（物理化学专业论文）酶催化的叶酸辅酶转移—碳单元的理论研究.pdf

山东大学博士学位论文 摘要 酶催化的一碳单元转移反应是生命体内的一个重要过程。在该过程中四 氢叶酸( t e t r a h y d r o f o l a t e ，t h f ) 以辅酶的身份参与了反应，虽然在不同的一 碳单元转移反应中起催化作用的酶各不相同，但是与之相关的辅酶只有四氢 叶酸和生物素两种，它们的主要功能是接受甲醇态、甲醛态、甲酸态以及二 氧化碳等各氧化态的一碳单元，并把它们转移给适当的受体。生物体内一碳 单元( 如甲基c h 3 一，次甲基c h 2 = ，亚甲基c h ；，甲酰基o = c h 一，亚氨甲基 n h = c h 一，羟甲基h o c h 2 一，脒基n h = c ( n h 2 ) 一等) 的转移反应大多数是在叶 酸辅酶的参与下进行的。叶酸辅酶在反应过程不仅可以作为一碳单元的载体， 而且还是细胞内许多物质( 包括d n a 和r n a ) 甲基化的直接甲基源。研究 一碳单元的转移反应，能够使人们认清生物合成和代谢过程的化学本质，从 而用于指导药物的设计与合成。 从二十世纪八十年代起人们开始了对酶催化一碳单元转移反应的广泛 研究，最初的研究主要集中于模型化合物的合成与反应上。在生物体内真正 的酶催化反应方面，生物工作者们从晶体学方面入手，也做了大量的工作。 由于酶催化反应是一种快速反应，实验上无法观测到整个酶催化过程，给实 验研究带来一定难度，难以用传统的实验方法测得确切而详细的反应机理， 随着计算技术的发展，我们有可能在理论上用各种计算手段得到酶催化反应 过程的各个中间体构型，通过分析这些构型特点及反应过程的能量变化就可 以得到酶催化机理。 康从民等用量子力学方法研究了一系列模型化合物的一碳单元转移反 应，他们通过分析反应过程的构型及能量变化，得出了模型化合物的一碳单 元转移反应的一般过程，并推测了这些模型化合物的反应机理。本篇论文继 续从理论上研究碳单元转移反应。一方面，研究了更多的模型化合物，另 一方面，使模型化合物更接近于生物体内的真实反应。通过对这些反应体系 的研究，得出了一些具有指导意义的结论，为以后理论上和实验上更系统、 更全面、更彻底地研究该类反应奠定了基础。 山东大学博士学位论文 本论文萸分f l 部分： 第一部分介绍了研究的方法，简要介绍了量子力学、分子力学理论发展 概况并对这些理论方法做了简单描述。分类归纳了生物体内的一碳单元转移 反应的各种类型，对酶催化一碳单元反应的研究现状做了评述。 第二部分用分层计算法研究了5 ，1 0 - c h 2 t h f 模型向脲嘧啶脱氧核糖核 营( 一磷) 酸( 2 - d e o x y u r i d i n e5 m o n o p h o s p h a t e ，d u m p ) 简化模型转移甲 醛态一碳单元的反应过程，由于该反应中质子转移有三条不同的路径，所以 一碳单元的转移过程也有三条路径。三条路径的能量变化表明，一碳单元转 移反应中的速度控制步是质子转移步。通过比较三条路径的质子转移势垒， 得出质子的直接转移是最佳的反应方式。从而得到了一碳单元的最佳转移途 径。 第三部分主要用密度泛函理论b 3 l y p 方法在6 - 3 1 g 基组水平上优化计 算了5 ，1 0 - c h + t h f 的一系列模型化合物与甲胺的反应过程，对不同的四氢 叶酸模型化合物的计算分析发现，它们的活性部位均在五元咪唑啉环上，并 且它们与甲胺反应的过程是相似的，都经历了亲核反应、质子转移、键断裂 等过程，其中质子转移反应的势垒最高，是反应的速度控制步，由此得出了 一碳单元转移反应需要一般的酸碱催化。该部分的最后一节讨论了5 ， 1 0 - c h + 一t h f 与具有两个亲核中心的邻苯二胺分子的反应，该反应的反应步 骤较多，且反应过程较前几节的体系复杂，但主要步骤是一样的，都经历了 亲核反应、质子转移和键断裂等过程，并且得出的结论是一致的，即质子转 移反应是反应的速度控制步。本部分对模型化合物的研究所得结论为研究非 模型类化合物的一碳单元转移提供了依据。 第四部分以生物体内d u m p 与5 ，1 0 c h 2 t h f 的真实反应体系作为研究 对象，模拟了生物体内d u m p 在辅酶5 ，1 0 - c h 2 一t h f 作用下甲基化为胸腺嘧 啶脱氧核糖核苷一磷酸( 2 - d e o x y t h y m i d i n e5 - m o n o p h o s p h a t e ，d t m p ) 的反应 过程。对该反应的研究采用了分层计算的o n i o m 方法。该反应过程中产生 的中间体复合物的立体构象与实验上测定的抑制剂三元复合物相同组成部 分的构象非常相似。由此说明该反应尽管没有酶参与催化，但是反应过程与 生物体内真正的反应过程是一致的。计算表明该反应的的最高反应势垒较 山东大学博士学位论文 高，这又从侧面反映了酶在反应中的重要催化地位。 论文的第五部分以小的酶片段参与的d u m p 亚甲基化的反应作为研究对 象，模拟了胸苷酸合成酶催化的四氢叶酸辅酶将d u m p 甲基化为d t m p 的反 应过程。酶片段参与前后的反应势垒差别较大，有酶片段参与的反应势垒较 无酶时低4 0 一5 0 k j m o l 。并且经过分析还可以发现在反应初始阶段以及亚甲 基转移完成后的复合物中底物辅酶与酶的氨基酸片段之间形成了氢键的空 间网状结构。从而得出了胸苷酸合成酶在d u m p 甲基化为d t m p 的过程中所 起的重要催化作用。它的催化作用不仅表现在活化d u m p 的c 5 位原予使亲 核反应易于发生，而且通过氢键的网状结构固定了底物与辅酶的相对位置， 使亲核反应之后的质子转移等反应过程易于进行。 本论文应用量子力学及分子力学理论方法主要研究了甲酸态及甲醛态 碳单元转移过程。主要得出了以下一些具有创新性的成果： 一、通过模型化合物一碳单元转移反应的计算研究，从理论上得出了质 子转移在一碳单元转移反应中的决定性地位，并由此得出了一碳单元转移需 要一般酸碱催化来实现这一结论。与实验上模型化合物的反应条件吻合。 在四氢叶酸模型化合物的实验研究中，实验工作者们通过分析实验过程 中产生的各化合物的组成，并根据实验发生的条件，推测在一碳单元转移反 应中质子转移步为速度控制步。本篇论文通过对四氢叶酸模型化合物的研 究，得出了模型化合物的一碳单元转移是一个多步反应，它需要亲核反应， 质子转移、五元眯唑啉的开环等过程才能完成一碳单元转移。在这些过程中， 质子转移过程的能垒最高，从而用理论计算方法证明了质子转移确是一碳单 元转移过程中的速度控制步。 二、通过胸苷酸合成酶( 胸腺嘧啶脱氧核糖核苷一磷酸合成酶， t h y m i d y l a t es y n t h a s e ，t s ，e c 2 1 1 4 5 ) 片段参与的脲嘧啶脱氧核糖核苷( 一 磷) 酸( 2 d e o x y u r i d i n e5 - m o n o p h o s p h a t e ，d u m p ) 亚甲基化过程的研究， 从理论上得出了胸苷酸合成酶在反应中的重要催化作用，即在反应过程中它 可以通过激活底物降低反应势垒，起到催化的目的。 在胸苷酸合成酶催化作用下5 ，1 0 - c h 2 一t h f 中的亚甲基就会转移给 山东大学博士学位论文 d u m p ，转移后的亚甲基在四氢叶酸的还原下变成甲基，d u m p 便完成了向 d t m p 的转化。在计算方法完全一样的情况下得出有酶片段参与的反应势垒 比没有酶片段参与的反应势垒低4 6 k j m o l ，因此说明酶片段的参与激活了 d u m p 的c 5 位原子。由此说明了酶在该一碳单元转移反应中的重要催化作 用。 三、生物体内发生的一切反应几乎都有酶的催化。酶的催化表现在很多 方面，一方面酶可以激活反应的活性部位，另一个方面，通过酶的氨基酸片 段与底物之间形成的氢键的空间网状结构将底物和辅酶固定在适当位置，使 反应易于反应。通过计算发现，底物和四氢叶酸确实与胸苷酸合成酶的部分 氨基酸片段之间形成了氢键，这些氢键在空间上相互交错，将反应物和底物 固定在适当位置，使在整个反应过程中，底物和辅酶都能够充分接触，加速 了反应的进程。亚甲基转移前后三元复合物的氢键组成几乎没有改变，由此 说明，氢键在整个反应中都发挥着作用。 几乎所有的生命物体中都存在酶催化的一碳单元转移反应，生物体内嘌 呤、嘧啶、胸苷酸的合成，氨基酸的代谢以及细胞内许多物质( 包括d n a 和r n a ) 的甲基化过程都伴随着一碳单元的转移反应。大多数酶催化的一碳 单元转移反应必须有辅酶提供一碳单元才能发生。有辅酶参与的一碳单元转 移反应的特点是反应步骤多、反应复杂且反应过程中间体难以探测等特点。 单从实验上对其进行研究显然是不够的，本论文对辅酶参与的酶催化一碳单 元转移反应用理论方法进行了初步的探讨，并得出几点具有创新性的结论， 为今后更系统更全面的理论研究奠定了基础，并为实验研究提供参考。 j 淦文主题词：一碳单元转移，胸苷酸合成酶( t s ) ，脲嘧啶脱氧核糖核苷 酸( d u m p ) ，理论计算，o n i o m 方法 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t e n z y r m a t i c o n ec a r b o nu n i t t r a n s f e ri s a ni m p o r t a n tp r o c e s si nv i v o o f a l m o s ta l ll i v i n g s t e t r a h y d r o f o l a t et a k e sp a r ti nt h er e a c t i o n a sac o e n z y m ei n t h i sp r o c e s s a l t h o u g ht h ee n z y m ec a t a l y z i n gd i f f e r e n to n ec a r b o nu n i tt r a n s f e r i s d i f f e r e n t ，c o r r e l a t i n g w i t ht h e mt h e r ea r e o n l y t w o c o e n z y m e s t e t r a h y d r o f o l a t ea n db i o t i n t h e i rf u n c t i o n i st o a c c e p ta l l k i n d so fo x i d a t i o n s t a t eo fo n ec a r b o nu n i ts u c ha sm e t h y l a t e ，f o r m a l d e h y d a t e ，f o r m a t ea n dc a r b o n d i o x i d a t ea n dt r a n s f e rt h e mt oa na p p r o p r i a t ea c c e p t o r m o s to ft h eo n ec a r b o n u n i t ( s u c h a sc h 3 一，c h 2 = ，c h - = ，o = c h - ，n h = c h ，h o c h 2 - ，n h 2 c ( n h 2 ) - ) t r a n s f e rr e a c t i o n si nv i v ot a k e p l a c e w i t ht h e t e t r a h y d r o f o l a t ec o e n z y m e p a r t i c i p a t i n gi n i nt h er e a c t i o n ，t e t r a h y d r o f o l a t ep a r t i c i p a t e sn o to n l ya s ao n e c a r b o nu n i tc a r r i e rb u ta l s oa sad i r e c tm e t h y lr e s o u r c ef o rm a n ym a t t e r ss u c ha s d n aa n dr n ai nc e l l s b ys t u d y i n go n ec a r b o nu n i tt r a n s f e ro n ec a nr e c o g n i z e t h e c h e m i s t r y e s s e n c eo fb i o s y n t h e s i s i n ga n dm e t a b o l i z i n gp r o c e s st h a t h a s t h e o r yi n s t r u c t i o ns i g n i f i c a n c ei nd e s i g n i n ga n ds y n t h e s i z i n gd r u g g e r y b i o m i m e t i cc h e m i s t r yo f e n z y m a t i co n ec a r b o nu n i tt r a n s f e rr e a c t i o na r i s e s f r o ml9 8 0 s ，a tt h a tt i m et h es t u d ym a i n l yf o c u s e do ns y n t h e s i sa n dr e a c t i o no f t e t r a h y d r o f o l a t em o d e lc o m p o u n d s f o rs t u d y i n gt h ee n z y m a t i co n ec a r b o nu n i t t r a n s f e rr e a c t i o ni nv i v o ，b i o c h e m i s t ss t a r tw i t hc r y s t a l l o g r a p h ya n dh a v ed o n ea l o to fe x p e r i m e n t b e c a u s ee n z y m a t i co n ec a r b o nu n i tt r a n s f e rr e a c t sr a p i d l y ， s o m ei n t e r m e d i a t e sp r o d u c e di nt h er e a c t i o np r o c e s sc a n tb ed e t e c t e d w h i c h b r i n g sc e r t a i nd i f f i c u l t yt oe x p e r i m e n t a ls t u d y ，w h i l et h i sp r o b l e md o e sn o te x i s t i nt h e o r e t i c a ls t u d y m a n yt h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o nm e t h o d sc a nb eu s e dt og e ta l l i n t e r m e d i a t e s p r o d u c e d i nt h e e n z y m a t i c o n ec a r b o nu n i tt r a n s f e rr e a c t i o n p r o c e s s b ya n a l y z i n gt h ec o n f i g u r a t i o no ft h e i n t e r m e d i a t e sa n dt h er e l a t i v e e n e r g y v a r i a t i o n a l o n gt h e r e a c t i o n p r o c e s s ，o n e c a n g e t t h e e n z y m a t i co n e c a r b o nu n i tt r a n s f e rm e c h a n is m 山东大学博士学位论文 h _ _ _ _ 一一 k a n gc o n g m i ne t c i n v e s t i g a t e d t h eo n ec a r b o nu n i tt r a n s f e rr e a c t i o no f m o d e lc o m p o u n d sw i t ht h e o r e t i c a lm e t h o da n do b t a i n e dt h eg e n e r a lo n ec a r b o n u n i tt r a n s f e rp r o c e s sa n dm e c h a n i s m i nt h i sd is s e r t a t i o nw ec o n t i n u et os t u d y o n ec a r b o nu n i tt r a ns f e rr e a c t i o nw i t ht h e o r e t i c a lm e t h o d t h er e s e a r c hf i e l d c o n s i s t so fn o to n l yt e t r a h y d r o f o l a t em o d e lc o m p o u n d sb u ta l s or e a lr e a c t i o n si n v i v o f r o mt h e o r ys t u d y ，w eh a v ea c q u i r e ds o m ei n s t r u c t i n gc o n c l u s i o nt h a tc a n l a yf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs y s t e m i ca n dt h o r o u g hs t u d y t h i sd i s s e r t a t i o ni sd i v i d e di n t of i v ec h a p t e r s ： i nc h a p t e r1 ，t h et h e o r e t i c a lm e t h o do fq u a n t u mm e c h a n i c sa n dm o l e c u l a r m e c h a n i c sa r ei n t r o d u c e da n dw e r e t r o s p e c tb r i e f l y t h e i r p r o c e s s o ft h e i r e v o l u t i o n i nt h i s p a r t ，o n e c a r b o nu n i tt r a n s f e rr e a c t i o ni sc l a s s i f i e dt ob e d i s c u s s e d ，a n dt h ep r e s e n ts t u d ys t a t u so ft h ee n z y m a t i co n ec a r b o nu n i tt r a n s f e r i sr e v i e w e d i n c h a p t e r2 ，o n i o mm u l t i l a y e rq u a n t u mm e c h a n i c s m e t h o di su s e dt o i m i t a t et h er e a c t i o no f5 ，1 0 - c h 2 t h fm o d e lt r a n s f e r r i n go n ec a r b o nu n i to n f o r m a l d e h y d e o x i d a t i o ns t a t et o 2 - d e o x y u r i d i n e - 5 一m o n o p h o s p h a t e ( d u m p ) m o d e l t h e r ea r et h r e ep o s s i b l ed i f f e r e n tp r o t o nt r a n s f e rp a t h si nt h i sr e a c t i o n s ot h e r es h o u l db et h r e ep o s s i b l ed i f f e r e n to n ec a r b o nu n i tt r a n s f e rr o u t e s t h e e n e r g yv a r i a t i o na l o n gt h et h r e ed i f f e r e n tp a t h ss h o w st h a tt h er a t e l i m i t i n gs t e p o ft h i sr e a c t i o ni sp r o t o nt r a n s f e r b yc o m p a r i s o no ft h eh i g h e s te n e r g yv a l u eo f t h r e ed i f f e r e n tp a t h s ，i tc a nb ec o n c l u d e dt h a tt h ed i r e c tp r o t o nt r a n s f e ri st h e o p t i m u m o n e i n c h a p t e r3 ，t h eb 3 l y pm e t h o do nt h e b a s i so f6 - 31 g + s e ti su s e dt o o p t i m i z e as e r i e so fr e a c t i o no f5 10 - c h + - t e t r a h y d r o f o l a t em o d e l s w i t h m e t h y l a m i n e 。b ya n a l y z i n gt h ec a l c u l a t i o nr e s u l t so fd i f f e r e n tr e a c t i v es y s t e m s ， w ec a nf i n dt h ea c t i v ep o s i t i o n so fa l lm o d e l sa r ea l lo nt h ef i v e - m e m b e r r i n go f i m i d a z o l i u m t h e i rr e a c t i o nc o u r s e sa r es i m i l a ra n dt h e ya l l p a s st h r o u g ht h e s t e p s o fn u c l e o p h i l i c r e a c t i o n ，p r o t o nt r a n s f e r a n db o n d sr u p t u r ea n ds oo n v 山东大学博士学位论文 a m o n g a l lt h ep r o c e s s e sm e n t i o n e da b o v e ，t h eh i g h e s te n e r g yb a r r i e ra p p e a r si n t h e p r o t o n t r a n s f e r p r o c e s s ，i t m e a n st h a tt h e p r o t o n t r a n s f e r s t e p i st h e r a t e l i m i t i n g o n e s ow ec a nc o n c l u d e t h a to n ec a r b o nu n i t t r a n s f e rn e e d s g e n e r a la c i d - b a s et oc a t a l y z ei t a tt h el a s tp a r to f t h i s c h a p t e r ，t h er e a c t i o no f 5 ，10 - c h + t h fw i t h1 ，2 - d i a m i n o b e n z e n e ，w h i c hh a st w on u c l e o p h i l i cp o s i t i o n s ， i sc a l c u l a t e da n dd i s c u s s e d t h i sr e a c t i o nh a sm o r er e a c t i o n s t e p s a n di t s r e a c t i o n p r o c e s s i sm o r ec o m p l e xt h a nt h eo t h e rs y s t e m sd i s c u s s e di n t h i s c h a p t e r ，b u tt h em a i ns t e p sa r et h es a m e t h e ya r en u c l e o p h i l i cr e a c t i o n ，p r o t o n t r a n s f e ra n db o n dr u p t u r e f r o mt h i sr e a c t i o n ，t h es a m ec o n c l u s i o ni sg o tt h a tt h e p r o t o nt r a n s f e rs t e pi sr a t e l i m i t i n go n e ，w h i c hp r o v i d e se v i d e n c ef o rf u r t h e r s t u d yo ns u c ho n ec a r b o nu n i tt r a n s f e rr e a c t i o n i nc h a p t e r4 ，t h er e a c t i o no fd u m pw i t h5 ，10 - c i - 1 2 - t h fi ss t u d i e dt om i m i c t h er e a lm e t h y l a t i o nr e a c t i o no fd u m pt o 2 - d e o x y t h y m i d i n e5 m o n o p h o s p h a t e ( d t m p ) u n d e rt h e c o n t r i b u t i o no f 5 ，1 0 - c h 2 一t h f i nv i v o t h e m u l t i l a y e r c a l c u l a t i o nm e t h o di s e m p l o y e dt os t u d yt h e w h o l er e a c t i o n p r o c e s s o ft h i s s y s t e m t h ec o n f o r m a t i o no fi n t e r m e d i a t ec o m p o u n dp r o d u c e di nt h ec o u r s eo f t h er e a c t i o ni si d e n t i c a lw i t ht h es a m e c o m p o s i t i o n i nt h e t e r n a r yc o m p l e x e t s - f d u m p 一5 ，10 - c h 2 一t h fc o e n z y m e i ti n d i c a t e st h a tt h er e a c t i o nc o u r s eo f t h i ss y s t e mi sc o n s i s t e n tw i t ht h es a m er e a c t i o no ft h er e a l e n z y m a t i co n e b y a n a l y z i n gt h ec a l c u l a t i o nr e s u l t sw e c a nf i n dt h eh i g h e s te n e r g yb a r r i e ra l o n gt h e r e a c t i o np a t hi s h i g h e r ，w h i c hi m p l i e st h es i g n i f i c a n c eo fe n z y m ei nr e a c t i o n i n d i r e c t l y c h a p t e r5m a i n l yd i s c u s s e st h em e t h y l e n a t i o nr e a c t i o no fd u m pw i t ht h e a m i n oa c i dr e s i d u eo f t h y m i d y l a t es y n t h a s e ( t s ) t a k i n gp a r ti n f o rt a k i n gi n t o a c c o u n tp a r to fe n z y m e ，t h i sr e a c t i o nh a si m i t a t e dt h es a m er e a c t i o n c a t a l y z e d b y t h ew h o l et sm o l e c u l ei nv i v o i t c a nb ef o u n db y c o m p a r i s o nt h a t t h e d i f f e r e n c eo ft h e e n e r g yb a r r i e r so ft h et w or e a c t i o n sw i t ho rw i t h o u te n z y m e s e g m e n t i s v e r yl a r g e ，t h ee n e r g y b a r r i e ro ft h er e a c t i o nw i t h e n z y m e i s 4 0 5 0 k j m o ll o w e rt h a nt h a to ft h er e a c t i o nw i t h o u te n z y m e t h ei n t e r m e d i a t e s 山东大学博士学位论文 e m e r g i n ga t t h e b e g i n n i n ga n dt h e e n do ft h em e t h y l e n et r a n s f e rr e a c t i o nh a s f o r r e e dt h r e e d i m e n s i o n a lr e t i c u l a t eh b o n d s c o n f o r m a t i o n s ot h ec o n c l u s i o n c a nb ea r r i v e da tt h a tt sh a ss i g n i f i c a n c ei nt h er e a c t i o no fd u m pm e t h y l a t i o n r e a c t i o n b ya n a l y z i n gi t c a nb ec o n c l u d e dt h a tt h ef u n c t i o no ft si se x p r e s s e d n o to n l yi na c t i v a t i n gt h e5 - p o s i t i o na t o mo fp y r i m i d i n er i n go fd u m p b u ta l s o i nt h a ti tc a nf i xt h er e l a t i v ep o s i t i o no fs u b s t r a t ea n dc o e n z y m ei n as u i t a b l e p o s i t i o nb yh b o n d st om a k e t h er e a c t i o nt a k ep l a c ee a s i l y i nt h i s p a p e rt h eq u a n t u mm e c h a n i c sa n dm o l e c u l a rm e c h a n i c st h e o r e t i c a l m e t h o da r eu s e dt o s t u d y o n ec a r b o nu n i tt r a n s f e ro n f o r m a l d e h y d a t e a n d f o r m a t es t a t e s t h em o s tv a l u a b l er e s u l t si nt h i st h e s i sc a nb es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1 f r o mt h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o no ft h er e a c t i o no ft h et e t r a h y d r o f o l a t em o d e l c o m p o u n d s ，t h ei d e at h a tt h ep r o t o n t r a n s f e rh a st h ed e c i s i v ep o s i t i o ni nt h eo n e c a r b o nu n i tt r a n s f e rc a nb eo b t a i n e da n di ta l s oc a nb ec o n c l u d e dt h a to n ec a r b o n u n i tt r a n s f e rn e e d sg e n e r a la c i d b a s et o c a t a l y z ei t ，w h i c hc o i n c i d e sw i t ht h e e x p e r i m e n tc o n d i t i o n d u r i n gt h es t u d yo fo n ec a r b o nu n i tt r a n s f e ro ft h et e t r a h y d r o f o l a t em o d e l c o m p o u n d s ，c h e m i s t s a s s u m e dt h a t a m o n gt h e r e a c t i o n p r o c e s s t h e p r o t o n t r a n s f e rs t e pi st h er a t e l i m i t i n gs t e pa c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n sa n d b ya n a l y z i n gt h ec o m p o s i t i o no f t h ec o m p o a n d sp r o d u c e dd u r i n gt h ee x p e r i m e n t p r o c e s s i nt h i sd i s s e r t a t i o nw ef i n db yt h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o nt h a tt h er e a c t i o n o ft h et e t r a h y d r o f o l a t em o d e lc o m p o u n d si sam u l t i s t e po n ea n di t u n d e r g o e s n u c l e o p h i l i ca t t a c k i n g ，p r o t o nt r a n s f e r r i n g ，f i v e - m e m b e r i m i d a z o l i n e c y c l e c l e a v i n ga n d s oo nt oc o m p l e t eo n ec a r b o nu n i tt r a n s f e r a m o n ga l lt h e s t e p s ，t h e p r o t o nt r a n s f e rh a st h eh i g h e s te n e r g yb a r r i e r ，w h i c hd e m o n s t r a t e st h a tp r o t o n t r a n s f e rs t e pi sar a t e l i m i t i n go n ed u r i n gt h eo n ec a r b o nu n i tt r a n s f e r 2 ，b yc o m p a r i s o n o fd u m p m e t h y l e n a t i o n r e a c t i o nu n d e rd i f f e r e n t c o n d i t i o n sw i t ho rw i t h o u tc y sr e s i d u eo f t h y m i d y l a t es y n t h a s e ( t s ) ，w ec a n v i l i 山东大学博士学位论文 p 一一 f i n dt h es i g n i f i c a n tc a t a l y z i n gf u n c t i o no ft sw h o c a nl o w e rt h er e a c t i o ne n e r g y b a r r i e rb ya c t i v a t i n gt h es u b s t r a t e c a t a l y z i n gb yt s t h em e t h y l e n eo f5 ，1 0 - c h 2 一t h f c a nb et r a n s f e r r e dt o d u m pa n dt h et r a n s f e r r e dm e t h y l e n ei sr e d u c e dt om e t h y lb yt e t r a h y d r o f o l a t et o c o m p l e t et h e t r a n s f o r m a t i o nf r o md u m pt od t m p + i nt h et w or e a c t i o n sa b o v e ， t h ec a l c u l a t i o nm e t h o d sa r e t o t a l l y i d e n t i c a lw i t he a c ho t h e r ，a n dt h eo n l y d i f f e r e n c eist h ec y sj o i n i n gi no n eo ft h et w o ，w h i l et h ee n e r g yb a r r i e ro ft h e r e a c t i o nw i t hc y st a k i n gp a r ti ni s4 6 k j m o ll o w e rt h a nt h a to ft h eo t h e ro n e b y c o m p a r i n g t h er e l a t i v ee n e r g yo ft h et w or e a c t i o ns y s t e m s ，w ec a nc o n c l u d et h a t t h ee n z y m eh a ss i g n i f i c a n tc a t a l y z i n gf u n c t i o n 3 a l lr e a c t i o n st a k i n gp l a c ei nv i v on e