（生物化学与分子生物学专业论文）几种不同nls对重组酶删除效率影响的初步研究.pdf

摘要 几种不同n l s 对重组酶删除效率影响的 初步研究 生物化学与分子生物学专业硕士研究生胥珊 指导教师罗克明教授 摘要 转基因植物给人类带来巨大经济价值的同时也存在生物安全隐患，因此，近年来人们一 直探索如何消除转基因植物可能带来的生物安全性问题。已经证实，来源于微生物的位点特 异性重组酶系统能有效删除转基冈植物中的抗性选择抗性标记基因，现已广泛应用于转基因 植物生物安全控制中。前期工作中，本实验室以重组酶系统c r e l o x p 与f l p f r t 为基础，构 建了一个新的基因删除系统“g e n e - d e l e t o r ”。为了进步提高该系统的删除效率，本论文在已 有研究基础上，重点研究了核定位信号序列( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ，n l s ) 对重组酶c r e 删除效率的影响。为此合成了四种被证实在多数植物中起作用的核定位信号，将它们分别与 g f p ：g u s 基因融合构建表达载体，通过遗传转化手段将其转入烟草，筛选出入核效率最高的 n l s ；再将其与重组酶基因c r c 融合构建表达载体，遗传转化烟草，初步分析了n l s 融合于 c r e 的n 端对其入核及删除效率的影响。主要结果如下： 1 不同类型n l s 协助蛋白入核效率比较分析 为了提高重组酶入核的效率，本论文选择四种典型的n l s ，分别为：单向的来自s v 4 0 大t 抗原的s v 4 0 n l s ；双向的来自玉米转录因子o p a q u e 一2 的0 2 n l s ；来自酵母蛋白m a ta 2 的r p l 2 5 n l s ( 这个n l s 只被i m p o r t i nb 识别) ，以及类似m a ta 2 n l s 的来自玉米转录因子的 n l s c 。将它们分别与标记基因( g 即? g 砸) 融合，构建融合表达载体，并转化烟草，确定 获得舣功能活性的g f p ：g u s 融合基因后；比较n l s s 介导g f p ：g u s 融合蛋白入核的效率。 首先，对叶片上皮细胞g f p 荧光的定性观察结果发现，转基因p b i s v 4 0 n l s g f p ：g u s 细胞层的荧光明显集中于细胞核；其他融合了核定位信号的转基冈植物细胞与未融合n l s 的 转基冈植物细胞中，荧光信号多呈现弥散分布，没有聚集的相对较强的荧光信号；非转基因 植株中未检测到任何荧光信号。 核蛋白g u s 酶活定量检测发现：p b i s v 4 0 n l s g f p ：g u s 植株的核内g u s 酶活在 9 0 3 8 0 u 之间，明显高于p b i g f p ：g u s 与其他融合n l s 的转基因植株，大约是它们的2 _ 4 倍。 两南大学硕十羊何论文 2 n l s 对重组酶效率影响的初步研究 进一步将已合成的s v 4 0 n l s 融合至重组酶c r e 的n 端，构建植物表达载体 p b i c a m v 3 5 s c r e - n o s 与p b i c a m v 3 5 s s v 4 0 n l s c r e n o s 。由发根农杆菌介导，二次转化 含特异识别位点的g u s 阳性烟草p l f g n ，获得二次转化的再生发根，g u s 染色统计删除效率， 分析s v 4 0 n l s 对重组酶c r e 效率的影响。结果发现：c r e 的n 端融合s v 4 0 n l s ，对重组酶在 烟草中的平均删除水平没有明显的影响，但能够协助其进入与聚集于烟草细胞核，促进重组 酶快速删除外源基因。 以上研究表明，我们筛选到的高效的核定位信号s v 4 0 n l s ，可以提高重组酶蛋白入核效 率，从而加快删除反应进行。但要获得真正效率提高的删除系统，还需进一步研究它对其他 重组酶的作用。 i l 关键词：基因删除系统核定位信号s v 4 0 n l sc r e 重组酶融合蛋白 a b s t r a c t e f f e c to fs e v e r a ln l s so nd e l e t i o ne f f i c i e n c yo f s i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a s e c a n d i d a t e ：s h a nx u s u p e r v i s o r ：p r o f k e m i n gl u o a bs t r a c t t od a t e ，m o r et h a n8 0m i l l i o nh e c t a r e so ft r a n s g e n i cc r o p sh a v eb e e ng o w nw o r l d w i d e t h ep o t e n t i a l l yn e g a t i v ee n v i r o n m e n t a li m p a c to ft r a n s g e n i cp l a n t sh a sb e e no fc o n c e mt o b o t ht h ep u b l i ca n dt h es c i e n t i f i cc o m m u n i t i e s h o w e v e r , n o n eo ft h ee x i s t i n gt e c h n o l o g i e st o a d d r e s st h i s p r o b l e m i s b r o a d l ya p p l i c a b l e f o rf i e l d c r o p s a l t h o u g hs i t e s p e c i f i c r e c o m b i n a t i o ns y s t e m s ，s u c ha sc r e l o x po ft h ep h a g ep1 ，r r so fz y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i i a n df l p f r to fs a c c h a r m y c e sc e r e v i s i a e ，h a v eb e e nu s e df o rr e m o v i n gs h o r td n as e q u e n c e s s u c ha sa n t i b i o t i cm a r k e rg e n e so rs p a c e rs e q u e n c e sf r o mp l a n tg e n o m e ，t h e i re x c i s i o n e f f i c i e n c i e sa r eg e n e r a l l yl o wi nh i g h e rp l a n t s i no u rp r e v i o u ss t u d y , w er e p o r tan o v e l “g m g e n e d e l e t o r s y s t e mt h a ti se x c e p t i o n a l l ye f f i c i e n t f o re x c i s i n ga l lf o r e i g ng e n e sf r o m p o l l e na n ds e e d so fg mp l a n t s t oi m p r o v et h ed e l e t i o ne f f i c i e n c yo f “g m g e n e d e l e t o r s y s t e m ，w ei n v e s t i g a t e de f f e c t so f s e v e r a ln u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l0 q l s ) s e q u e n c e s ，w h i c h h a v eb e e nd e m o n s t r a t e dt of u n c t i o ni nh i g h e rp l a n t s ，o nd e l e t i o ne f f i c i e n c yo fs i t e - s p e c i f i c r e c o m b i n a s e f i r s t l y , f o u rn l s s w e r ea r t i f i c i a l l ys y n t h e s i z e da n df u s e dt og u s ：g f pg e n ea n d i n t r o d u c e di n t ot o b a c c op l a n t sv i aa g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dm e t h o d t h en l s w i t ht h eh i g h e s t e f f i c i e n c yo fn u c l e a rt r a n s f e rw a so b t a i n e da n dc o m b i n e dw i t hs i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a s ec r e - a f t e rt r a n s f o r m a t i o n ，w ef u r t h e rd e t e r m i n e dt h ee f f e c t so ft h en l ss e q u e n c eo ni m p r o v e m e n t o ft h en u c l e a rt r a n s f e rc r er e c o m b i n a s ea n do ne l i m i n a t i o ne f f i c i e n c yo f “g m - g e n e - d e l e t o r s y s t e m 1 1 1 西南大学硕十学位论文 蔓曼曼蔓曼曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼曼曼i i _ i 曼舅! ! 曼曼曼 1 c o m p a r i s o no fm e d i a t e d - n u c l e a ri m p o r te f f i c i e n c yo fn l ss e q u e n c e s f o u rk i n d so fc l a s s i c a ln u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l s ( n l s ) ，n a m e da ss y 4 0 n l s ，o 羽l s n l s ca n d r p l 2 5 n l s , w e r ea r t i f i c i a l l ys y n t h e s i z e da n df u s e dw i t hg f p ：g u sr e p o r t e rg e n e c o n f o c a ls t u d y r e v e a l e dt h a tg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ( g f p ) w a sl o c a l i z e di nt h en u c l e u so fe p i t h e l i a lc e l l so f t r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t sc o n t a i n i n gp b i s v 4 0 n l s g f p ：g u s ，w h i l eg f pw a sd e t e c t e dt h r o u g h o u t t h ew h o l ec e l li nt h e s et r a n s g e n i cp l a n t sc o n t a i n i n go t h e rn l s s a san e g a t i v ec o n t r o l ，n og f p s i g n a l w a so b s e r v e di nw i l d t y p ep l a n t s q u a n t i t a t i v ea s s a y so fg u sa c t i v i t yi nt h en u c l e if r o mi n d i v i d u a ll i n e so ft r a n s g e n i ct o b a c c o p l a n t sh a r b o r i n gg f p ：g u s , s v 4 0 n l s - g f p ：g u s , 0 2 n l s - g f p ：g u s n l s c - g f p ：g u sa n d r p l 2 5 n l s - g f p ：g u s ，r e s p e c t i v e l y , s h o w e dt h a tt h eh i g h e s tg u sa c t i v i t y ( 9 0 3 8 0n m o y m g m i n ) w a s d e t e c t e di nt r a n s g e n i cs y 4 0 n l s g f p ：g u se v e n t s w h i c hl e v e lw a s2 t o4 - f o l dh i g h e rt h a nt h a to f t r a n s g e n i cp l a n t s t r a n s f o r m e dw i t h g f p ：g u s , r p l 2 5 n l s - g f p ：g u s , 0 2 n l s - g f p ：g u n l s c g f p ：g u s 。t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts v 4 0n l sw a st h em o s te f f e c t i v et om e d i a t en u c l e a r i m p o r ti nt o b a c c op l a n t s 2 e f f e c to fn l ss e q u e n c eo nd e l e t i o ne f f i c i e n c yo fs i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a s e t oi n v e s t i g a t ee f f e c to fs v 4 0 n l so i ld e l e t i o ne f f i c i e n c yo fc r er e c o m b i n a s e ，t w oe x p r e s s i o n v e c t o r s ，p b i c r ea n dp b i - s v 4 0 n l s - c r ei nw h i c hs v 4 0 n l sw a sf u s e dt ot h en - t e r m i n u so f c r eg e n e ， w e r ei n t r o d u c e di n t o t r a n s g e n i c t o b a c c o c o n t a i n m m g v e c t o r p l f - g n w i t h l o x p f r t - 3 5 s g u s ：n p t h l o x p f r t f r a g m e n t ，r e s p e c t i v e l y , v i aa g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n d e l e t i o ne f f i c i e n c i e so ft h et r a n s g e n e si nt r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t sw e r ee x a m i n e d b yg u sh i s t o c h e m i c a ls t a i n i n go ft h et r a n s g e n i ch a i r yr o o t s 1 1 1 er e s u l t sr e v e a l e dt h a ta d d i t i o no fa n n 4 e r m i n a ln l sd i dn o ti n c r e a s ed e l e t i o ne f f i c i e n c yo fc r er e c o m b i n a s ei nt r a n s g e n i ct o b a c c o ，b u t p r o m o t e dt h el o c a l i z a t i o no ft h ec r ep r o t e i ni n t ot h en u c l e u s ，r e s u l t i n gi naf a s t e rr e c o m b i n a t i o n r e a c t i o n k e yw o r d s ：g m - g e n e - d e l e t o rs y s t e m ，n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l , s v 4 0 n l s ，c r e ， f u s i o np r o t e i n i v 缩略词表 缠 曼 一j t l 一 3 5 sc a m v3 5 sp r o m o t e r a m p a m p i c i l l i n b p b a s e p a i r ( s ) b s i a b o v i n es e r u ma l b u m degree c e l s i u s c a m v c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s c e f c e f o t a x i m e c m c e n t i m e t e r c r e i c a u s e sr e c o m b i n a t i o n c t a bc e t y l t r i e t h y la m m o n i u m b r o m i d e d n ad e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d n t pd e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d f l p f l i p p i n gd n a f r t f l pr e c o m b i n a t i o nt a r g e t g f p g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g m g e n e t i c a lm o d i f i c a t i o n g u s 1 3 - g l u c u r o n l d a s e k bk i l o b a s e p a i r ( s ) ll i t e r ( s ) l o x p l o c u so fc r o s s i n go v e ri np i r a i nm i n u t e ( s ) m m o lm i l l i m o l a r ( s ) m o lm o l a r ( s ) n g n a n o g r a m ( s ) n l s n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns e q u e n c e n o s n o p l i n es y n t h a s e n - p t i i n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e i i o d o p t i c a ld e n s i t y o l i g o o l i g o m e r p v p p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e r n a r i b o n u c l e i ca c i d r p l2 5 r i b o s o m a lp r o t e i nl 2 5o ft h ey e a s ts a c c h a r o m y c e s e a r l 8 b e r g e n 8 1 8 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s s c s o d i u mc h l o r i d e s o d i u mc i t r a t e s v 4 0 s i m i a nv i r u s 4 0 t e t r i s - e d t ab u f f e r t r i st r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e uu n i t ( s ) l a g m i c r o g r a m ( s ) i t lm i c r o l i t e r ( s ) + p m o l m i c r o m o l a r ( s ) - x g l u c 一i ：坠翌翌2 ：垒：坠1 2 翌：i 璺垒2 z ! ：巨：旦：g ! 旦呈坚型2 型l 一 _ _ _ _ - - _ _ _ - - _ _ _ - _ _ _ _ - _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ 一 独创性声明 学位论文题目：且盈丕回堕坠兰挝重组鳖删险教室墅煎鲍塑生盟究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了标注。 学位论文作者： 寄卟 签字日期： 渺潍 钿乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：督斟 、i 签字日期：沙7 年钼 导师签名：骘至耐 i ，多日 签字日期：1 年多月，乡日 成果声明 本人声明所呈交的学位论文及取得的研究成果是本人在导师指 导下进行的研究工作。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一起工作的同志对本研究所作的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示感谢。 本学位论文成果是本人在西南大学生物技术中心读书期问在导 师指导下取得的，论文成果归西南大学所有，特此声明。 指导教师： 研究生： b 皇蚂 胥竹 p 7 年 6 其f 毛日 第一章文献综述 11 转基因植物生物安全性问题 在全球范田内由于人i 1 急剧增长，- 叮耕作土地资源迅速减少，以及生态环 境几益恶化，目前仪靠传统农业生产技术已不能有效地提高粮食的产量，满足人 们日益增长的需求。 自第一例转蔡囚烟草( z a m b r y s k e ，1 9 8 3 ) 诞生以柬随着基凼工程技术的发展， 转基因植物及其产品大量问1 廿在世界范围内掀起了生物技术发展的一个高潮。 据i s a a a ( t h e i n t e r n a t i o n a ls e r v i c e f o r t h e a c q u i s i t i o no f a g r i - b i o t e c h a p p l i c a t i o n s 农业生物技术廊用国际1 叠 务组织) 统计2 0 0 8 年全球转基因作物种植面积达到了 1 25 亿公顷，从1 9 9 6 年到2 0 0 8 年全球转基因作物种植面积累计达到8 0 亿公顷 ( j a m e s ，2 0 0 8 ) ，见图i1 。目前在世界范围内，转基因植物的种植面积仍在飞 速增加，转基囚技术给人类带柬的好处日益凸现，植物转基因技术已在农业生产 中掀起了一场新的革命，成为了世界上增加粮食产量、减少环境污染最重要的手 段之一。 ( - l o b l r ot 删 m _ 1 1 f j nh d t c 1q q 2 0 0 m 吧嚣：嚣嚣黑：嚣 t ：嚣囊篙警嚣：璺雾；“ 图1 1 全球转基因作物种植面积( 1 9 9 62 ( ) ( j an l c s 2 0 0 8 ) f i g l 12 l o b a la m io f i ，i t e c hc r o p s ( 1 9 9 6 2 0 0 8 ) ( j a m c x2 0 0 8 ) 但是，随着转基因作物产品的广泛应用，人们对转基因植物的生物安全性问 题越来越关注。这是由于在转基因作物中导入了抗虫、抗病、抗除草剂甚至抗生 素等基因，这蝗基因的存在是古会对生态环境和人类健康带来生物安全性问题， 目前人们尚不清楚。因此公众对这方面的担忧日益增加这己严重影响到了转 基因作物的大面秘商业化推广。 两南大学硕十 何论文 1 1 1 转基因植物生物安全性涉及的重要问题 目前人们对转基因作物生物安全性的担忧主要集中在两个方面：一方面是转 基因植物通过花粉扩散等方式，导致外源基因逃逸，可能对生态环境造成危害； 另一个方面是转基因植物食品可能对人类健康带来不利影响( 贾士荣，1 9 9 9 ) 。 环境安全性。环境安全性的核心是对生物多样性的影响，如转基因作物会跟杂草 和野生近缘种杂交，发生基因漂移，改变基因自然进化的模式；转基因作物自身 形成杂草或使近缘杂草转变为超级杂草，使自然种群发生变化( r i e g e r , 2 0 0 2 ) ；转基 因抗虫、抗病作物对有益捕食性昆虫、有益微生物产生负作用等( h i l b e c k ，1 9 9 8 ) 。 上述问题都可能给生态平衡和生物多样性带来灾难性的后果。食品安全性。首 先公众担心转基因产品中杀虫、抗菌基因以及过敏蛋白在食用时是否有毒性或引 起过敏反应。因为转基因产物本身可能含有过敏蛋白，如果转入蛋白与已知过敏 蛋白的氨基酸序列在免疫学上有明显的同源性，或转入蛋白的类蛋白家族中有的 成员是过敏蛋白都有可能引起交叉过敏反应( 贾士荣，1 9 9 7 ) 。其次，当转基因产 品所携带的选择标记基因是编码某些应用于临床或肠道抗生素的抗性蛋白质时， 它们是否可能被转移到微生物中从而增强病原微生物的抗药性，引起抗生素失效 ( y o d e r , 1 9 9 4 ) 。最近的一项研究发现，人体内微生物的某些基因能够水平转移到人 类基因组上，这可z 月匕l - , 对人类健康构成潜在危险( s c h l i e p e r , 2 0 0 5 ) 。 1 1 2 目前解决转基因植物生物安全性问题的手段 当公众对生物安全性日益担忧时，科学家们正在积极探索控制转基因生物安 全隐患的策略和方法，使转基因植物产品安全合格。这些研究主要集中在如何控 制和消除抗生素等筛选标记基因的生物安全隐患上。从理论上讲，提高转基因植物 中标记基因的安全性有3 种策略：完全不用标记基因；使用安全的筛选标记基 因；转化时使用抗性标记基因，转基因成功后将该基因彻底剔除。 1 1 2 1 无标记基因的安全策略 如果能够不使用标记基因就获得只含有目的基因的转基因植株，这是最直接有 效的获得相对比较安全的转基因植株的方法。然而当前所使用的植物转基因手段， 无论是基因枪法还是农杆菌介导法都存在转化频率极低的问题。如果不使用合适 的标记基因，则在后期难以筛选到含有目的基因的转基因植株。随着超强毒性农杆 菌菌株的发现和p c r 技术的普及，v e t t e n 等( 2 0 0 3 ) 结合应用强毒型农杆菌菌株、 p c r 鉴定筛选技术和优化的基因转化载体在没有使用标记基因的条件下获得大量 的含目的基因的转基因植株。但当前该方法仅限于特定的遗传转化菌种，并且仅 在马铃薯和木薯等植物中报道，后期筛选无标记基因又无载体骨架d n a 且仅含单 2 文献综述 拷贝t - d n a 插入的转基因植株，需要s o u t h e r n 等分子手段过程非常烦琐，其进一 步的推广还有较长的过程。 1 1 2 2 安全标记基因的策略 安全标记基因是指与传统的抗性标记基因相对应，无抗生素或除草剂等抗性 的基因，对生态环境和生物健康来说是相对安全的。目前常选用的无争议的生物 安全标记基因，如绿色荧光蛋白基因( g f p ) 、核糖醇操纵子( 脱) 和6 磷酸甘露糖异 构酶基因( p m l ) 等( 王兴春，2 0 0 3 ) 。虽然这些标记基因已在广泛使用，但是这种 策略无法解决目的基因( 如抗病基因) 可能带来的生物安全隐患。 1 1 2 3 抗性标记基因删除的策略 抗生素等外源基因删除的生物技术通常从两方面考虑： 一方面，为了防止外源基因逃逸带来的生态问题，比较可行的方法就是使转 基因花粉和种子不育或无籽，切断基因逃逸的途径。如：( d b a r n a s e ( 细胞毒素基 因) 技术。1 9 9 0 年m 撕a n i 等首次将细胞毒素基因b a r n a s e 在绒毡层细胞特异启动 子t a 2 9 引导下表达，导致了转基因植株花粉不育，得到了雄性不育株系。反义 r n a 等导致的雄性不育。1 9 9 2 年v a nd e rm e e r 等将合成花粉发育必需的类黄酮的 关键酶基因( 凹s ) 反义r n a 与c a m v3 5 s 启动子及花药特异性序列构建成嵌合 基因，获得了矮牵牛的不育系。种子败育或无籽技术。对于获得无籽果实的研 究，报道较多的是将单性结实基因导入植物，调控植物激素的合成，或者是通过 控制细胞毒素基因在种子形成中的特异表达，获得无籽果实( 高双成等，2 0 0 2 ) 。 另外一种使种子不育的方法是通过所谓的“终止子”技术( o l i v e r ，1 9 9 6 ) 。美国孟 山都公司为了保护植物品种而发展出来的一种技术，运用该技术可以使种子不育。 “终止子”技术的核心就是种子不育技术。其原理是：采用一个种子后期表达的特异 性启动子控制一个细胞毒素基因，在它们之间插入一段间隔d n a ，由于有了间隔 d n a 的存在，细胞毒素基因不会表达。而间隔d n a 可以被一个位点特异性重组 酶系统删除掉，该系统又受化学诱导启动子控制，当需要细胞毒素基因在种子中 表达时，加入少量的化学试剂就可以了。叶绿体转化技术。由于转基因植物中 外源基因逃逸主要是通过花粉或种子的扩散所引起的，而大多数植物的花粉和种 子中没有叶绿体存在，如果将外源基因导入到叶绿体基因组中，可以避免外源基 因的逃逸。虽然叶绿体的遗传转化难度很大，该技术近年也逐渐发展起来 ( d a n i e l l ，2 0 0 5 ) ，但在实际生产中应用的可能性还是较低。 另一方面为了实现转基因植物的环境安全和食用安全，主要是将外源基因在 不需要的时候从植物体内删除掉。删除外源基因的技术主要有：共转化系统 两南人学硕十学位论文 ( c o t r a n s f o r m a t i o n ) ，分别利用整合有目的基因和选择标记基因的d n a 共同转化来 消除标记基因。转座子( t r a n s p o s o n ) 技术，如基于a c d s 转座系统建立的转化系 统，当a c 转座酶存在的情况下，非自主型d s 转座成分仍可激活发生转座。位 点特异性重组酶( s i t e s p e c i f i cr e c o m b i n a s e ) 技术，如利用噬菌体p 1 c r e l o x 位点持 异性重组系统，c r e 基因通过转化或有性杂交整合到事先整合有l o x 基因的植物基 因组的l o x 位点上，消除克隆在两个3 4 b pl o x 序列间的外源基因。已报道的这些系 统，均存在删除外源基因的效率低、删除外源基因的周期长等缺点，远不能满足田间 大规模种植的转基因作物安全性控制的需要相对而言，在这些技术中，位点特异性 重组酶技术在转基因植物中研究较多、应用最为广泛( 罗克明，2 0 0 4 ) 。 1 2 位点特异性重组系统 重组是现代生命科学的两大重要技术之一，分为同源重组，位点特异性重组， 非同源重组以及转座重组( 王关林，2 0 0 4 ) 。位点特异性重组( s i t es p e c i f i c r e c o m b i n a t i o n ) 是指在重组酶介导下，在特异的重组位点间发生重组，导致重组位 点间交换的一种精确重组。该系统可克服传统基因工程技术的一些局限性，对基因 进行定时、定位的改造，并可进行大片段的染色体改造工程( 易厚富，1 9 9 9 ) 。位 点特异性重组技术已成为现代生命科学中研究基因敲除与靶向整合的工具，在转 基因植物安全问题上是一类很好的删除抗性标记基因的工具。 1 2 1 位点特异性重组酶的种类 位点特异性重组系统由介导基因重组的重组酶和相应的特异性位点组成。重 组酶是来源于细菌或酵母，可识别特异位点发生精确重组的一类酶。根据序列的同 源性及催化氨基酸的特性，重组酶可分为酪氨酸和丝氨酸两大家族( g r o t h ，2 0 0 4 ) 。 迄今发现的重组酶虽然已有几百种，但对于研究真核生物体内基因组，应用于异 源细胞环境中d n a 分子的操作的系统有：a 酪氨酸家族：a 来源于噬菌体p 1 ( b a c t e r i o p h a g ep 1 ) 的c r e 酶，识别位点l o x p ( h o e s sr e ta 1 ，1 9 8 4 ) ；b 来源于发芽 酵母( s a c c b a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的2 “环状质粒编码的f l p 酶( v e t t e rd e ta 1 ，1 9 8 3 ) ， 识别位点是f r t ；c 来自酵母( z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i i ) p s r l 质粒编码的r 酶，位 点为r s ( o n o u c h i ，1 9 9 1 ；s e r r emc e ta 1 ，1 9 9 2 ) ；d 来自噬菌体m u 的经修饰过的g i n 酶，识别位点是g x ( m a e s e rsa n dk a h m a n nr ，1 9 9 1 ) 。b 丝氨酸家族：来自链霉 菌噬菌体( s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s ) 的o c 31 ，识别两个不同d n a 序y u - 3 4 b p 的a t t b ( b a c t e r i a la t t a t c h m e n ts i t e ) 位点与3 9 b p 的a t t p ( p h a g ea t t a t c h m e n ts i t e ) 位点。 4 文献综述 1 2 。2 位点特异性重组酶的作用机制 位点特异性重组酶系统根据识别位点方向和位置的不同，能够产生3 种效应， 分别为：若一对反向识别位点位于目的基因的两端时，在对应重组酶的作用下， 识别位点问的所有基因将发生倒位( i n v e r s i o n ) 。当一对同向识别位点位于目的 基因的两端时，其相应的重组酶将删除( e x c i s i o n ) 识别位点之间的所有外源基因 和一个识别位点。如果识别位点分别位于细胞中不同的染色体上，那么在对应 重组酶的作用下，两条染色体可以在识别位点的位置发生染色体片段的互换，产 生杂合的染色体，即易位( t r a n s l o c a t i o n ) 。具体过程见图1 2 中所示意( v o z i y a n o v p ，a 1 9 9 9 ) 。 图1 2 位点特异性重组酶系统工作示意图( v o z i y a n o vd 巩1 9 9 9 ) f i g 1 2 a s c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f s i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o ns y s t e m ( v o z i y a n o v e t 以1 9 9 9 ) 1 2 3 位点特异性重组系统在植物生物安全控制的应用 目前，在植物生物安全控制上应用较多的位点特异性重组酶系统主要是酪氨酸 家族的三大大系统：噬菌体p 1 ( b a c t e r i o p h a g ep i ) 的c r e l o x p ；酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 2 1 a 质粒的f l p f r t ，以及z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i i 的r r s 系统。而上 述各系统中噬菌体p l 的c r e l o x p 是应用最为普遍，研究最为深入，在植物中应用 最为广泛的系统( 宋洪元，2 0 0 6 ) 。 1 2 3 1 位点特异性重组酶系统作用原理 酪氨酸家族完成重组过程所需元件仅仅包括：重组酶( r e c o m b i n a s e ) 和该重 组酶能特异识别的位点( r e c o g n i t i o ns i t e ) 。其中，c r e 重组酶基因表达的是一个 3 8 k d 大小的蛋白质，它能特异识别位点l o x p ，调节l o x p 位点内和位点间的特异性 重组。l o x p 是一段3 4 b p 的d n a 序列，两端是两个1 3 b p 的反向重复序列，中间有 一个8 b p 非对称间隔区域。4 8 k d 的f l p 重组酶特异性识别重组酶位点f r t , 调节 其分子内与分子间的特异重组。f r t 与l o x p 的碱基序列如图1 3 所示。 两南大学硕十学何论文 它们的工作原理十分简单，过程为：重组酶识别基因组中对应的特异性识别 位点，并与之结合形成“h o l l i d a y ”结构；然后重组酶c 端酪氨酸残基的羟基发生亲 核攻击，破坏识别位点中不对称8 b p 序列两端的磷酸键；随后重组酶4 个单体发 生脂基转移，将位于识别位点间的d n a 片断和1 个识别位点删除；最后，基因组 d n a 重新连接，完成重组( v o z i y a n o v e ta 1 1 9 9 9 ) 。 厂 ，r 丁：5 ，。g a a g t t c c t a t t cl t a c g t t a a lg t a t a g g a a c t t c 3 i o x p ：5 _ a t a a c t t c g t a t ai t c t a g a a al t a t a c g a a g t t a t 3 _ l k , i 一 b i n d i n gs i t es p a c e rb i n d i n gs i t e 图1 3 特异识别位点f r t 与l o x p 的碱基序列 f i g 1 3t h es e q u e n c eo fl o x pa n d ，r r s i t e s 1 2 3 2c r e l o x p 系统在植物生物安全控制上的应用 通过位点特异性重组系统，删除转基因植物中的选择标记基因，是目前在植 物安全控制上研究的主要策略。它所基于的基本原理是：将选择标记基因构于两 个同向特异性重组位点之间，选择标记基因完成转化组织筛选的作用后，利用重 组酶介导发生特异位点问的序列重组，删除选择标记基因。 自从d a l e 等( 1 9 9 0 ) 首次利用位点特异性重组系统( c r e l o x p ) 在转基因烟草中 实现选择标记基因h y g ( 潮霉素基因) 的剔除，c r e l o x p 系统在烟草、玉米、水稻、 小麦以及拟南芥等多种植物实现标记基因的删除的报道越来越多。r u s s e l l 等( 1 9 9 2 ) 证实c r e l o x p 系统在烟草与番茄基因组中的删除作用。2 0 0 1 年，t t c 等将重组酶 c r e 与特异识别位点l o x 分别构建表达载体转化水稻，获得转基因植株后进行杂交， 得到l o x 位点间的标记基因h y g ( 潮霉素基因) 的删除杂合子，证明了c r e l o x p 系统 能够在水稻基因组中作用。 以上这些早期研究，都是通过二