（预防兽医学专业论文）2型RA42KDa外膜蛋白的原核表达及免疫活性研究.pdf

摘要 本试验利用p c r 技术扩增了标准血清2 型r a 的4 2 k d a 外膜蛋白基因片段( o m p a 2 ) 1 0 4 5 b p ， 与原核表达载体d g e x 4 t - i 连接构建重组表达载体，转入大肠杆菌b l 2 1 菌株中，在1 m m 的i p l g 诱导下，表达融合蛋白，诱导后5 h 蛋白表达量达到高峰。融合表达蛋白g s t - o m p a l - 2 的分子量 约为6 5 k d a ，以包涵体形式存在。 以脱氧胆酸钠( d o c ) 洗涤包涵体，然后崩n 一十二烷基肌氨酸钠( s k l ) 溶解，将溶解包 涵体进行透析复性。分别用亲和层析法、电洗脱法和研磨法对g s t - o m p a l - 2 融合蛋白进行了纯 化，亲和层析纯化效果不佳，电洗脱法和研磨法则获得了较好的纯化效果。 将g s t - o m p a l 2 融合表达蛋白免疫鸭，采血分离血清。g s t - o m p a ，2 以0 8 5 p g m l 的浓度 包被酶标反应板，鸭抗2 型r a 阳性血清进行2 0 0 x 稀释，h r p 山羊抗鸭i g g 作5 0 0 0 稀释，建 立间接e l i s a 方法检测免疫鸭的抗体水平。间接e l i s a 和w e s t e r n - b l o t t i n g 试验结果均表明 g s t - o m p a l 2 表达蛋白具有良好的反应原性。以2 型r a 强毒攻击免疫鸭结果表明g s t - o m p a l 一2 表达蛋白对免疫鸭不能提供完全保护。 研究认为g s t - o r n p a 、2 表达蛋白具有良好的反应原性，阻断试验表明不存在血清型特异性， 所以，g s t - o m p a ，2 可望作为包被抗原用于r a 的诊断试剂盒的制各。 关键词：r a ，o m p a ，免疫，e l i s a a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , 1 0 4 5 b pg e n ef r a g m e n to f t h e4 2 k d ao m p ao f r as e r o t y p e2 ( o m p a - 2 ) w a sa m p l i f i e d b yp c r ，t h e nc o m b i n e dw i t hp g e x 一4 t - 1v e c t o r , a n d as e q u e n c e ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dc o n t a i n i n g o m p a 一2g e n ef r a g m e n tw a so b t a i n e d t h er e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i n ( g s t - o m p a l 2 ) w a se x p r e s s e d a th i g h e s tl e v e li ne c o i lb l 2 1i n d u c e db yl m m o l li p t gf o r5 hi nt h ef o r mo fi n c l u s i o nb o d i e s t h e m o l e c u l a rw e i g h t so f g s t - o m p a r 2i sa b o u t6 5k d a t h ei n c l u s i o nb o d i e sw e r ew a s h e dw i t hd e o x y c h o l i ea c i ds o d i u ms a l t ( d o c ) f o rs e v e r a lt i m e s ，a n d t h e nd i s s o l v e di nn l a u r o y ls a r c o s i n es o d i u m ( s k l ) f o rd e n a t u r a n t a r e rt h a t ，ag o o dr e n a t u r er e s u l t w a so b t a i n e db yd i a l y s i s t h ep u r i f i c a t i o no fg s t - o m p a t 2w a sd o n eb ya f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yo fg l u t a t h i o n es e p h a r o s e 4 b ，e l e c t r o d i a l y s i sm e t h o da n da b r a s i o nm e t h o d ，w h i l eo n l yt h e l a s tt w om o h o d sa t t a i n e dp e r f e c t r e s u l t s t h eg s t - o m p a l - 2w a su s e dt oj m m u n i z ed u c k t h ei n d i r e c te l i s aw a se s t a b l i s h e dt od e t e c tt h e l e v e lo fa n t i b o d yo fv a c c i n a t e dd u c k sw i t hp r o c e d u r e f o l l o w s ：r e a c t i o np l a t ec o a t i n gb y g s t - o r n p a v 2o f 0 s s p g m l 2 0 0xd i l u t i o no f r ap o s i t i v es e r u ma n dt h e n5 0 0 0xd i l u t e dh r p 。g o a t a n t i d u c ki g g t h er e s u l t so fi n d i r e c te l l s aa n dw e s t e r n - b l o t t i n gs h o w e dt h a tg s t - o m p a l - 2h a dg o o d a n t i g e n i c i t y g s t - o m p a l 2s h o w e dn o ta b s o l u t ep r o t e c t i o nf o rt h ed u c kw h e nc h a l l e n g e dw i t hr aq p e 2t ot h e i m m u n ed u c k s f r o mt h es t u d y , i tc a l lb ec o n c l u d e dt h a tg s t - o m p a i 2h a dg o o da n t i g e n i c i t ya n ds h o w e dn o s p e c i f i c i t yb e t w e e nv a r ys e r o t y p e so fr ab yb l o c k i n ge l i s a ，s oa p p l i c a t i o nt ot h ec l i n i c a ld e t e c t i o no f r ai n f e c t i o na n ds e r o l o g i c a li n v e s t i g a t ei sp o s s i b l e k e yw o r d s ：r a ，o m p a ，i m m u n e ，e l i s a 缩略词表 独创性声明 。f 7 4 6 0 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 丽使恿泣豹材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说聪并表示了谢意。 僦躲叫欤缉 时间：伽歹 年么月声 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 勾军 i f 时间：撕y 年z 月7 日 导师签名= 膨勘彪 帆帅r 年歹月夕日 中国农业大学硕士学位论文 引言 引言 鸭疫里默氏菌( r i e m e r e l l a a n a t i p e s t i f e r ，r a ) 是一种革兰氏阴性，无运动力，不形成芽孢的 球杆状细菌，主要侵害家鸭，也可感染鹅、火鸡、鸡等家禽，亦有报道从野禽和家养猪中分离到 本菌【i j 。由该菌引起的鸭疫里默氏菌病( 又名新鸭病，鸭疫综合征，鸭传染性浆膜炎和鸭败血症 等) 是一种高致病性、接触性传染病，主要引起感染鸭急性或慢性败血症、纤维素性心包炎、肝 周炎、气囊炎、脑膜炎和干酪性输卵管炎，还可出现结膜炎、关节炎以及生长发育迟缓等症状。 目前本病已成为危害养鸭业的主要细菌性传染病口j 。 r i e m e r ( 1 9 0 4 ) 首次报道了鹅发生本病并称之为“鹅渗出性败血症( s e p t i c e m i aa n s e r u m e x s u d a t i v e ) ”。美国的h e n d r i c k s o n 和h i b e r t 于1 9 3 2 年首次报道纽约长岛三个鸭场的北京鸭发生 感染l j j 。如今，该病已呈世界范围分布，几乎可在所有集约化养鸭生产的国家发现。郭玉璞等【4 1 于1 9 8 2 年在北京郊区首次确定本病，此后。在全国许多地区相继有本病发生的报道口“。”。由于 该病分布的广泛性以及引起小鸭的高死亡率、发育迟缓和淘汰率增加给养鸭业造成巨大的经济 损失。所以，对r a 进行深入、细致研究，以便预防和控制、乃至最终消灭本病，有着重要的经 济意义。 1 r a 的分类地位 从最初发现r a 至今，其分类地位几经变更。首先分离和鉴定该致病菌的h e n g r i c k s o n 和 h i l b e r t ( 1 9 3 2 年) 将其命名为鸭疫斐佛氏苗( p f e i f f e r e l l aa n a t i p e s t i f e r ) t 3 1 。1 9 5 4 年b r u n e r 和f a b r i e a n t 研究比较了该菌与布鲁氏菌属、巴氏杆菌属、莫拉克氏蔼属、放线菌属和嗜血杆菌属细菌的特征， 认为本菌与莫拉克氏箧属有较多的共同之处，因而建议采用鸭疫莫拉克氏菌( m o r x w l l a a n a t i p e s t i f e r ) 这名称i 。第七版伯杰氏细菌学鉴定手册将其命名为鸭疫巴氏杆菌( p a s t e u r e l l a a n a t i p e s t i f e r ) 。p i e c h u l l a ( 1 9 8 6 ) 等1 9 1 通过比较r a 和相近细菌的d n a 碱基组成、d n a d n a 杂交 同源性分析、甲基化细胞脂肪酸图象、电镜形态以及甲基萘醌类和分支脂肪酸的产生等，发现 r a 与黄杆菌，噬纤维菌群( f l a v o b a c t e r i u m c y t o p h a g a ) 的某些成员在很多方面是相同的，因此建 议将其划入黄杆菌噬纤维菌r r n a 同源群中。s e g e r s 等( 1 9 9 3 ) i l ”通过研究r r n a 顺反子相似性， 将其列为同源群的单独一个r r n a 分支，即属于r r n a 总科v 中的一个r r n a 同源群s u b r a m a n i a m 等( 1 9 9 7 ) t ”j 研究了4 株r a 编码的1 6 sr r n a 的r r s 基因，通过d n a 序列分析进一步证实了本菌 的系统发育位置，即属丁r r n a 总科v 中的黄杆菌科的一个独立的r r n a 分支。为纪念r i e m e r ， 亦为了避免新名词所致的混淆，遂将其命名为鸭疫里默氏菌属( r i e m e r e l l a a n a t i p e s t i f e r g e n n o v ) ， 其典型菌株是l m g l l 0 5 4 = a t c c l l 8 4 5 = m c c m 0 5 6 8 = c c u g l 4 2 1 5 。这一更名得到了世界其他国家 学者的认可，并被国际权威性专业期刊如a v i a nd i s e a s e 、a v i a np a t h o l o g y 所引用“。 2 血清型 r a 的血清型众多，过去不同国家采用不同的分型系统，结果同一血清型往往有不同的名称 中国农业大学硕士学位论文 引言 为避免这种混乱，后来统一采用美国的阿拉伯数字分型系统i l 。到目前为止，世界上报道的公认 的r a 血清型共有2 1 个“1 6 , ”l ，即血清1 2 l 型，各血清型对应的参考菌株见表l 。p o r n p e n p a t h a n a s o p h o n 等( 2 0 0 2 ) i ”铡用h a e l l l 酶切分析了8 0 株r a 分离株的1 6 sr r n a 的h t i 基因的p c r 扩增片段，根据h a e i i l 酶切图谱的差异，认为k - - - 6 7 0 8 9 不适合做2 0 型的标准株，建议以6 9 8 9 5 代替之。汪铭书、程安春等( 2 0 0 3 ) 【1 目从不同代次的5 9 0 日龄患有典型鸭传染性浆膜炎的病 死鸭中分离到4 个不属于1 2 l 型的新的抗原型，分别命名为2 2 、2 3 、2 4 、2 s 裂。 表1r a 血清型及参考菌株 t a b l e1s e r o t y p e so f r aa n dr e f e r e n c es t r a i n s s a n d h u 等( 1 9 7 9 ) 1 9 1 认为r a 各血清型之间不发生交叉反应，但张大丙等( 2 0 0 2 ) 2 0 1 发现2 型与1 7 型在玻片凝集试验中存在明显的双向交叉反应，在试管凝集试验中表现为单向低度交叉 反应。张大丙等( 2 0 0 2 ) 2 1 i 还证实6 型、1 2 型与1 6 型之间存在交叉反应。至于其它血清型r a 是否存在交叉反应以及交叉反应程度的强弱还有待于进一步研究。 3 诊断 3 1 临床诊断 典型的r a 感染可根据流行病学特点、l 艋床症状和病理变化做出初步诊断“。 流行病学特点：1 8 周龄的鸭对自然感染都易感，但尤以2 4 周龄最易感且发病率高。本 病的感染率很高，可达9 0 ，死亡率在5 一8 0 不等。一年四季均可发生，主要经呼吸道或皮肤 感染。恶劣的环境条件可成为促发本病的诱因。 临床症状：最急性病例看不到任何明显症状突然死亡；急性病例除常见精神沉郁、嗜睡症状 外，还可出现下痢、眼和鼻腔有分泌物、头颈震颤、角弓反张等症状；慢性病例往往出现脑膜炎 神经症状。 病理变化：病理割检常见有纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、脑膜充血、出血， 病程长者渗出物干酪化，慢性病例可能有输卵管炎、关符炎和局灶性蜂窝织炎 中国农业大学硕士学位论文 引言 3 2 细菌学诊断 由于在鸭传染性浆膜炎流行期间也常有鸭大肠杆菌败血症、鸭副伤寒、鸭巴氏杆菌病等并发 或继发，其病理变化非常近似，几乎用肉眼难以区分。因此确诊还必须进行细菌学检查。对r a 的实验室诊断技术包括：病变器官涂片镜检、细菌的分离、生化特性的鉴定、荧光抗体法检查、 问接血凝试验、间接e l i s a 等，还可以采用平板凝集、试管凝集和琼腊扩散实验相结合的方法进 行血清型鉴定8 3 ，“】，必要时可测定细菌d n a 的g + c 含量以及未定型菌与定型菌进行d n a 同源 性比较。 3 3 分子生物学诊断技术 现在国内外出现很多新的全自动微生物培养、检测仪器这些仪器尽管都不同程度地缩短了 检测时间但是，目前一般仍需要培养2 4h 以上，且成本也大大提高。而且，细菌作为一种有生 命的细胞，繁殖速度虽然远远快于其他生物，但却不可能无限制地缩短，这就决定了以细菌繁殖 为基础的培养鉴定法，无论使用何种先进仪器都不可能最终克服其耗时长的缺陷，并且，传统的 细菌学检验与鉴定方法对某些不宜培养的细菌也往往不能给出理想的鉴定结果。而分子生物学方 法的检测对象是核酸，正可以克服这一缺点，能快速、准确地检测标本中病原微生物的感染。随 着分子生物学技术的发展，生物学家开始应用分子生物学技术来研究微生物的种系发育、系统进 化和种群分析等问题。尤其是p cr 技术的出现使问题出现了转机，它避开了扩大培养这一步， 实现了对目的基因的直接扩增，使许多难于培养或根本不能培养的微生物也可以被研究。 本试验中的r a 属苛养菌，对营养成分和培养条件要求比较严格，德国的h i n z 等( 1 9 9 8 ) 2 4 l 利 用常规方法和a p i 微量检验系统对1 9 9 株r a 以及从不同宿主菌分离的相似菌株进行了广泛的生 化试验但其生化特性不尽一致，不足以作为r a 分类的依据。此外，鸭传染性浆膜炎与大肠杆 菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鼻气管鸟杆菌、考诺尼亚菌等细菌引起的疾病在临床症状和病 理变化上相似”，因此，亟需建立一种方便、快速、准确的方法对r a 进行鉴别诊断。一般 p c r 通常只检测特定病原体，在病原体来明时，需用多对不同引物对不同的病原微生物进行扩增 费时费力，所以该技术在临床检测病原微生物中的应用受到一定的限制。基于此，一些新的分子 生物学方法应运而生。 3 2 1r f l p 分析法 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 分析是第一代以 d n a 指纹图谱为基础用于微生物分型鉴定的方法。其原理是用限制性内切酶将细胞基因组d n a 进 行切割，然后在琼脂糖凝胶上电泳分离，以显示不同种群基因组d n a 的限制性片段长度多态性。 r f l p 产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定，但往往会因r f l p 产生的指纹图 谱十分复杂而造成分析上的困难。r i c h a r db 等b m 利用1 7 种内切酶对r a 基因组d n a 进行了指 纹分析，其中咀h i n f i 和d d ei 内切酶消化的r a 染色体d n a 经琼脂糖电泳后的指纹图谱清晰可见， 可用于试验中8 9 株r a 的鉴别，其余1 5 种内切酶由于- 酶切图谱杂乱无章而无法应用。 中国农业大学硕士学位论文引言 3 2 2r e p - p c r 分析法 重复序列p c r 基因指纹分析( r e p e t i t i v ee l e m e n tp c rg e n o m i cf i n g e rp r i n t i n g , r e p - p c r ) 也是一 种以d n a 为基础的分型方法。目前应用于p c r 的重复序列主要是b o x 片段，大小为1 5 4 b p ，是由 保守性不同的弧序列组成，最初定义了3 种不同的亚单位，b o x a ( 5 7 b p ) 、b o x b ( 4 3 b p ) 和 b o x c ( 5 0 b p ) ，而只有b o x a 亚单位在不同细菌中表现山多拷贝和高保守性。按照b o x a 亚单位设计 的寡核苷酸引物进行p c r ，使得位于重复序列之间的不同基因区域得以选择性扩增，得到大小不等 的dna 扩增片段，通过对p c r 产物进行电泳图谱分析获得分类学信息口9 i 。该技术己应用于大肠 杆菌、肠炎沙门氏菌【，l i 、黄单胞菌1 3 2 i 等的分类和鉴定。结果表明：r e p p c r 基因指纹分析具有 分辨率高、稳定、重现性好、简便易行等特点，是一种快速而有效的dna 指纹技术。b i nh u a n g 等1 3 3 1 利用r e p p c r 法分析了3 5 株r a 的电泳图谱，得到1 9 个不同的电泳谱型，并认为可根据电泳 谱型不同区分同一血清型的不同菌株。该方法对所有r a 菌株的适用情况有待于进一步验证。 3 2 31 6 sr r n a 基因序列分析法 在众多的d n a 分析方法中，d n a 序列分析可谓微生物鉴定的黄金指标。细菌基因组通常 含有多拷贝r r n a 基因操纵子，每个操纵子由1 6 s 、2 3 s 、5 sr r n a 。t r n a 及间隔区序列组成。 尽管r r n a 基因的保守性很强，但不同种群r r n a 基因操纵子中的片段序列存在差异，因而所产 生的限制性片段具有多态性，有可能产生有用的分类学信息。其中1 6 sr r n a 基因序列分析在微 生物种群分析方面应用的更为广泛。 1 6 sr r n a 为原核生物核糖体中的一种核糖体r n a ，是核糖体小亚基的骨架。其基因在结构 上分为保守区、半保守区和非保守区，保守区序列基本恒定，半保守区和非保守区序列因不同种、 属细菌而异，一般可分为9 1 0 个可变区。图l 表示了大肠杆菌i t n 操纵子上部分保守序列的相 对位置口“。1 6 sr r n a 所含信息量丰富且睦度适中( 1 5 0 0 b p 左右) ，易于测序。v a n d e n 等i ”j 通过 1 6 sr r n a 序列分析表明：在细菌域、古菌域和真核生物域间序列相似性低于6 0 ，而域内的 序列相似性都高于7 0 ，由此可对微生物物种进行分类并构建进化树。随着微生物核糖体数据库 的日益完善，1 6 sr r n a 分类系统已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。大约2 5 0 0 个种的1 6 s r r n a 全序列已被报道，根据它们的序列同源性，已经构建了各静属的系统发育树p “。目前也已 有许多株r a 的1 6 sr r n a 的部分基因序列被测出，并存入到g e n b a n k 中这为直接利用这些序 列设计p c r 引物或寡核苷酸探针检测r a 提供了便利条件。 | 生；巾j f 号1 1 0 表示下州棱酸片段： t h en n m w 1 - 0 什f n m n f f h “l 删n 异n 讪稚“s ! f i i 猢惮m 融8 ： w i & i nl 酏d t n a 孽m ： l ：b 、2 7 ；2 ：1 弹i 一1 4 1 d ；3 ：1 4 9 1 一l5 i 培；4 ：1 5 2 5 一 5 4 1 ： 呐t h i n 黔sd l n a “： 5 ：2 i 一3 8 ；6 ：1 1 5 1 3 2 1 7 l 8 8 坷b ；s ：4 2 2 4 3 7 ；9 ：4 4 1 4 柏 1 0 ：啪一4 _ 4 图1 - 1 大脯杆菌rr n 撮纵予上部分保守序列的相对位置 f i g i - 1t h er e l a t i v ep o s i t i o no f p a r t i a lc o n s e r v a t i v es e q u e n c e so f e c o l ir r no p e r o n 4 中国农业大学硕士学位论文 引言 3 2 4 外膜蛋自在诊断中的应用 胡清海等根据已发表的i 认1 5 型c v l l l o ，8 9 株编码4 2 k d a 主要外膜蛋白的基因序列设计引 物，建立p c r 方法对7 个血清型的r a 纯培养菌及野外病死鸭病料进行检测。结果表明，7 个血清型 的r a 纯培养菌d n a 均可扩增出8 0 9 b p 的d n a 片段，而对照的大肠杆菌和沙门氏菌纯培养菌d n a 扩增结 果为阴性。由此可见，针对外膜蛋白建立的p c r 方法可用于r a 的鉴定和快速诊断。 4 防制 4 1 药物 鸭传染性浆膜炎作为一种细菌性传染病，抗生素类药物对其有一定的治疗效果。虽然药敏试 验表明r a 对多种药物敏感i 琊孵，但实际生产中的应用效果并不理想，要达到比较好的防治效果， 必须反复投药，这既增加了生产成本，又易产生耐药性，且长期使用抗生素类药物势必会破坏正 常菌群。影响免疫力使鸭只更易发生感染。因此，制各有效力的菌苗来预防鸭传染性浆膜炎是 当务之急。 4 2 疫苗 目前，国内外研制的r a 疫苗有灭活疫苗、弱毒疫苗“叩 ”，亚单位疫苗正在研制中。 s a n d h u ( 1 9 8 4 ) 等”针对美国主要流行株中的1 、2 、5 型r a 研制了三价福尔马林灭活苗。该三价 苗对这三个型的细菌均有保护作用，但保护力持续时问较短。p a t h a n a s 叩h 0 n ，e0 9 9 6 ) 等h 2 证明无 细胞滤液制备的灭活苗具有与细胞灭活苗同等的效力。t a n 等( 1 9 9 3 ) 4 3 1 利用血清1 型的1 株 单抗通过e l i s a 试验发现能与1 ，2 ，6 ，7 ，l o ，1 1 ，1 4 ，1 5 和1 7 型的r a 起反应，证实了r a 中存在群 反应性位点。这种具有免疫原性的群反应性位点给研制一种疫苗米抗儿种血清型的r a 感染带来 了可能。 c h a n g 等1 4 4 4 5 对6 0 株r a 进行了质粒提取，发现7 7 的r a 菌株至少带有一个质粒，6 0 的 r a 菌株含3 9 k b 的质粒。1 2 的菌株含5 6 k b 和1 6 0 k b 的质粒，5 的质粒含2 9 k b 、1 6 0 k b 、 1 8 0 k b 的质粒，2 3 的r a 菌株不带质粒。他们对分离的3 9 k b 和5 6 k b 的两个质粒作了d n a 测序与分析，发现其开放读码区有编码r a 毒力摆关基因( w p d l ) 。对v a p d l 序列进行p c r 检 查表明v a p d l 序列仅存在于含质粒的r a 菌株中，这对阐明r a 的致病机制具有重要意义，并 可为开发针对含质粒菌株的亚单位疫苗提供一条新的途径。 国内，高福等 4 6 1 用1 型r a 制各的福尔马林灭活苗和油乳剂苗对实验和野外感染均有较高的 保护作用，但需进行两次免疫；苏敬良等【4 7 1 研制出铝胶灭活苗。同样需免疫两次才有较好的保护 作 l 。张鹅晓等1 4 s 对用不同疫苗免疫鸭的抗体消长规律测定发现，油佐剂疫苗免疫效果最好，甲 醛灭活苗两次免疫次之，甲醛灭话苗一次免疫效果最差，同时，他们还从抗体水平角度推断，雏 鸭1 0 日龄左右用苗最好。黄瑜等1 4 9 1 研究了l 型r a 铝胶苗、蜂胶苗和油乳剂苗3 种灭活苗的特 性，证实油乳剂灭活苗能提供最高的免疫保护率。程安春等p 针对1 、2 、4 和5 型研制的ra 四 价铝胶复合佐剂灭活苗可对雏鸭提供良好的免疫保护。苏敬馥等【5 ”对1 裂r a 的荚膜提取物的免 中国农业大学硕士学位论文 引言 疫原性进行了研究。结果表明，荚膜粗提取物和经过苯酚抽提纯化后的荚膜提取物，经2 次免疫 7 日龄北京鸭后对同源细菌的攻毒保护率分别为9 0 和7 0 。 由于在本病流行时，往往伴随大肠杆菌( e ，c o l i ) 感染，为了控制r a 与e c o l i 的混合感染， s a n d h u ( 1 9 8 5 ) 9 “研制了r a e c o l i 甲醛灭活苗，但需要接种两次才能有效地保护到上市日龄；吕 敏娜等进行了r a ( 1 型) e ，c o l i ( 0 7 i ) 二联蜂胶灭活苗的研究h 。二免保护率可达8 0 9 0 。 4 3 外膜蛋白免疫原性分析 4 3 1 外膜蛋白的结构组成 近年来关于细菌外膜蛋白( o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ，o m p ) 的研究，国内外学者做了大量工作， 也取得了很大进展。外膜在细菌胞浆膜和肽聚糖的外侧包围整个细菌是革兰氏阴性菌细胞壁 所特有的结构，厚约8 1 0 r i m ，约占细胞干重的8 0 ，由脂质双层、多种外膜蛋白和脂多糖组成 ( 见图2 ) 。外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的重要组成成分，按其在细胞中的拷贝数高低分为主 要蛋白和微量蛋白。主要外膜蛋白包括外膜a 蛋白( o u t e rm e m b r a n ep r o t e i na ，o z p a ) 、微孔 蛋白( p o r i n s ) 、脂蛋白( l i p o p r o t e i n ，l p p ) 等。一般在细胞内的拷贝数为l x l o l 2 x 1 0 。但 外膜蛋白的数量及种类随着不同的菌株及不同的培养条件而有所变化。o m p 在细菌代谢物质的运 输、维持细菌的形态及调节细菌有关物质合成方面起重要作用。o m p 在细菌致病性和免疫原性方 面也发挥着重要的作用p ”， 外舶i 壹白f c 圈l - 2 革兰氏阴性菌细胞壁外展的构成 【引自舞炳华分于内毒素学) f i g c o n s t i t u t e so f t h eo m pa f g - b a c t e r i a 4 3 2 ， 咸蛋白的致病作用 抗厦 置白 病原菌的致病作用必须能够逃避或适应宿主的防御，许多研究已证实，某些细菌的o r n p 在 细菌致病过程中起着重要的作用。在大多数感染过程中，病原微生物只有吸附于机体的易感部位 才能致病，而某些细菌的o m p 有助于细菌对宿主细胞的吸附，如s c h u l z e k o o p e k l 9 9 3 ) l s s l 报道肠 6 中国农业大学硕士学位论文 引言 致病性耶尔森氏菌y a d a 外膜蛋白可以饱和浓度依赖性的方式介导细菌与细胞的结合，这种细菌 或细菌蛋白产物与组织中细胞外基质结合方式可能是组织粘附的种机制。m o s e 等( 1 9 9 3 ) 1 5 6 j 还发现空肠弯杆菌外膜蛋白粗提物或纯化的外膜蛋白在体外试验中对入胚小肠上皮细胞系i n t 4 0 的亲和力远远高于其鞭毛提取物。其次，o m p 有助于细菌逃避机体的免疫防御。例如引起新生期 脑炎的大肠埃希氏菌o m p 在对脑微血管内皮细胞的侵入中起一定作用。此外，细菌的o m p 通过 抗吞噬、抗补体及抗血清杀菌作用也对细菌的致病过程起着非常重要的影响【57 1 。 4 3 3 外膜蛋白的兔痘活性 t a n 等( 1 9 9 1 ) p ”用免疫转印技术测定了血清1 0 型和l 型r a 分别具有分子量为6 7 k d a 、 4 8 k d a 的免疫原性蛋白，但它们能否诱导保护性抗体的产生尚不清楚。p a t h a n a s o p h o n 等1 5 9 1 应用 饱和硫酸铵沉淀法和s e p h a d e xg 2 0 0 凝胶柱提纯了l 型r a 的外膜蛋白，对1 4 日龄雏鸭一次性 皮下注射氢氧化铝吸附的r a 蛋白( 1 0 0 p g p ) ，免疫后2 l 天攻以同源菌( 5 x 1 0 9 c f u ! 只) ，可获 得1 0 0 的保护。苏敬良等用1 型r a 外膜蛋白抗原加弗氏佐剂免疫北京鸭检测其保护性，结 果表明对同源细菌攻击的保护率为1 0 0 。另有试验表明，r a 蛋白半数有效荆量为4 3 i a g 只，经 甲醛灭活的r a 菌体疫苗也能很好地抵抗同源菌的攻击，经1 0 0 y ：处理1 h 或用胰蛋白酶处理后完 全丧失免疫原性，经脂酶处理后丧失部分免疫原性，表明外膜蛋白是r a 的主要免疫原，这为研 制和开发r a 蛋白苗奠定了基础。 目前对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、放线杆菌、流感嗜血杆菌的外膜 蛋白研究的比较充分，研究表明这些细菌的o m p 均具有良好的免疫原性i “】。苏敬良等( 1 9 9 9 ) 1 6 ” 通过提纯的1 型r a 外膜蛋白进行免疫印迹实验证实1 型r a 的4 4 k d a 外膜蛋白具有很强的免疫 原性。o m p 不仅可以激发机体的体液免疫反应而且还可以引起细胞免疫| 6 7 j 0 9 1 ，其交叉保护作用也 已在不少革兰氏阴性菌中得到证实2 1 。 苏敬良( 1 9 9 9 1 1 叫对分自北京郊区几个鸭场1 0 株1 型r a 的外膜蛋白进行分析，发现其外膜蛋 白电泳图谱基本相同，仅l 株的图谱与其它9 株略有差异；朱德康( 2 0 0 3 ) ”分析了五种血清型r a 外膜蛋白的电泳图谱，根据其图谱的差异，可将r a 外膜蛋白分为3 个不同的o m p 型。是否可据 此将r a 按电泳图谱划分为不同的o m p 型，需要进一步收集更大量的菌株进行比较，结合流行病 学调查资料，进行统计分析才能做出定论。 用细菌o m p 制备疫苗，可保护机体抵抗同型或异型菌的攻击，但由于从菌体中直接提取o m p 产摄太低，所以需要采用一种新的能获取大量o m p 的方法。随着分子生物学的发展，克隆表达 技术披广泛应用到各种细菌o m p 片段的表达中。已有许多基因被克隆并在不同的宿主系统中表 达。一些学者也对r a 的o m p 基因的克隆表达进行了研究。新加坡的s u b r a m a n i a m 等( 2 0 0 0 ) 7 4 1 克隆表达了r a 中编码4 2 k d a 主要保护性外膜蛋i 自l ( o m p a ) 的基因片段，并分析了其结构，发现 o m p a 是一个保守性和抗原性很强的蛋白。h u a n g 等( 2 0 0 2 ) ”利用重组表达的1 5 型r a 的4 2 k d a o m p a 和1 2 型r a 的4 1k d a 的部分蛋白( p 4 5 n ) 免疫鸭检测其免疫原性和保护原性。免疫印迹和 e l i s a 结果均表明重组表达蛋白具有很好的免疫原性，但针对1 5 型强毒株( 3 4 9 0 ) 的攻击，没有 提供有效的保护。 7 中国农业大学硕士学位论文引言 5 本研究的目的意义 虽然具有致病作用，但其致病作用往往是在完整的细菌中以及与其它致病因子协同作用 才表现出来。迄今为止还没有试验证明提纯的o m p 和表达的具有致病性，相反，众多试验研 究证明提纯的o m p 和表达的o m p 具有良好的抗原性，能刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。r a 外膜蛋白的保护作用究竟是由外膜蛋自的多个成分共同完成还是由免疫原性强的单独成分起作 用尚不清楚。已有资料报道r a 的4 2 k d a 外膜蛋白具有较强的免疫原性。本试验针对我国临床常 见多发型一2 型r a 的4 2 k d a 外膜蛋白进行了克隆表达和免疫活性研究。旨在探索r a 外膜蛋白中 起主要免疫作用和保护作用的成分，为制备诊断试剂盒和开发r a 外膜蛋白作为亚单位疫苗提供 科学依据。 8 中国农业大学硬士学位论文第一章2 型r a 外膜蛋白基因的克降及序列分析 1 材料 第一章2 型r a 外膜蛋白基因的克隆及序列分析 1 1 菌株与载体 2 型r a 标准菌株：本实验室保存。 d h 5a 感受态菌株：购自北京天为时代科技有限公司。 e c o l i b l 2 1 菌株：基因型为f ，o m p t , h s d sn t ，m d ) ，g a l ，购于博大泰克生物公司。 克隆载体：p g m t - e a s yv e c t o r , 购自北京天为时代科技有限公司。为两端带有t 接头的线性 克隆载体，含a m p 抗性基因和l a c z 基因。 表达载体：p g e x - 4 t - 1 ，系农业部兽医诊断中心孙明博士惠赠。全长4 ，9 7 0 b p ，为含有t a c 启动子和a m p 抗性基因的原核高效表达载体，表达带有g s t - t a g 的融合蛋白。 1 2 主要试剂 t a qd n a 聚合酶、d n t p s 、t 4d n a 连接酶：t o y o b o 公司生产。 限制性内切酶e c o r i 、b a m h i 、x h o i ：购自n e b b i o l a b s 公司。 d n a 快速纯化回收试剂盒：购自北京天为时代科技有限公司。 离心拄型质粒提取试裔4 盒：购自北京天为时代科技有限公司。 t s a 、t s b 培养基：为d i f c o 公司产品。 i p t g 。x g a l 等：购自北京天为时代科技有限公司。 1 3 实验所用溶液及其配制 1 3 1 实验菌株所用培井基 t s b 培葬基： 却至5 0 左右， t s a 培养基： 却至5 0 左右， 称取3 0 9 t s b 粉剂加入1 0 0 0ml 去离子水中混匀， 按2 的比例加入新生牛血清，4 保存备用。 称取4 0 9 t s a 粉刺加入t 0 0 0ml 去离子水中混匀， 按2 的比例加入新生牛血清。4 。c 保存备用。 1 3 2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液 1 2 i 。c 高压灭菌2 0 m i n ，冷 1 2 1 c 高压灭菌2 0 a i n ，冷 1m o l lc a c l 2 贮存液： c a c l 21 1 1 9 溶y - 1 0 0 m l 双蒸水中，过滤除菌，分装，2 0 贮存，使用时稀释至0 1m o l f l 。 氨苄青霉素( a m p ) 贮存液： 按1 0 0 m g ml 比例将a m p 粉剂溶于双蒸水中，过滤除菌，分装， 2 0 冻存。 9 中国农业大学硕士学位论文 第一章2 型r a 外膜蛋白基园的克隆及序列分析 2 0 m g ml x - g a | 贮存涟： x g a l 2 0 m g 溶于l m l 】二甲基甲酰胺中，一2 0 c 避光保存。 l o o mm o l l i p t g 贮存液； i p t g2 3 8m g 溶于1 0m l 双蒸水中，过滤除菌，分装，2 0 c 冻存备诱导表达用。 l b 液体培养基： t r y p t o n el o g y e a s te x t r a c t 5 9 n a c i l o g 加9 5 0ml 蒸馏水，用】0 m o l ln a o h 调节p h 值至7 4 ，然后定容至1 0 0 0ml ，】2 】高压 灭菌2 0 r a i n 。 l b 琼脂：按1 5 ( w v ) 加入琼脂粉，冷却至5 0 c 左右时，倾注无菌平皿。 a m p l b 液体培养基：于l b 液体培养基中，加入a m p 贮存液至终浓度为1 0 0ug m e ， 4 c 保存。 a m p l b 固体培养基：琼脂粉1 5 9 溶于1 0 0 ml 液体培养基中，1 2 1 高压灭菌2 0 m i n ，冷却 至5 0 c 左右，加入a m p 贮存液至终浓度为1 0 0i x ml ，浇制平扳。 a m p l b x g a l f l p t g 平板：在制各好的a m p l b 平扳上加4 0ulx - g a l ( 2 0 m g ml ) 和7ul i p t g ( 2 0 0 r a g ml ) ，用灭菌涂布器均匀涂布于平扳表面，3 7 c 温育至完全吸收。 1 3 3 质粒d n a 提取用溶液 s t e 溶液： 1 0 0m m o i ln a c l 1 0m m o l l t r s c i ( p u s 0 1 lm m o u l e d l a ( p r i g 0 1 溶液i ： 5 0 m m o l l 葡萄糖 2 5m m o l l i r i s c i ( p h 8 0 ) 1 0m m o l l e d t a ( p h 8 l1 5 高压灭菌2 0m i n ，4 c 贮存。 溶液： 0 2m o l ln a o h 1 s d s 现用现配。 可先配成1 0m o l l 的n a o h 和1 0 的s d s 的贮存液。 溶液： 5 m o l ，l 乙酸钾6 0 m l 冰乙酸 1 1 5 m l 蒸馏水 2 8 5 m l t eb u f f e r ( p h 8 ，0 ) ： o 中国农业大学硕士学位论文 第一章2 型r a 外膜蛋白基因的克隆及序列分析 1 0 m m d l l t n s - c i ( p h 8 o ) lm m o l l e d t a ( p h 8 0 、 1 2 l 高压灭菌2 0r a i n 。 r n a s ea 贮存液：将r n ea 溶于1 0m m o l l i r i s c i ( p h 7 5 ) 及1 5m m o l ln a c i 中，配成l o m g m l 的浓度，l o o c 自n 热1 5m i n 缓慢冷却至室温无菌分装成小份，2 0 c 冻存。 1 0m o l l n a o h ：4 0g n a o h 加8 0m l 水溶解，定容至1 0 0m l 。 1 0 s d s ：1 0g 电泳级s d s 加5 0m l 水，加热至6 8 ( 2 助溶，定容至1 0 0m l 。 o 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) ：1 8 6 1gn a 2 e d t a 1 2 h