（生物化学与分子生物学专业论文）ai、rk和rpe基因的克隆、表达及活性分析.pdf

嬲燃嬲 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本卢明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 崔仡侮 日期：加扣年月7 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南人学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导卜完成的沦文成果知识产权步1 属海 南大学和中国热带农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文储虢柱缸枷翩虢纭啄易 日期：叫9 年6 月i ) 日日期：仞fo 年6 月7 目 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。回童迨塞堡童丘造五j 旦上生i 旦二生；垒! 三生筮壹。 论文作者签名：程手岔彳2 b 日期：切l 口年6 月7 e t 导师签名：巯酝取易 吼纱7 d 年6 月7 日 摘要 由于未来对燃料需求的上升，原油的价格也随之增长，在对生物能源的需求预计将 在未来几年大幅增加。在潜在的可替代生物能源的物质中，木质纤维被认为是主要生物 燃料的来源和具有高附加值的产品。将木质纤维素中的纤维素和半纤维素水解成葡萄糖 和戊糖并发酵生产乙醇正在被广泛地研究。阿拉伯糖是半纤维素的组成成分之一。由于 酿酒酵母缺乏l 广阿拉伯糖异构酶( 灿) 、l 核酮糖激酶( r k ) 和l 核酮糖5 磷酸4 一差向异 构酶( r p e ) 而不能直接代谢阿拉伯糖生成乙醇。本项目研究l - 阿拉伯糖异构酶( m ) 、 l 核酮糖激酶( r k ) 和l 核酮糖5 磷酸4 一差向异构酶( r p e ) 的基因克隆以及在酵母中的 表达以及活力分析。 本实验通过p c r 法扩增到了阿拉伯糖操纵子的三个结构基因口f 、成和r p e ，并使其 基因的3 末端融合了h i s 标签，有利于其蛋白的纯化。用e c o ri 和n o ti 双酶切后将其 克隆进p p i c 9 k 和p g a p 9 k 表达载体，获得带有p a o x l 启动子的诱导型重组表达质粒 ( p p i c 9 k - a i 、p p i c 9 k r k 和p p i c 9 k r p e ) 和带有p g a p 启动子的组成型重组表达质粒 ( p g a p 9 k a i 和p g a p 9 k - r p e ) 。 用b g l i i 酶切、线性化重组质粒后，用电击法将重组载体转化毕赤酵母g s l l 5 ，经 p c r 检测获得含目的蛋白的酵母工程菌。通过g 4 1 8 筛选法获得多拷贝重组菌株。经 7 0 0 1 t g m l 的g 4 1 8 抗生素筛选得到诱导型阳性菌株g s l l 5 ( p p i c 9 k - a i ) 、g s l l 5 ( p p i c 9 k - 哟 和g s115 ( p p i c 9 k 一，p 力组成型阳性株g s1 15 ( p g a p 9 k - a 0 和g s115 ( p g a p 9 k r p e ) 。 外源蛋白的表达在摇瓶中进行。g s l l 5 ( p p i c 9 k - a ) 、g s l l 5 ( p p i c 9 k - r k ) 、 g s l l 5 ( p p i c 9 k r p e ) 以甲醇为唯一碳源，而g s l l 5 ( p g a p 9 k a i ) 和g s l l 5 ( p g a p 9 k - w e ) 以甘油为唯一碳源。s d s p a g e 分析结果显示，l 阿拉伯糖异构酶、l - 核酮糖激酶和 l 一核酮糖一5 磷酸4 差向异构酶成功地在pp a s t o r i s 中分泌表达。用糖酵解法进行活性分 析表明这些摇瓶表达的重组酶都具有酶活性。 利用电转化技术将线性化后的p g a p 9 k a i 质粒转化酿酒酵母京龙i 号，经过g 4 1 8 抗性筛选获得高基因拷贝重组子j l l ( p g a p 9 k a i ) 。摇瓶发酵工程菌株j l l ( p g a p 9 k a i ) 表达l 阿拉伯糖异构酶，用糖酵解法作活性分析表明这些摇瓶表达的重组酶都具有酶 活性。 综上所述，本实验成功地克隆了l 广阿拉伯糖异构酶、l - 核酮糖激酶和l 一核酮糖5 磷酸4 差向异构酶基因，实现了在毕赤酵母中表达l - 阿拉伯糖异构酶、l 核酮糖激酶 和l 核酮糖5 磷酸4 一差向异构酶和在酿酒酵母中表达l 广阿拉伯糖异构酶。同时，证明 了酵母表达的来源于ec o l i 的l 阿拉伯糖异构酶、l 核酮糖激酶和【广核酮糖一5 磷酸4 差向异构酶具有活性。为今后构建直接利用来自半纤维素的阿拉伯糖的酿酒酵母工程 菌，直接代谢阿拉伯糖生成乙醇，以及生产重组l 阿拉伯糖异构酶、l 核酮糖激酶和 i l 核酮糖5 磷酸4 差向异构酶而应用于半纤维素乙醇的生产打下基础。 关键词：l 阿拉伯糖异构酶；l 核酮糖激酶；l 核酮糖一5 磷酸4 一差向异构酶；基因克隆； 毕赤酵母；酿酒酵母；表达；酶活性 a b s t r a c t i nv i e wo fr i s i n gp r i c e so fc r u d eo i ld u et o i n c r e a s i n gf u e ld e m a n d s ，t h en e e df o r a l t e m a t i v es o u c e so fb i o e n e r g yi se x p e c t e dt oi n c r e a s es h a r p l yi nt h ec o m i n gy e a r s a m o n g p o t e n t i a la l t e r n a t i v eb i o e n e r g yr e s o u r c e sl i g n o c e l l u l o s i c sh a v eb e e ni d e n t i v e da st h ep r i m e s o u r c eo fb i o f u e l sa n do t h e rv a l u e - a d d e dp e o d u c t s t h em a j o rg l u c o s ea n dp e n t o s es u g a r s f r o mh y d r o l y s i so fc e l l u l o s ea h dh e m i c e l l u l o s eo fl i g n o c e l l u l o s e sh a sb e e ne x t e n s i v e l y i n v e s t i g a t i o n l - a r a b i n o s e i so n eo ft h e c o m p o s i t i o n o fh e m i c e l l u l o s e b e c a u s e s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a es t r a i n s a r el a c ko fl a r a b i n o s ei s o m e r a s e ，l - r i b u l o k i n a s ea n d l r i b u l o s e 一5 一p h o s p h a t e - 4 - e p i m e r a s e ，t h e yc a n n o tc o n v e r tl - a r a b i n o s ei n t oe t h a n o ld i r e c t l y o u rl a b o r a t o r ys t u d yo nc l o n i n g ，e x p r e s s i o ni ny e a s t s ，a n db i o a c t i v i t ya n a l y s i so f 口f 班 a n d r p e t h es e r i e se s c h e r i c h i ac o l ia r a b a do p e r o no fa i 、r ka n dr p ew e r ec l o n e da n d a m a l g a m a t i o nh i s 6b yp c rt e c h n i c t h e n c o n s t r u c t e di n d u c i b l e e x p r e s s i v e v e c t o r s ( p p i c 9 k - a i 、p p i c 9 k r ka n dp p i c 9 k - r p e ) a n dc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i v ev e c t o r s ( p g a p 9 k - a i a n d p g a p 9 k r p 西 l i n e a r i z e de x p r e s s i v ev e c t o r sw i t hb g l1 1w e r et r a n s f o r m e di n t op i c h i ap a s t o r i sg sl15w i t he l e c t r o p o r a t i o nt e c h n i q u e t h ep o s i t i v et r a n s f o r m a n t sw e r ef i r s td e t e r m i n e db yp e rt e c h n i q u e g 4 18m e t h o dw a su s e dt os c r e e nt h eh i g hc o p yi n t e g r a t i v et r a n s f o r m a n t s t r a n s f o r m a n t sg sll5 ( p p i c 9 k a i ) ，g s115 ( p p i c 9 k 一删，g s115 ( p p i c 9 k r p 矽，g sll5 ( p g a p 9 k a o ，g s ll5 ( p g a p 9 k r p e ) h a db e e no b t a i n e d a l lo ft h o s es t r a i nc a nr e s i s t g 4 1 8i n7 0 0i - t s m l t h ef o r e i g ng e n e sh a db e e ne x p r e s s e di n s h a k i n gf l a s k g s 115 ( p p i c 9 k - a i ) ，g sll5 ( p p i c 9 k - r k ) ，g s ll5 ( p p i c 9 k - r p 力，c a nu t i l i z em e t h a n o la sac a r b o na n dg sll5 ( p g a p 9 k - r p 砂 a n ds115 ( p g a p 9 k a oc a nu t i l i z eg l y c e r o la sac a r b o n s d s p a g ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a t l a r a b i n o s ei s o m e r a s e ，l r i b u l o k i n a s ea n dl r i b u l o s e 一5 一p h o s p h a t e 4 一e p i m e r a s ec a ns e c r e t o r y e x p r e s s i o ns u c c e s s f u l l yi npp a s t o r i s t h e1 - a r a b i n o s ei s o m e r a sa c t i v i t y t e s tw i t l ls u g a r f e r m e n t a t i o nt u b es h o wt h a tr e c o m b i n a t i o np r o t e i nw i t ha c t i v i t y l i n e a r i z e dp g a p 9 k - a ip l a s m i dw i t hb g l1 1w e r et r a n s f o r m e di n t o s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ej l lb ye l e c t r o p o r a t i o nt e c h n i q u e g 418m e t h o dw a su s e dt os c r e e nt h eh i g hc o p yi n t e g r a t i v et r a n s f o r m a n t s e n g i n e e r e ds t r a i nj l l ( p g a p 9 k - a ) h a db e e ne x p r e s s e d i ns h a k i n gf l a s ka n de n z y m ea c t i v i t ya n a l y s i sw i t hs u g a rf e r m e n t a t i o nt u b es h o wt h a t r e c o m b i n a t i o np r o t e i nw i t ha c t i v i t y w ed e s c r i b eh e r et h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o no fg e n eo fl - a r a b i n o s ei s o m e r a s e ，l r i b u l o k i n a s ea n dl - r i b u l o s e - 5 一p h o s p h a t e 一4 一e p i m e r a s ef r o mec o l id h 5 ai np i c h i ap a s t o i i i r i sa n de x p r e s s i o no fg e n eo fl a r a b i n o s ei s o m e r a s ei ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e t t f i s r e s e a r c hh a db u i l tag o o df o u n d a t i o nf o rc o n s t r u c t i o ne n g i n e e r e d & c e r e v i s i a es t r a i n w h i c hu t i l i z ea n dm e t a b o l i c1 - a r a b i n o s ef r o mh e m i c e l l u l o s ed i r e c t l yp r o d u c tb i o e t h a n o l a n dp r o d u c t i o nr e c o m b i n a t i o nl - a r a b i n o s ei s o m e r a s e ，l - r i b u l o k i n a s ea n dl - f i b u l o s e - 5 p h o s p h a t e 一4 - e p i m e r a s ew h i c hu s e dp r o d u c t i o no fe t h a n o lf r o mh e r n i c e l l u l o s e k e yw o r d s ：l - a r a b i n o s e ；i s o m e r a s e ；l - r i b u l o k i n a s e ；l - r i b u l o s e 一5 - p h o s p h a t e - 4 一e p i m e r a s e ；d o n e ； p i c h i ap a s t o r i s ；s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；e x p r e s s i o n ；a c t i v i t y 目录 摘要i a b s t r a c t i 目录v 第一章文献综述1 引言1 1 1 纤维素类生物质制备生物乙醇研究进展1 1 1 1 发展非粮燃料乙醇的必要性2 1 1 2 国内外纤维素乙醇产业化发展现状2 1 1 3 发展燃料乙醇的重要意义4 1 1 4 纤维素乙醇产业化亟待解决的技术问题及发展策略4 1 2 利用木质纤维素发酵生产乙醇的研究意义5 1 2 1 纤维素质原料生产乙醇的原理6 1 2 2 纤维素类物质的组成与结构6 1 2 2 1 纤维素结构与组成6 1 2 2 2 半纤维素结构和组成7 1 2 2 3 木质素结构和组成7 1 2 3 木质纤维素制取燃料乙醇的技术路线8 1 2 3 1 木质纤维素预处理8 1 2 3 2 水解和发酵工艺9 1 2 4 木质纤维及其组成部发酵菌种的选择9 1 2 5l 有关阿拉伯糖的研究1 0 1 2 5 1 【广阿拉伯糖生产乙醇代谢途径1 0 1 2 5 2l 阿拉伯糖异构酶1 l 1 2 5 3l 阿拉伯糖的制备1 l 1 3 酵母表达系统研究进展1 2 1 3 1 酿酒酵母表达系统研究1 2 1 3 2 毕赤酵母研究进展1 3 1 3 2 1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点1 4 1 3 2 2 巴斯德毕赤酵母表达系统的启动子1 5 1 4 立题背景及意义1 6 1 5 技术路线1 7 第二章口f 、r k 、r p e 基因的克隆1 8 2 材料与方法1 8 2 1 实验材料18 2 1 1 菌株和质粒1 8 2 1 2 工具酶、抗生素及试剂1 8 2 1 3 试剂盒18 2 1 4 溶液配制18 2 1 4 1 质粒提取试剂1 8 2 1 4 2 基因组d n a 提取试剂19 2 1 4 3 琼脂糖凝胶电泳1 9 2 1 5 培养基配制1 9 2 1 5 1 大肠杆菌培养基1 9 2 2 实验方法1 9 2 2 1 口f 、r k 、r p e 基因的克隆2 0 2 2 1 1 引物设计2 0 2 2 1 2 模板质粒d n a 的提取2 0 2 2 1 3 细菌基因组d n a 的制备2 1 2 2 1 4 聚合酶链式反应( p c r ) 2 1 2 2 1 5 琼脂糖凝胶电泳2 2 2 2 2p c r 产物回收连接转化测序2 2 2 2 2 1p c r 产物的沉淀回收2 2 2 2 2 2p c r 产物的琼脂糖凝胶回收2 2 2 2 3 表达载体的构建2 3 2 2 3 1p c r 产物及载体质粒d n a 的单酶切2 3 2 2 3 2p c r 产物及载体质粒d n a 的双酶切2 3 2 2 3 3p c r 产物及载体质粒d n a 的酶切回收。2 4 2 2 3 4 目的片段与载体酶切后的连接2 4 2 2 4ec o ，j 删她感受态细胞的制备2 5 2 2 5 转化一2 5 2 2 6 转化子的鉴定。2 5 2 2 7 测序及序列分析2 6 2 3 结果与分析。2 6 2 3 1 含口f 、庸和r p e 基因的毕赤酵母表达载体构建2 6 2 3 1 1 表达载体的构建模式2 6 2 3 2 2 含口f 基因克隆与表达载体的构建2 7 2 3 2 3 含庸基因载体的构建2 8 2 3 2 4 含r p e 基因载体的构建3 0 第三章a i 、r k 、r p e 基因表达3 3 3 材料与方法3 3 3 1 实验材料3 3 3 1 1 菌株。3 3 3 1 2 酵母基本培养基3 3 3 1 3 酵母其他培养基贮存液3 3 3 1 4 发酵所用试剂3 4 3 1 5 蛋白电泳试剂3 5 3 1 6 糖发酵管制作试剂。3 6 3 2 实验方法3 6 3 2 1 毕赤酵母和酿酒酵母的电转化3 6 3 2 1 1 电转化感受态细胞的制作3 6 3 2 1 2 重组质粒线性化3 7 3 2 1 3 电转化。3 7 3 2 3 重组子的鉴定3 8 3 2 3 1 重组酵母基因组提取3 8 3 2 4 高拷贝转化子的筛选3 8 3 2 5 重组酵母的摇瓶发酵表达3 9 3 2 5 1 组成型摇瓶表达3 9 3 2 4 2 诱导型摇瓶表达3 9 3 2 6 重组酵母的生物反应器发酵表达3 9 3 2 7 重组蛋白的检测4 0 3 2 7 1 重组蛋白的初步纯化4 0 3 2 7 2s d s p a g e 分析4 1 3 2 8 酶活测定4 2 3 3 结果与分析4 2 3 3 1 含舐r k 、r p e 基因的毕赤酵母工程菌构建4 2 3 3 1 1 转化毕赤酵母g s l l 5 4 2 3 3 1 2 重组酵母转化子鉴定4 4 3 3 1 3 筛选高拷贝重组转化子= 4 6 3 3 2 摇瓶发酵表达重组蛋白k 4 6 3 3 2 1 诱导型表达蛋白分析4 6 3 3 2 2 组成型表达蛋白分析叫4 8 3 3 3 重组蛋白酶活力测定4 9 3 3 3 1 尸p a s t o r i s 表达产物的酶活测定4 9 3 3 3 2 酿酒酵母表达产物的酶活测定5 0 第四章讨论与结论- 5 1 4 1 讨论51 4 4 1 应用半纤维素的组成成分阿拉伯糖生产乙醇的前景5 1 4 1 2 毕赤酵母蛋白表达方式的选择5 2 4 1 3 毕赤酵母表达外源基因时启动子的应用5 3 4 2 结论5 4 4 2 1 口f 、r k 、r p e 基因的克隆5 4 4 2 2 表达载体的构建5 4 4 2 3 工程菌的构建5 4 4 2 4 摇瓶发酵表达蛋白5 4 4 2 5 酶活力测定5 4 参考文献5 5 附录1 ：缩写词( a b b r e v i a t i o n ) 6 2 附录2 主要实验仪器6 3 附录3l 阿拉伯糖异构酶一级和二级结构分析6 4 致谢6 8 v i 第一章文献综述 引言 当今世界存在着三大危机，即人口爆炸，环境破坏及资源枯竭。这些危机正在日益 向全球范围内蔓延，环境、能源和持续发展已经成为目前世界性的问题。能源是一个国 家经济和社会发展的重要基础，也是各国战略安全的重要组成部分。然而，随着现代工 业、农业和国防科技事业的迅猛发展，人类对能源的消耗量显著增加。据国际能源资料 统计及专家预测，适合经济开采的石油和天然气资源最多可供开采5 0 年，作为核能燃 料的铀矿资源可供开采6 0 年，储量巨大的煤炭也仅供开采3 0 0 年。因此，一场全面的 能源危机己摆在人类面前。7 0 年代和8 0 年代的三次石油危机已充分证明了这一严峻现 实，能源己成为一个国家经济、科技和国防发展的支柱产业。面对煤炭、石油等化石能 源资源日益枯竭、环境污染日益严重以及全球气候变暖的威胁，开发生物质燃料已成为 全球关注的焦点之一( 、a n dl i n2 0 0 9 ) 。生物质能源是蕴含在各类生物质资源中的化 学能，可转化为热能、电能、液体燃料和气体燃料等二次能源。目前，世界上约8 5 的 能源是通过燃烧不可再生的化石燃料石油、天然气和煤来获得的。能源是国民经济的命 脉，它覆盖了化学工业、石油、食品、医药、材料和冶金等诸多领域。化石资源是能源 的主要供给方式，目前正逐步走向衰竭。因此，能源危机将是2 1 世纪人类社会发展所 面临的最大的压力，在矿物资源枯竭之前，人类必须寻找到适宜的可替代能源，而生物 质是唯一可持续再生资源。 1 1 纤维素类生物质制备生物乙醇研究进展 随着科学技术的发展和机械化程度的提高，以及能源需求和油价持续上升，燃料能 源短缺现象日趋严重。人类越来越认识到寻求可再生清洁能源和能源的多元化的迫切 性。开发石化能源的替代品已成为全世界关注的焦点。生物质是唯一可以转化为液体燃 料的可再生资源，将生物质转化为液体燃料，不仅能够弥补化石燃料的不足，而且有助 于保护生态环境。其中由生物质生产的燃料乙醇以其可再生性、无污染性、不引起温室 效应和提高汽车的防爆性能等特点而被公认为最有工业应用前景的可再生能源之一，得 到了广泛的研究。( y u a n ，t i l l e re ta 1 2 0 0 8 ) 自1 9 1 0 年h e i n e r c h 等首次利用木材经酸水解 生产纤维素乙醇以来，纤维素乙醇作为一种清洁的可再生燃料，已经经历了近百年的历 史。当前，世界石油资源紧缺、石油价格的波动和温室效应的压力使纤维素乙醇作为 一绿色可再生能源倍受关注。 纤维素乙醇来源于秸秆、草皮、树皮和城市垃圾等，在解决能源短缺问题的同时， 又有助于解决环境污染问题，一举两得。纤维素乙醇与利用玉米等农作物提取乙醇的传 统方法相比，不存在与人争粮的问题，其产业化更可以变废为宝。纤维素乙醇在燃烧时 1 产生的能量高于生产时消耗的能量，燃烧时温室气体排放量不仅比汽油减少9 0 ，而 且远低于谷物类乙醇燃料，避免了温室效应现象( s u k u m a r a n ，s i n g h a n i ae ta 1 2 0 0 9 ) 。 1 1 1 发展非粮燃料乙醇的必要性 在全球化石能源渐趋枯竭，环境压力日益沉重的时代背景下，以及在对可持续发展、 保护环境和发展循环经济的追求中，全球各国也出于加强能源安全、减少温室气体排放 和促进农业发展等多方面的考虑，已经将目光聚焦到丰富的、可再生的纤维素为原料， 生产更加安全、环保和高性价比的能源，以期部分替代化石能源和石化产品。在这种环 境中，发展生物能源己成为不可逆转的新趋势，它将是一个未来的主要选择。尽管将生 物有机质转化为燃料的构想早在内燃机诞生之日就有了，围绕生物燃料的各种探索也从 未间断过。但直到今天，生物能源的应用才有了广泛的实践，相关技术也开始日益成熟。 用纤维质原料生产乙醇是未来燃料乙醇的发展方向。 乙醇( 俗称酒精) 是一种重要的工业原料。广泛应用于化工、食品、饮料工业、军 工、日用化工和医药卫生等领域。并且乙醇作为一种优良的燃料可以提高燃油品质。鉴 于世界石油需求增长和油价暴涨，各国不得不加速发展替代能源，其中生物乙醇需求和 发展尤为显著。燃料乙醇制造多以粮食等农作物为原料，属于可再生能源，具有可持续 发展的意义。但生产生物乙醇的原料，目前主要是粮食和糖料，存在成本高、与民争粮 ( 争地) 等问题。将来生物乙醇的根本出路在于用农作物秸秆、木屑等纤维素为原料的 方法。这就需要将发酵工程、酶工程和代谢工程这些工程的综合的整体进行优化，并且 能通过一些新技术将木质纤维产业化( h a h n h a g e r d a l ，g a l b ee ta 1 2 0 0 6 ) 。 发展生物乙醇的前提条件之一是稳定的原料生产及供应。尽管从长远来看，以木质 纤维素为原料生产生物乙醇的潜力巨大，但当前的原料主要还是依靠糖和淀粉( t u r h a n 。 b i a l k ae ta 1 2 0 1 0 ) 从可持续发展和能源安全的角度看，我国需要加快生物质燃料乙醇的 开发，从国家粮食安全的角度考虑，我们不能把玉米、小麦等主要粮食作物大量用于燃料 乙醇的生产，而是要突破以玉米、小麦等陈化粮为生产原料的瓶颈，寻找适合燃料乙醇 生产发展所需要的非粮其他原料( h o y e r , g a l b ee ta 1 2 0 0 9 ) 。为避免对粮食生产威胁，我 国发展燃料乙醇也正在从粮食为主的原料路线向非粮转变。 1 1 2 国内外纤维素乙醇产业化发展现状 1 ) 国外纤维素乙醇产业化发展现状 美国在将纤维质转化为燃料酒精的研究、生产和应用方面走在了世界的前列。1 9 9 8 年1 0 月第一家商业性转化纤维质为酒精的工厂是以蔗渣和稻壳为原料，年产酒精2 0 x 1 0 6 加仑，先进技术的应用使生产燃料乙醇的成本降低了2 3 ( f u l t o ne ta 1 2 0 0 4 ；张以祥等 2 0 0 4 ) ，除此之外，加利福尼亚和纽约用城市垃圾生产酒精的建厂计划亦在进行中。其 次，加拿大纤维质燃料乙醇工业一直处于领先地位。i o g e n 和s u n o p t a 公司都是生物技术 2 公司，主要开发纤维素酶技术，其中i o g e n 公司是首家纤维质乙醇工业化公司，处于世界 领先地位。采用的技术是用稀酸结合蒸汽气爆预处理半纤维素，年产3 2 万升乙醇。而 s u n o p t a 公司同样在世界范围内的纤维质原料转化乙醇技术上，处于领先地位( s u ny e t a 1 2 0 0 2 ) 。日本全国每年有1 0 0 0 万吨废木屑，不少企业利用自行开发的技术或引进美 国技术开展了以废木屑为原料生产燃料乙醇的工业试验。2 0 0 3 年5 月投资5 亿日元建成工 试，目前日产乙醇2 5 0 t 。试成后拟建2 0 0t d 的商用装置，成本目标为2 5 日元l ，将低于 美国现有水平。a b e n g o a 是欧洲最大的乙醇生产厂，同时也是世界排名第二的生产厂家， 是以小麦秸秆为原料生产乙醇的瑞典生产商。目前，a b e n g o a 的目标是在2 0 11 年前使该 技术商业化。瑞典e t e k 中试乙醇厂日产量4 0 0 - - 5 0 0 升乙醇，每日需要消耗锯末或其他纤 维质原料2 t ( 以干物质计) 。根据瑞典原材料的成本计算乙醇价格为每升0 3 5 - - 0 4 5 欧元， 但从长远角度考虑，纤维素生产乙醇作为能源前景比较可观。 2 ) 我国纤维素乙醇产业化发展现状 我国燃料乙醇起步较晚，但是发展迅速，已成为继巴西、美国之后世界第三大燃料 乙醇生产国。目前我国有一些科研机构、大学和企业在这方面也开始了研发工作，取得 了一些进展。河南天冠集团2 0 0 6 年6 月2 6 日建成投产了我国首条秸秆乙醇中试生产线， 秭 标志着我国在生物质能源利用领域已跻身世界行列。目前，河南天冠集团成功开发了新 ” 型乙醇发酵设备，可明显缩短发酵周期。同时天冠集团将在稳定中试生产线的基础上， 通过优化工艺以秸秆生产乙醇的成本可望与粮食生产乙醇基本持平。上海华东理工大学 能源化工系，已建成年产燃料乙醇6 0 0 t 的示范工厂，正在研究如何将其产业化。现在的 技术还不够完善，市场竞争力小。在十一五期间，将进一步扩大规模，达到年产燃料乙 醇3 0 0 0 - - 6 0 0 0 t 。同时还将围绕降低成本和规模化生产展开研究，使其在经济上更具有竞 ：j 争力。黑龙江肇东金玉乙醇有限公司已进行了3 0 0 t 的玉米秸秆制乙醇的中试。吉林轻工 业设计研究院吉林沱牌农产品开发公司与丹麦瑞速国家实验室合作研究玉米秸秆湿氧 化预处理生产乙醇，2 0 0 3 年开始，2 0 0 5 年阶段性鉴定，规模为1 0l 发酵罐全自动发酵乙 醇，2 0 0 6 年在此基础上进行了改进创新，并自主创新建成具有国际先进水平的实验室纤 维质原料预处理装置。河北农业大学食品科技学院实验室研究用c 0 2 爆破法对纤维物质 预处理后用稀酸水解半纤维素，然后用酶法水解纤维素转化为单糖，发酵乙醇。江南大 学生物工程系实验室试验：以玉米芯先浓酸后稀酸水解得糖率为8 1 ，石灰中和后，接 种酵母发酵生产乙醇，题为酸两步水解法。山东大学微生物技术国家重点实验室开展纤 维素原料转化乙醇关键技术研究。用基因手段提高产酶量或改进酶系组成、纤维素酶生 产技术、天然废物利用策略等研究。安徽丰原集团全力拓展燃料乙醇生产所需原料和相 关技术的创新，并与国内相关高校和科研院所合作进行系统工程研究。 3 1 1 3 发展燃料乙醇的重要意义 面对世界人口的急剧膨胀和粮食短缺，用粮食生产乙醇的发展将受到限制。纤维素 原料制取燃料乙醇是一个具有巨大潜力的新领域，实现了废物资源化、无害化、减量化。 纤维素类资源如稻草、玉米秸秆、麦秸、蔗渣及森林工业副产品等有机废弃物具有来源 丰富，品种多，再生时间短等优点( p r o c h n o w ，h e i e r m a n ne ta 1 2 0 0 9 ) 随着科学技术发展， 纤维素废物乙醇发酵实现工业化将成为现实，具有十分重要的现实意义。 1 ) 保障能源安全 随着经济建设尤其是汽车工业的迅猛发展，我国对汽油的需求量日益增多，与此同 时，我国已成为石油消费和进口大国，石油资源短缺日益严重，石油价格全面上涨，大 量进口石油对我国的能源安全造成极大威胁。降低国家经济发展对石油进口的依赖性， 增强国家能源安全保证，促进可循环发展，推进生物质能源的可持续发展。 2 ) 可增加农民的收入、推动区域经济的发展 纤维素燃料乙醇可充分利用农业废弃物( 作物秸秆等) 作为原料，有效延长农业产 业链，开辟一条新的可再生绿色能源道路。使粮食由农业作物向经济作物转化，能够促 进农业和农村经济结构战略性调整并带动相关产业的发展。有效解决粮食深加工问题， 具有十分重要的意义。 3 ) 保障粮食安全 在人口急速增长、耕地面积迅速减少、汽车保有量迅速增加、化石能源日益紧张的 今天，国家利用发展燃料乙醇作为调控粮食市场的有效手段，这对于稳定粮价、增加农 民收入具有积极意义，生物质原料制备燃料乙醇也具有深远的现实意义( 袁敬伟2 0 0 9 ) 。 4 ) 有利于环境保护 由于环境的恶化，温室效应、沙尘暴、酸雨等已给我们赖以生存与发展的地球带来 严重危害和汽车工业的迅速发展，汽车尾气对大气环境的污染在逐年增加。大量使用生 物燃油对中国大气环境的保护和改善有着突出的意义。与石化燃料相比，生物燃油的使 用很少产生n o x 和s o 。等大气污染物；由于生物质c 0 2 的吸收和排放在自然界形成碳循 环，其能源利用导致的c 0 2 排放远低于常规能源，以至不易造成温室气体的产生 ( s i l a l e r t r u k s a , g h e e w a l ae ta 1 2 0 0 9 ) 。 1 1 4 纤维素乙醇产业化亟待解决的技术问题及发展策略 纤维素乙醇以可再生的生物质作为原料，它既不同于石化能源的不可再生性，又不 会如石化能源那样大量排放温室气体造成环境污染。因此具有传统能源无可比拟的优越 性，是未来能源的新宠。同时以木质纤维素为原料的第二代生物质燃料开发既是全球研 发的热点也是难点。欧盟国家和美国的中长期生物质能源发展路