（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕凋亡相关基因bmicad的表达及其功能研究.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口。 学位论文作者签名：马同 日期：2 0 卜年弓月乙1 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：吖队 一p 日期：砷f o 年月、日 浙江理工大学硕士学位论文 本研究由 国家8 6 3 计划课题 ( n o 2 0 0 7 a a l0 0 5 0 4 、 n o 2 0 0 7 a a 0 217 0 3 ) 和浙江省自然科学基金 ( n o y 3 0 9 0 3 3 9 ) 提供资助 浙江理工大学硕士学位论文 魉露军太梦 z h e jia n gs ci t e c hu niv ers it y 硕士学位论文 论文题目：塞蚕迥圭担差基国勉z 丝2 鲍麦达盈基功能巫窒 学科专业： 生物化堂皇盆王生物堂 作者姓名： 马且 指导教师：壬威 副教授 毯耀浏教授 递交日期： 2 q ! q ：兰 浙江理工大学硕士学位论文 - - _ 一一一 at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i t e c h u n i v e r s i t yf o rd e g r e eo fm a s t e ro fs c i e n c e t i t l e ：, e x p r e s s i o na n d f u n c t i o n a l a n a 1 y s i s o f b m 1 c a d g e n e i ，一 r e l a t e dt oa p o p t o s i si ns i l k w o r m , b o m b l ：x m o r i c a n d i d a t e sn a m e ： m 宝 s u b m i s s i o nd a t e ： 丛圣l2 q ! q 单位代码10338 研究生学号q 12q 丛01o30 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 i c a d ( d f p 钙) 基因在细胞凋亡过程具有重要的作用。在脊椎动物细胞中， d f f ( d n af r a g m e n t a t i o nf a c t o r ) 引起d n a 的断裂是细胞凋亡中的关键步骤， d f f 由蛋白复合体i c a d d f f - 4 5 和c a d d f f 一4 0 组成。i c a d 不仅可以抑制c a d 的d n a s e 活性，还具有分子伴侣作用。当细胞凋亡信号激活，效应酶c a s p a s e 3 被激活开始裂解i c a d ，释放c a d 进入细胞核从而引起d n a 裂解和核浓缩。 为了研究i c a d 在家蚕细胞凋亡过程中的作用，本研究通过提取家蚕五龄幼 虫组织的总r n a ，利用r t - p c r 的方法获得了b m l c a d 基因的e d n a 序列，该 e d n a 序列全长8 4 4b p ，含有一个5 2 2b p 的o r f ，编码1 7 4 个氨基酸残基，预 测分子量为1 9 6k d ，等电点为4 2 3 。将b m l c a d 基因片段克隆到大肠杆菌表达 载体p e t - 2 8 a ( + ) 相应的酶切位点中，得到重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) b m l c a d ，经p c r 、 酶切鉴定以及测序分析证实重组质粒正确。将该重组质粒转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，经i p t g 低温诱导( 2 5 ) 表达后，裂解菌体作s d s p a g e 分析，与 阴性对照相比在2 5k d ( 融合标签为3 8 4k d ) 附近有一条特异性蛋白条带，与 预测值相符。重组蛋白主要以上清溶解的形式存在，利用亲和层析的方法纯化重 组融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，e l i s a 检测该抗 体血清的效价可达到1 ：2 5 6 0 0 以上。亚细胞定位结果表明b m l c a d 在家蚕培养 细胞b i n 5 中主要分布在细胞质中。r n a i 、m t t 检测和d n a 片段化检测结果表 明8 m ，c 4 d 基因被干扰后会显著增加b m n 细胞的凋亡比例。蛋白互作研究结果 表明b m i c a d 与两个蛋白因子家蚕的d n a 超螺旋因子( d n as u p e r c o i l i n g f a c t o r ，s c f ) 和家蚕的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白( s e c r e t e dp r o t e i na c i d i ca n d r i c hi nc y s t e i n e ，s p a r c ) 相互作用。以上的研究结果表明，b m i c a d 具有抑制 细胞凋亡的作用，s c f 和s r 讯c 两个蛋白因子可能通过与b i n i c a d 的相互作用 分别在d n a 断裂和细胞凋亡这一过程中起重要作用。 关键词：家蚕；b i i l i c a d ；亚细胞定位；r n 础；蛋白互作 浙江理工大学硕士学位论文 e a n df u n c t i o n a la n a l y s i so fb m 。翻dgenexoressmna n l lu n c t m n n a l y s l sb m lg e n e e 0 il 4 r e l a t e dt oa p o p t o s i si ns i l k w o r m ，b o m b y xm o r i a b s t r a c t t h ei c a d ( d f f - 4 5 ) g e n ep l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so fa p o p t o s i s ( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) c l e a v a g eo fc h r o m o s o m a ld n ai n t on u c l e o s o m a lm u l t i m e r f r a g m e n t si sah a l l m a r ko fa p o p t o s i s ，w h i c hi sm e d i a t e db yt h ed n af r a g m e n t a t i o n f a c t o r ( d f f ) c o m p l e x d f fi sah e t e r o d i m e r i cp r o t e i nc o m p l e xc o n s i s t i n go fa4 5k d ( d f f 4 5 i c a d ) a n da4 0k d ( d f f 4 0 c p a n c a d ) s u b u n i t i c a d d f f 4 5a c t sa sa n i n h i b i t o rf o rd f f 4 0e n z y m a t i ca c t i v i t ya n dc h a p e r o n ef o rc a d d f f - 4 0d u r i n gi t s s y n t h e s i s i c a di sac a s p a s e 一3s u b s t r a t et h a tm u s tb ec l e a v e dt ob ei n a c t i v a t e da n d a l l o wc a d d f f 4 0t oe x e c u t en u c l e a ri n t e m u c l e o s o m a ld n a f r a g m e n t a t i o n b m l c a dg e n ew a so b t a i n e df r o mt h ef i f t hi n s t a rl a r v ao fb o m b y xm o r ib yr t - p c r t h eb m l c a de d n aw a s8 4 4b pi nl e n g t h ，c o n t a i n i n ga5 2 2b po p e nr e a d i n g f r a m e ( o r f ) ，w h i c he n c o d e dap r o t e i no f17 4a m i n oa c i d s ；t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h i sp r o t e i nw a se s t i m a t e dt ob e19 6k da n dt h ei s o e l e c t r i cp o i n tw a s4 2 3 t h eg e n e w a sc l o n e di n t ot h ep e t - 2 8 a ( + ) v e c t o r , a n do v e re x p r e s s e di ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a s h i s - t a g g e df u s i o np r o t e i n s ，i n d u c e db yi p t ga t2 5 t h er e s u l t so fs d s p a g e s h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a ss o l u b l ea n dw a sp u r i f i e db ym e t a l - c h e l a t i n g a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y r b m l c a dw a su s e dt og e n e r a t ea n t i b m l c a dp o l y c l o n a l a n t i b o d y a n t i b m l c a dp o l y c l o n a la n t i b o d yw a su s e dt od e t e r m i n et h es u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fb m l c a d i m m u n o s t a i n i n gi n d i c a t e dt h a tb m l c a d p r o t e i nc o u l db e f o u n di nc y t o p l a s mn e a rt h en u c l e u s o u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tr n a ic a ni n h i b i t b m l c a dg e n ee x p r e s s i o na n do b v i o u s l yi n c r e a s et h ea p o p t o s i sr a t eo fb m nc e i l s a h i sp u l l d o w na s s a yw a su s e dt of u r t h e rs t u d yt h ep o s s i b l ei n t e r a c t i o np r o t e i n sw i 也 b m l c a d t w op r o t e i n s ，d n as u p e r c o i l i n gf a e t o r ( s c f ) a n ds e c r e t e dp r o t e i na c i d i c a n dr i c hi nc y s t e i n e ( s p a r c ) ，w e r ef o u n dt oi n t e r a c tw i t hb m l c a d t h e s er e s u l t s s h o w e dt h a tb m l c a dc a ni n h i b i tt h ea p o p t o s i so fb m nc e l la n ds c fa n ds p a r c m a yp l a ya l li m p o r t a n tr o l eb yi n t e r a c t i n gw i mb r r d c a dd u r i n gt h i sp r o c e s s k e y w o r d s ：b o m b y xm o r i ；b m i c a d ；s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ；r n a i ；p r o t e i n i n t e r a c t i o n h 浙江理工大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 目录i i i 缩略语 第一章绪论1 1 1 细胞凋亡概述1 1 1 1 细胞凋亡的概念和意义1 1 1 2 细胞凋亡的过程和特征：1 1 1 3 细胞凋亡的检测方法2 1 1 4 细胞凋亡的诱导4 1 2i c a d 与细胞凋亡的关系的研究进展。5 1 2 1i c a d 的发现5 1 2 2i c a d 的结构和特性5 1 2 3i c a d 在细胞凋亡中的作用7 1 3 家蚕细胞凋亡的研究进展8 1 4 主要内容和技术路线9 1 4 1 实验目的和意义。9 1 4 2 研究的主要内容9 1 4 3 研究技术路线1o 第二章生物信息学分析1 1 2 1 生物信息学工具1 1 2 2 b m l c a d 基因的生物信息学分析。1 1 2 2 1b m l c a d 的基因序列1 1 2 2 2b m l c a d 的保守结构域分析1 2 2 2 3b m l c a d 蛋白性质的预测13 2 3 讨论l5 第三章b m l c a d 基因的克隆表达、纯化和多克隆抗体制备1 7 3 1 试剂与材料1 7 3 1 1 材料17 3 1 2 试剂1 7 3 1 3 试剂配制17 3 2 方法2 0 3 2 1 家蚕组织总r n a 的提取和e d n a 的合成2 0 3 2 2 引物设计和目的基因的获得2 1 3 2 3p c r 产物与表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 的双酶切2 2 3 2 4 连接反应2 3 3 2 5f _ c o l it g l 、b l 2 1 ( d e 3 ) 感受态细胞的制各( c a c l 2 法) 1 6 4 2 3 3 2 6 连接产物的转化2 3 3 2 7 重组克隆的筛选与鉴定2 4 3 2 8 序列的测定2 4 3 2 9 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达2 5 3 2 1 0 重组蛋白的镍柱亲和层析纯化i c e 一2 6 i i i 3 3 7w e s t e r nb l o t t i n g 检测3 2 3 4 讨论3 3 第四章b m l c a d 在家蚕培养细胞中的亚细胞定位3 5 4 1 材料与试剂3 5 4 1 1 材料3 5 4 1 2 试剂3 5 4 1 3 试剂的配制3 5 4 2 方法3 6 4 3 结果3 6 4 4 讨论3 7 第五章b m l c a d 基因的r n a i 对家蚕培养细胞生物活性的影响3 9 5 1 材料与试剂3 9 5 1 1 材料3 9 5 1 2 试齐0 3 9 5 1 - 3 试剂的配制3 9 5 2 方法4 0 5 2 1d s r n a 的合成4 0 5 2 2r n a i d s r n a 的转染4 1 5 2 3m t t 检测，4 2 5 2 4e l i s a 法检测细胞凋亡4 2 5 3 结果；4 3 5 3 1d s r n a 的合成4 3 5 3 2b m l c a dr n a i 的m t t 检测结果分析一4 4 5 3 3e l i s a 检测b m l c a dr n a i 对b m n 细胞凋亡的影响4 5 5 4 讨论4 6 第六章b m l c a d 蛋白的相互作用蛋白4 7 6 1 材料与试剂4 7 6 1 1 材料4 7 6 1 2 试剂4 7 6 1 3 试剂的配制4 7 6 2 方法：4 9 6 2 1 重组蛋白b m i c a d 的制备4 9 6 2 2b m n 细胞总蛋白的制备5 0 i v 浙江理工大学硕士学位论文 6 2 3h i s p u l ld o w n 5 0 6 2 4 双向电泳分析51 6 2 5 质谱分析。5 2 6 3 结果与分析。5 3 6 3 1b m l c a d 互作蛋白的s d s - p a g e 结果分析5 3 6 3 2b m l c a d 互作蛋白的双向电泳结果分析5 3 6 3 3b m l c a d 互作蛋白的质谱分析结果5 5 6 4 讨论。5 7 结论5 8 参考文献5 9 致谢6 5 在学期间发表的论文6 6 v 浙江理工大学硕士学位论文 缩略语 a pa m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 d a p i 4 - 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e 4 , 6 一联咪- 2 - 苯基吲哚 e d t a e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附实验 f c a f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t弗氏完全佐剂 f i af r e u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n t弗氏不完全佐剂 i p t g i s o p r o p y l t h i o p d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代- p - d 半乳糖苷 k a n k a n a m y c i n 卡那霉素 n c b in a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n美国国立生物技术信 息中心 o r f o p e nr e a d i n gf r a m e开放阅读框 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p d g f p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r 血小板衍生生长因子 s d s p a g es o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l ya c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s十二烷 基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 t e m e d n , n , n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e n ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺 b m s p a r c b o m b y xm o r is e c r e t e dp r o t e i na c i d i ca n d r i c hi ne y s t e i n e家蚕富含 半胱氨酸的酸性分泌蛋白 v i 浙江理工大学硕士学位论文 1 1 细胞凋亡概述 1 1 1 细胞凋亡的概念和意义 第一章绪论 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) ，又称程序性细胞死亡( p c d ，p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) ， 是细胞在自身凋亡基因的调控下发生的一种自主性的自杀现象【1 】。细胞凋亡是多 细胞生物正常生长、发育、分化过程中起重要作用，是自然发生受基因调控的细 胞死亡过程，与细胞衰老及细胞损伤密切相关【2 埘】。细胞凋亡对于多细胞生物个 体发育的正常进行以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用【5 】。 细胞凋亡现象最早是k e r r 在1 9 6 5 年观察到的，他发现结扎鼠门静脉后，电 镜观察到大鼠肝细胞在局部缺血条件下细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组 织中脱落并被吞噬机体吞噬，无炎症反应，当时他称这种现象为“皱缩型环死”【6 7 1 。1 9 7 2 年k e r r 等【7 t8 1 发表论文首次提出细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡研 究的真正开始。现在对细胞凋亡的机制已经有了基本的了解，但不少细节仍需进 一步阐明。细胞凋亡与疾病关系的研究己取得了较大的进展，细胞凋亡的研究成 果，将为人类某些重大疾病的治疗和控制提供有效的方法【9 】。 1 1 2 细胞凋亡的过程和特征 在细胞凋亡时，细胞可发生一系列形态学和生物化学的变化【1 0 1 。在形态学 上细胞凋亡发生的过程可分为三个阶段【1 1 1 3 】：( 1 ) 凋亡的起始。该阶段的形态 学变化表现为细胞表面的特化结构消失，细胞间的连接消失，细胞膜依然完整， 未失去选择性；细胞质中，线粒体基本完整，核糖体逐渐从内质网上脱离，内质 网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿 着核膜分布。( 2 ) 凋亡小体的形成。首先，核染色质断裂为大小不等的片段，与 某些细胞器一起聚集，被反折的细胞膜所包围。从外观上看，细胞表面产生了许 多泡状或芽状突起。然后逐渐分离，形成单个的凋亡小体；( 3 ) 凋亡小体逐渐被 周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。 细胞凋亡的生物化学变化：细胞染色体的d n a 断裂降解是细胞凋亡的显著 浙江理工大学硕士学位论文 特征之一【。d n a 双链在核小体与核小体的连接部位断裂，形成约1 8 睢- 2 0 0b p 的亚片段( 或其倍数的片段) 在琼脂糖凝胶电泳时呈现梯形l a d d e r 图谱【1 2 1 。 1 1 3 细胞凋亡的检测方法 基于细胞凋亡的形态学和生化特征发展了一系列的凋亡检测方法【1 3 】： 1 1 3 1 形态学观察 形态学观察检测是最直观的细胞凋亡检测方法。应用各种染色剂对细胞进行 染色，然后在显微镜下观察凋亡细胞的各种形态学特征。如丫淀橙( a o ) 1 1 4 j 染 色，用荧光显微镜观察，胞质呈红色荧光，活细胞核呈黄绿色荧光。凋亡细胞核 染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状突起及凋亡小体。透射电镜 观察，可观察到凋亡细胞核染色质固缩、趋边、凋亡小体的形成及凋亡小体被邻 近巨噬细胞吞噬等形态。本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典 型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征性的指标，客观性重复性差，本方法可用 于凋亡现象的初步观察，作为细胞凋亡的分析指标之一【1 5 1 。 1 1 3 2d n al a d d e r 检测 细胞凋亡的一个显著特征就是d n a 的断裂，d n a 的断裂出现在细胞凋亡 晚期。故可检测d n a 的断裂情况来检测细胞的凋亡。细胞凋亡过程中，内源性 核酸酶被激活，染色体d n a 链在核小体之间被切割，形成1 8 0 2 0 0 个碱基或其 整数倍的d n a 片段，将这些d n a 片段抽提出来进行电泳，可得到d n a 梯状条 带( d n a l a d d e r ) 。 1 1 3 3t u n e l 测定法 t u n e l 测定法，即d n a 断裂的原位末端标记法。细胞凋亡晚期中，核酸 内切酶在核小体之间剪切核d n a 产生大量长度在18 0 2 0 0b p 的d n a 片段。细 胞凋亡过程中，染色体d n a 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3 - o h 末端， 利用t d t 将由荧光素标记的核苷酸聚合到暴露的d n a3 o h 末端上，然后通 过酶联显色或荧光检测定量分析结果【1 6 】，从而在原位检测细胞核的d n a 断裂， 2 u n lb r o m i d e 染料。m t t 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞的线粒体中的 琥珀酸脱氢酶能使外源性的m t t 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( f o r m a z a n ) 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜( d m s o ) 能溶解细胞中的甲 瓒，用酶联免疫检测仪在4 9 0n l n 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数 量。在一定细胞数范围内，m t t 结晶形成的量与细胞数成正比。 1 1 3 5 抗体检测法 在细胞凋亡的过程中，一些特异性的细胞蛋白被激活或降解。这些蛋白的活 性和分子量变化，可以作为判断凋亡发生的依据。细胞凋亡发生时，是由于钙 镁依赖性核酸酶进入核小体间切割d n a ，产生1 8 0 2 0 0 b p 或其倍数的核小体片 段。而核小体由于与组蛋白h 2 a 、h 2 b 、h 3 和h 4 形成紧密复合物而不被核酸内 切酶切割【lo 】。采用双抗体夹心酶免疫法，应用抗d n a 抗体和抗组蛋白的单克隆 抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段 1 5 1 。 1 1 3 6 流式细胞分析 1 9 8 0 年，l a n g l o s i s 首先使用流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 分析了凋 亡细胞的染色体【l ，目前，国外己经研究出至少六种利用流式细胞术分析细胞 凋亡的方法，即h o e c h s t p i 染色法、乙醉抽提法、选择性光解法、末端标记法、 丫淀橙( a o ) 染色法、缺口平移法【1 8 】。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减 弱而右向角散射光增强或不变，前向散射光减弱反映了细胞的皱缩，而右向角的 改变反映了细胞核的骤缩和破裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均 减弱。由于细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱【1 8 ，1 9 1 。所以， 只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。 浙江理工大学硕士学位论文 细胞凋亡过程中核酸内切酶在d n a 分子核小体间的断裂，导致小分子d n a 漏 出，核d n a 含量下降，细胞采用碘化丙啶( p r o p i d i n ei o d i d e ，p i ) 或a n n e x i n v 与p i 联合荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在d n a 直方图上正常二倍体 细胞的g 0 g 1 峰前出现一个亚二倍体( x u b 一( 3 1 峰，即a p o p t o t i c p e a k ) ，代表凋亡 细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。 1 1 4 细胞凋亡的诱导 诱导细胞凋亡发生的因素或因子有许多，大致可以分为三类： 1 1 4 1 物理因子诱导凋亡 诱导细胞凋亡的物理性因子主要包括：射线( 如紫外线u v 等) ，一定程度 的温度刺激( 如热激、冷激) 等，导致d n a 的损伤。u v 主要包括u v a ( 3 2 0 r i m 4 0 0 n m ) 和u v b ( 2 9 0 r i m 3 2 0 n m ) ) ，已经证明了u v 可以诱导表皮角质 化细胞的凋亡【2 0 】。长期在u v 条件下会导致肿瘤坏死因子的释放从而激活细胞膜 表面死亡受体及线粒体凋亡信号通路【2 1 1 ，从而诱导细胞凋亡。 1 1 4 2 化学因子诱导凋亡 诱导细胞凋亡的化学因子包括活性氧集团和分子( 如h 2 0 2 、超氧自由基、 羟自由基) ，细胞毒素等。过氧化氢能释放o h ，氧化细胞内大量的内容物，如 蛋白、d n a 、磷脂等，从而最终导致细胞的死亡瞄】。另一方面，h 2 0 2 可使死亡 受体通路活化，f a c c h i n e t t i 等【2 3 】证明，h 2 0 2 是通过诱导f a s 及其配体f a s l 的表 达增高而实现的。 1 1 4 3 生物因子诱导凋亡 生物因子包括肿瘤坏死因子( t n f - 0 【) ，正常因子的失调( 如激素、细胞生 长因子等) ，病毒等因子均可导致细胞凋亡。在某些靶细胞中，肿瘤坏死因子 ( t n f 0 【) 可诱导其发生凋亡，这些靶细胞表面具有与f a s 同源的t n f 受体【2 4 】。 还有许多抗肿瘤药物可诱导肿瘤细胞发生凋亡，如维生素e 类似物、哇啉衍生 物、大黄酸、当归等等 2 5 - 2 8 】。 4 浙江理工大学硕士学位论文 1 2i c a d 与细胞凋亡的关系的研究进展 1 2 1i c a d 的发现 1 9 9 8 年，e n a r i 等人在f a s 诱导的淋巴细胞中发现了一种不仅可以快速降解 细胞内d n a 而且可消化裸d n a 的物质，因为该物质是以一种前体的形式存在 于细胞中，需要c a s p a s e 3 的激活才可发生作用，因此该物质又称半胱天冬氨酰 酶激活的核酸酶( c a s p a s e - a c t i v a t e dd e o x y r i b o n u d e a s e s ，c a d ) ，其抑制剂为i c a d ( i n h i b i t o ro f c a d ) 1 1 2 。对于人类，c a d 的同源物为d f f 4 ( d n af r a g m e n t a t i o n f a c t o r 4 0 ) ，i c a d 同源物为d f f 4 5 ( d n af r a g m e n t a t i o nf a c t o r4 5 ) 2 9 1 。在非凋 亡的细胞中，c a d 与i c a d 以无活性的c a d i c a d 复合物形式表达于肾、肝、 脑等多种细胞中，当凋亡诱导物刺激c a s p a s e 级联活化后，c a s p a s e 对复合物中的 i c a d 部分进行切割，使c a d 从中游离出来而被激活，进而引起d n a 断裂和 染色质固缩1 2 3 0 0 5 1 。 1 2 2i c a d 的结构和特性 从鼠w r l 9 l 细胞和人j u r k a t 细胞中表达提纯到的i c a d 有两种结构形式 分别命名为i c a d l 和i c a d s ，i c a d l 含有3 3 1 个氨基酸，i c a d s 含有2 6 5 个氨 基酸，二者前2 6 1 个氨基酸是完全同序的( 图1 1 ) 【1 2 】。i c a d 根据在第5 内含子处 剪接方式的不同，i c a dm r n a 可以产生i c a d l 和i c a d s 两种m r n a ，其中 i c a d - lm r n a 含6 个外显子和5 个内含子；i c a d sm r n a 含5 个外显子和4 个内 含子，i c a d l 与c a d 结合，具有功能活性；而i c a d s 则主要以游离形式存在【3 2 3 3 。b l a s t 比对发现i c a d l 与人d f f 4 5 ( d n af r a g m e n t a t i o nf a c t o r4 5 ) 7 6 1 序 列完全相同( 图1 2 ) 【1 2 2 9 1 。i c a d l 和i c a d s 都为酸性蛋白，等电点约为4 5 , e 右，分子序y 0 中a s p l1 7 和a s p 2 2 4 为c a s p a s e 3 的作用位点【1 2 3 。c a s p a s e 3 可以 在a s p l1 7 和a s p 2 2 4 将i c a d d f f - 4 5 切割为三段【3 1 3 5 1 ，在i c a d d f f - 4 5 和 c a d d f f 4 0 c 鲇) n 的n 端具有约8 0 个氨基酸残基的n 端结构域( 图1 3 ) ，被称 为c i d e ( c e l ld e a t h - i n d u c i n gd f f 4 5 1 i k ee l e c t o r ，c i d e ) 3 3 - 3 s l 。该结构域保守性 极强，具有一定的保守位点，故将具有此类特殊n 端结构的细胞凋亡相关蛋白归 类为c i d e n 端结构域家族【3 8 t4 1 - 4 2 1 。i c a d d f f - 4 5 、c a d d f f - 4 0 通过c i d e - n 端保守结构域相互作用f 3 3 。4 2 1 。 也工。氏d s ： i 吐e a d - i ： 也丁= c a d s ： 峨工c a ) 一o ： m l c a d - e ：t 五w v e 露翰篷塑s r a 例商赫v 勰蕊怼乩s s ：强窜您啦锫述兰 碡z c 壳d l ： 一一一一一一- 一一一一，_ - _ ：二：二二 礴：c 茂d s ： 鞠蕾c a 臼一o ： 确童c a 0 一s ： 盈王c 2 0 l ： 蜮c a d - 髫： 瑚玉c a 一：- ： 图i i 鼠的i c a d l i c a d s 序列比对1 1 2 l f i g1 1c o m p a r i s o no fa m i n o - a c i ds e q u e n c e so fm o u s ei c a d sa n di c a d l - 工c 臼l ： 五d 彦p 0 4 5 ： 虹c 毒d l ： 五d 窭量o 5 ： l z c 囊d 氩z 囊d 霉譬一舔： 日盘c 量d l ： 五d 曾亨一5 ： ! 竺暨兰疑s 瓠s a 譬d p o d v 麓p 五k p c 五连珏l 精冀g 鼠3 q 目8 智a 置s s i l 雹2 工墨l s 冀菊d ：! e ：兰 m 匮v ：g 脯s 酋= 鬣锄髓q 正删辅国朗蹄涵粼。工腻淑g 暑口匹。云 翌翌嘲髓髋矾糊渤翟鞠髓t c 盟镪唧孵踢z a 册黝溅渤矗蔷 置正溉t 烈能踊u 逆骝t 鞠吼搬啪嬲瞻z 觑潮姐霉翰工 5 跚嫩翰柏献i ：三! ，罂：! 竺竺： s n q 譬s k 裔盘工s 毫e _ 辅茂坷端程团e 踟飘s 基亿王。r s o 工工t ! 工- k e a 目；蓉 协厢q s ：k 路s 弧s 鞠e 懿旺砌落潮您1 5 您丁s s 矾隋工国8 矗1 翟池矗嚣磊 ! ，氅：竺竺罨蕊s 8 龊湃s 髓跏憾幽嘞也渤z 端蹦跚胡螽c ：矬罐工融茹 埔张一鹪：溉鳓跚脚锶圆强酗娜氏硼疑掰跚帮嫡西c 已承斑函工i 三勘 虹c 铂扎：口s 强岛龇强r r s 现麒= ep 饼理髑臣醚弛s s h 瑚学。馅；： 够黼端柚嗡工翻埒k 忍s 翘崦0 域掇捌獭奢鼠0 0 鞭 图1 2 鼠i c a d - l 与人d f n 5 的序列比对1 1 2 l f