（无机化学专业论文）若干细胞色素b5突变体蛋白的性质研究.pdf

摘要 细胞色素b ，是一种电子传递蛋白，参与生物体内一系列氧化还原过 程：包括依赖于n a d h 的脂肪酸的脱饱和过程，细胞色素p 4 5 0 催化的氧化 还原反应和高铁血红蛋白的氧化还原作用等。细胞色素b ，由血红素b 辅基和 一条多肽链组成。整个分子在结构上可以分为两个部分：一个是由非极性残基 组成的疏水结构域，其功能是将蛋白固定在膜上；另一部分是含有血红素的亲 水结构域，具有电子传递的功能本文以胰蛋白酶消化的牛肝微粒体细胞色素 t k 为研究对象。该蛋白又可细分为两个亚结构域：一个以仪一螺旋为主的c o r e i ，和另一个以b 折叠为主的c o r e i i 。其中c o r e i 含有蛋白活性中心血红素b ， 主要参与各类氧化还原反应，而c o r ei i 则用以维持蛋白的结构稳定性。 本文集中研究了细胞色素b ，c o r ei 肽链上的氨基酸残基突变体，对蛋白 质c o r ei 的结构及其电子传递等性质的影响。 以往的研究表明细胞色素b ，在与其电子传递伙伴蛋白进行电子的传递过 程中，、其血红素暴露于溶剂一侧高度密集的带负电荷的氨基酸残基，与其电子 传递伙伴蛋白通过静电作用相互识别，从而进行电子传递。模型研究及实验表 明，细胞色素b ，表面参与静电识别的带负电荷的氨基酸残基及其作用方式并 不是只有一种方式。为了进一步研究静电作用对电子传递的影响，我们选择了 模型研究认为有争议的e 4 4 、e 5 6 两个位点进行突变所得到的三个突变体蛋白 e 4 4 a 、e 5 6 a 和e 4 4 5 6 a ，以及四点突变体蛋白e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 a 为研究对 象，并与明显改变电子传递反应驱动力的细胞色素b ，f 3 5 y 突变体相对照，分 别考察了所有突变体蛋白中血红素与蛋白肽链的相互作用，以及与细胞色素c 、 质体蓝素和小分子配合物【b 删h 3 ) ，r u l c t ，的电子传递过程。在进行表达和 纯化后，分别获得了高纯度的野生型及各突变体细胞色素b ，以及经过提纯获 得实验所需的肌红蛋白、脱辅基肌红蛋白、细胞色素c 、质体蓝素等蛋白，并 成功地合成了配合物( b z l m ( n h ，) ，r u c i ，) 后，我们依次进行了各种性质研究。 本论文第三章研究了细胞色素b ，与脱辅基肌红蛋白间血红素的传递反 应，考察了细胞色素b ，中血红素与蛋白肽链的相互作用，即血红素的稳定性。 实验结果如下： w t e 5 6 a e 4 4 a e 4 4 a e 4 4 5 6 a e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 a ，影响程度与表面负电荷的多少有累加关 系。但是我们注意到四点突变体的电子传递速率为1 1 4 x 1 0 7s 1m ，而野生型蛋 白为1 7 9 x 1 0 7s 1 m ，变化程度不是非常明显。说明静电作用对细胞色素b 。与 细胞色素c 的电子传导过程有影响但不是主要影响因素。由蛋白间的结合和电 i l 子传递的实验结果可见，静电作用同时影响了细胞色素b s 与细胞色素c 间的 结合和电子传递过程，但对结合和电子传递过程的影响又不完全一致。静态的 结合过程不能完全反映电子传递前体络合物的识别过程。 细胞色素b 。f 3 5 y 突变体明显改变了细胞色素b ，与细胞色素1 2 电子传递 的驱动力，表现出较快的电子传递速率。表明细胞色素b ，与细胞色素c 的电 子传递过程除受静电作用影响外，还与热力学驱动力相关。 此外在第五章，我们研究了野生型细胞色素b ，与质体蓝素及它们的突变体 间的电子传递反应。由于细胞色素b ，与质体蓝素并非天然的电子传递伙伴蛋 白，所以这是首次研究这两个蛋白间电子传递过程。实验结果发现，在热力学 驱动力大于细胞色素b ，和细胞色素c 的情况下，细胞色素b ，与质体蓝素间 的电子传递速率却远远小于细胞色素b ，与细胞色素c 之间的速率。当增加体 系的离子强度或减少细胞色素b ，表面的负电荷时，电子传递速率大幅度增加。 由于细胞色素b ；与质体蓝素蛋白表面均带有较多的负电荷，静电斥力较大， 两蛋白在溶液中不易相互接近，这可能是导致两蛋白间电子传递速率减慢的主 要原因。其中细胞色素b 。表面四点突变体蛋白的电子传递速率比野生型快了近 五倍，更进一步证实了上一解释。如果说静电作用影响了细胞色素b ，与细胞 色素c 间的电子传递，那么细胞色素b 。与质体蓝素间的电子传递是受静电作 用调控的。在对细胞色素b 。的f 3 5 y 、f 3 5 l 突变体蛋白与野生型质体蓝素和 野生型细胞色素b 。与质体蓝素y 8 3 l 和y 8 3 f 突变体蛋白的研究中发现，疏 水作用及热力学驱动力对蛋白间的电子传递反应作用较小，而主要表现为由静 电作用调控。至于细胞色素b 。与质体蓝素之间的电子传递途径，对细胞色素b 。 而言，是通过血红素暴露区还是疏水斑区，对质体蓝素而言，是通过分子“北” 端还是“东”端等问题，还需进一步的实验验证。 最后，在第六章中，我们尝试了细胞色素b 。与小分子配合物 b z l m ( n h 3 ) 5 r u c 1 3 的电子传递研究。在合成了 b z i m c n h 3 ) 5 r u c 1 3 ，并进行了 元素分析和光谱鉴定的基础上，我们研究了二者之间的电子传递反应。实验表 明细胞色素b ，与 b z i m ( n i - 1 3 ) ，r u c i ，的电子传递是一个非常复杂的过程。这 种奇特的电子传递现象，有待于进一步用其它方法研究。 一) ， 关键词：细胞色素b 。，电子传递，定点突变，静电作用 i i i a b s t r a c t c y t o c h r o m eb 5i sa h e m e p r o t e i n i n v o l v e di ne l e c t r o nt r a n s f e rw i t hav a r i e t yo f p r o t e i n s i nb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，w h i c hi n c l u d en a d h - d e p e n d e n td e s a t u r a t i o no ff a t t y a c i d ，c y t o c h m m ep 4 5 0 l i n k e dr e d o xr e a c t i o n ，a n dt h er e d u c t i o no fm e t m y o g l o b i n e t c t h en a t i v ef o r mo f c y t o c l l r o m eb 5c o n s i s t so f t w od o m a i n s ，o n ei sah e i n e c o n t a i n i n g h y d r o p h i l i cd o m a i n ，t h eo t h e ri sah y d r o p h o b i ct a i l ，w h i c ha n c h o r st h ep r o t e i nt ot h e m e m b r a n e t h et r y p t i cf r a g m e n to fc ”o c h r o m et b 5w a su s e di na l lt h es t u d i e s h e r e w i t h t h i sf r a g m e n ta l s oc o n t a i n st w op a r t s ：o n ei st h e n o n - p o l a r r e s i d u e s c o n s t i t u t i n gh y d r o p h o b i cc o r ei ，w h i c hi st h ea c t i v ec o m e ro fc ”o c h r o m et b 5 ，t h e o t h e ro n ei sc o r e 2 ，m a i n t a i n i n g t h es t r u c t u r a li n t e g r i t yo f t h e p r o t e i l l r e s e a r c hi nt h i st h e s i sf o c u s e so i lt h er o l ep 】a y e db yt h er e s i d u e sl o c a t e da r o u n d t h ec o r e1o i lt h e p r o p e r t i e so f t h es t r u c t u r ea n de l e c t r o nt r a n s f e ro fc ”o c h r o m eb 5 p r e v i o u s l ys t u d i e ss h o w e d t h a tt h en e g a t i v e l yc h a r g e dr e s i d u e sa r o u n dt h eh e m e e x p o s i n ge d g eo fc y t o c h r o m eb 5 w e r ei m p o r t a n ti n s t e e r i n ga n dd o c k i n gi t s r e d o x p a r t n e r i nt h ee l e c t r o nt r a n s f e r p r o c e s s m o d e l l i n g c a l c u l a t i o n sa n de x p e r i m e n t s s u g g e s t e dt h a ts e v e r a lr e s i d u e si n v o l v e di nt h er e c o g n i t i o no ft h ee l e c t r o nt r a n s f e r p a r m e r s ，a n dt h eg e o m e t r yw a sn o tu n i q u e i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to ft h e e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n0 nt h ee l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n s b o t ht h er e s i d u e sa t4 4a n d 5 6 ，w h i c hw e r ec o n t r o v e r s i a li n m o d e l l i n gs t u d i e s ，a r c s e l e c t e dt om u t a t e w e o b t a i n e dt h e e 4 4 a ，e 5 6 a ，e 4 4 5 6 a m u t a n t p r o t e i n s a s w e l la st h e e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 aq u a d r u p l em u t a n to fc ”o c h r o m e b ro n t h eo t h e rh a n d ，t h ef 3 5 y m u t a n to fc ”o c h r o m eb 5w a sa l s os e l e c t e dw h o s er e d o xp o t e n t i a lw a sd r a s t i c a l l y c h a n g e d a m o n g t h ef o l l o w i n g c h a p t e r s ，w ed i s c u s s e dt h ee f f e c t so f m u t a t i o n so nt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nc o r e1 p e p t i d ea n dh e i n ep r o s t h e t i cg r o u p ；o nt h ee l e c t r o n t r a n s f e rb e t w e e nc y t o c h o m e 也a n d c y t o c h r o m ec ，c y t o c h r o m eb sa n dp l a s t o c y a n i n ， a n d c y t o c h r o m eb 5a n d b z l m ( n h 3 ) 5 r u c 1 3e t c i v c h a p t e r3 c o n c e r n st h eh e m et r a n s f e rr e a c t i o n sb e t w e e nh o l o - c y t o c h r o m eb s a n da p o m y o g l o b i n ，w h e r et h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc o r e1p e p t i d ea n dh e i n eg r o u p w e r ei n v e s t i g a t e d t h eo r d e ro f t h es t a b i l i t yo f h e m eg r o u pi nt h ep r o t e i n si sf o l l o w i n g w t e 5 6 a e 4 4 a e 4 4 5 6 a e 4 4 a e 4 4 5 6 a e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 a a m o n gt h e m ，t h e r a t ec o n s t a n to ft h eq u a d r u p l em u t a n ti s 1 1 4 1 0 7s 1m ，a n dt h a to f w i l dt y p ec y t o c h r o m eb 5i s1 7 9 x 1 0 7s 。1 m t h em i n o r c h a n g e ss u g g e s tt h a tt h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o ni s o n eo ft h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h e e l e c t r o nt r a n s f e rp r o c e s s ，b u ti ti sn o tt h em a j o ro n e a l lt h e s es u g g e s t e dt h a tt h e r ei s n oc o r r e s p o n d i n gr e l a t i o n s h i pb e t w e e nb i n d i n ga n de l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n s t h e b i n d i n gc o n s t a n t sr e f l e c tat h e r m o d y n a m i cs t e a d ys t a t ei nt h ep r o t e i ns y s t e m ，w h i l e t h ee l e c t r o nt r a n s f e rr a t ec o n s t a n ta l et h ed y n a m i c p a r a m e t e r s t h ef 3 5 ym u t a n to fc y t o c h r o m eb 5 ，w h i c hh a sah i g h e rd r i v i n gf o r c ei n e l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o nw i t hc y t o c h r o m ect h a no t h e rv a r i a n t s ，s h o w st h eh i 曲e s t e f f i c i e n c y o fe l e c t r o nt r a n s f e ra m o n ga l lt h em u t a n t s i tc l e a r l yd e m o n s t r a t e st h a t e x c e p t t h ee l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n ，t h e e l e c t r o nt r a n s f e r p r o c e s s i sa f f e c t e d b y t h e r m o d y n a m i cd r i v i n g f o r c ea sw e l l m o r e o v e r , i nc h a p t e r5 ，t h ee l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n sf r o mf e r r o c y t o c h r o m eb 5 t op l a s t o c y a n i nw e r es t u d i e d b e c a u s et h e s et w op r o t e i n sa r en o tt h en a t i v ee l e c t r o n p a r t n e r s ，t h i s i st h ef i r s tt i m et o i n v e s t i g a t et h ee l e c t r o n t r a n s f e rb e t w e e nt h e m c o n t r a s tt ot h a to fe y t o c h r o m e b 5a n dc y t o c h r o m ec ，t h et h e r m o d y n a m i cd r i v i n gf o r c e b e t w e e nc y t o c h r o m eb 5a n dp l a s t o c y a n i ni sq u i t eh i g h ，b u tt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h ee l e c t r o nt r a n s f e rr a t ec o n s t a n tb e t w e e nt h e s et w op r o t e i n si sv e r y s l o w w h i l e i n c r e a s i n g t h ei o n i c s t r e n g t hi n r e a c t i o n s y s t e m s o rd e c r e a s i n gt h e n e g a t i v ec h a r g e so nc y t o c h r o m ek ，b o t hi n c r e a s e d t h er a t e so f p l a s t o e y a n i nr e d u c t i o n c o n s i d e r i n gb o t ht h es u r f a c e so f t h et w o p r o t e i n sh a v eq u i t eaf e wn e g a t i v er e s i d u e s ， t h ee l e c t r o s t a t i cr e p u l s i v ef o r c ei sq u i t es t r o n g t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t t h e s et w op r o t e i n sc a nn o tf o r mp r e - c o l l i s i o nc o m p l e xi ns o l u t i o ne a s i l y t h er a t e c o n s t a n to f c y t o c h r o m e b 5q u a d r u p l e m u t a n tt op l a s t o c y a n i ni sa l m o s tf i v et i m e sf a s t e r t h a nt h a to fw i l dt y p ep r o t e i n s c o m p a r i n gw i t l lt h es m a l ld i f f e r e n c e so ft h ee l e c t r o n t r a n s f e ri nc y t o c h r o m eb 5a n dc y t o c h r o m ecs y s t e m ，i ts u g g e s t e dt h a tt h ee l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o nc o n t r o l l e dt h er e d u c t i o no f p l a s t o c y a n i nb y c y t o c h r o m eb 5 d u r i n gt h el a t e r i n v e s t i g a t i o no ft h ee l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n sf r o mt h ef 3 5 yf 3 5 lm u t a n tso f c y t o c h r o m eb 5t op l a s t o c y a n i na n di nv e r s e ，f r o mc y t o c h r o m eb 5t ot h ey 8 3 f , y 8 3 l v i m u t a n t so fp l a s t o c y a n i n ，a l lt h er e s u l t sd i dn o ts h o wo b v i o u sc h a n g e so ne l e c t r o n t r a n s f e re f f i c i e n c y i to n c ea g a i nd e m o n s t r a t e dt h a tt h er e d u c t i o no fp l a s t o c y a n i nw a s c o n t r o l l e db ye l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s w h e t h e rt h ee l e c t r o nt r a n s f e rp a t h w a y , t ot h e c y t o c h r o m eb 5 i s t h r o u g ht h e h e i n e e x p o s e de d g e o rt h ef 3 5r e s i d u el o c a t e d h y d r o p h o b i cp a t h ；t ot h ep l a s t o c y a n i ni st h r o u g ht h e n o r t h p o l eo rt h e “e a s f p o l e e i sn o tc l e a r , w h i c hn e e df u r t h e rs t u d i e s a tl a s t ，i n c h a p t e r6 ，w et r y t o i n v e s t i g a t et h e e l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n s b e t w e e n c y t o c h r o m eb sa n d b z l r n ( n h 3 ) 5 r u c 1 3 ft h e b z i m ( n h 3 ) 5 r u c i s c o o r d i n a t e dc o m p l e xi s s y n t h e s i s e d ， a n dc h a r a c t e r i s e d b y e l e m e n t a l a n a l y s i s a n d p h o t o s p e c t r o s c o p i c d e t e r m i n a t i o n i nf a c t ，t h er e a c t i o nb e t w e e nt h e mi s v e r y c o m p l i c a t e d ，s ow em a y n e e dt of i n do t h e rw a yt oi n v e s t i g a t ei te x t e n s i v e l y k e yw o r d s ：c y t o e h r o m eb g e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n ，e l e c t r o nt r a n s f e r , s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s 第一章绪论 第一章绪论 一细胞色素b ，的生理功能 细胞色素( c y t o c h r o m e s ) 是生物体内一类重要的血红素蛋白 ( h e m o p r o t e i n s l ，存在于生物体的电子传递链中，参与生物体内一系列氧 化还原反应，提供生物体生存所必需的能量。k e l i n 于1 9 2 5 年首先提出 它们含有一个或多个血红素，通过血红素辅基中铁离子价态的可逆变化 实现其传递电子的生理功能。按照细胞色素所含血红素辅基的不同，可 将细胞色素蛋白分为a 、b 、c 、d 四大类。细胞色素b 5 ( c y t o c h r o r n eb 5 ，c y t b 。) ，其辅基为血红素b ，结构如图1 1 。它广泛地存在于生物的各种细胞 器和微粒体( o a r 触e l ，1 9 6 3 ) 中，如：高尔基体( i c h i k a w a 口，a ，】9 7 0 ) ，肝 i s o m e r a i s o m e r b f i g i i s t r u c t u r eo f h e m e b aa n dbr e f e rt ot h et w oh e i n eo r i e n t a t i o n so f c y tb 5w h i c h d i f f e rb ya18 0 。r o t a t i o na l o n gt h e0 吖- m e s oa x i s l e t t e r sa - hr e f e rt ot h el a b e l i n gs y s t e mt h a ti sd e f i n e d b y t h eh e i n e p o s i t i o na n di si n d e p e n d e n to f t h eh e m eo r i e n t a t i o n 第一章绪论 线粒体膜( r a we ta l ，1 9 5 8 ；s o t t o c a s a e t a l ，1 9 6 7 ) ，兔白细胞中性颗粒 f s h i n a g a z ae t a l ，1 9 6 6 ) ，肝核膜( f l e i s c h e re t a l ，1 9 7 1 ) ，酵母前线粒体( c r i d d l e e t a l ，1 9 6 9 1 等细胞器中。另外，在猪l 肾脏匀浆上清液( m a n g u me t a l ，1 9 7 0 ) 和哺乳动物的红细胞中( h u l t q u i s te ta l ，1 9 7 8 ) 也发现有细胞色素b ，的存 在。微粒体细胞色素b ，是一个结合在膜上的两亲性的氧化还原蛋白，与 黄素蛋白一n a d h 细胞色素b 。还原酶或n a d p h 细胞色素p 4 5 0 还原酶一 起，参与n a d h 链中脂肪酸去饱和过程( h i l d e b r a n d te ta l ，1 9 7 1 ；c a n o v a d a v i se l a l ，1 9 8 4 ；p e t e r s o ne t a l ，1 9 8 6 ) ( 图1 - 2 ) 。在红细胞中，细胞色素b 5 也 n a 矿 n a d h + r f i g 1 - 2 r o l eo fc y tb 5i nt h ee l e c t r o nt r a n s f e rf r o mn a d h t oc o aa n dh 2 0 c s fr e f e r st ot h ef a t t ya c i dd e s a t u r a s em o l e c u l e s c dr e f e r st ot h es t e a r y l c o ad e s a t u r a s e 起着重要作用。红细胞中能够载氧的正常血红蛋白的铁离子是+ 2 价， 每天约有3 的正常血红蛋白被氧化为高铁血红蛋白，而失去载氧功能 ( e d e re ta 1 ，1 9 4 9 ) ，由于可溶性细胞色素b 5 能与n a d h 一细胞色素b 5 还原 酶一起组成一个还原体系，将失去正常载氧功能的高铁血红蛋白还原为 正常的血红蛋白( h u l t q u i s te ta 1 ，1 9 7 1 ) ，因此保证了血红蛋白功能的正常 发挥。目前对于线粒体细胞色素b ，的功能还不十分了解( v e r g e r e se la l ， 1 9 9 5 ) 。 二细胞色素b 。的结构 1 9 5 0 年s a n b o r n 和w i l l i a m s 首先在蚕的幼虫中发现了细胞色素b 5 ( s a n b o r ne ta 1 ，1 9 5 0 ) ，几年后，v e l i c k 和s t r i t t m a t t e r 纯化并初步表征了鼠肝 微粒体细胞色素b ，的水溶性部分( v e l i c ke ta l ，1 9 5 6 ) 。此后科学家用表面 谢出 嘣= 基舞器 啬苗x 咖 砉 、， 0 双盛怒器 ， 第一章绪论 活性剂处理牛肝微粒体得到了完整形式的细胞色素b 5 ( s p a t z e ta l ，1 9 7 1 ；i t o e ra 1 1 9 6 8 ) 。它是一个两亲性的膜蛋白，分子量约为1 6 0 0 0 道尔顿，整个 蛋白分子由含血红素辅基的亲水性结构域和将蛋白固定到膜上的疏水性 结构域两部分组成。如果用不同的蛋白水解酶消化，可得到长度不等的 水溶性结构域，如：用脂肪酶( l i p a s e ) 消化，可得到长度为9 3 个氨基 酸残基的，含有血红素结构域的可溶性细胞色素b 。( l i p a s e s o l u b i l i z e dc y t b 。，l b ；1 ，分子量为1 1 0 0 0 道尔顿：用胰蛋白酶( t r y p s i n ) 消化，可得到 长度为8 2 个氨基酸残基的含血红素结构域的可溶性细胞色素b ，( t r y p s i n s o l u b l i z e dc y tb 5 ，t b ，) ，分子量约为9 4 0 0 道尔顿( o z o l s ，1 9 7 2 ) 。牛肝微 粒体细胞色素b ；胰蛋白酶消化的水溶性区域氨基酸残基序列如图1 3 所 示。研究表明，完整形式的细胞色素b 。中，疏水性结构域的主要作用是 ，一一t 一一1 一，i * ! ! 一：, ：二：譬2 i a ：a 一盅一。s t ；r t ；8 翟j 怒焘积；二掣i i 媾诗娥量， 。 l 一二一jh v v 、九、，u w “i v v 、九厂u 粕：n 一屿， 降一卢4 爿 ，j ；一。；j 一- ：一。：一j 嚣一t ：；一；：一。；一s i ：一。：一。； 一 f i g 1 3 t h ea m i n os e q u e n c eo f l i p a s e - s o l u b i l i z e dc y tb 5 t h ea - h e l i c a ls e g m e n t s ( h ) ， r e g i o no f1 3 - s h e e t ( 1 3 ) ，a n dt h ec o o r d i n a t i o no f t h eh e m eg r o u p a r ei n d i c a t e d t h ed a s h e d b o xi n d i c a t e st h er e s i d u e sw h i c hw e r en o tv i s i b l ei nt h e e l e c t r o n - d e n s i t ym a p 第一章绪论 将蛋白固定到内质网膜上，对蛋白的活性影响不大，而含有血红素的亲 水性结构域则是整个蛋白的活性部位。有证据表明，分别用脂肪酶和胰 蛋白酶消化得到的细胞色素b ，可溶结构域与完整蛋白的反应活性非常接 近( o z o l s ，1 9 7 2 ；w a l k e re ta 1 ，1 9 8 8 ) ，而且它们的结构与红细胞中细胞色素 b 。的结构相同( s l a u g h t e re ta 1 ，1 9 8 2 ) 。为了避免完整蛋白易发生多聚等因 素，因此细胞色素b ，的研究工作主要限于亲水性结构域。在本文中，我 们以胰蛋白酶消化所得的牛肝细胞色素b ，的亲水结构域细胞色素t b ；为 研究对象。 1 蛋白的总体结构 不同来源的细胞色素b 。氨基酸序列略有不同。表1 1 列出了八种动 物肝脏和人血液中细胞色素b 。的一级氨基酸序列( m a t h e w se ta l ，1 9 8 5 f u n ke t a l ，1 9 9 0 ；l i o y de t a l ，1 9 9 4 ) 。从中可以看出，细胞色素b ，家族具有很 高的同源性，尤其是其活性部位即与血红素结合部位的同源性高达9 0 以上，表明了该蛋白活性结构域在进化过程中的保守性。m a t h e w s 等人 1 9 7 2 年首次报导了脂肪酶降解的牛肝细胞色素l b ，的分辨率为2 8a 的 晶体结构( m a t h e w se ta l ，1 9 7 2 ) 。d u r l e y 和m a t h e w s 给出了该蛋白分辨率 为1 5a 的晶体结构( d u r l e ye ta l ，1 9 9 6 ) 。最近，本实验室发表了细胞色 素t b 5 重组蛋白分辨率为1 9a 的晶体三维结构( w ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。l b 5 的二级结构共包含六个口螺旋、5 个b - 折叠和六个转角( 图1 4 ) 。六个a 一 螺旋( a i c t v e ) 分别位于t h r 8 - h i s l5 ，l y s 3 4 - h i s 3 9 ，g l y 4 2 一g l u 4 9 ， a l a 5 4 v a l 6 1 ，s e r 6 4 - p h e 7 4 和a s p 8 2 i l e 8 7 。五个b 一折叠分别是l y s 5 t y r 7 ， t h r 2 1 l e u 2 5 ，t y r 2 7 l e u 3 2 ，g l y 5 1 - a l a 5 4 和p h e 7 4 h i s s 0 。六个转角分别 由a s n l 7 - s e r 2 0 ，l e u 2 5 l y s 2 8 ，l e u 3 2 一p h e 3 5 ，h i s 3 9 - g l y 4 2 ，g l u 4 9 一g l y 5 2 和h i s s 0 a s p 8 3 肽段组成。肽段两端的s e r l - l y s 2 肽段和t h r 8 8 一s e r 9 3 肽 段的运动自由度较大，在x 一射线衍射电子云密度图中，难以确定它们 的位置。该蛋白分子的三级结构呈桶状，分子直径约为3 1a ，高约为3 7a ( m a t h e w s e ta 1 ，1 9 6 9 ，1 9 7 1 ，1 9 7 9 ，1 9 8 0 ；r o s e m a r ye la 1 ，1 9 9 6 ) 。四个c c 一螺旋 ( c d i 0 l v ) 构成桶壁，五个d 一折叠构成桶底，血红素辅基插入桶中，中 4 第一章绪论 心的铁离子分别与肽链的h i s 3 9 和h i s 6 3 残基上的咪唑氮原子配位，两个 丙酸根伸向分子外。此外，血红素b 能够沿着卟啉环上的仪、y 轴旋转 1 8 0 。，以正反两种方式与肽链结合，形成异构体a 和b ( 图1 1 ) ( k e l l e r e ta l ，1 9 7 0 ；l a m a re ta 1 ，1 9 8 1 ) 。 2 蛋白结构特性 细胞色素b ，分子形似“桶”状。整个分子中含有三个疏水残基高度 密集区( m a t h e w se ta 1 ，1 9 7 6 ) 。第一个疏水区域f h 绕在血红素周围的1 4 个 疏水氨基酸残基围，构成“桶”的内壁，其中某些氨基酸残基与血红素 卟啉环的最近距离列于表1 2 。第二个疏水区域是细胞色素b ，的“桶”底 t a b l e1 - 2 r e s i d u e so ft h eh e m eb i n d i n gp o c k e ta n dt h e i rd i s t a n c e so fc l o s e s t a p p r o a c h h e m ea t o mr e s i d u ed i s t a n c e ( a ) 2 c 2p h e 3 5c e 2 3 4 9 f eh i s 3 9n e 22 0 7 4 c 3 g l y 3 9c a 3 4 6 3 c bv 砒4 5 0 3 2 2 3 c hp h e 5 8c d l3 5 2 f eh i s 6 3n e 2 2 o o 1 0 1s e r 6 4o g 2 7 1 1 0 2s e r 6 4 n 2 8 4 部分，它由l e u 9 ，i l e l 2 ，t r p 2 2 ，i l e 2 4 ， v a l 2 9 ，i l e 7 6 ，l e u 7 9 和i l e 8 7 组成，对维持蛋白的整体结构起重要作用( m a t h e w se ta l ，1 9 7 9 ) 。第三个 疏水区域由位于分子表面的p h e 3 5 ，p r 0 4 0 ，l e u 7 0 和t y r 7 4 构成了面积 约为3 5 0a 2 的表面疏水斑区( m a t h e w se ta l ，1 9 8 5 )( 图l 一5 ) 。此区域 夹在仪i i 螺旋和( x v 螺旋之间，并被许多带负电荷的氨基酸残基包围。 此外，细胞色素b 。表面正负电荷分布极不均匀。分子的上半部分有1 1 个 酸性氨基酸残基和2 个碱性氨基酸残基，净电荷为一9 。分子的下半部分 有7 个酸性氨基酸残基和8 个碱性氨基酸残基，净电荷为+ 1 ( t a m b u r i n i e t a l ，1 9 8 5 ；s t r i t t m a t t e re t a l ，1 9 9 0 ；m a u ke t a l ，1 9 9 5 ) ( 图1 6 ) 。电荷的这种 第一章