌 蛋白酶的研究则主要集中在对嗜热真菌蛋白酶产生菌株的鉴定、酶的纯化技术和酶的普 通性质的研究上。在一些研究中，对天然酶或重组酶之间的构象差异、与底物作用的氨 基酸残基的不同、疏水中心的包装、静电相互作用和螺旋稳定作用的差异等作了探索。 2 高温细菌和高温古生菌是高温蛋白酶的最重要来源 嗜热真菌和高温放线菌产生的蛋白酶活性温度比较低，一般在6 5 。c 以下，少数可达 7 0 。c 以上。在真细菌域的高温细菌和超高温细菌、古生菌域的高温古生菌以及超高温古 1 n 生菌中均找到了高温蛋白酶，其最适酶活性温度高于前二者。在微生物酶中，芽孢杆菌 ( b a c i l l u s 属及g e o b a c i l l u s 属) 是具有重要工业、商业应用价值酶的主要来源之一，高温 b a c i l l u ss p 产生有应用价值酶的报道己有许多，这些酶的最适活性温度超过6 0 。c ，有的 甚至高达8 5 ，在9 0 仍有很高的活性。在高温细菌中，b a c i l l u s 属和新成立的g e o b a c in u s 属的大多数种都发现了高温蛋白酶。 ( 三) 高温蛋白酶与中温蛋白酶酶学特征的差异 极端酶来自嗜极细菌，但井非嗜极细菌体内所有的酶都是极端酶。来源于高温菌的 高温蛋白酶最适活性温度接近或高于其产生菌株的最适生长温度，日本的 t a d a y u k i l m a n a k a 等从芽抱杆菌分离胞外蛋白酶也发现，菌体适合生长于6 2 c 和p h l l 5 ： 而酶的适宜条件为8 5 和p h l 2 1 3 。一般地，高温菌蛋白酶的酶活在6 0 1 0 0 或更 高，而与之相比，来源于中温生物的蛋白酶最适温度不超过5 0 。因此，高温菌蛋白酶 除了具有蛋白酶的共有特性外，还具有高温热稳定性。热稳定性是高温酶最显著的特征， 是酶催化功能正常发挥的前提，同时也是制约酶商业化、工业化应用的重要原因之一。 高温蛋白酶对有机溶剂有良好的抗性，这是它的又一个生理特性。蛋白酶不仅可以 水解蛋白质，还可以逆向催化合成小肤。这种酶促反应合成小肤的方法比化学合成方法 优越。在酶促合成反应中，作为底物的氨基酸衍生物侧链不需要任何保护，在温和条件 下即可产生立体专一性的酶促反应产物。当反应体系在有机溶剂中进行，反应达至平衡 状态时，合成反应的产率很高，而且，如果酶固定在多孔支撑物上，还会更有利，高温 蛋白酶很稳定，可以重复使用。酶分子周围是水相，而在水相外层是有机相。酶分子外 周的微环境保护了酶空间结构的完整性和功能上的稳定性。一般地，与在水溶液中相比， 酶在有机相中的活性往往有所下降，在极性的有机溶剂中尤为突出，为了改善酶的作用， 采用了多种措施包括基因定点突变来提高酶在有机溶剂中的稳定