（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕前纤维蛋白的亚细胞定位及其表达分析.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 摘要 前纤维蛋白是一种低分子量肌动蛋白结合蛋白，它的高级结构主要包括三 个保守的结合域，分别为肌动蛋白结合结构域，多聚l 一脯氨酸结合结构域和磷 脂酰肌醇结合结构域，这三个结构域成为前纤维蛋白行使功能的基础。目前发现 前纤维蛋白在一些细胞过程中如膜转运、小的g t p a s e 信号途径、核内活性及神 经发生及分化和肿瘤形成中起重要作用。广泛存在的前纤维蛋白与很多不同的配 体相互作用，包括多聚磷脂酰肌醇、肌动蛋白、肌动蛋白相关蛋白及聚脯氨酸蛋 白，前纤维蛋白可能通过特异的方式连接到不同的信号通路。 我们从本实验室构建的家蚕c d n a 文库中获得家蚕前纤维蛋白c d n a ，命名 为b m p f n ，其开放阅读框长度3 8 1b p ，编码由1 2 6 个氨基酸残基组成的肽链。 经d n a s t a r 软件计算分子量为1 3 7k d a ，等电点为6 11 。多序列比对结果显示其 与赤拟谷盗( t r i b o l i u mc a s t a n e u m ，鞘翅目) 的前纤维蛋白同源性最高，1 2 6 个氨基 酸残基中有1 0 5 个一致，同源性为8 3 。设计p c r 引入e c o r i 和n o t i 酶切位点， 双酶切连入表达质粒p g e x 5 x 1 ，成功构建重组质粒p g e x 5 x 1 b m p f n 。将重 组质粒转入b l 2 1 ( d e 3 ) 并诱导表达，经s d s p a g e 鉴定在约4 0k d a 处有明显的 表达条带，与预测的g s t - p r o f i l i n 融合蛋白大小相符。融合蛋白先后经s e p h a d e x g 5 0 分子筛层析及g s t 亲和柱纯化至s d s p a g e 检测为一条带。用纯化的融合 蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，间接e l i s a 法测得抗体效价为1 ：3 2 0 0 0 ，用 重组菌表达总蛋白做w e s t e r n b l o t t i n g 检测呈一条带。利用多克隆抗体对家蚕细胞 b m 5 进行亚细胞定位研究表明b m p f n 主要分布于细胞质中。同时也进行了荧光 定量p c r 分析不同组织及发育时期该基因的表达差异，定量内参选用1 8sr r n a ， 结果显示在各组织中丝腺表达量最高，生殖器表达量次之，脂肪体中的表达量最 低；在卵、幼虫、蛹和蛾四个发育时期中，幼虫的表达量最高，蛹次之，蛾中较 少，卵中表达量最少。r n a 干扰实验显示b m p f n 在家蚕细胞正常的增殖中起 重要作用。本论文第一次对家蚕的前纤维蛋白进行了克隆表达及功能的研究，为 今后家蚕前纤维蛋白的研究创造了条件。 关键词：前纤维蛋白；肌动蛋白；表达分析；亚细胞定位；定量p c r i i i 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t p r o f i l i ni sak i n do fl o wm o l e c u l a rw e i g h ta c t i nb i n d i n gp r o t e i n i t ss t r u c t u r e c o m p r i s et h r e eh i g h l yc o n s e r v e db i n d i n gd o m a i n s ，w h i c ha r ea c t i nb i n d i n gd o m a i n ， p o l y - l - p r o l i n e ( p l p ) s t r e t c h e sb i n d i n gd o m a i na n dp h o s p h a t i d y l i n o s t i t o lb i n d i n g d o m a i n ，a n dt h et h r e ed o m a i n sa r et h ef o u n d a t i o no fp r o f i l i n sf u n c t i o n s r e c e n t f n d i n g sh a v es h o w nt h ee v i d e n c eo fa r o l ef o rp r o f i l i n si nc e l l u l a rp r o c e s s e ss u c ha s m e m b r a n et r a f f i c k i n g ，s m a l lg t p a s es i g n a l i n ga n dn u c l e a ra c t i v i t i e s ，i na d d i t i o nt o n e u r o l o g i c a lf o r m a t i o na n dd i f f e r e n c i a t i o n ，t u m o rf o r m a t i o n p r o f i l i ni sf o u n di n c y t o p l a s ma n da l s oi nn u c l e u s t h eu b i q u i t o u sp r o f i l i nh a sa ni n t e r a c t i o nw i t h n u m e r o u sl i g a n d s ，i n c l u d i n gp h o s p h a t i d y l i n o s t i t o l ，a c t i n ，a c t i nr e l a t e dp r o t e i n s ，a n d p r o t e i n sr i c hi np l p a tp r e s e n ta na s s u m p t i o ni sr a i s e dt h a tp r o f i l i nc o n n e c t st oo t h e r d i f f e r e n ts i g n a lp a t h w a y si nas p e c i f ca n ds e l e c t i v ew a y t h ep r o f i l i ne d n af r o mt h es i l k w o r mp u p ae d n al i b r a r yi sn a m e db m p f n ， w h o s eo r fi s3 81b pa n dc o d e sap r o t e i no f12 6a m i n oa c i d s i t sm o l e c u l a rw e i g h t c a l c u l a t e db yt h ep r o g r a md n a s t a ri s13 7k d a ，a n di t sp ii s6 11 t h er e s u l to fm u l t i b l a s ti st h a ti th a st h eh i g h e s th o m o l o g yw i t ht r i b o l i u mc a s t a n e u m ，10 5o f12 6 a m i n oa c i d sa r ei d e n t i c a l ，a n dt h eh o m o l o g yi s8 3 t h ee n t i r eo r fw a so b t a i n e db y p c r ，a n de c o r i - n o t ir e s t r i c ts i t e sw e r ea d d e db yp c r 。t h eo r fw a sd i g e s t e db yt h e t w oe n z y m e sa n dl i n k e di n t op g e x - - 5 x 1t oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n tp l a s m i dp g e x - 5 x 一1 一b m p f n t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t ob l 2 1 ( d e 3 ) a n d i n d u c e dt o e x p r e s s t h ef u s i o n p r o t e i ng s t - p r o f i l i n s d s p a g e i n d i c a t e da n e x p r e s s i v eb a n dw i t ha na p p r o x i m a t e4 0k d ac o n s i s t e n tw i t ht h ep r e d i c t e dr e s u l t t h e f u s i o np r o t e i nw e n tt h r o u g hs e p h a d e xg 50a n dg s t a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yi nt u m t og e ta ne x c l u s i v eb a n db ys d s p a g e i m m u n i z a t i o no fr a b b i t sw i t ht h ep u r i f i e d f u s i o np r o t e i nt o p r e p a r ep o l y a n t i b o d yo b t a i n e dah i g ht i t e ra n t i s e r u m ( 1 ：3 2 0 0 0 ) w e s t e mb l o t t i n gw i t hr e c o m b i n a n te c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t o t a lp r o t e i ns h o w e dt h a tt h e a n t i s e r u mw a ss p e c i f i ct of u s i o np r o t e i ng s t - p r o f i l i n t h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n e x p e r i m e n tw i t hp o l y a n t i b o b yi n d i c a t e dt h a tt h ep r o f i l i nw a sm a i n l yd i s t r i b u t e di n 浙江理工大学硕士学位论文 c y t o p l a s m w ea l s ou t i l i z e dr e a lt i m ep c r t oa n a l y z et h ed i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n s i nd i f f e r e n tt i s s u e sa n dd e v e l o p m e n ts t a g e s t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ep r o f i l i nw a s e x p r e s s e dt h em o s tl o w l yi nf a t t yb o d ya n dt h em o s th i g h l yi n s i l kg l a n d i tw a s e x p r e s s e di nl a r v a ，p u p a ，m o t ha n do v a w i t had e g r e s s i v el e v e l w ef i r s t l ye x p r e s s e d t h ep r o f i l i ng e n ef r o ms i l k w o r m ，a n dw ea l s oh a da ni n i t i a lf u n c t i o n a la n a l y s i so ni t k e yw o r d s ：p r o f i l i n ；a c t i n ；e x p r e s s i o na n a l y s i s ；s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ；r e a lt i m e p c r v 浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本 人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用 的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的 内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律 结果由本人承担。 蓄螽鬻爹鲫 浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口在年解密后使用本版权书。 不保密口 学位论文作者签名：缛确 日期叼年3 月日 i i 指导教师签 日期： 浙江理工大学硕士学位论文 a m p b m i p f n b s a d a p i e d l a e l l s a g s t i p t g n c b l o p d o r f p a g e p c r p f n p 口2 p l p p v d f s b s s d s v a s p 缩略语 a m p i c i l l i n b o m b y xm o r ip r o f i l i n b o v i n es e n l ma l b u m i n 4 6 一d i a m i d i n o 2 - p h e n y l i n d o l ed i h y d r o c h l o r i d e e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d a l z y l n el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y g l u t a t h i o t ms - w a n s f e r a s e i s o p r o p y l t h i o - i - d - g a l a c t o s i d e n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n o - p h e n y l e n e d i a m i n e o p e nr e a d m gf r a m e p o l ya c r y l a m i d eg e le l e c 仃o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r o f i l i n p t d l n s ( 4 ，5 ) v 2 p o l yl - p r o l i n e p o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d e s i m u l t a n e o u sb i d i r e c t i o n a ls e q u e n c i n g s o d i u md o d e c y ls u l f a t e v a s o d i l a t o rs t i m u l a t e dp h o s p h o p r o t e i n 氨苄青霉素 家蚕前纤维蛋白基因 牛血清白蛋白 4 , 6 联脒- 2 苯基吲哚 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附实验 谷胱甘肽硫转酶 异丙基硫代一b d 一半乳糖苷 美国国立生物技术信息中心 邻苯二胺 开放阅读框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 前纤维蛋白 磷脂酰肌醇4 ，5 - 2 磷酸 多聚l 脯氨酸 聚偏氟乙烯 同时双向测序 十二烷基硫酸钠 血管扩张药刺激的磷酸篮白 浙江理工大学硕士学位论文 1 前言 第一章肌动蛋白抑制蛋白的研究进展 微丝是真核细胞中三种细胞骨架之一，它确定细胞表面特征，使细胞能够 运动和收缩，其动态变化对细胞正常行使生物学功能至关重要 1 2 l 。微丝在细胞 中的聚合解聚动态平衡受到很多调控因子的调控，其中肌动蛋白结合蛋白是一大 类重要的调控因子。前纤维蛋白是最早发现的肌动蛋白结合蛋白之一，存在于目 前发现的所有真核细胞，甚至牛痘病毒也编码一种前纤维蛋白相似蛋白【3 】。1 9 7 6 年t i l n e y 在从t h y o n e 精子中发现肌动蛋白非聚合形式的过程中意外地鉴定出了 前纤维蛋白，当时发现这种复合物包含肌动蛋白和一个1 6k d a 的蛋白，被命名 为“p r o f i l a m e n t o u sa c t i n ”，后来简写为“p r o f i l a c t i n ”。前纤维蛋1 ；t ( p r o f i l i n ) 是c a r l s o n 从术语“p r o f i l a c t i n ”中提出来的【4 】。前纤维蛋白的氨基酸序列在各物种间的同源 性并不是很高，但是它的高级结构却很保守【”】。前纤维蛋白调控肌动蛋白的聚 合解聚动态平衡，目前很多实验室正致力于研究前纤维蛋白调控肌动蛋白聚合的 模型。广泛存在的前纤维蛋白与许多不同的配体有着相互作用的关系，包括多聚 磷脂酰肌醇、肌动蛋白、肌动蛋白相关蛋白、及聚脯氨酸蛋白。前纤维蛋白通过 与不同配体相互作用，将不同的信号通路与肌动蛋白聚合解聚动态相连 8 , 9 1 。目 前发现前纤维蛋白在一些细胞过程中，如膜转运、g t p a s e 信号途径、r n a 剪接 及神经疾病和肿瘤形成中起重要作用【1 ”。作为一个在肌动蛋白组装中起关键作用 的调控因子，前纤维蛋白在植物细胞如花粉管和根毛的极性生长中也起到关键作 用1 1 h 。植物前纤维蛋白已经被鉴定为人对花粉及食物过敏反应的潜在过敏原 1 1 2 1 4 1 。前纤维蛋白在胞质和细胞核中都存在，尽管核内肌动蛋白的功能并不是很 清楚，但是核内微丝成份的存在表明微丝与核质动态有关，目前的报道表明肌动 蛋白参与染色质重构和r n a 转运 1 5 , 1 6 1 。 浙江理工大学硕士学位论文 2 前纤维蛋白分子结构与基因家族 2 1 前纤维蛋白的分子结构 | j 纤维蛋白在进化中是相当保守的，其分子量介于1 2 1 6k d a ，三维结构主 要由3 个旺螺旋和7 个p 折叠构成 i s 】( 图1 ) 。尽管不同物种间前纤维蛋白的氨基 酸序列同源性很低，但是目前发现的| j i 纤维蛋白都具有相似的高级结构，如人的 p r o f i l i n i 和p r o f i l i n l i 的结构几乎一样，只是表面电荷分布不同【1 7 】。 图1 1 人p r o f l l i n i 空间结构示意图1 1 ” f i g 1 1s t r u c t u r eo fh u m a np r o f i l i n i 前纤维蛋白的肌动蛋白结合结构域是第一个被了解的结构域，另外两个结 合结构域为：磷脂酰肌醇结合结构域，主要结合p i p 2 和p i p 3 1 9 - 2 1 1 ；多聚l 广脯氨 酸( p l p ) 结合结构域。后一个结构域由n 端和c 端d 螺旋组成，两个螺旋形成p l p 的结合槽 2 2 , 2 3 1 ( 图2 ) 。目前已经证明p i p 2 对前纤维蛋白与肌动蛋白和p l p 的结合 起调节作用 1 9 , 2 4 ，前纤维蛋白的这3 个结构域成为其行使生物学功能及进行修饰 调控的结构基础。 浙江理工大学硕士学位论文 图1 2 前纤维蛋白的3 个结合结构域6 i f i g 1 2t h et h r e ed o m a i no f p r o f i l i n 2 2 前纤维蛋白基因家族 大多数低等真核生物如酵母只有一个基因编码前纤维蛋白口5 1 ，但兼性单细 胞阿米巴d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m 是一个有趣的特例，因为它有3 个前纤维蛋白 基因，目前对其中两个已经比较了解2 6 1 。在大部分多细胞真核生物中，要么i j 纤 维蛋白基因数目在进化中得到增加，要么通过更复杂的转录调控方式来产生更多 的表达模式。如d r o s o p h i l a 的前纤维蛋白基因( c h i c k a d e e ) 具有两个启动子，其中 一个启动子为卵巢特异性表达，另一个则在各个组织中都表达2 7 1 。此外经拟南芥 转基因及瞬时表达分析发现莳纤维蛋白基因家族的第一个内含子对其表达模式 产生重要影响【2 引。 拟南芥中至少存在五个家族成员，p r o f i l i n i ，p r o f i l i n l i ，p r o f i l i n l l i ，p r o f i l i n i v 和p r o f i l i n v 。盘基网柄菌中已有两个l j 纤维蛋白被分离鉴定，即p r o f i l i n i 和 p r o f i l i n l i ，分子量上p r o f i l i n l 比p r o f i l i n l i 要大一些( 1 3 0 6 4d av s1 2 7 2 9d a ) ，等电点 也比p r o f i l i n l i 偏低0 l6 6 2v s7 2 6 ) ，这两个基因的核酸序列及氨基酸序列的同源 性都很低( 1 2 6 个氨基酸中6 8 个一致) ，只有靠近c 端和n 端的区域同源性较高。 小鼠和人中已经有四种前纤维蛋白被分离定性，第一个分离出的哺乳动物 4 浙江理工大学硕士学位论文 前纤维蛋白( p r o f i l i n l ) ，从胸腺中分离得到f 3 l 。进一步的表达分析显示p r o f i l i n i 在 整个胚胎时期表达，在成熟小鼠中存在于除骨骼肌之外的几乎所有类型的细胞和 组织中【2 9 1 。哺乳动物p r o f i l i n i i 是在对人脑c d n a 文库进行测序时发现的，它只 在发育中的神经细胞及已经分化的神经元中表达1 3 0 1 。p r o f i l i n i 和p r o f i l i n l l 表现出 相似的生化特性【3 1 】，但是人的p r o f i l i n i 肌动蛋白亲和性大于p r o f i l i n i i ，而牛的 p r o f i l i n i 与p r o f i l i n l i 的肌动蛋白亲和性却相反，这可能是因为种属特异性的缘故 阱】。与人类不同，小鼠脑中p r o f i l i n l i 转录子可以通过选择性拼接产生一个较小 的p r o f i l i n l i 形式( p r o f i l i ni i b ，最后3 2 个氨基酸与p r o f i l i n l i a 有所不同) ，p r o f i l i n l i b 只在特定的组织中表达并且表达量较低，更重要的是p r o f i l i n l i a 与p r o f i l i n i i b 的 配体结合特性及胞内分布有很大不同【3 2 l 。小鼠中p r o f l l i n i 和p r o f i l i n i i a 与肌动蛋 白的亲和性相似，但是对p i p 2 和p l p 有着不同的亲和力2 4 川。在体外实验中， 植物的前纤维蛋白表现出与动物肌动蛋白结合的特性 3 3 - 3 5 】，甚至在体内植物前纤 维蛋白可以挽救果蝇前纤维蛋白基因敲除后的致死性【3 6 】。第三个哺乳动物前纤维 蛋i 刍( p r o f i l i n l l i ) 与肌动蛋白及p l p 的结合特性与其它前纤维蛋白相似，目前认为 p r o f i l i n l i i 基因只在睾丸中表达【3 ”。而第四个哺乳动物| ； 纤维蛋i ；t ( p r o f i l i n l v ) 也是 一种睾丸特异的前纤维蛋白，尽管p r o f i l i n l v 与其它哺乳动物前纤维蛋白只有 3 0 的氨基酸同源性，然而数据库搜索表明它与前纤维蛋白的三个保守结构域有 明显的匹配现象。经n o r t h e r n b l o t 分析及原位转录杂交表明p r o f i l i n l v 与p r o f i l i n i i i 一样只在生殖细胞中转录，然而在大鼠睾丸发育及大鼠精子发生周期中， p r o f i l i n i v 与p r o f i l i n i i i 的表达时期不同【3 ”。 3 前纤维蛋白与配体的相互作用 3 1 已发现的配体 前纤维蛋白与配体的结合完全由其三个结合结构域决定，其中肌动蛋白结 合结构域负责与肌动蛋白结合，而另外两个结合结构域分别与富含p l p ( 多聚l 脯氨酸) 的蛋白质及磷脂酰肌醇( p i p 2 和p i p 3 ) 结合。尽管很早以前就已经知道前 纤维蛋白与p l p 结合，但是直到1 9 9 5 年才鉴定出第一个前纤维蛋白配体，富含 脯氨酸的血管舒张剂刺激磷蛋白( v a s o d i l a t o rs t i m u l a t e dp h o s p h o p r o t e i n ，v a s p ) 【3 ”。v a s p 能够促进肌动蛋白在微丝生长端聚合，并能防止帽蛋白的加帽作用， 浙江理1 = 大学硕士学位论文 前纤维蛋白能够增强v a s p 对生长端的保护作用f 删。最近几年，新发现的前纤维 蛋白结合蛋白的数目在急剧增加，这些蛋白质中的相当一部分可能像v a s p 或 m e n a ( m o u s e h o m o l o g o f d r o s o p h i l ae n a b l e a ) - - 样能够直接将前纤维蛋白与肌动蛋 白聚合相连，如新鉴定的配体p a l l a d i n ，它在募集前纤维蛋白到肌动蛋白聚合区 起重要作用f “i 。此外很多核输出受体、内吞调节因子、r a c 、r h o 因子及转录因 子也结合到前纤维蛋白上。尽管这些相互作用中有很多还未被证实其生理作用， 但是与前纤维蛋白相互作用的蛋白质及其复合物组成的鉴定，使得前纤维蛋白在 细胞中未知的作用越来越被人们所了解。此外，在一些病原体中也发现存在配体 与i j 纤维蛋白的结合。如l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s 表达的a c t a 蛋白是一种前纤维 蛋白结合蛋白，它能诱导肌动蛋白聚合，使细菌在细胞质中运动4 2 1 。 表1 1 已发现的前纤维蛋白配体i i o l t a b l e1 1l i g a n d so f p r o f i l i ni d e n t i f i e ds of a r p r o f 目i n | 和，罐s p a r e l y c i t l l u k t rp m h w n y 再黼it 饼娃- 咖 v a s t k c e i v l p l 畦缸 s - 觯t i 艟 g e e p h y f l f l ， d 惜瓣讯 c 融n i n i i p h i l l n 糯m 豫竹概赫” 【h 0 n w p c l 椭r l n i 却r o 辨如 h u n t m g h n b v n a i l 煳舯i n a n n # 撕n i p a k r h oo r 畦列2 簟n 曩l l 嶝 p o p 1 3 0o rc y 辩p r o c k m d i 嘲黼o 炜 f r l w a s p w l p w a v e c i t m n - n a 扛鑫 h m 2 甜 h 4 ， n u c k i a r p 潮* i 投 p m f l p m f 2 i 畸o f l p r o f 2 l f l ，删嚣 l 蜘| 州秘 i f l 。耐 p m f l 甜嘏 p r o f l ，“碱 p m f 2 m 1 p 耐 升辨2 p m f 2 p r o ( 2 轴托州尉 h m p r 耐2 p r 埘 埘蝌2 p 坩科t 绍 e r o t l m 搬 p r o f l p r o f l 州堪性 p r o f 2 p r o f l 删2 p 嘲2 p j c l v a n ；m 心np _ h f l n d i n g f o c a l 街# “目e 博 m l ( ；o n l 3 4 b i 轴删t l u m f i 嘴 o n d l t t i ct 扛 n l i v - | k l r i l 6 0 t i n g a t r l _ , , n t l wr 蝴p t o r # d 目a 州 e 慨￥m s i l n d a “均摹i l v 翻l i c i * t m l i d d n g w m c l it f l f l a i n g n 矗a n 黼垂i 确m b r t m f f i c i l t i n 口 # _ k ，慨i k x 喇m 凡脯r 抽4 u 墙r 口w l h f 铂。丸m m r i m m t o f 口啪 f i 曲mf u m 渊乏d o 引a m v a t i o n * 坊帮j g a 耐 f h m ，i t c t i “q 姐翻 衙a 蚓o f g o n t z a l t j o n 妇，a n dr a p l a m e m b r a n e m e m , 1 w a n ot m f l k “帕 x p o i n0p 耐 斜搬抽，- 硼h 擞整塑型! 曼筮鲤! 蔓壁登婴：鼎篓! 坠苎曼丝 6 浙江理。r = 大学硕士学位论文 图1 3 前纤维蛋白与其它分子的相互作用网络呻i f i g 1 3n e t w o r ko fm o l e c u l a ri n t e r a c t i o n so fp r o f i l i n 3 2 配体结合的调控 配体结合是前纤维蛋白的一个重要性质，通过与配体的结合将各信号通路 与微丝骨架动态相连接，大部分配体结合到前纤维蛋白n 端和c 端螺旋构成的 p l p 结合域。前纤维蛋白中结合配体所必需的结构目自u 还不是很清楚，所有的前 纤维蛋白配体都含有伸展的富含脯氨酸结构域，这对于结合前纤维蛋白来说是很 关键的。然而一个连续的脯氨酸结构并不足够，用合成的不同长度的多聚l 一脯 氨酸体外研究表明要高效结合至少需要一个d e c a m e ，但是这并不能推断到蛋白 质并用于判断配体的亲和能力，事实上很多配体有不超过三个或四个的脯氨酸重 复，有效的 i 纤维蛋白结合域似乎由包含这样的一致序列的重复：z p p x ( z 为p g 或a ；x 为任何疏水氨基酸) 【4 3 1 。 关于不同的纤维蛋白异构体结合配体的特异性已有报道，哺乳动物p r o f i l i n i 和p r o f i l i n l i 与配体的高特异性结合可能有更多的参数要考虑而不仅仅是p l p 结 合域。哺乳动物的p r o f i l i n i 和p r o f i l i n i i 结构已经研究得很清楚，它们的高级结构 浙江理工大学硕七学位论文 很相似。然而p r o f i l i n l 和p r o f i l i n l i 表面的电荷分布有所不同，这可能就是导致配 体结合的特异性的主要原卧3 1 j 。 前纤维蛋白与配体的结合必须是一个动态过程，一定存在一种机制使前纤 维蛋白在一定的生理条件下释放配体。在形成p r o f i l a c t i n 复合物时p i p 2 可以使肌 动蛋白释放，可能有相似的机制用来调控前纤维蛋白与配体的结合。动力蛋白 i 与p r o f l l i n l i 的相互作用受到p i p 2 调控，而m e n a - p r o f i l i n 或v a s p p r o f i l i n 复合 物的相互作用不受p i p 2 调控【6 j 。与m e n a 或v a s p 及其它配体的结合可能通过其 它的方式调控，例如通过前纤维蛋白或配体的磷酸化1 或其它修饰【4 5 1 ，前纤维 蛋白的磷酸化常发生在酪氨酸残基上，p h a s e o l u sv u l g a r i s 的i j i f 纤维蛋白可以直接 与p 1 3 k ( 磷酸肌醇3 激酶) 结合，体外结合分析显示p 1 3 k 以一种依赖于p l j p 结合 结构域内酪氨酸磷酸化的方式与前纤维蛋白结合【4 6 l 。 4 前纤维蛋白的作用机制 体外研究已经表明前纤维蛋白直接与肌动蛋白结合并通过与肌动蛋白单体 以1 ：1 形成复合物而抑制肌动蛋白聚合。然而当| j 纤维蛋白与g 肌动蛋白结合， 便促进g 一肌动蛋白上的a d p a t p 转化的核苷酸交换活性，靠此来补充a t p 一肌 动蛋白库，所以也促进肌动蛋白的聚合。新产生的肌动蛋白纤维由a t p 一肌动蛋 白组成，由于肌动蛋白的内源a t p a s e 活性，a t p 一肌动蛋白在纤维的旧末端慢慢 地转化为a d p 肌动蛋白。a t p 纤维受到g e l s o l i n ，c o f i l i n 等蛋白的保护，但是a d p 纤维端快速降解，这为细胞提供了一种调控肌动蛋白纤维转换的机制。其它的调 控肌动蛋白纤维长度的机制是加帽和封闭纤维的生长端，如加帽蛋白e a p g 和 c a p z 。除了加速肌动蛋白单体的核苷酸交换，前纤维蛋白也可以促进纤维自由端 去除帽蛋白后的延伸。f o r m i n s 是肌动蛋白组装的起始因子，也是组装过程中的 重要促进因子，能够促进a t p 一肌动蛋白上的a t p 的水解，过去的观点认为a t p 的水解可以提供能量加速肌动蛋白纤维的组装，而最新的研究表明a t p 的水解 对于f o r m i n s 促进肌动蛋白纤维的组装作用来说并不是必需的【4 8 铷1 。除了加速肌 动蛋白单体的核苷酸交换，前纤维蛋白也可以促进纤维生长端去除帽蛋白后的延 伸。纤维的自由端与前纤维蛋白一肌动蛋白复合物相连，结合l ； 纤维蛋白的肌动 蛋白被释放并添加到肌动蛋白纤维上。通过这种机制前纤维蛋白将肌动蛋白单体 浙江理 ：大学硕士学位论文 添加到生长的纤维末端4 7 1 ( 图3 ) 。 瓤动麓白纤箍生长端 o 口 l j l 动曩白扦雉蘑聚馥 o o 口 口 。 湖臼籼，o = 互互= o o o o 胁蝴白。舳卜嬲白 强懿纤髅白 口 图1 4 前纤维蛋白通过催化a o p - 肌动蛋白转化为a t p 一肌动蛋白而加速肌动蛋白聚合 f i g 1 ap r o f i l i na c c e l e r a t et h ep o l y m e r i z a t i o no fa c t i nf i l a m e n tb yc a t a l y z i n gn u c l e o t i d e s e x c h a n g e 5 前纤维蛋白的生物学功能 5 1 前纤维蛋白与膜转运 低等真核生物已经提供了足够多的证据证明前纤维蛋白在内吞和膜转运中 起作用1 5 1 , 5 2 1 。在哺乳动物细胞中，前纤维蛋白也涉及到膜转运，正如p r o f l l i n l 出 现在高尔基体囊泡上及p r o f i l i n i 依赖的d y n a m i n l l 募集到高尔基体上所证实的那 样，这种募集是高尔基体囊泡出芽所必须的1 5 3 。支持前纤维蛋白在内吞中的作用 的证据来自于小鼠脑的蛋白质组实验，这些实验第一次系统地提出了前纤维蛋白 配体结合的特异性。在脑中网格蛋白和富含v a l o s i n e 蛋白( v c p ) 也是p r o f i l i n i 复 合物的一部分，但是p r o f i l i n l l 只与d y n a m i n i ，s y n a p s i n 和n c k 关联蛋白n a p l 相互 作用。网格蛋白在细胞膜上的胞吞处组装形成包被点，v c p 与酵母的s e c l 8 同源， s e c l 8 涉及囊泡转运【5 ”。动力蛋白是一种g t p a s e ，位于芽泡的茎部，突触蛋白与 分泌囊泡相关，n a p 是一种膜结合接头分子。p r o f i l i n l i 能够通过与已知动力蛋白 i 配体如g r b 2 ，a m p h i p h y s i n 和e n d o p h i l i n 竞争调控动力蛋白的功能，通过这种方 法抑制内吞复合体的形成。 浙江理丁大学硕十学位论文 5 2 前纤维蛋白与胚胎发育 肌动蛋白的聚合一解聚动态在很多细胞功能中起重要作用，包括细胞分裂、 细胞运动及吞噬、细胞极性和细胞间接触。前纤维蛋白对肌动蛋白的聚合解聚 动态起关键性的调控作用，它可以根据信号转导上调及下调肌动蛋白聚合。前纤 维蛋白在这方面的重要性已经通过对盘基网柄菌”l 、果蝇 5 6 】、酵母【5 7 】及小鼠例 的基因敲除实验进行了验证，基因敲除之后它们都表现出严重的与肌动蛋白聚合 相关的问题。同时敲除盘基网柄菌p r o f i l i n i 和p r o f i l i n l i 后f 肌动蛋白含量增加， 胞质运动出现异常，运动能力降低，存活力下降。酵母i i i 纤维蛋白基因敲除后生 长缓慢，表现为温度敏感型，形状发生改变，比正常酵母细胞变大，并且细胞内 常存在多个细胞核，肌动蛋白组装调控失常。果蝇前纤维蛋白基因敲除实验中 加“”突变体在胚胎时期死亡，咖圳”突变体虽然能够存活，但是在卵母形成、 精子形成及刚毛形成方面存在严重缺陷，有丝分裂也受到严重影响，形成许多双 核细胞。小鼠p r o f i l i n i 对胚胎存活力的影响呈剂量依赖关系，p r o f i l i n i 完全敲除 的受精卵在受精后很快死亡：p r o f i l i n l l 只在神经系统中表达，敲除p r o f i l i n l i 基因 或过表达p r o f i l i n l i 基因会导致神经出芽的增加或抑制从而导致神经发育受阻。 在功能上前纤维蛋白是高度保守的，这在用植物和牛的前纤维蛋白做的 d d i s c o i d e u 互补实验可以证明 5 8 , 5 9 1 。 5 3 前纤维蛋白的核内功能 前纤维蛋白在细胞核内的存在已经有很多报道，我们可以推测前纤维蛋白 与肌动蛋自在r n a 剪接，染色质重构及转录调控中起重要作用【删。例如p r o f i l i n i 与一些亚核结构相关联，如核糖核蛋白和c a j a l 小体，前纤维蛋白抗体能干扰体 外剪接，表明p r o f i l i n i 在m r n a 前体的加工中起作用【1 2 , 6 0 1 。p r o f i l i n l 和p r o f i l i n i i 在细胞核中的作用通过它们与运动神经元生存蛋白( s u r v i v a lo fm o t o rn e u r o n ， s m n ) 的相互作用得以证实，在培养细胞中p r o f i l i n l 和p r o f i l i n l i 与s m n 共定位 于核上【6 3 1 ，s m n 通过富含脯氨酸序列与前纤维蛋白结合，在脊椎肌肉萎缩症 中s m n 的表达量明显下降，s m n 复合物在剪接小体s n r n a 的组装上起重要作 用，它确保将s m 蛋白正确地组装到靶r n a 位点上，对于正常调节r n a 拼接是 不可缺少的。同时的纤维蛋白也与很多转录调控因子结合，在荧光素酶分析中转 1 0 浙江理工大学硕士学位论文 录抑制因子p 4 2 哪( 一种m y b 相关的转录因子) 的活性被前纤维蛋白大大抑制，表 明前纤维蛋白能调控p 4 2 p 0 9 的活性进而对转录过程进行调控i 删。甚至发现前纤 维蛋白与呼吸道含胞病毒( r e s p i r a t o r ys y n c i t i a lv i r u s ，r s v ) 编码的转录因子磷酸蛋 白p 直接相互作用，前纤维蛋白的结合导致转录活性的增加【6 ”。此外前纤维蛋 白及肌动蛋白骨架在核转运中也起重要作用，前纤维蛋白对于正常的核输出是必 要的，核输出调控蛋白r a ng t p a s e 激活蛋( r a ng t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n ， r a n g a p ) 的正确定位受前纤维蛋白的控制。在对t r a d e s c a n t i av i r g i n i a n a 的前纤维 蛋白在各细胞周期的定位分析发现，除了在胞质中分布，静纤维蛋白在细胞间期 和有丝分裂前期特异聚集在核上：在前中期和后期，前纤维蛋白均匀地分布于胞 质中；在终期核膜及核基质重新形成，染色体解聚缩，前纤维蛋白又聚集到核上， 似乎前纤维蛋白的核上定位与核基质及核膜的存在与否有关1 6 6 1 可以推测核内前 纤维蛋白在控制肌动蛋白聚合动态及染色质聚缩解聚方面起重要作用。目前不清 楚的是关于核内前