（生物化学与分子生物学专业论文）人参根hg型果胶的制备及鉴定.pdf

摘要 人参根粗多糖经淀粉酶除淀粉，s e v a g e 法脱蛋白，8 0 无水乙醇醇沉后得到 人参根多糖g r ，之后，配成1 0 m 咖l 的水溶液，在搅拌过程中加入2 0 质量分 数的h 2 s 0 4 溶液至终浓度为0 0 9 ，1 0 0 水解2 h ，加入b a c 0 3 中和，过滤除去 不溶物，上清浓缩后，8 0 乙醇( v v ) 醇沉过夜，4 8 0 0 r m i n 离心2 0 m i n ，沉淀 依次用3 倍体积的无水乙醇，乙醚洗3 次，常规干燥后得到g r p 。苯酚硫酸法 检测得g r 、g r p 总糖含量分别为5 7 9 0 ，9 9 8 4 ；间羟联苯法检测g r 、g r p 的糖醛酸含量为3 5 3 0 ，9 7 3 1 ；考马斯亮蓝法检测g r p 不含蛋白质；h p l c 法检测g r p 的单糖组成为g a l u a ，痕量g a l ，缸a 和g l c ；红外光谱检测g r p 中的糖醛酸为a 构型；果胶酶解和1 3 cn m r 分析表明g r p 主要由 a ( 1 _ 4 ) d g a l u a 构成，在2 ，3 位上有由a ( 1 4 ) d g a l u a 构成的支链。 利用果胶酶p e c t i n e xu l t r as p l ( n o v o z y m e s ) 对g r p 进行水解，打断a ( 1 _ 4 ) d g a l u a p ，用s e p h a d e xg 7 5 分离获得g r p 结构中的非a ( 1 4 ) d g a l u a 结构的 精细单元，通过柱前衍生化技术使所得的单糖及寡糖片断具有紫外吸收，提高监 测的灵敏度，经过h p l i ：的o d s 柱获得部分非a ( 1 4 ) d g a l u a 结构的精细单元 的寡糖片断，通过单糖组成的测定对其精细单元进行初步分析。 关键词：人参多糖；h g ；果胶；柱前衍生化；寡糖； a b s t r a c t h gp e c t i nw a sp r e p a r e df r o mt h ec m d ew a t e 卜s o l u b l ee x t r a c t i o no ft h er o o t so f 砌咒似，l s 绷gc 彳肘哕e r b yp a n i a lh y d r 0 1 y s i s t h ec a r b o h y d f a t ec o n t e n to fg ra n d g r pw a s5 7 9 0 a n d9 9 8 4 ，d e t e n n i n i n gb yt h em e t h o do fp h e n 0 1 一s u l f u r i ca c i d t 1 l eu r o n i ca c i dc o n t e n to fg r 锄dg r pw a s3 5 3 0 a n d9 7 3 1 a c c o r d i n gt ot h e m e t h o do fm - h y d r o x y p h e n y l t 1 l er e 鲫l to fh p l cs h o w e dt h a tg r pw a sc o m p o s e do f g a l u aw i t ht r a c eg l c ，a r aa n dg a l g r pw a sm a i n l yc o n s i s t e do fa - ( 1 4 ) - d - g a l u a w i t hb r a n c ha tp o s i t i o n2o r3b yt h ea n a l y s i s0 f p e c t i n a s eh y d r o l y s i sa n d 1 cn m r u s i n gt h ep e c t i n e xu l t r as p l ( n o v o z y m e s ) t oh y d r o l y z et h eg r 只b r e a k i n g a - ( 1 _ 4 ) - d - g a l u ，s e p a r a t e dw i t hs e p h a d e xg 一7 5 ，w eo b t a i nt h en o n a - ( 1 _ 4 ) 一d g a l u as t n l c t u f ef i n eu n i to fg r p ，e n h a n c et h es a c c h a r i d ed e t e c t i n gs e n s i t i v i t yb y p r e c o l u m nd e r i v a t i o n ，o b t a i nt h ep a n i a ln o n a 一( 1 4 ) 一d g a l u as t m c t u r ef i n eu n i t b y t h eh p l co d sc o l u 砌，c a r 巧 o nt h e p r e l i m i n 9 r ya n a l y s i st h r o u g h t h e m o n o s a c c h a r i d ec o m p o s i t i o nd e t e 加i n a t i o no fi t sf i n eu n i t ， l 【e y w o r d s ：百n s e n gp o l y s a a m a r i d e s ；h g ；p e c t i n ；p r e c o l u m nd e r i v a t i o n ； o l i g o s a c c h a r i d e ； l i 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：至盖堕兰 日期： 善如长6 | 丐 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：主差垦羔 日期：塑曼。笸：1 5 学位论文作者毕业后去向： 指导教师签名： 日 期： 电话： 13 9 4 4 q q ! q ! 鱼 邮编：! 墨q q 墨2 东北师范大学硕士学位论文 第一章引言 1 中药植物多糖的研究概况 糖是含有多羟基的醛和酮类化合物，是自然界存在的一大类具有广谱化学结构和 生物功能的有机化合物。作为生命物质的组成成分之一，糖类化合物不仅为生命有机 体提供了碳骨架结构和能量来源，而且还广泛地参与细胞的各种生命现象及生理过程 的调节。尽管多糖是自然界中重要的高分子有机化合物，但是因长期未受到重视，其 研究发展较蛋白质和核酸慢得多。2 0 世纪5 0 年代，随着化学和生物学的发展以及分 离技术的提高，人们才开始认识到多糖的结构是非常复杂多样的，其生物学功能也决 非仅仅是能量和结构上的功能，而是具有复杂的、多方面的生物活性。尤其是近二十 年来，随着细胞生物学，分子生物学的发展，人们对糖类物质的认识也有了质的飞跃， 充分认识到糖类物质是除核酸和蛋白质之外的另一重要生物大分子，涉及到多细胞生 命的全部时间和空间，如受精、着床、分化、发育、免疫、感染、癌变、衰老等等。 因此，对糖类物质的研究已成为人们关注的焦点，各国学者竞相从各种生物材料中寻 找和提取具有生理活性的糖类物质，从而使关于糖类物质的研究有了空前的发展i l 叫。 多糖种类繁多，来源广泛，在动物、植物、微生物( 细菌和真菌) 和海藻中都有 分布，它们又可分为胞外和胞内多糖，其中研究较多的是植物多糖和微生物多糖1 2 j 。 植物多糖来源于植物的根、茎、叶、皮、种子和花。从各种中草药和其他植物中 都可以提取分离出多糖。我国近年来对植物多糖，特别是中草药多糖的药物活性进行 了广泛研究。据报道有降血糖活性的中草药已达到1 0 0 余种，其中药效显著的有2 0 多种，有关抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、抗辐射、抗突变、抗遗传损伤、抗凝血、抗血 栓等药物活性的报道也较多，有些作为药物已应用于临床1 5 j 。 1 1 中药植物多糖的提取分离 多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱或稀盐溶液提取，尽量 避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。稀酸提取时，时间宜短、温度不宜 超过5 0 【6 j 。由于水提时间长且效率低，酸碱提易破坏多糖的立体结构及生物活性， 采用酶法提取多糖，即采用复合酶一热水浸提相结合的方法，复合酶多采用一定比例 的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶，此法具有条件温和、杂质易除和提高得率等优点。 同一原料，分别用水、酸、碱、盐或酶法提取所得的多糖往往是不相同的p j 。多糖提 取之后，往往含有许多杂质，可利用多糖难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行 反复洗涤多糖沉淀，除去一部分醇溶性杂质。、用s e v a g e 法、三氟三氯乙烷法或三氯 醋酸法能脱去多糖中的游离蛋白质【8 1 ，但是去除结合蛋白质时要用一定量蛋白酶。除 去蛋白质以后，应用透析方法除去小分子的杂质。这样得到的溶液基本上是没有蛋白 1 东北师范大学硕士学位论文 质与小分子杂质的多糖混合物1 7 l 。 1 2 中药植物多糖的分级纯化 分级纯化多糖是分析多糖结构的关键，只有得到一种分子量和极性均一的多糖， 才能确定其结构。多糖分级( 将多糖混合物分离纯化为单一的多糖) 方法很多，主要 有分部沉淀法、盐析法、金属络合法、季铵盐沉淀法、分子筛排阻层析法、离子交换 柱层析、亲和层析等1 9 j 。多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即使 是多糖纯品其微观也是不均一的【1 0 1 。多糖的纯度只代表相似链长的平均分布。我们 通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。【8 l 常用的纯度鉴定方法有 超离心、比旋光度测定、高压电泳、凝胶层析和高效液相色谱等，现在应用较多的是 高效液相色谱法。通常要确定某一多糖的均一性，必须要有两种方法以上的鉴定结果 才能肯定。 1 3 中药植物多糖的结构研究 多糖结构比蛋白质和核酸的结构更为复杂，可以说是最复杂的生物大分子。从化 学观点来看，结构的复杂性无疑给多糖链的结构测定带来了很多困难。单糖是多糖的 组成单元。多糖的一级结构是指单糖基的组成、糖基排列顺序、相邻单糖基的连接方 式、异头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等。多糖的一级结构非常复杂， 加上糖残基上可以连接硫酸基、乙酯基、磷酸基、甲基等，就更加剧了多糖一级结构 的复杂性。目前多糖结构的研究主要集中在其一级结构【8 加】。由于分析技术的原因， 关于多糖高级结构的研究较少。现在已确立了一些分析多糖结构的研究方法： 化学方法瞰j ：将多糖链水解为单糖，是分析多糖链组成成分的主要手段。水解 法包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。一般呋喃糖苷键较吡喃型易水 解，a 型较b 型易水解，含有糖醛酸或氨基糖的多糖不易水解。水解试剂的不同会影响 水解条件。水解之后生成的单糖混合物经中和、过滤，可采用纸层析( p c ) 、薄层 层析( t l c ) 、气相色谱法( g c ) 、液相色谱法( h p l c ) 和离子色谱法进行分析。 高碘酸氧化和s m i t h 降解是分析多糖结构的经典方法【8 】。高碘酸可以选择性的氧化断 裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸。反应定量地进行， 每断裂一个c c 键消耗一分子高碘酸，通过测定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量，可 以判断糖苷键的位置、连接方式、支链状况和聚合度等结构信息。s m i t h 降解是将高 碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分酸水解。由于糖基之间以不同的位置缩合，用 高碘酸氧化后则生成不同的产物，可由这些降解产物来获取多糖的结构信息。【8 j 将多 糖中各种单糖残基的游离羟基全部甲基化，进而将甲基化多糖水解，水解后得到的化 合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点。，根据不同甲基化单糖的比例， 可以推测这种连接键型在多糖重复结构中的比例。【8 j 多糖的甲基化方法较多，有p u r d i e 法、h 锄o n h 法、m e n z i e s 法、h a k o m o r i 法等。甲基化反应的关键在于甲基化完全，多 糖甲基化完全后水解成甲基化单糖，经乙酰化后通过g c 或g c m s 分析，也可用 h p l c 直接分析。 酶学方法【确j ：酶促反应具有高度专一性的特点，且副产物少，因此酶学方法在 2 东北师范大学硕士学位论文 糖链的结构分析中也是一种重要的手段。在多糖结构分析中常用的酶有：唾液酸酶、 b 半乳糖苷酶、a 甘露糖苷酶和b 乙酰氨基葡萄糖苷酶等。 此外，有很多科学家正尝试用免疫学方法来研究多糖的复杂结构。 1 4 中药植物多糖的结构与功能的关系 糖类化合物的分布十分广泛。内质网、高尔基体和分泌泡中的糖基化和去糖基化 作用类似于蛋白质的磷酸化和去磷酸化作用，可以帮助蛋白质的组装、修饰加工和运 输分泌等1 2 训。细胞膜的研究表明，糖蛋白及糖脂的多糖部分总是位于细胞膜的外表 面，而绝大部分细胞因子均有糖链结构，作为信息分子，游离于整个有机体。作为基 质的蛋白多糖以其支持与保护功能，分布于整个有机体的细胞外间质、细胞膜表面和 一些滑囊粘液结构中i n 引。 糖类的功能多种多样，如确保蛋白的正确折叠和组装，从空问上调节糖复合物的 整体结构，保护多肽链不被蛋白酶水解，防止复合物之间的非特异作用，调节溶解度 和离子浓度等。聚糖中许多令人感兴趣的方面反映了它们的生物和分子的进化作用。 近年来的研究表明：糖链作为信息分子涉及多细胞生命的全部空间和时间过程，如精 卵识别、组织器官形念形成、老化、癌变等，在血液和淋巴循环中，起着动态的更为 灵敏的信号识别和调控作用，涉及到多种严重疾病的发生过程，如炎症和自身免疫病 箜“3 j 寸。 关于糖链的生物学作用，有如下一般规律：1 ) 很难预知某一特定糖链的功能和 对生物体的重要性；2 ) 同一寡糖序列在生物体的不同部位和不同的个体发育阶段有 不同的功能；3 ) 较为专一的生物作用通常是通过不寻常的序列或常见序列的不寻常 表达或修饰来介导的，而这些特殊的糖链也是毒素和病原体的识别目标【3 j 。归根结底， 糖链的共同特点是介导专一的“识别”和“调控”生物学的过程，因此对糖链的生物学作 用也只能逐个地分别研究。 多糖的功能是由其结构决定的。多糖的构效关系是指多糖的一级结构和高级结构 与其生物活性的关系。就其一级结构而言，多糖中单糖的组成、糖苷键的类型以及一 些官能团对其生物活性都有影响。至今已发现大多数具有抗肿瘤活性的多糖都具有 b d 一( 1 3 ) g l 印的主链结构i 列，奇果菌属分离出的具抗肿瘤活性的奇果菌多糖，基本 结构是由b d ( 1 _ 3 ) g l 印构成的直链葡萄糖，3 个单糖残基中有1 个8 d ( 1 _ 6 ) g l 印 构成的侧链葡聚糖【引。但是，也有一些多糖虽然具有b d ( 1 3 ) g l 印构成的葡聚糖 主链结构，却几乎没有抑瘤活性，这表明主链结构并不是多糖抗肿瘤活性的最基本原 因l _ 川。另据报道a ( 1 _ 3 ) d g l 印构成的葡聚糖也具有较强的抗肿瘤活性1 1 1j 。多糖的 高级结构的研究还较少，但科学家己肯定多糖的高级结构对功能的影响比一级结构重 要得多。有些多糖具有相同的一级结构，但活性大不相同，这主要是由高级结构的差 别引起的。一般高级结构呈b 一螺旋的多糖活性较高，而可拉伸带状或皱纹型带状的 活性一般较低甚至没有1 8 1 。例如：x 一衍射分析表明，1 7 1 香菇多糖及裂褶多糖均具b 一 三股绳状螺旋型立体结构，将香菇多糖加入尿素或二甲亚砜中，其活性就丧失。这二 种多糖在水溶液的比旋光度不同于在尿素或二甲亚砜中的旋光度，暗示在尿素或二甲 气 东北师范大学硕士学位论文 亚砜中，多糖立体构型改变了，从而引起活性的丧失。这充分证实立体构型对多糖活 性的显著性影响。目前，对于这种细微结构的影响机理，仍不甚了解。另外，1 1 u l 多 糖的分子量、溶解度、旋光度、粘度、药剂量等性状也影响其生理活性。如分子量为 9 0 ，0 0 0 左右的右旋糖具有一定活性，其活性随着大于或小于此分子量而迅速降低。 总之，到目前为止，除了对肝素碎片寡糖的构效关系研究得较详细外，其他多糖( 及 寡糖) 的构效关系研究至今尚不多，且相当不完善，是一个有待加强的研究领域。 1 5 中药植物多糖在医药中的应用 ( 1 ) 免疫调节作用 多糖不仅能激活t 细胞、b 细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤性t 细胞、 淋巴因子激活的杀伤细胞( l a k ) 等免疫细胞，还能促进集落刺激因子( c s f ) 、白 细胞介素、肿瘤坏死因子( n 咂) 和干扰素( i 烈) 等细胞因子的生成，调节抗体和 补体f 2 1 。 ( 2 ) 抗肿瘤作用 对多糖抗肿瘤作用的免疫学机制研究较多，一般认为多糖提高宿主的免疫功能是 其抗肿瘤作用的主要机理。另外，也有学者从多糖对肿瘤细胞膜组成、磷脂酰肌醇( p i ) 转换、抗癌基因的影响等角度研究其抗肿瘤作用机理。近年来，有些学者在研究多糖 抗肿瘤作用过程中，运用生物标记跟踪了肿瘤在不同时期的变化，如在肿瘤发生期中 d n a 加合物的形成、d n a 的氧化性损伤、谷胱甘肽转移酶活性的诱导、在肿瘤形成 期中佛波酯诱导的酪氨酸激酶及鸟苷酸脱羧酶活性的提高、自由基的形成等掣撕j 。 这些结果对进一步阐明多糖的抗肿瘤作用机制提供了新的思路。【2 j 多糖的毒副作用很 小，与化疗药物联用有协同效应，还可对抗化疗药物引起的骨髓抑制等不良反应。 ( 3 ) 抗病毒作用 许多多糖对病毒有抑制作用，【7 填作用机制可能有三种途径：一是能抑制病毒在 细胞内的复制；二是能抑制病毒与靶细胞结合；三是能增强机体免疫功能。多糖在抗 病毒药物的研究中也常常作为佐剂，许多研究结果表明多糖与其它抗病毒药物联用具 有协同作用。将多糖作为佐剂可以防止或推迟耐药株的出现，提高药物的抗病毒活性， 减少用药量。例如硫酸优选糖酐与叠氮胸苷具有协同作用，可以减少用药量，降低不 良反应，提高患者的耐受性【8 j 。 ( 4 ) 抗溃疡 人参多糖【2 5 1 、角叉菜胶、红藻类多糖、鹿茸多糖等均有较好的抗溃疡作用。多 糖的抗溃疡作用可能与其降低胃酸和抑制胃蛋白酶活性有关。 ( 5 ) 降血糖、降血脂作用 药理实验证明，茶多糖具有明显的降血糖的作用，其中有降血糖作用的多糖为半 乳葡聚糖。汪东风等人的实验结果表明茶多糖在降低四氧嘧啶高血糖模型小鼠的血 糖浓度的同时肝糖元大量增加，并且对小鼠基本无毒副作用。香菇多糖具有对胆固醇 的溶解作用。黑木耳多糖具有缓解动脉粥样硬化的功效。有文献报道多糖的侧链结构 对于其降血糖活性至关重要，但具体的构效关系还有待于进一步研究i l 4 。 4 东北师范大学硕士学位论文 ( 6 ) 抗衰老作用 对衰老发生的机理有众多学说，如遗传学说、自由基学说、交联学说以及免疫功 能下降学说等等。由于多糖类化合物可以增强机体的免疫功能，因此很有希望将它们 作为抗衰老药应用于临床。近十多年来，化学家们己从扶f 固本等补益中药中得到了 多种多糖类化合物，实验证明这些多糖不但能促进机体的免疫功能，而且有些多糖确 实有抗老延寿的作用【1 4 j 。 ( 7 ) 其他 研究表明，冬虫夏草多糖在治疗慢性乙型肝炎中可在免疫调节、保肝和抗病毒三 方面发挥作用，并具有较好疗效。中华猕猴桃具有较强的清除活性氧自由基的能力， 并且还有与机体内源性抗自由基体系相类似的作用能力。云芝胞内多糖可有效地清除 血液循环中的内毒素。黑木耳多糖具有抗辐射作用【2 引。由六糖或八糖重复单位组成 的肝素，可抑制凝血蛋白酶原转变为凝血酶，有抗凝血作用。 近年来在糖生物学成就的基础上对“糖类药物”的概念进行了新的认识，强调的是 作用于糖的生物过程的药物分子【矧。它不仅指一般的含有糖类的药物，还包括可以 通过与糖类、糖类相关的结合蛋白狈酶类的相互作用，影响一些生理和病理过程的化 合物。 糖药物的最重要特点是他们中间的大多数是作用于细胞表面。因为糖类或糖复合 物主要分布在细胞表面，参与细胞和细胞、细胞和活性分子的相互作用，而且往往是 一系列生理和病理过程的第一步，如果这第一部被阻断了，有关的生理和病理过程也 就不能随之发生。由于多数以糖类为基础的药物的作用位点是在细胞表面，而不进入 细胞内部，因此，这种药物对于整个细胞、进而对整个机体的干扰，要比进入细胞核、 质内的药物要小得多。就这点而言，糖药物是副作用相对最小的药物。因此不仅可以 作为治疗疾病的药物，而且可以作为保健类药物【1 1 1 。同时可以利用多糖在消化道中的 稳定、悬浮、成膜、纳水、凝聚、润滑和延效等作用发展的新型多糖复合药物，用于 多种消化道疾病的防治和延长药效。 1 6 中药植物多糖的修饰 为提高多糖的生物活性，国内外进行了大量的有关多糖分子修饰( 结构改造) 的 研究。1 1 5 j 将多糖或寡糖进行降解、硫酸化、磺酰化、乙酰化、烷基化等，都有可能 改善多糖的生物活性，磷酸酯化、硬脂酰化、棕榈酰化、二乙基氨基乙基化、羧甲基 化、羧乙基化、碘化、氨基化等方法也常用来修饰多糖分子。 糖类经过修饰后在医药方面有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒细菌、降血糖、降血脂、 抗衰老、抗凝血等作用【“】。最令人兴奋的是自1 9 8 1 年以来德国人将木聚糖硫酸酯化 从而成为治疗爱滋病等疾病的药物( ，1 9 8 9 ) ，已申请专利，并试用于临床。因而国内 外掀起了对硫酸酯化修饰多糖的热门研究旧。 2 h g 型果胶的研究进展 就化学组成和生物合成而言，果胶类多糖是植物细胞壁多糖类家族中最为复杂的 5 东北师范大学硕士学位论文 一员，其化学结构和分子量在不同的植物组织中各有所不同。2 0 世纪8 0 年代初，p - b e r s h e i m 【1 8 】等用高纯的内切聚半乳糖醛酸酶水解悬铃木细胞，释放出各种多糖片段， 并推断d 一半乳糖醛酸残基在4 位连接的占优势，l 鼠李糖残基在2 位和2 ，4 位连接的约各 占一半。鼠李糖残基以2 ，4 糖苷键连接在d 半乳糖醛酸残基上，由此分支的侧链，主要含 l 阿拉伯糖和d 半乳糖残基。1 9 8 5 年，p 砧b e r s h e i m 进一步应用h p l c 色谱、g c 色谱和 1 h 。n m r 分析了各种多糖碎片，证实了以上推测。一个世纪以来，众多科学家在果胶多糖 领域进行着细致而深入的研究，使果胶多糖的结构、化学组成越来越趋于系统和完善。 果胶类多糖的分子量介于1 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 之间，其分子结构分为光滑区与毛发区：光滑 区由q d 半乳糖醛酸残基通过1 ，4 糖苷键线形连接；毛发区由高度分支的o l 广鼠李半 乳糖醛酸组成。因此，按照结构分类，果胶类多糖包括三大类：半乳糖醛酸聚糖 ( h o m o g a l a c t u r o n a n sh g ) 、鼠李半乳糖醛酸聚糖i ( r h 锄n o g a l a c t u r o n 觚sr g i ) 和鼠 李半乳糖醛酸聚糖i i ( r h a m n o g a l a c t u r 0 n a n sr g i i ) h g 型是由q d 半乳糖醛酸残基通过1 ，4 糖苷键连接而成的线性糖链，由1 0 0 5 0 0 个g a u a 残基组成。其中半乳糖醛酸的羧基有不同程度的甲酯化，因此天然果胶分为 高甲氯基果胶( h m ) 和低甲氧基果胶( l m ) 。未甲酯化的羧基则以游离酸形式或以k 、 n a 、c a 盐等形式存在。h m 果胶在有足够的糖浓度和酸条件下才能形成凝胶；l m 果 胶在c a “存在时通过半乳糖醛酸链与c a 2 + 交联发生分子间缔合而形成凝胶。酯键的 去除有利于钙的交联，更易形成凝胶。有的g a l u a 的c 2 或c 3 位羟基还发生乙酰化，乙酰 化果胶在甜菜及土豆中含量较蒯1 9 j 。 2 1 果胶的结构分析 果胶类多糖的结构分析主要采用化学方法和酶法。化学方法对糖分子结构破坏较 严重，酶法则相对比较温和，结果更加可靠。q ( 1 4 ) 聚半乳糖醛酸酶( g a l u 卸和聚半 乳糖醛酸甲基酯酶m g m t ) 的开发和应用极大地推动了果胶类多糖结构的研究进程。 g a l u 觚水解主链半乳糖醛酸的q ( 1 4 ) 糖苷键，它的真正底物是果胶酸而不是酯化 的果胶多糖【2 0 】，h g m t 是一种特异性酶，可使果胶聚半乳糖醛酸的甲酯水解，生成果胶 酸，既不破坏r g i 和r g i i 的结构，且有利于g a l u a t 对聚半乳糖醛酸的q ( 1 4 ) 糖 苷键的降解，从而使果胶类多糖分解为q ( 1 4 ) 聚半乳糖醛酸、r g i 和r g i i 多糖片 段。r g i 半乳糖酶( r g i g a l t ) 、r g i 阿拉伯糖酶( r g i 趾a t ) 及r g i 一甲基 酯酶( r g i m t ) 被应用于r g i 结构的研究。r g i i 甲基酯酶( r g i i m ，r ) 用于r g 一 1 i 的结构研究。通过内切糖酶的作用，对r g i 、r g i i 片段进行研究，发现r g i 、r g i i 结构的改变会直接影响到植物的生长发育。用于果胶类多糖结构分析的糖酶多达4 6 种f 2 l 】。用酶法将果胶类多糖降解，产生不同的寡糖片段，进而将这些寡糖片段通过 h p l c 色谱、g c 色谱并结合质谱和多维n m r 技术进行指纹识别，从而对果胶类多糖的 精细结构进行深入的描述和论证，是进行果胶类多糖结构鉴定的最为有效的手段。 2 2 果胶的性质及其应用 果胶具有优良的胶凝性和乳化性【2 列，自2 0 世纪4 0 年代以来便得到广泛研究与 应用。商品果胶最早在食品工业中用作增稠剂、胶凝剂、乳化剂、稳定剂；近年来医 6 东北师范大学硕士学位论文 药、化妆品、纺织、印染、冶金、烟草等行业中都有广泛的应用，尤其在医药领域的 应用日益广泛，美国药典已收载了药用果胶的质量标准。目前商品果胶的原料主要是 柑橘皮( 含果胶3 0 ) 、柠檬皮( 含果胶2 5 ) 及苹果皮( 含果胶1 5 ) 。此外，甜菜废粕、 向日葵盘、芒果渣、洋葱中也含有较丰富的果胶，可做为果胶生产原料。不同来源的 果胶，由于分子量、甲酯化程度、带有其它基团的多少等均有区别，导致其理化、功能 性质也不尽相同。 果胶类多糖的提取方法一般采用水提【2 3 1 、酸提【2 41 和碱提法l2 5 1 ，食品工业上通常 采用酸法提取。为了提高其纯度，通常先用甲醇和氯仿等有机溶剂对原料预处理以除 去小分子物质及低聚糖；用o 5 的福尔马林溶液处理可去除多酚类物质并降低酶活， 以防止果胶类多糖的降解。在提取过程中，采用e d t a 等金属离子螯合剂也可提高产 率。由于果胶为细胞壁物质，它与细胞壁半纤维素之间以共价键结合，同时与细胞壁上 的其他类多聚糖( 纤维素、木质素) 通过次级键紧密缔合【2 6j ，因此提取得到的多糖通常 是果胶类多糖和其他半纤维素的混合物，即使是单纯的果胶类多糖也含有中性和酸性 果胶多糖。通过乙醇分级沉淀、离子交换色谱及凝胶色谱可以根据带电荷性质及分子 量的不同进行分级、纯化：同时利用专一性的聚半乳糖醛酸酶、半乳糖酶和阿拉伯糖 酶的降解作用可得到尽可能纯的半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖、阿拉伯半乳： 聚糖和阿拉伯聚糖。由于果胶分子存在极性区和非极性区，因此果胶具有多种功能性 质，能够用于不同的食品体系中，如制造果酱、果冻、凝胶软糖、蜜饯、面包、乳制品、 罐头、果汁饮料等。近年来，在低热量食品中果胶用作脂肪或糖的代用品。美国 h e r c u l e s 公司生产的脂肪代用品果胶，可1 0 0 代替脂肪，用于制作无脂冰激凌。低糖软 饮料占有巨大的饮料市场份额，但降低甜味剂用量会影响传统饮料的口感，添加一定比 例的h m 果胶会抵消此缺陷。在冷冻食品中，果胶能减缓冷冻过程中冰晶的长大，改善 冰制品的质构。果胶无毒，食用安全，e a o 刖h 0 食品添加剂联合委员会推荐果胶为不 受添加量限制的安全食品添加剂。此外，由于果胶类多糖具有降低血糖预防糖尿病、 降血脂、防止肠癌增强抗癌力、防止肥胖以及抑制肠内致病菌的繁殖等功效，因此可 用于制作防治糖尿病、肥胖症、高血脂等症的保健食品。随着功能性多糖的开发研究， 果胶类多糖作为水溶性膳食纤维，将越来越受到重视。 果胶类多糖具有抗菌、止血、消肿、解毒、止泻、降血脂、抗辐射等作用，还是 一种优良的药物制剂基质，可单独或与其它制剂合用配制软膏、膜、栓剂、微囊等药 物制剂。果胶对维持血液中正常的胆固醇含量具有非常好的效果。m i e t i n n e n 和t a 印1 i a 报道：服用果胶两周后，血清胆固醇含量降低了1 3 。c e d f a 等发现在冠状心脏病患者的 膳食中补给果胶使血液胆固醇含量降低了7 6 1 1 例! 国外多项研究显示，果胶能令餐后 升高的血糖降低。糖尿病患者如摄入果胶类多糖，血糖不仅不会升高，还可避免为补充 碳水化合物不足而多吃脂肪类食品所诱发的心脏病，心血管栓塞等疾病。 研究发现：橘皮和苹果皮中的碳水化合物一果胶具有阻止前列腺癌转移的作用。 此项结果已经在大鼠实验中得到证实。研究认为经过处理的果胶能阻止肿瘤细胞上的 化学物质一植物血凝素与其他细胞表面上的碳水化合物结合，从而使其不能黏附在血 7 东北师范大学硕士学位论文 管壁上而阻止其转移。因此可被研制成药物用于阻止前列腺癌的转移。果胶还能防止 有毒阳离子中毒，能有效地去除肠胃和呼吸道中的铅和汞；据报道，降解后的果胶与铁 形成复合物对于治疗缺铁性贫血效果非常好；英国专利报道，铋d 聚半乳糖醛酸复合 物是药品中强化铋的有效途径；果胶与其它胶相结合被广泛用于治疗腹泻疾病，特别是 婴幼儿的腹泻疾病；果胶、氢氧化铝和氧化镁的混合物对于治疗胃溃疡和十二指肠溃 疡的效果也很显著。 3 人参根多糖的研究进展 3 1 人参根多糖的分离纯化及结构分析研究 1 9 6 8 年，t f s o l o v 曲a 等从人参根水提物中分离得到人参果胶。部分酸水解表 明，分子中存在a ( 1 _ 4 ) d 聚半乳糖醛酸片断。果胶酶处理和部分酸水解后得到 a ( 1 _ 3 ) d 聚半乳糖，a ( 1 - 6 ) d 聚半乳糖和一种杂多槲2 剐。 1 9 8 2 年，张翼伸等对人参果胶进一步分级纯化，得到s a ，s b 两种均一级分， 部分酸水解，高碘酸氧化和s m i t h 降解分析，s a 是一种具有多层分枝，结构复杂的 酸性杂多糖，s b 的主体结构是a ( 1 _ 4 ) d 聚半乳糖醛酸f 1 9 - 2 。同时，梁忠岩等从人 参根热水提取物中分离出p a ，p b 两个蛋白多糖级分，其分子量分别为1 8 0 万和5 2 万，蛋白质含量分别为5 3 4 ，7 6 【2 2 】。日本东北大学k 0 n n o 等自1 9 8 4 年以来，选 用s e p h a r o s e 6 b ，s e p h a c r y l s 2 0 0 和s 5 0 0 ，d e a e t 0 y o p e a r l6 5 0m 等色谱柱反复分 级纯化不同产地的人参根多糖，共分离出2 1 种多糖级分陟3 3 1 。 1 9 9 1 年，s u n 等从人参根碱提液的季铵哉沉淀中分离得到一种碱溶性多糖g r a - 4 其中糖含量为6 6 5 ，糖醛酸含量为2 2 6 ，蛋白只含量为1 0 9 【柏1 。t o m o d a ( 1 9 9 3 ) ， s o n o d a ( 2 0 0 2 ) 分别选用d e a e s e p h a d e x a _ 2 5 ，c o i a s e p h a r o s e 和t o y o p e a r l h w 5 5 凝胶色谱柱，从人参根多糖的季铵盐沉淀和上清液中分离出p a ，p b ，s ia 和s i i a 四个多糖级分，其分子量分别为1 6 万，5 5 万，5 6 力，1 0 力j ，并分析出了它们的详 细结构【3 8 j 。同样，1 9 9 4 年，高其品，傅平平等结合凝胶色谱柱d b 墟t 0 y o p e a d ， c o i a s e p h a r o s e ，s 印h a r o s e c l 6 b 从季铵盐沉淀得到的人参根多糖g r 5 中分离纯 化出3 个均一级分即主链为a 一( 1 _ 4 ) 连接的葡萄糖g r 5 n 和两种果胶类多糖 g r - 5 a u h ，g r 5 a u l f 2 3 j 。1 9 9 8 年，j i e y o u n gs 彻g 等用凝胶色谱柱s e p h a c r y l s 5 0 0 ， d b 姬s e p h a d e x a 5 0 从人参根水提液中分离纯化出一种主要由a ( 1 _ 6 ) 连接的吡喃 型葡萄糖和b ( 2 _ 6 ) 。连接的呋喃型果糖构成的酸性多糖g i n s a n ，其分子量为2 0 0 万 1 4 。2 0 0 6 年，j i - h y ek e 等采取q s e p h a r o s ef f ，s e p h a c r y l s 2 0 0 等色谱柱从人参水 提液中分离纯化出p g f 2 和p g h m w 两种果胶型多糖，但并未深入研究其结构1 6 1 j 。 3 2 人参根多糖的活性研究 人参是五加科人参属植物，是中国传统的名贵中药，具有滋补养气，活血化瘀， 止咳平喘，延年益寿等功效。过去人们一直注重人参皂苷的研究，而忽视了人参中的 另一重要活性成分一人参多糖1 1 9 】。大量实验研究表明：人参根多糖具有很好的药理 活性，可显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能，激活网状内皮系统( r e s ) ，并增强其 8 东北师范大学硕士学位论文 吞噬功能，促进抗体的形成，提高小鼠免疫球蛋白和补体的含量，对小鼠溶血素的产 生也有明显的刺激作用【2 2 乏3 1 。 人参根多糖的生物活性主要表现在对免疫功能的影响以及由此产生的免疫抗肿 瘤性。如：人参根多糖可使正常小鼠脾细胞的n k 活性及c o n a 刺激后的i l 2 和i f n 吖 水平明显增高，同时人参根多糖还能促进慢性肾功能衰竭患者的细胞转化及i l 2 的 诱生f 矧。 人参根多糖具有直接或间接的抗肿瘤活性。体外细胞毒性实验表明：人参根多糖 致敏血清对人和小鼠的肿瘤细胞株均有不同程度的杀伤和抑制作用，也可使体内移植 瘤发生明显的出血性坏死。王本祥等研究发现，人参根多糖对实验性小鼠肿瘤有明显 的抑制作用，对s 1 8 0 和艾氏腹水瘤的瘤重抑制率为4 0 6 0 。关于人参根多糖的抗 肿瘤机制，有报道认为可能是诱生了肿瘤坏死因子t n f 【3 6 】。 人参根多糖对髓系造血干( 祖) 细胞的增殖分化有明确的调控作用，这可能与其 上调造血微环境中的基质细胞分泌造血生长因子( h g f ) ，调节血细胞的生成有关 【3 4 粕】。戴勤等研究发现，人参根多糖g p s 在体外对c f u g m 增殖也有明显促进作用。 从人参根中分离纯化出的单体多糖主要是由半乳糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖，以 及少量的鼠李糖构成【1 9 2 。这种单体人参根多糖可以引起血糖和肝糖原的含量降低， 可以增加琥珀酸脱氢酶( s d h ) 和细胞色素氧化酶( c c o ) 的活性，这种单体多糖对 肝脏及组织细胞的有氧氧化过程的促进作用可能是其降血糖的主要原斟3 0 。3 3 1 。据有关 研究表明，人参根多糖降低肝糖原的作用也可能与其抑制乳酸脱氢酶( u ) h ) 的活性 有关f 3 4 l 。 4 本论文实验材料及选题依据 人参是我国传统的名贵中药，具有滋补养气，活血化瘀，止咳平喘，延年益寿等 功效1 2 引。过去人们一直注重人参皂苷的研究，而忽视了人参中的另一重要活性成分 一人参多糖【球3 0 1 。大量实验研究表明，人参多糖具有很好的药理活性，但是由于分离 纯化和结构分析比较困难，导致了在应用上的障碍。为了更好的研究和应用人参多糖， 本文拟研究人参多糖中人参果胶g r p 的分离制备方法及理化性质分析。 注：本文所片j 的缩写名词： g l c 一葡萄糖g a l u a 一半乳糖醛酸m a i r 甘露糖m a 一阿拉伯糖 g a 卜半乳糖g l c u a 葡萄糖醛酸 r h a 一鼠李糖1 r i 认一三氟乙酸 9 东北师范大学硕士学位论文 第二章结果与讨论 1 人参根多糖中h g 型果胶的分离制备及理化性质分析 1 1g r p 的分离制备 将1 0 0 9 人参根粗多糖配成质量分数为5 的水溶液，充分溶解，离心去除沉淀， 上清液加入3 0 m g 淀粉酶脱淀粉，得到人参根脱淀粉粗多糖3 7 9 ( 收率3 7 ) 。 称取人参根脱淀粉粗糖3 5 9 配成1 0 的水溶液s e v a g e 法脱蛋白后，得到人参根 多糖g r3 3 2 5 9 ( 收率9 5 ) 。 称取3 0 9 人参根多糖g r ，配成1 0 m g m l 的水溶液， 经过o 0 9 h 2 s 0 4 溶液水 解，醇沉，沉淀常规干燥后得到1 7 7 6 9g r p ( 收率5 9 2 ) 。 g r p 的分离制备流程见图2 1 。 1 2g r 、g r p 的物理性状 g r 为浅褐色固体，易溶入水，溶解度大于5 0 m g m l 。 g r p 为深褐色固体，在水中的溶性较差，溶解度约为1 吣l ，室温溶解2 d 后，溶 解度可达5 m g m l 。g r p 在酸碱溶液中的溶解性更差，但是在1 0 m m 的e d t a 溶液中溶 解性相对较好。 1 3g r 、g 肿的总糖含量测定 以葡萄糖为标准单糖绘制标准曲线( 图2 2 ) ，苯酚硫酸法测定g r 的总糖含量。 0o 0 2 o 0 40 0 6o 0 80 1 q u a lit yo fc a r b o h y d r a t e ( - g ) 图2 - 2 t h es t 锄d a r dc u r v eo fc a r b o h y d r a t ec o n t e n t 1 0 l 9 8 7 6 5 哇 3 2 1 o 仉仉仉c：钆 仉仉仉仉 o q 东北师范大学硕士学位论文 人参根粗多糖 ( 吉林省宏久生物科技股份有限公r 司提供) 上清液 拌溶解过夜， 沉淀弃去 人参根脱淀粉粗多糖 上清液弃去 沉淀弃去 s e v a g e 法脱蛋白，踟乙醇( v ) i n 离心2 0 m i n 沉淀 上常规干燥 g r 上清液 残渣弃去 ) 醇沉过夜， 沉淀 山常规干燥 g r p 图2 1g r p 的分离制备流程 1 l 搅拌过程中加入h 2 s 0 4 至终浓度 b a c 0 3 中和，过滤 过 沉醇 咖燥醇规乙常 液i l 截 j日lv清山 匕 东北师范大学硕士学位论文 以半乳糖醛酸为标准单糖绘制标准曲线( 图2 3 ) ，苯酚一硫酸法测定g r p 的总 糖含量。两种人参根多糖g r 、g r p 的总糖含量，如表2 1 所示。 0 4 口 西 = o 3 s o 3 0 2 5 0 2 0 1s 0 1 0 0 5 0 00 0 50 10 1 s0 2 q ：i l a l i t yo fc a r b o h y d r a te ( i g ) 图2 3 t h es t a n d a r dc u n ，eo fc a f b o h y d r a t ec o n t e n t 表2 _ 1g r 、g r p 的总糖含量 1 4g r 、g r p 的糖醛酸含量测定 以半乳糖醛酸为标准单糖绘制标准曲线( 图2 4 ) ，间羟联苯法测定g r 、g r p 的糖醛酸含量。两种人参根多糖g r 、g r p 的糖醛酸含量，如表2 2 所示。 o 6 m n 霉o 5 0 o 拿 0 2 o 1 o 0o 0 l 0 0 2 0 0 3o 0 4 0 0 5 q n d i t yo f r o n i c - c i d “g ) 图2 4t h es t a n d a r dc u r v eo fu r o n i ca c i dc o n t e n t 1 2 东北师范大学硕士学位论文 表2 2g r 、g r p 的半乳糖醛酸含量 根据上述糖醛酸含量，可以确定g r p 以半乳糖醛酸为主要成分的酸性多糖。 1 5g r 、g r p 的蛋白质含量测定 以牛血清白蛋白为标准蛋白绘制标准曲线( 图2 5 ) ，考马斯亮蓝法测定g r 、g r p 中的蛋白质含量。两种人参根多糖g r 、g r p 的蛋白含量，如t a b 1 所示。 o 4 5 o 4 0 3 5 o 3 茸 莓0 2 5 昌o 2 0 1 5 0 1 0 0 5 o ol o2 03 04 0 图2 5t h es t 锄d a r dc u r