（物理化学专业论文）具有荧光探针功能环糊精衍生物的合成及其在生物检测中的应用.pdf

中文摘要 溶液中 加入z n z 十 后， 荧光增强5 .7 倍， 并且生物体系中 含 量 较多的 碱金属或碱土 金属离 子几乎不 干扰z n z + 的 荧 光。 由 于h q a s - 1 - c d的 环 糊 精 单 元与 细 胞膜中的 磷脂分子、 胆固醉甚至蛋白 质有一定结合力， h q a s - 1 - c d 可以 吸附 在细胞膜上。 向h q a s - 1 - c d处理过的酵母细胞培养液中 加入锌离子， 酵母细胞呈 现绿色荧 光。 这一结果表明， h q a s - 1 - c d可以 作为细胞非渗透性 锌荧光探针监测细胞分 泌物中锌离子的含量。 3 . 为了进一步提高锌荧光探针的水溶性和与细胞表面的结合强度，通过一 条 柔性长链将h q a s 和13 - c d 连 接 起来， 得到了 水 溶性更 好的 修 饰环 糊 精 锌荧 光 探 针( h q a s - 2 - c d ) ， 该 探针 对z n z 十 的 选择性和荧光 增强 程 度 与h q a s - 卜 c d 相当. 以 十六烷基三甲 基澳化 胺( c t a b ) 胶 束模 拟细胞 膜的 疏水 层， 利用1 h n m r , 荧 光光谱和荧光寿命测定研究h q a s - 2 - c d与c t a b 胶束的 作用 模式。 结果表明， h q a s - 2 - c d的修饰基团h q a s 能 嵌入c t a b 胶束的 疏水层， 同 时 其环糊精空腔 能 包结c t a b分子， 这两者的 协同 作用使h q a s - 2 - c d可以 固 定在胶束表面。 酵 母细胞染色实验结果表明，h q a s - 2 - c d锌配合物对酵母荧光成像效果远比 h q a s - 1 - c d好. h q a s - 2 - c d可以 作为固定 在细胞表面的 锌荧光探针， 捕捉透 过细胞表面的锌离子，用于活细胞锌流出物的荧光显微分析，以及借助微注射 技术观测神经元中锌离子的真实分布形态。 关键词: 环糊辅、 锌a n . 械( 山 ) 、 荧光探针、 胶束、 细胞 英文摘要 ab s t r a c t t h e s y n t h e s i s o f b i f u n c t i o n a l c y c l o d e x t r i n w h i c h c o u l d c o o r d i n a t e t o m e t a l i o n s a n d i n c l u d e o r g a n i c m o l e c u l e s h a v e b e c o m e s i g n i f i c a n t t o p i c s i n s u p r a m o l e c u l a r c h e m i s t ry . c y x l o d e x t r i n p o s s e s s i n g a p h o t o a c t i v e m e t a l c e n t r e i s a n i m p o r t a n t b u i ld in g b l o c k t o d e s i g n p h o t o m o l e c u l a r d e v i c e s w it h f u n c t i o n s s u c h a s s e n s in g , e n e r g y t r a n s f e r o r d i r e c t i o n a l e l e c t r o n t r a n s f e r . c o n s i d e r e d m e t a l l o c y c l o d e x t r i n s p o s s e s s i n g fl u o r e s c e n c e c h a r a c t e r h a v e p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n s i n b i o l o g i c a l d e t e c t i o n , t h e c y c lo d e x t r in s m o d i f ie d w it h l i g a t i n g s it e b e a r i n g t b 3 o r z n 2 w e r e s y n t h e s i z e d . t h e i n t e r a c t i o n o f m o d i f i e d c y c l o d e x t r o n s o r t h e i r m e t a l c o m p l e x e s w i t h m i c e l l e s o r c e l l m e m b r a n e w a s i n v e s t i g a t e d . o u r , s p e c i a l i n t e r e s t i s t o d e s i g n fl u o r e s c e n c e p r o b e s u s e d f o r b i o l o g i c a l l a b e l o r m e t a l i o n s e n s o r s . t h e m a j o r c o n t e n t s o f t h i s d i s s e r t a t i o n a re a s f o l l o ws : 1 . p y r i d i n e - 2 , 6 - d i c a r b o x y l i c a c i d m o d i f i e d p - c d ( p y - c d ) w a s s y n t h e s i z e d . p y - c d c a n f o r m a s t o i c h i o m e t r i c 3 : 1 c o m p l e x w it h t b 3 . t h e p y r i d i n e g ro u p s in p y - c d c a n s e n s itiz e th e lu m in e s c e n c o f t b 3 t o g iv e s t r o n g g r e e n fl u o re s c e n c e . m e a n w h i le , p o s s e s s i n g t h re e c y c l o d e x t r i n c a v i t i e s , t h e c o m p l e x o f p y - c d w it h t 6 3 c a n i n c l u d e b i l e s a l t m o l e c u l e s a n d i n d u c e t h e s m a l l m i c e l l e s o f b i l e s a l t a g g re g a t e t o l a r g e m i c e l l e c l u s t e r s ( p s e u d o - s t a t i o n a r y p h a s e ) . t h e s e m i c e l l e c l u s t e r s c a n b e e a s i l y o b s e r v e d b y t e m m e a s u re m e n t a n d fl u o re s c e n c e m i c ro s c o p y . t h e s e re s u lt s m a y p r o v i d e a n e f fi c i e n t a n d c o n v e n i e n t m e t h o d t o l a b e l a n d c a p t u re b i l e s a l t m i c e l l e s , w h i c h w i l l h a v e t h e p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n i n d i a g n o s t i c s a n d s e p a r a t i o n s c i e n c e s . 2 . 6 - m e t h o x y - ( 8 p - t o l u e n e s u l f o n a m i d o ) q u i n o l i n e ( t s q ) a n d i t s d e r i v a t i v e s a r e t h e f ir s t c la s s o f fl u o re s c e n t p ro b e s t o b e u s e d f o r im a g in g o f z n 2 in v i v o . t h e y e x h ib it h i g h s e le c t i v i ty f o r z n 2 a s c o m p a re d t o c a 2 + , m g t a n d o t h e r m e t a l i o n s . b u t t h e w a t e r s o lu b i l i ty o f t s q a n d it s d e r iv a t i v e s i s v e ry p o o r i n n e u t r a l a q u e o u s s o l u t io n , w h i c h i n e v i t a b l y h i n d e r s t h e i r a p p l i c a t i o n s i n v i v o . a n a n a l o g u e o f t s q , i . e . , n -( 8 - q u i n o l y l ) p - a m i n o b e n z e n e s u l f o n a m i d e ( h q a s ) w a s c o v a l e n t l y l i n k e d t o p - c d . t h e re s u l t i n g w a t e r - s o l u b l e h q a s - m o d i f i e d p - c d ( h q a s - 1 - c 功s h o w e d i n 英文摘要 s a t i s f a c t o ry w a t e r s o l u b i l i t y , a h i g h b i n d i n g a f f i n i t y a n d g o o d fl u o re s c e n c e s e n s i n g a b i l i t y t o z n 2 + . u n d e r t h e s a m e c o n d it i o n s , s e v e r a l m e t a l i o n s c o m m o n l y p r e s e n t i n a p h y s i o lo g i c a l e n v i r o n m e n t , s u c h a s n a , k , c a 2 , m g 2 , mo, f e 2 , a n d c o t + , s h o w e d l itt l e in t e r f e r e n c e t o t h e fl u o re s c e n c e re s p o n s e t o z n 2 + . s i m u lt a n e o u s l y , h q a s - 1 - c d a l s o p o s s e s s e s t h e a b i l i t y t o i n c l u d e o r g a n i c m o l e c u l e s c o m p o s i n g o f c e l l me mb r a n e a n d a d h e re t o c e l l s u r f a c e . 3 . a n o t h e r m o d i f i e d p - c d ( h q a s - 2 - c d ) w a s s y n t h e s i z e d b y l i n k e d h q a s t o k d w i t h a fl e x i b l e c h a i n . t h e o b t a i n e d h q a s - 2 - c d p r e s e n t s m o re g o o d w a t e r s o l u b i l i t y a n d p o s s e s s e s t h e s i m i l a r f u n c t i o n s t o h q a s - c d . t h e i n t e r a c t i o n o f h q a s - 2 - c d w i t h c t a b ( c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e ) m i c e l l e s w a s i n v e s t i g a t e d b y 1 h n m f , fl u o re s c e n c e s p e c t r a a n d fl u o re s c e n c e l i f e t i m e m e a s u r e m e n t s . t h e re s u l t s s h o w n t h e h q a s g ro u p o f h q a s - 2 - c d c a n d e e p l y i n s e t i n t o c t a b m i c e l l e a n d t h e c d c a v i t y o f h q a s - 2 - c d c a n i n c l u d e c t a b m o l e c u l e . t h e t w o f o l d c o o r d i n a t i o n e ff e c t m a k e h q a s - 2 - c d t i g h t l y a d h e r e o n t h e s u r f a c e o f c t a b m i c e l l e . c e l l m e m b r a n e i s c o m p o s i n g o f l e c i t h o i d m o l e c u l e s a n d h a s s i mi l a r s t r u c t u r e t o c t a b m i c e l l e . t h e s t a i n i n g e x p e r i m e n t s t o y e a s t c e l l s s h o w e d h q a s - 2 - c d c a n a l s o a n c h o r o n c e l l s u r f a c e a n d c o u ld b e u s e d f o r im a g in g o f z n 2 i n e f fl u x o f c e l l s . k e y wo r d s : c y c l o d e x t r i n , t e r b i u m ( i i i ) , z i n c ( i i ) , fl u o re s c e n c e , m i c e l l e , y e a s t c e l l 】 v 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容: 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本; 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、 缩印、扫描、 数字化或其它手段保存论文;学校有权提供目 录检索以及提供本学位 论文全文或者部分的阅览服务;学校有权按有关规定向国家有关部门 或者机构送交论文的复印件和电子版;在不以 赢利为目的的前提下， 学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名: 年月日 经指导教师同 意， 本学位论文属于保密， 在 授权书。 年解密后适用本 指导教师签名: 学位论文作者签名: 解密时间: 年月日 内部 5 年 ( 最长5 年， 可少于5 年) 秘密*1 0 年 ( 最长1 0 年，可少于 1 0 年) 机密*2 0 年 ( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体， 均已 在文中以明确方式标明.本学位论文原创性声明的法律责任由本 人承担。 学位论文作者签名: 年月日 第一章前言 第一章前言 第一节 分子识别和超分子化学概述 生物化学家很早就注意到不同生物大分子之间存在一些特异作用， 例如抗 体和抗原间，酶与底物间存在专一性结合。这种特异结合并不是来自 于大分子 之间的 共价键或离子键等强作用， 而是依靠两个分子结合部位的结构互补， 通过 分子间的非共价键力结合在一起，这种非共价键力包括范德华力和氢键等弱作 用力. 尽管非共价键相互作用力相对于共价键力要弱得多，但是大分子间多位 点弱相互作用力的协同叠加以及空间结构的互补性往往产生非常强的专一性结 合。 两种分子间的相互“ 认识” 、 结合过程的排它性就是我们通常所说的分子识别。 分子识别是指主体 ( 受钧对客体( 底物 ) 选择性结合并产生某种特定功能的 过程， 既是分子组装体信息处理的基础，又是组装高级结构功能大分子的重要途径之 一分子识别是一种普遍的生物学象。搪链、蛋白 质、核酸和脂质各自间以及 它们相互之间都存在分子识别，药物分子也只有通过对特定分子的识别才能发 挥作用。 生命体系中 广泛存在的分子识别现象，也引起了化学家的极大兴趣。1 9 6 7 年c . j . p e d e r s e n 首次报道了冠醚的合成方法，发现这种环状化合物可以识别金 属离子 a l 。 随后d . j . c r a m改进了 冠醚的合成方法， 报道了 一系列具有光学活性 的冠醚， 并根据这些化合物可以 作为主体选择性结合伯胺盐( 客钩 形成配合物的 现象， 提出了 “ 主 客体化学” 的 概念12 。 这一时期环糊精及杯芳烃的 一些重要特 性引起了许多化学家的重视。人们发现具有柱锥状结构的环糊精可以选择性的 识别有机客体分子，而且能形成稳定的包合物。具有杯状结构的杯芳烃不仅能 够识别中性客体分子也能够识别阳离子和阴离子.显然环糊精的空腔和杯芳烃 的笼在分子识别中起到了结构互补作用。考虑到分子识别及分子间非共价键作 用在化学和生命科学中的普遍性和重要性，j . m . l e h n 于1 9 7 8 年首次提出了超 分子化学的概念3 1 。 超分子体系是由 两个或更多的分子物种( s p e c i e s ) 在分子识别 的基础上通过分子间的非共价作用维持在一起构成高度复杂的有组织的统一 体，即通过建立于特定作用方式之上的分子识别过程，实现在分子及超分子水 第一章前言 平上的 信息 存储( s t o r a g e ) 、 恢复 ( r e t r i e v a l ) 、 转移 ( t r a n s f e r ) 和 处 理 ( p r o c e s s i n g ) . 对 于理解和揭示高级特异性生物过程，如酶或受体与底物的结合、蛋白质配合物 的形成、核酸的嵌合物、基因密码的破译、神经传递过程和细胞识别等现象有 着非常重要的意义.正因为如此，对超分子化学的发展有着巨大推动作用的三 位科学家j . m. l e h n , d . j . c r a m和c . j . p e d e r s e n 分享了1 9 8 7 年的诺贝尔化学奖 4 !。 他们的 获奖也极大地推 动了 超分子化学的 快速发 展。 一 系列具有特殊结构的 人工合成受体被设计和合成出来，其中具有环状结构的冠醚，环糊精和杯芳烃 分别被称为超分子化学的 第一代、 第二代和第三代主 体化 合 物 is ) . 具有特定功能 的化合物，如:叶琳、酞普、环番、葫芦脉和环肤等， 也是构筑超分子有序体 的重要单元， 甚至c 6 0 , 碳纳米管和金纳米粒子等也成为超分子化学的 基本建筑 模块16 1 由于环糊精无毒、易溶于水、易于化学修饰，环糊精已 成为超分子化学体 系中最重要的合成受体之一。环糊精及其衍生物不仅可以包结各种客体分子形 成超分子配合物，而且还可以作为构筑高级有序体的基本建筑块，在生命科学 和材料科学领有着重要应用前景.由于本论文主要着眼于具有荧光特性的修饰 环糊精金属配合物的合成及其在生命科学中的应用。下面将重点介绍以环糊精 为受体的超分子化学最新研究进展。 第二节以环糊精为受体的超分子体系 1 . 2 . 1 基于环糊精和环糊精衍生物的分子识别 环糊精( c y c lo d e x t r in s ， 通常简称为 c d ) ，是一类由d - 毗 喃葡萄糖单元通过 a - 1 , 4 糖昔键首尾相连形成的大环化合物。早在 1 8 9 1 年vil l i e r s 在淀粉发酵过程 中就分离得到了 环糊精闭 ， 但是环糊精的发现在二十世纪 早期 一直未受到足够的 重视。 2 0 世纪5 0 年代c r a m e r 7 f 3 跃迁发射， 其中5 4 5 n m的 跃迁发射最强. 第二章 修饰b - 环糊精wi ii ) 配合物的荧光特性及其与胆 酸胶束的 作用 表 2 . 1 t b i 和e u 3 + 的 光谱项和能级 t b ( 1 1 1 )e u ( ii i ) 谱项能 级 ( c m )谱项能 级 ( c m ) s g 3 2 7 5 6 0s d 3 2 4 1 0 0 气1 o 2 7 1 5 0s d z 2 1 2 5 0 s g 6 2 6 5 0 0s d , 1 8 9 5 0 叭2 0 4 5 05 d o 1 7 2 6 7 t o 5 7 0 0i f 4 9 7 8 f , 5 4 7 2 f 5 3 9 0 9 f 2 5 0 2 4 f 4 2 8 7 7 f 3 4 3 4 5 j f jf f 2 1 0 4 5 f 5 2 1 时 乍 1 3 8 0 y 6-8 5t o 0 s g 6 s d y ha叭sdo勿 一一、羹一 ，盆 ， 一 “ 7 r j 一m 勺, t b -h 圈2 . 1配体对稀土离子能量传递简图 事实上，对于稀土离子无机盐水溶液，只有以激光为激发光才能检测到对 应的特征发射，普通的荧光光谱仪器几乎观测不到稀土离子的特征荧光。这是 因为稀土离子的f - ) f 跃迁属禁戒跃迁，即稀土离子的电 子吸收很弱，光照后到 达激发态的电子很少。而含有大的二 共扼体系的有机物对2 4 0 m n - 3 6 0 m n的紫外 光有很强的吸收。 2 4 0 m n - 3 6 0 n m对应的能级是4 0 0 0 0 c m- 2 7 7 7 8 c m ， 其范围 第二章 修 饰0 - 环糊精wi i i ) 配合物的荧光特性及其与胆酸胶束的 作用 恰好在t b 3 + 的s d a 能级和e u 3 + 的s d o 能级之上.当这些有机配体 与稀土离子形 成配合物后，由于配体与稀土离子存在匹配的能级差，通过分子内的共振能量 传递， 使基态电 子 达到稀土离子激发态， 最终发射稀土离子的 特征荧光3 ) . 其能 童 传递 过 程如图2 . 1 所示14 1 从图2 . 1 可以看出，当有机配体吸收光能后，电子从基态 s o 激发至第一激 发态s l ，在第一激发态的电子通过无辐射跃迁至第一激发三重态t i ，经分子内 能 量传递过程， 能量由 配体三重态t , 传递至t b 3 + 或e u 3 + 的 可发 射荧光的 激发态， 处于激发态的电子以 荧光发射方式回到基态. 对于 .1 .6 3 十 配合物， 要获得较强的 特征荧 光， 配体第一激发三重态的 能级必须介于.1 .6 3 + 的s d a 和勿3 能级 之间， 太 高或太底都不利于实现能量传递。如果配体能吸收2 2 0 - 3 0 0 n m的紫外光，其激 发三重态的能级基本上介于th3 + 的低 和s d 3 能级之间. 通常带 有苯环、 毗咤环 和卜 二 酮基团的 有 机 配体， 都能 敏 化t b 3 + 的 荧光5 . 要获 得e u 3 + 的 特 征荧光， 条件要苛刻得多. 一方面， e u 3 + 的 荧光极易被水分子 。 - h键的 伸缩振动碎灭， 配体必须很好地满足e u 3 十 的多 配位数，能够密封着e u 3 + ，以 阻止水分子对e u 3 + 的 进攻: 另一方面， e u 3 + 的s d o 能 级较低， 七。 与s d ， 和勺: 的能 级差 很小， 配体 同 时向 s d . 和s d 2 能 量 传递的 几率 增 大， s d ， 和s d 2 激发 态电 子易 无 辐 射回 到基 态。 这 样电 子 处于可发 射荧 光的低 激 发 态的 几 率降 低。 另外， 在s d 2 能 级以 上还有 电 荷 迁 移 态 ( c t s ， 配 体 与e u 3 十 形 成的 共 扼体 系， 能 级 在2 6 8 0 0 c n i ， 左 右 ) ， 如果 配体三重态能级高于c t s 能 级， 主要发生电 子转移过程， 几乎检测不到e u 3 + 的 特征荧光.例如，乙酞丙酮和邻轻基苯酚类配体，其最大吸收在2 7 0 n m左右， 最低激发三重态能级高于 c t s能级，在配合物中存在电荷转移吸收，不能发生 从配体到e u 3 + 的能 量传递， 观测不到e u 3 + 的 特征荧光。 而噬吩甲 酞三氟丙酮配 体， 其最大吸收在3 9 0 左右， 最低 激发 三重态能级与e u 3 + 的溉 能级匹 配， 能够 发生从配体到 e u 3 + 的能量传递， 可以发射很强的红色荧光。一般情况下，配体 最大吸收峰在3 2 0 - -3 9 0 n m之间时， 其三重态能级与f u - 的s d o 能 级基本匹 配， 可敏化e u 3 + 的 特征荧光。 将稀土离子配位基团引入到环糊精上，可以得到带有环糊精单元的稀土配 合物，在前言部分我们介绍的几种环糊精稀土配合物具有一定的代表性。冠醚 或 e d t a修饰环糊精，尽管能与稀土离子配位，修饰环糊精自 身并不包含能对 稀土离子能量传递的官能团，在水溶液中几乎检测不到稀土离子的特征荧光。 但是，当环糊精空腔包结含有苯环、蔡环或葱环等芳香烃客体分子时，具有强 第二章 修饰卜 环糊精斌1 功配合物的 荧光特性及其与 胆酸胶 束的 作用 吸光特性的客体分子能够对稀土离子进行非共价能量传递， 从而发射稀土离子 的特征荧光.因此这种修饰环糊精可以间接检测芳香性客体分子。在三联毗咤 修饰环糊精稀土配合物中，修饰基团自身带有能对稀土离子能量传递的官能团， 配合物可发射稀土离子的特征荧光。配合物自 身有的三个环糊精单元，不仅可 以 键合其他有机小分子，通过多位点的协同作用，配合物还有可能作为荧光探 针标记在生物大分子上，甚至标记在胶束、囊泡或细胞膜上. 与三联毗睫类似，毗吮二甲酸与稀土离子形成 3 : 1配合物，配体三重态能 级与th3 + 的5 d a 能级非常匹 配， 该配合物可以 发射tb3 + 的 特征 荧光. 因 此我们考 虑通过乙 二肢链将毗咤二甲 酸 连接在环糊精上， 该修饰环 糊精也与n3 + 形成3 : 1 配合物，并呈现械离子的绿色特征荧光.本章我们将以该稀土配合物为荧光探 针，考察其与胆酸胶束的作用特征. 胆盐( 通常以 钠盐形式存在) 是一类类似表面活性剂的 具 有一定生理活性的 有机化合物，其疏水端由胆固醉骨架构成，其亲水端由 短的狡酸链构成.在生 物体内，胆囊分泌的胆汁是多种胆盐的混合物，其中脱氧胆酸和胆酸是主要成 分，图2 .2 给出了 它们的结构简式。 c ooh cooh 山p o x y c h o l i c a c i d ( d c a ) 洲 o c h o l i c s t i l e ( c a ) 图2 .2脱氧胆酸和胆酸的结构式 由 于胆盐胆固 醉骨架的 结 构尺寸与卜 环糊精的空腔的 大 小非常匹配， p 一 环糊 精几乎与 各种 胆酸均能 形成 稳定的 包合物 . 目 前， 单 个的 胆 酸分 子 与卜 环糊 精 及其衍生物的作用特征已有很多报道，借助二维核磁科学家己经建立了各种胆 酸分子与r - 环糊精及其衍生 物的 包结模式. 胆酸的浓度不同， b - 环糊精与胆酸的 键合比 不同， 有1 : 1 配合物， 也有2 : 1 配合物。 胆酸的 种 类不同， 卜 环糊精与胆 酸的包结方式不同，有的是胆盐的狡基从环糊精空腔的大口 端进入，有的是胆 盐的 梭 基从 环糊精空 腔的 小口 端 进入7 1 . 人 们之所以 对 胆 盐 与卜 环 糊 精的 作用 特 征有浓厚兴趣，是因为环糊精可以作为难溶性药物的载体，当环糊精药物包合 物到达胃部之后，人体分泌的胆盐与药物分子竞争进入环糊精空腔，使药物分 子从环糊精空 腔释放出 来， 通过小 肠药物分子被充分吸收1j . 然而， 在胆管中 胆 第二章 修饰s - 环糊精 钱( i i i ) 1 e 合物的荧光特性及其与胆酸胶束的 作用 盐的 浓 度 达 到5 .7 g / l ， 几 乎 是 胆 盐 一 级 临 界 胶 束 浓 度 ( c m c ,) 的1 0 倍9 。 也 就是 说，胆管中胆盐是以胶束的形式存在的，胆酸胶束不仅能增强脂肪和磷脂的溶 解性，也能与难溶性药物形成混合胶束提高药物分子的溶解度和生物利用度。 环糊精结合胆盐后是以游离的形式存在，还是与胆盐胶束形成混合胶束，至今 还不十分清楚11 0 1 . 为了 设计更复杂的 修饰环糊精药物载体， 弄清环糊精与胆盐 胶束的 作用机制是 必 要的。 另 外，以a - 环糊精和胆酸胶束混 合 体 系为固 定 相， 可以 用 于对手性药 物的 拆 分 1 1 e c a m i l l e r i 及其合作者曾 提出 了卜 环糊 精与 胆酸 胶束作用的可能机制，通常， 在高于胆酸胶束浓度时，胆酸胶束与自由胆酸分 子达到动态平衡，环糊精结合游离的胆酸分子，使胆酸分子从胶束相向水相转 移， 己 结合胆酸分子的 环糊精自 聚集成新的“ 假稳态” 相. 该“ 假稳态” 相与胆 酸胶束间存在动态平衡 1 2 1 . 这种现象与环糊精从细胞膜中 提取胆固 醉后的 情况 类似， 即结合胆固醉的环糊精也形成新的聚集体( 混合胶束) ， 该混合胶束与细胞 膜存在动态平衡 13 1结合胆酸的 环糊精是否形成新的 无定型胶束，能否观察到 这种混 合胶束， 是我们重点 解决的问 题. 本章我们将以 毗咤二酸修饰 y - 环糊精 $ d ( ii i ) 配合物为荧光 探针， 研究其与脱氧胆酸( d c a ) 胶束的 作用特征。 d c a存在 两个胶束浓度， 一级胶束 浓度 ( c m c i ) 为 7 m m左右， 二级胶束浓度( c m c z ) 大约 是6 0 m m。当d c a的浓度在一级胶束浓度和二级胶束浓度之间时，大约 1 0 个 d c a分子聚集成小胶束，其疏水端背靠背指向胶束内 部，其狡基暴露在外面. 当d c a的浓度大于二级胶束浓度时， 一级胶束逐渐转化成大的棒状胶束， 胶束 大约4 纳米长( 在d c a浓度远大于二级胶束浓度时， 可以 聚集成微米级棒状胶 束 ) ，d c a的 亲 水 基 构成 胶 束内 壁， 胶束内 部 充满了 水 1 1 4 1 。 考虑 到 胆管中d c a 的浓度高于一级胶束浓度， 因此我们选择d c a的浓度介于一级胶束浓度和二级 胶束浓度之间。 第二节实验部分 2 . 2 . 1 试剂 氧化锨( t b 4 o7， 纯度9 9 . 9 9 % ) 购于包头稀土化学公司， 使用前用5 0 %的硝酸 加热溶解， 缓慢燕发至析出晶体， 然后6 0 殡真空干燥1 2 小时， 室温真空千燥一 周。 配 置 1 w 2 m硝 酸 tt( i i i ) 储 备 液， 以 二甲 酚橙为 指示 剂， 用e d t a标定t b 3 + 第二章 修饰13 - 环糊精i d ( i i i ) w , 合物的 荧光特性及 其与 胆酸胶束的 作用 含量. 脱氧胆酸盐( n a d c a ) 购于s i g m a 公司， 使用前在5 0 筑真空千燥2 天。 卜 环糊精需重结晶 两次， 然后在9 5 效真空 千燥2 4 小 时. 对甲 基苯磺酞氛和 乙二胺购于科锐思公司，对甲苯磺酞抓使用前要进行简单处理，即将化学纯的 对甲 苯磺酞抓5 0克 溶于乙 醚中 制成饱和溶液， 用5 % n a o h水溶液 ( 5 0 0毫升) 洗涤两次，再用蒸馏水洗四 次，乙醚层用 3 0克无水 m g s o 4 千燥， 过滤除去 m g s o 4 ， 挥发滤液除去乙 醚得到白 色对甲 苯 磺酞抓固 体. 二 环己 基碳化二胺( d c c ) 和 1 - ) 1 基苯并三哇( h o b t ) 购于s i g m a 公 司. 毗淀2 ,6 - 二甲 酸由2 , 6 一 二甲 基毗 吮氧化制备， 重结晶 后备用。 n ,n - 二甲 基甲 酞 胺( d m f ) 用c a i4 2 干澡 2天后， 于 4 0摄氏度下减压蒸出备用。 2 . 2 . 2 仪器 荧光光谱测定在带有恒温装置的 j a s c o f p 7 5 0荧 光光谱仪上进行，使用 l o x 1 0 x 4 5 m m样品 池， 以 硼砂为缓冲体系， 保持测定液的p h为9 . 1 8 , 测量温度 2 5 筑，激发和发射狭缝宽均为5 n m。浊度测定在s h i m a d z u u v 2 4 0 1 紫外分光光 度计上进行，配合物和胆酸的混合溶液在超声波下振荡 5分钟，再在室温下平 衡2 4 小时.以p h为9 . 1 8 的 硼砂缓冲液为空白 溶液， 在2 5 筷测定3 5 0 n m吸光 度变化一 维和二维核磁测定在v a ri n m e r c u ry ( v x 3 0 0或v x 6 0 0 ) 核磁共振仪上 进行。 样品 均用p d为9 . 1 8 的d 2 0配置， 测定 温 度2 5 . 使 用p h i l ip s t e c n a i g 2 2 0 s t wi n透射电镜观测胶束微观结构， 测定前配合物和胆酸的混合溶液超声波 振荡5 分钟，再在室温下平衡2 4 小时，取一小滴样品溶液滴在支持薄片上，在 真空下快速干燥. 荧光显微观测在n i k o n e c l ip s e t e 2 0 0 0 u荧光显微镜上进行。 以紫外光为激发光源，利用n i k o n c c d彩色数码相机采集图片。 2 . 2 . 3 s e p h a d e x g2 5柱的制备 称取8 0 g s e p h a d e x g - 2 5 加入到7 0 0 m 1 =次 蒸馏水中 ， 沸 水浴溶解2 小时，除 去凝胶中污染的细菌和排除凝胶内的气泡。用倾析法除去凝胶上层水及细小颗 粒，反复以蒸馏水洗涤直到无细小颖粒为止，因为细小颗粒的存在会影响层析 的流速.洗净的层析柱保持垂直的位置，柱底放入少许脱脂棉，然后加入大约 5 0 m 且 二次水， 打开活塞以 排出 柱底的空气， 然后从柱 顶加 入 搅匀的 s e p h a d e x g - 2 5 浆液，打开柱底部出口，调节流速为0 一1 毫升/ 分，凝胶随柱内水溶液慢慢流下 而均匀沉降到层析柱底部，不断补入凝胶浆直到凝胶床为柱高的3 / 4 为止。然后 第二章 修 饰0 - 环糊精锹) 配合物的 荧光特性及其与胆酸胶束的作用 再用大量的水淋洗，以使柱粘实，没有空气贮存，最后床面上保持有一定的洗 脱液。 2 . 2 . 4 环糊精衍生物的分离 应该指出的是， 环糊精柱色谱分离时通常要使用t l c 检测手段来确定收集的 组分， 这种方法虽然可行，但对于无紫外吸收的化合物需用碘蒸法观测.通过 物质的颜色或洗脱曲线上吸光度的变化来检测，也可以大致判断哪些试管中有 所需的 产品，这种方法有时必须重复分离二到三次才能得到纯品. 2 . 2 . 5 合成 ( 1 )单6 - o t s - 卜 c d 取二次重结晶卜 环糊精2 1 0 g ， 溶解于1 3 0 0 m 1 蒸馏水中， 充分搅拌后溶液变 成白 色乳状液， 加入氢氧化钠溶液 ( 1 7 .2 8 , 5 0 m l ) ， 搅拌1 . 5 小时。 称量对甲 苯磺 酞抓2 6 .0 g , 溶解于8 0 m 1 乙 睛溶液中， 将该溶液缓慢滴加到卜 环糊精碱液中， 室温搅拌2 小时， 抽滤除去少 量不溶物，用2 m盐酸调节滤液p h值至7 .5 ， 此 时有大量沉淀产生，抽滤除去滤液。在加热下将沉淀溶解于 4 5 0 m l 水中， 趁热 滤掉不溶物， 滤液在0 孩重结晶1 2 小时， 过滤后得到的沉淀再重结晶三次， 6 0 缤 真空 干 燥1 2 小时 即 得到 纯的 单6 - o t s - 卜 c d约1 8 g ， 产率8 % 左右. ( 2 ) 乙 二胺修饰卜 环糊精 6 - o t s - f - c d ( 3 g ) 加入2 0 m l 乙 二 胺 溶液中， 在8 0 反 应8 小时， 冷却 后将 反 应液 滴入丙酮中 ， 收 集沉 淀即 可 得到乙 二 胺修饰6 - 环 糊精( 2 .3 g ) ， 产 率8 4 % . ( 3 )毗 吮2 , 二甲 酸 修饰f - ff m v( p y - c d ) 2 .6 1 g ( 2 m m o l) 乙 二 胺修 饰p - 环 糊精溶于 无水d m f ( 5 0 m l ) 中， 冷却 至0 a左 右。 向 该溶液中 加入 二环己 基碳 化二亚胺 ( d c c ) 0 .4 g 和1 - m基苯并三哇 ( h o b t ) 0 . 3 g , 冰浴搅拌1 小时后加入毗pit 2 , 二甲 酸0 .4 g ( 2 .4 m m o l) ， 反应液在冰浴搅 拌 1 2 小时，室温搅拌 1 2小时。6 0 筷减压蒸千反应液，残余物用少量水溶解， 然后滴入3 0 0 m 1 丙酮中， 收集白色沉淀并真空干燥， 以蒸馏水为展开剂， 用g - 2 5 葡萄糖凝胶柱提纯. 真空干燥后得纯品0 .6 6 g ， 产率2 2 %o m s ( e s i ) : m / z 1 3 2 6 .3 9 ( m + h ) ; h n m r ( d 2 0 , t m s , p p m ) : 8 2 .6 - 3 . 1 ( m , 4 h ) , 3 .2 - 4 .0 ( m , 4 2 h ) , 4 .9 0 ( s , 7 h ) , 7 . 8 8 ( s , 3 h ) . a n a l . c a l c d f o r ( c 5 1 h 7 9 0 3 7 n oh z 0 ) c , 4 4 . 3 8 ; h , 6 . 2 1 ; n , 3 .0 5 . f o u n d : c , 4 4 .5 0 . h , 6 .4 1 ; n , 3 . 1 8 . f t - i r ( k b r ) u / c n f 4 3 8 , 5 3 2 , 5 7 9 , 6 0 8 , 6 5 1 , 7 0 7 , 第二章 修饰s - 环糊精w i l ) 配合物的 荧光特性及其与 胆酸 胶束的 作用 7 5 7 , 8 4 7 , 9 4 4 , 1 0 3 1 , 1 0 7 9 , 1 1 5 5 , 1 2 4 2 , 1 3 6 9 , 1 4 3 4 , 1 5 7 2 , 1 6 1 5 , 2 1 5 2 , 2 9 3 0 , 3 3 3 7 . 第三节结果与讨论 2 . 3 . 1 p y - c d的合成与提纯 由 卜 环糊精合 成毗 吮2 ,6 - 二甲 酸修 饰卜 环 糊精( p y - c d ) 需 三步 完成， 其反应 历程如图2 . 3 所示。 对甲苯磺阮抓 n a o h / h 2 o , r t c-oh二。 厂 1n h z 毗咤z 6 - 二甲酸 图2 .3毗 吮2 ,6 - 二甲 酸 修 饰卜 环糊 精 合 成 路 线 对甲 苯磺酞氛与p - 环糊精反 应可以 方便地得到 6位 单 取代的 对甲 苯 磺酞基 修饰卜 环糊精( 单6 - o t s - 卜 c 功。 目 前单 取代6位卜 环 糊 精 衍 生 物的 合成 主要是 通过f - c d先与对甲 苯 磺 酞氛反 应生成6 - o t s - f - c d , 然 后 经6 - o t s - p - c d与亲 核试剂作用生成目 标化合 物。 这 样作为中间 产物及原料的6 - o t s - 卜 c d的 合成在 环糊精化学修饰过程中 就 变得非常 重要. 文献报道6 - o t s - p - c d的合成有两条路 线p 5 ) 。 这两条路线相比 较， 一条路线使用毗淀作为溶剂， 被人们所广泛采用。 在这条合成路线中，反应中所用的药品，试剂，溶剂等都必须事先严格干燥， 否则微量的水也