（无机化学专业论文）超氧化物歧化酶模型化合物的设计、合成及生物活性研究.pdf

中文摘要 模拟金属酶活性部位的模型体系，不仅对理解酶的催化机理是重要的，而且 可以用来发展小分子量的生物模拟催化剂。超氧化物歧化酶是一种金属酶，可以 通过循环氧化一还原机理，歧化超氧离子使之转变为分子氧和过氧化氢。研究表 明：在超氧化物歧化酶的活性部位中，组氨酸的咪唑在金属离子的配位中起着重 要作用。三足四齿配体三( 2 _ 苯并咪唑亚甲基) 胺( n t b ) 和- - 2 一( n _ 甲基) 苯并 咪唑亚甲基1 胺( m e n t b ) 在配位方面与组氨酸咪唑类似，与过渡金属作用形成许多 超氧化物歧化酶的模型化合物。本论文以生物体中的铜锌超氧化物歧化酶和锰超 氧化物歧化酶的活性部位的结构为背景，在查阅大量文献的基础上，设计，合成 了4 5 种新的单核和双核配合物，进行了波谱表征和晶体结构测定，测试了模拟 配合物的生物活性，探讨它们的结构一功能之间的关系。 1 对铜锌超氧化物歧化酶和锰超氧化物歧化酶的功能，结构，催化机理作了 概述；介绍了模拟超氧化物歧化酶的研究进展。 2 合成了以三( 2 一苯并咪唑亚甲基) 胺和= - - 1 2 一( n 二甲基) 苯并咪唑亚甲基1 胺为主配体，旺，b 一不饱和酸等为副配体的4 5 个铜，锌，锰的三元配合物。并通 过元素分析，摩尔电导，红外光谱，热重差热，紫外一可见光谱，核磁共振，电 子顺磁共振，循环伏安等测试方法对配合物进行了表征。研究发现，配合物与超 氧化物歧化酶的结构近似。从模拟配合物的循环伏安实验可以得出，铜，锰模拟 配合物的电化学性质与天然酶相似，配合物具有一定的超氧化物歧化酶活性。 3 解析了下列四个配合物的晶体结构： z n ( n t b ) ( t r a n s c i r m a m a t e ) ( n 0 3 ) ( d m f ) ( h z o ) ，中心离子z n ( i i ) 的配位方式为 n 4 0 ；配体n t b 作为四齿n 给予体与肉桂酸根的羧基氧原子完成配位；中心离子 z n ( i i ) 的配位几何结构最好被描述为扭曲的三角双锥，近似的对称性为凸。沿着 晶轴a 在两个n 6 c 1 8 c 2 4 平面之间形成一个纳米空洞( 1 1 5 8 9 7 2 2 2a ) ，其中填充 着硝酸根、水和d m f 。 c u ( n t b ) ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 ) ( 4 - p i c o l i n en - o x i d e ) ( h 2 0 ) ，配合物的整个晶体结构可以被 看作通过弱的兀兀超分子间作用力和c h o 、强的n h o 和o h o 氢键连 接所形成的三维网状结构。 m n ( n t b ) ( a c r y l a t e ) ( c 1 0 4 ) 23 ( c h 4 0 ) ( h 2 0 ) ，在晶体中出现两个化学等同而晶 体学不等同的 m n ( n t b ) ( a c r y l a t e ) + 阳离子，中心离子m n ( 1 ) 和m n ( 2 ) 都是以n 4 0 2 配位的部分三角锥的几何结构，但是它们相应的键长和键角却有差异，m n ( 1 ) 所形成的部分三角锥的几何结构比m n ( 2 ) 更扭曲。 m n ( n t b ) ( c t m e t h a c r y l a t e ) 】( c 1 0 4 ) h2 ( c h 4 0 ) ( h 2 0 ) ，在晶体中出现两个化学不 等同而晶体学也不等同的 m n ( n t b ) ( 仅一m e t h a c r y l a t e ) + 阳离子。中心离子m n ( 1 ) 是 以n 4 0 2 六配位部分三角锥的几何结构；m n ( 2 ) 是以n 4 0 五配位三角双锥的几 伺结构，近似的对称性为g ，这种结构与天然m n s o d 的活性部位结构相似。 高自旋d 5m n ( i i ) 没有晶体场稳定化能，因此与不同的配体配位产生不同的几何结 构。 4 采用邻苯三酚自氧化法研究了配合物的超氧化物歧化酶的活性，筛选出具 有超氧化物歧化酶活性的配合物，用i c 5 0 表征了配合物的超氧化物歧化酶活性的 大小。其中以配合物l o 的活性最好，i c 5 0 - - 2 1 3t a m o l l 。 关键词：超氧化物歧化酶，模拟化合物，合成，表征，晶体结构，生物活性。 a b s t r a c t m o d e ls y s t e m st h a tm i m i ct h ea c t i v es i t e so fm e t a l l o e n z y n m sa r ei m p o r t a n tn o t o n l yf o rt h eu n d e r s t a n d i n go fe n z y m em e c h a n i s m s ，b u ta l s of o rt h ed e v e l o p m e n t o f s m a l lm o l e c u l a rw e i g h tb i o m i m e t i cc a t a l y s e s s u p e r o x i d ed i s m u t a s e s ( s o d ) a r e m e t a l t o e n z y m e s t h a t d i s p r o p o r t i o n a t es u p e r o x i d e i n t om o l e c u l a r o x y g e n a n d h y d r o g e np e r o x i d et h r o u g hac y c l i c o x i d a t i o n - r e d u c t i o nm e c h a n i s m s t u d i e sh a v e s h o w nt h a th i s t i d i n ei m i d a z o l cp l a y sa ni m p o t r a n tr o l ei nt h ec o o r d i n a t i o no fm e t a l s a t t h ea c t i v es i t e s o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e s t h et e t m d e n t a t e t r i p o d a ll i g a n d s ， t r i s ( 2 - b e n z i m i d a z o l y l m e t h y l ) a m i n e ( n t b ) m a dt r i s ( 2 一( n m e t h y l ) b e n z i m i d a z o l y l m e t h y l ) a m i n e ( m e n t h ) ，a r es i m i l a rt ot h eh i s t i d k t ei m i d a z o l ei nt h e i rc o o r d i n a t i o na s p e c t s ， a n df o r mm a n ym i m i c s u p e r o x i d ed i s m u t a s ec o m p l e x e s w i t l lt r a n s i t i o nm e t a l s i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，4 5n o v e lm o n o n u c l e a ra n db i n u c l e a rc o m p l e x e so f t r a n s i t i o nm e t a l s ( c u ， z n ，m n ) h a v eb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e da tt h eb a s i so fg o i n g o v e ra n da n a l y s i n g ag r e a td e a lo fr e f e r e n c e s ，a n di nt h e b a c k g r o u n do fc u z n s o da n dm n s o d a c t i v e s i t es t r u c t u r e t h em i m i cc o m p l e x e sh a v eb e e nc h a r a c t e r i z e d b ys p e c t r a a n a l y s i s a n ds t r u c t u r e a n a l y s i s t h e i rb i o l o g i c a la c t i v i t i e s h a v e b e e nt e s t e d t h e s t r u c t u r ea n df u n c t i o nr e l a t i o n s h i pw e r e d i s c u s s e d 1 t h e f u n c t i o n s ，s t r u c t u r e s a n d c a t f l y t i c m e c h a n i s mo fc u z n s o da n d m n s o dw e r er e v i e w e d ；a n dt h ea d v a n c eo f m i m i c s u p e r o x i d ed i s m u t a s ew a sg i v e n 、 2 t h e4 5t e r n a r y c o m p l e x e s o f c u ，z n ，m n w i t hn t bo rm e - n t ba sf i r s tl i g a n d ，a n d d ，b - u n s a t u r a t e dc a r b o x y l a t e s a ss e c o n d l i g a n d ，h a v e b e e n s y n t h e s i z e d a n d c h a r a c t e r i z e db ye l e m e n t a la n a l y s i s ，m o l a rc o n d u c t i v i t ym e a s u r e m e n t ，i r s p e c t r a ， h - i l v n rs p e c t r a ，t g d t a ，u v - v i ss p e c t r a ，e p ss p e c t r a ，c y c l i cv o l t a m m o g r a m t h e r e s u l t ss h o wt h ec o o r d i n a t i o n g e o m e t r yo ft h em i m i cc o m p l e x e si s c l o s et ot h e s t r u c t u t a l l y c h a r a c t e r i z e da c t i v es i t eo fs o d t h ec o p p e ra n dm a n g a n e s em i m i c c o m p l e x e sh a v ec e r t a i ns o d a c t i v i t i e sf r o m c y c l i cv o l t a r n m o g r a m 3 t h ec r y s t a ls t r u c t u r e so f t h e f o l l o w i n g f o u r c o m p l e x e s w e r e a n a l y z e d ： z n ( n t b ) ( t r a n s c i n n a m a t e ) ( n 0 3 ) ( d m f ) ( h 2 0 ) t h ez i n c ( i i ) i sf i v e c o o r d i n a t e w i t han 4 0l i g a n ds e t t h e l i g a n dn t b a c ta sat e t r a d e n t a t en d o n o ra n dt h e c a r b o x y l a t eg r o u p o ft h et r a n s c i n n a m a t ea r ec o o r d i n a t e d t ot h ez i n c t h e c o o r d i n a t i o n g e o m e t r y o ft h ez i n c m a yb e b e s td e s c r i b e da sd i s t o r t e dt r i g o n a l b i p y r a m i do fs i t es y m m e t r yc 3 an a n o c a v e ( 1 1 5 8 9 7 2 2 2a ) f i l l e db yn i t r a t e ， d m fm a dw a t e rm o l e c u l e sw e r eo b s e r v e db e t w e e nn 6 ci g c 2 4p l a n e sa l o n gt h e c r y s t a l l o g r o p h i ca a x i s c u ( n t b ) ( h z o ) l ( c 1 0 4 ) ( 4 一p i c o l i n en o x i d e ) ( h 2 0 ) t h ew h o l ec r y s t a l s t r u c t u r e m a y b er e g a r d e da sat h r e e - - d i m e n s i o n a lh y d r o g e n - b o n d e dn e t w o r k j o i n e db y t h ew e a k s u p r a r n o l e c u l a r 兀兀a n dc h o s t r o n gn h 0 a n do h 0 h y d r o g e n b o n d i n g i n t e r a c t i o n s m n ( n t b ) ( a c r y l a t e ) ( c 1 0 0 23 ( c t t 4 0 ) ( h 2 0 ) t h ec r y s t a l s t r u c t u r es h o w st w o c r y s t a l l o g r a p h i c a l l yi n d e p e n d e n t b u tc h e m i c a l l yi d e n t i c a l m n ( n t b ) ( a c r y l a t e ) + c a t i o n s a l t h o u g h t h em n ( 1 ) a n dm n ( 2 ) b o t ha r es i x c o o r d i n a t i o nw i t han 4 0 2 l i g a n dd o n o r s e t a n dt r i g o n a ip y r a m i d a lp a r t i a lg e o m e t r y ，t h e i rb o n dd i s t a n c e sa n da n g l e sa r ed i f f e r e n t t h ef o r m i n gt r i g o n a lp y r a m i d a lp a r t i a l g e o m e t h yo fm n ( 1 ) i sm o r ed i s t o r t e dt h a n m n ( 2 ) m n ( n t b ) ( a - m e t h a c r y l a t e ) ( c 1 0 4 ) 22 ( c h 4 0 ) ( h 2 0 ) t h ec r y s t a ls t r u c t u r es h o w s t w o c r y s t a l l o g r a p h i c a l l yi n d e p e n d e n t a n d c h e m i c a l l y d i f f e r e n t 【m n ( n t b ) ( d m e t h a c r y l a t e ) + c a t i o n s t h em n ( 1 ) i ss i x - c o o r d i n a t i o nw i t han 4 0 2l i g a n d d o n o rs e ta n dt r i g o r m l p y r a m i d a lp a r t i a lg e o m e t r y t h em n ( 2 ) i sf i v e c o o r d i n a t i o n w i t han 4 0l i g a n dd o n o rs e ta n dd i s t o r t e d t r i g o n a lb i p y r a m i d a lg e o m e t r yo fs i t e s y m m e t r yo ，w h i c hg e o m e t r yc o r r e s p o n d st ot h ea c t i v e s i t e g e o m e t r yo fn a t i v e m a n g a n e s es u p e r o x i d ed i s m u t a s e t h eh i g h s p i nd 5m a n g a n e s e ( i i ) i o nh a sn oc r y s t a l f i e l ds t a b i l i z a t i o n e n e r g y , s oi t c o u l dh a v ev a r i o u s g e o m e t r i e sd e p e n d i n go nt h e c o o r d i n a t e dl i g a n d 4 - a n a s s a yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s ea c t i v i t yo f c o m p l e x e sh a v eb e e np e r f o r m e d b yn l e a n so fp y r o g a l l o la u t o o x i d a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts o m ec o m p l e x e s h a v e a c t i v i t yo f s o da n dt h e i ra c t i v i t yo f s o dw e r e e h a r a c t r e i z e db yi c 5 0 t h ea c t i v e o f t h e c o m p l e x 1 0i sh i g h e s t ，i c s o = 2 ，1 3g r n o l l k e y w o r d s ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，m i m i cc o m p l e x e s ，s y n t h e s i s ，c h a r a c t e r i z a t i o n ， c r y s t a ls t r u c t u r e ，b i o l o g i c a l a c t i v i t y v i 兰州大学博士学位论文2 0 0 5 燕 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的 成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内 容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：送篚猛曰期：三竺丝! 鱼 兰州大学博士学位论文 2 0 0 5 年 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：至烂褪导师签名： 、o 圣兰终日 期：迎蚴歹 第一章前言 1 1 绪论 众所周知，氧气是需氧生物生活必不可少的条件。若氧的浓度低于正常生理 水平，即造成缺氧，对机体产生损伤，甚至死亡。但是若氧的浓度超过正常水平， 亦可损伤机体，危及生命。经过大量的实验证明，在富氧条件下，有机体内产生 活性氧。活性氧是氧经过多步单电子氧化过程和质子化过程形成的、具有高度化 学活性的自由基，如超氧阴离子自由基0 2 _ 、羟基自由基o h 等，它们对生物体 产生一系列的毒害作用。例如，进攻多聚不饱和脂肪酸引起脂质过氧化，导致生 物膜结构和功能的改变；损伤蛋白质的巯基和氨基使蛋白质变形，酶失活；d n a 受损，导致细胞突变【1 - 2 1 。因此，生物体内活性氧的清除对生命活动的正常进行 非常重要。生物体内消除活性氧的一条重要途径是通过超氧化物歧化酶 ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 催化0 2 歧化为0 2 和h 2 0 2 【3 副。 ( 1 ) s o d + 0 2 j ；= 一s o d + 0 2s 0 吩起氧化作用，氧化性 ( 2 ) s o d + 0 2 。+ 篮r _ ；= 一s o d + h 2 0 2s 0 嗽原作用，还原性 ( 1 ) 邯) 2 1 r + 町+ 听且h l 一0 2 + h 2 0 2 超氧化物歧化酶是生物体内普遍存在的一种氧化一还原酶，酶的活性部位含 有金属，故也称为金属酶6 。7 】。作为氧化还原酶，特别是参与电子传递的氧化还 原酶，其结构与作用机制一般较复杂，人们对其了解比其它酶要少的多。作为金 属酶根据金属辅基的不同可将超氧化物歧化酶分为三类：第一类含c u 和z n 离 子( 简称c u z n s o d ) ，主要存在于真核细胞的细胞浆中；第二类含m n 离子 ( m n s o d ) 存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中；第三类含f e 离子( f e s o d ) 只存在于原核细胞内。 超氧化物歧化酶的功能：s o d 用以清除对生物机体有害的超氧阴离子自由 基o z 。，从而可防止0 2 在需氧生物体内聚积，阻止通过其它反应产生羟基自由 摹o h ，0 2 。和o h 可引起生物膜损伤和核酸，蛋白质等大分子降解破坏，甚至 第1 章前言 引发各种炎症，肿瘤，白内障等疾病。在动物实验中已证明了s o d 及其模型化 合物有防止氧自由基对生物体损伤的作用【8 】。在植物体内，s o d 可增强植物抗寒， 抗旱，抗早衰及抗化学药害的能力19 。1 们。近年来，人们发现类风湿关节炎、皮肤 炎、红斑狼疮等炎症，溃疡、癫痫、糖尿病、心脏病、肿瘤和癌症以及电离辐射 诱发的各种慢性病，患者体内的s o d i l 于正常人，这是由于0 2 。积累引起病变1 1 1 l 。 因此人们把s o d 用于临床，它可用来抗辐射伤，抗肿瘤，抗衰老，治疗自身免 疫性疾病及上述各种病症。s o d 还可用于日用化学工业【1 2 - 1 3 ，根据衰老的自由 基学说，人体衰老是氧自由基产生和消除发生故障的结果，多余的氧自由基不仅 会损伤细胞，还会引起脂质过氧化产生色素沉着。皮肢衰老是人体衰老的主要特 征，世界上一些国家经过长期精心的研究，确认补充一定量的外源s o d 有消除 色斑，延缓皮肤衰老的作用。因此，s o d 在防御氧的毒性、抗辐射性损伤、预 防衰老以及防止肿瘤和炎症等方面，发挥了其独特的功能1 1 4 - 1 7 】。 1 2 铜锌超氧化物歧化酶( c u z n - s o d ) 在已发现的三类超氧化物歧化酶( s o d ) ：c u ，z n - s o d 、m n - s o d 和f e s o d 中，对c u ，z n s o d 的研究最为充分。1 9 3 8 年m a r n 首次从牛红细胞中分离得到 c u ，z n - s o d ，1 9 6 9 年m c c o r d 和f r i d o v i c h 等人进一步研究了它的生物活性。 对于c u ，z n s o d 结构的突破始于1 9 7 2 年，r i c h a r d s o n 实验室首次获得了可供 x 一射线晶体结构分析的单晶，其晶体结构测定结果首次提供了结构数据2 0 l ；1 9 8 2 年获得2a 分辨率电子密度图，比较清楚地看到c u , z n s o d 活性中心位置的排 列( 图1 一1 ) 【2 1 。2 2 1 。 图1 - 1c u ，z n s o d 活性中心结构 2 吴辉禄兰州大学博士学位论文 2 0 0 5 年 c u ，z n s o d 活性中心中，c u 2 + 离子被四个组氨酸残基h i s4 4 、4 6 、6 1 和1 1 8 咪哗环上的n 原子配位，另外一个水分子中的o 在轴向与c u ”弱配位构成一个 畸变的n 。o 四方锥构型，而z n 2 + 离子被h i s 一6 1 ，6 9 ，7 8 咪唑环上的n 原子和天 冬氨酸残基a s p8 1 的一个羧基o 原子配位形成近似的n 3 0 四面体结构。h i s 一6 1 的眯唑起着“桥”的作用，将c u 2 + ，z n 2 + 连接起来，c u 与z n 之间相距6 3 a 。 c u 暴露于溶剂中，且距离c u2 8a 处还有1 个轴向配位水分子指向精氨酸 a r g 一1 4 1 ，它有吸引0 2 入腔的作用，并诱导0 2 。进入活性中心，且可在催化过 程提供质子，使催化反应速度大大加快。酪氨酸t h r - 1 3 5 因含有一o h ，从而对腔 的亲水性起重要作用，且天冬氨酸a s p - 1 2 4 与h i s 一4 4 和h i s 一6 9 通过氢键形成桥 联结构，因而对腔的稳定性起重要作用。三维结构的最主要特征是八股反平行的 b 一折迭结构。当除去或以其它金属离子取代s o d 活性中心结构中的z n ”离子 时，s o d 仍然保持着较高的活性，但是当c u 2 + 离子被除去或被其它金属离子取 代时，则酶活性几乎丧失，表明c u ”离子是具有活性不可缺的因素。 c u ，z n s o d 超氧化物歧化酶的催化机理，由于超氧化物歧化酶催化o f 歧化 速度快，中间过渡态不易检出，给催化机理及反应动力学研究带来了困难。它的 催化机理及途径有多种提法。 机理一：7 0 年代中期，f e e 和l i p p a r d 等分别通过研究c u ，z n s o d 酶催化 c u ”歧化的动力学，发现速率限制过程是0 2 与活性中心的键合过程。在 p i t = 5 2 9 6 间结合速率与p h 无关，并且酶在水中歧化0 2 。的反应速率与在重 水溶剂中是相同的，说明质子转移不是结舍过程的一部分，质子传递非催化反应 的决速步骤，由此提出了铜锌咪唑桥质子化并断开和重接循环作用机理【2 3 1 。该机 理认为催化过程中第一个0 2 。将氧化态酶中c u ：+ 还原为c u + ，本身被氧化为一 分子0 2 ，同时h i s 一6 1 咪唑桥在c u 侧断开并质子化；接着另一个0 2 一将还原态 酶中c u + 氧化为c u 2 + ，本身还原为0 2 ，并自质子化h i s 一6 1 的咪唑获得质子 牛成h 0 2 ，同时h i s 一6 1 咪唑桥重新形成( 图l 一2 ) 。据此机理，在0 2 + 歧化过程 中伴随c u 的氧化态的转移及铜锌咪唑桥的断裂和重新形成，且咪唑桥为过氧根 的质子源。 多年来，此机理被人们接受并被后来的实验结果所支持。第一，c u ( i ) c o s o d 与c o s o d 在可见区的电子光谱和c d ( 圆二色性) 谱吸收带均很相似【2 4 1 ，且 第1 章前言 2 4 0 0 2 5 0 0 c m o 处的肩峰被归属为桥连咪唑与铜之间的配体一金属电荷转移跃 迁带，因而此肩峰的出现与咪唑桥的存在有关。研究表明c u ，z n s o d 和 c u ，m s o d ( m = c o ，n i 和c u ) 均存在此肩峰，但c u ( i ) c o s o d 则无，说明被还 原酶可能发生了咪唑桥断开；第二，c u ( i ) c o s o d 酶的1 h n m r 谱为咪唑桥断开 机理提供了间接证据【l ，由于c o ( i i ) j l 颐磁性使得与c o ( i i ) 配位的h i s 残基质子化 学位移向低场，比较水和重水中的1 h n m r 谱，发现氘化后在低场附近有三个共 振峰完全消失。可归因于3 个n h 质子发生了氘代，说明3 个与c o ( i i ) 配位的咪 唑环各存在1 个n h 质子，除h i s - 6 9 和h i s - 7 8 各贡献1 个n h 外，还有1 个 n h 质子可归因于h i s 一6 1 咪唑桥与铜结合的n 原子上发生了质子化，表明还原 酶导致眯唑桥在铜侧断开。第三，广延x 射线吸收精细结构( e x a f s ) 研究表 明，c u ( i ) ，z n s o d 中c u - _ n ( 曲键长( 1 9 4 a ) 比c u 0 0 ，z n s o d ( 1 9 9a ) 要短。如果 还原前后铜的配位数保持不变，还原后酶的c u - n 键长应该伸长，而实际上的 c a ( i ) ，z n - s o d 的c u - - n ( a ) 键长相对于c u ( i i ) ，z n s o d 缩短了，说明还原后 c u ( i ) ，z n s o d 的中的c u ( i ) 可能为了配位，另一个h i s 咪唑环与铜的配位键发生 了断裂，推测很可能是h i s 咪唑桥在铜侧断裂。 图1 - 2c u ，z n - s o d 催化0 2 循环示意图 4 机理二：g o l d s t e i n 等利用脉冲辐射技术研究s o d 酶的c u ( n ) 多肽类模型化 合物催化0 2 一歧化反应后，提出了另一种催化机理【2 5 j 。 c u 2 + + 0 2 一+ 2 h + c u 3 + + o ， 氧化 c u 3 + + h 2 0 2 c u 2 + + 0 2 通过研究一系列c u ( i i ) 多肽化合物发现，随着还原电势e o c u 3 c u * 的升高，o f 歧化 活性明显下降。当e o c 。n 高于e o o m 仉( o 9 4v ) 催化活性消失。由此推测 c u z n s o d 酶亦有可能通过先氧化后又重新还原的催化途径，而 e o c u ( i i ) z 。一s o d c u ( 0 z n s o d ( o 2 6 v ) 介于e o o 舳( 0 1 6 v ) 与e o o , - m , o ：( o 9 4 v ) 之间， 故c u z n - s o d 酶可能按先氧化后还原的催化方式进行反应 1 l3 锰超氧化物歧化酶( m n - - s o d ) m n - s o d 活性中心结构直到1 9 8 5 年才有s t a l l i n g s 弄清楚【2 6 】。m n - s o d 的 x 一射线衍射分析表明，m n - s o d 由两个等价的亚基组成，在每个亚基中，由2 0 3 个氨基酸残基组成的多肽链形成一个“全a ”式和一个“b 旺”式结构域；这两个 结构域由一个锰离子连接在一起，构成m n - s o d 的活性中心。酶处于还原态时， m n ( i i ) 与三个组氨酸残基的咪唑氮原子，一个天冬氨酸残基的羧基氧原子，一个 水分子的氧原子配位，形成一个三角双锥的几何构型( 图1 。3 ) 。 。龇i 1 1 2 s 陬。：m n ：+ n t h i s 一8 3 ) n 。_ n ( h i s 2 8 ) n i 。 m n - s o d 超氧化物歧化酶的催化机理与c u z n s o d 酶相似( 图i 4 ) 【2 7 j ；主 要的不同是在m n - s o d 酶处于氧化态时，水以羟基的形式与中心三价锰配位， 因此不能被超氧离子取代；相反超氧离子与金属的键合增加了中心锰离子的配位 数。还原过程中导致键合的羟基质子化形成水，然后在氧化第二个超氧离子时再 将质子传递给超氧离子，形成过氧化氢。 = “- 一黼s 产= ( h i s 2 8 ) ni 。 。( h i s 2 8 ) n o h i 1 一、n ( h i s 8 3 ) 1 i n 女f h i s l 6 9 ) l 一h + 旷 卜 i 0 2 ( a s p l 6 5 ) o , m 。1 ，。一n(hisa3)(aspl65)00h。o lu 2 删s z s ) n m 土。n h q h 百n 芒但缸8 3 1 4 超氧化物歧化酶模型化合物的研究进展 为了阐明s o d 酶的结构与功能间的关系，揭示其催化作用机理，合成活性 中心模型化合物，研究模型物的结构、活性和功能的关系对探讨酶的作用机理有 重要意义：且目前市场销售的s o d 多从牛血、牛心或大肠杆菌中提取，手续麻 烦，价格昂贵，酶分子量大，不易穿过细胞膜；而且在体内代谢时间短，临床应 用易引起机体排异反应而使其应用受到限制，因此小分子模拟化合物的研究受到 极大重视。近二十多年来生物化学家和配位化学家合成了咪唑、苯并咪唑、联吡 啶、邻菲罗啉、氨基酸、多肽和席夫碱的含c u ( i i ) ，m n ( i i ) ，f e ( i i i ) 的小 分了s o d 模拟化合物，并采用脉冲辐射，e s r 自旋追踪，极谱等方法对它们的 拟s o d 活性进行了研究 2 s - 3 s 1 ，以期用小分子配合物代替天然s o d 用于临床及日 用化工。 1 4 1 咪唑类单核、双核、异多核s o d 模拟配合物的研究 n o 8 0 年代初l i p p a r d 等率先开展了有关s o d 酶模型化合物的研究工作p ，试 图合成c u 、z n 异核模型配合物，但未能成功，仅得到一系列咪唑桥多核c u 配 合物，接着c o s t e r 4 0 1 和w e s e r t 4 1 1 分别合成了 ( a e ) c u ( 1 m ) n i ( a e ) ( c 1 0 4 ) 、 ( p i p ) c u ( i m ) c o ( n h 3 ) 5 ( c 1 0 4 ) 4 和 ( p m d t ) c u ( i m ) z n ( p m d l ) 】( n 0 3 ) 2 2 h 2 0 ，等配 合物，但配合物的结构和模拟s o d 性质未见报道。其中， p l p a e n 尸 y nn y p m d t ( c u 3 ) 2 n ( c n 2 ) 2 n , ( c n 2 ) 2 n ( c h 3 ) 2 i c h 3 1 9 8 7 年，沈孟长、陈晓青等人在国内首次报道了几种含氮的铜配合物的合 成，观察到它们在不同程度上具有模拟s o d 歧化超氧阴离子的作用【4 “。文中报 道了 n a 2 c u ( s a l ) 2 】、 c u ( d i e n ) 】( n 0 3 ) 2 、 c u 2 ( d i e n ) 2 ( i m ) ( c 1 0 4 ) 3 、 【c u ( d i e n ) g m h ) ( c 1 0 4 ) 2 ( 其中s a l ：水扬酸根，d i e l l ；二乙三胺，i m ：咪畔根) 模 拟化合物的超氧化物歧化酶活性，并与s o d 作了对照，测得对n b t 还原速率抑 制5 0 时各化合物的浓度分别为1 5 1 ，1 3 f 2 ，8 2 2 ，1 5 9pm o l l ，s o d 的浓度为0 0 6 1 tm o l l 。发现双核的铜配合物比单核的铜配合物有较高的活性，铜的双核咪唑 桥配合物的活性高于结构相近的单核配合物，这可能是由于前者的结构与s o d 的活性中心的结构相似。天然s o d 的结构虽然非常复杂，但起到超氧化物歧化 酶活性作用的主要是s o d 的活性部位。研究表明，c u ，z n s o d 活性中心中催 化0 2 的歧化是发生在c j + 的一侧。用化学法除去酶分子中的z n 2 + 。而保留酶分 子原有环境中的c u “，则酶仍有较高活性，但以a g + 替代分子中c u 2 + ，同时用 c u 2 + 置换酶分子中的z n 2 + ，即c u 2 + 换到z n 2 + 的位置，酶就失去全部活性。这表 明酶分子中c u 2 + 所处的环境对酶的活性有重要影响。合成超氧化物歧化酶模型化 合物，主要是合成具有天然s o d 酶活性中心类似结构的化合物。在c u z n s o d 中，c u ”、z n ”之间由咪唑桥相连，c u 周围为n 4 0 配位，因此合成咪唑桥及n 配位的c u 的双核，异多核配合物就成为人们研究的主要内容。 7 已案 耋! ：! 曼! 墨! ：! q 里鳖塑些生：堂墨基焦型塑匹! ! 堡尘! ! ! ! ! 竺2 兰! f 坐里! 豳坚! 旦尘堕塑叁墼塑堕墼 结构参数模型物c u ，z n s o d c u - n + 和z n - n 分别为c u 、z n 与桥联咪唑环n 原子间的键长。 表卜2 含c u ( 1 1 ) 配合物及c u ，z n - s o d 酶催化0 2 。歧化的活性( n b t 法) 南京大学配位化学研究所试验了一种用配合物做配体合成咪唑桥异多核配 合物的新合成法。用d 6 构型低自旋取代惰性金属的单核眯唑或多昧唑配合物 i n l + ( n h 3 ) 5 i m 2 + n i i m m l + ( c n ) 2 5 n + ( m 1 + = c o ”、r h 3 + 和r u 3 + ) 等为配体，再与有空 配位点的配合物l m ”( m = c u 、z n 和n i 等) 或m 2 十作用定向合成了多种类型 眯唑桥异多核配合物 4 3 4 4 1 。采用上述的配合物配体法，以2 个均为动力学活性的 配位离子 ( t r e n ) c u ( i m ) + 或 ( d 衄a ) c u ( i m ) 为配体与【z n ( t r e n ) 2 + 或 z n ( d t m a ) + 作 用得到了2 种相当接近于c u ，z n s o d 酶活性中心结构的c u 、z n 异核模拟物 ( t r e n ) c u ( i m ) z n ( t r e n ) ( e 1 0 4 ) 3 【4 5 】和 ( d m l a ) c u ( i m ) z n ( d t m a ) ( c 1 0 4 1 【4 6 l ( d t m a = 二： 乙烯三胺一n 一乙酸根和t r e n = 三乙撑四胺) 。表1 - 1 列出了 ( d t m a ) c u ( 1 m ) z n ( d m l a ) ) ( c 1 0 4 ) 与c u ，z n s o d 酶活性中心有关结构参数值，可以 看出模拟物中c u 、z n 间的距离及c u - n 和z n - n 键长均与酶的相应值接近。为 探讨模型体系电子结构和成键性质，作者同时研究了 ( d t m a ) c u ( i m ) z n ( d t m a ) ) ( c 1 0 4 ) n ( d t m a ) l z n ( 1 m ) z n ( d t m a ) ( c 1 0 4 ) ，以1 ：1 5 比例得 到混合单晶的e s r 谱。发现单晶胞中有4 个磁不对称位点，并用最4 , - 乘法拟 合得到了4 套晶位的g 张量、a 张量及其它方向余弦。模型物的g 值( 鲰= 2 2 0 8 4 、 蜀。，= 2 0 4 8 、g 叠= 2 2 4 0 ) 与c u ，z n - s o d 酶q = 2 0 7 、g 一= 2 2 6 ) 基本相同，说明两者的 配位环境相似f 4 5 l 。考虑到咪唑桥联配合物在p h 。1 0 时咪唑桥可能断裂【4 6j ，因此 在p h = 7 8 和p h = 1 0 5 用n b t ( 硝基四氮唑兰) 法分别测定了配合物