（分析化学专业论文）化学发光免疫成像分析法的研究.pdf

：鱼壅苎堑苎查兰! ! ! ! 竺塑翌壅生生些堡圭 化学发光免疫成像分析法的研究 侯凌燕 摘要本论文由综述、研究报告两部分组成。 综述分别介绍了化学发光免疫分析的主要类型、新方法和化学发光免疫成像 分析的历史发展和应用前景。 化学发光免疫分析是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，通 过化学发光反应来测定发光标记物或酶标记物的化学发光信号，从而确定待测抗 原或抗体的浓度。化学发光免疫分析具有分析方法简便、灵敏度高、线性范围宽、 标记物有效期长、无放射性危害、可实现全自动化等优点，越来越受到人们的广 泛关注。与各种技术如流动注射技术、高效液相色谱、毛细管电泳、电子偶合显 像系统等广泛结合，化学发光免疫分析的应用范围得到了更进一步的发展。目前， 化学发光免疫分析的发展趋势在于合成新的发光标记物、研究出更灵敏、发光量 子产率更高的化学发光反应。 。 化学发光免疫成像分析就是目前最受关注的化学发光免疫检测的方法之一， 它是化学发光免疫分析与成像技术的联用，在实际应用中不但具有化学发光免疫 分析的优点，同时也具有成像分析高通量，能多组分同时测定的优势。 研究报告由四部分组成。第一个部分是从几种常见荧光探针( 如丁基罗丹明、 罗丹明b 、罗丹明6 g 、四甲基异硫氰酸罗丹明b 、荧光素、异硫氰酸荧光素等) 的化 学发光成像分析出发，建立了可以分析多种荧光物质的过氧化草酸酯过氧化氢 ( h 2 0 2 ) 一咪唑- 荧光物质化学发光体系。实验表明，利用过氧化草酸酯( t c p o ) 化学发 光体系，对荧光探针的化学发光成像分析均具有高灵敏度、高通量、线性范围宽 和检出限低等优势，比相同条件下荧光成像的检出限低一个数量级。第二个部分 研究了多种辣根过氧化物酶催化反应产物的化学发光成像分析，实验将辣根过氧 化物酶催化荧光反应与t c p o - h 2 0 2 咪唑荧光物质化学发光体系相结合，实现了 t c p o 化学发光体系在成像分析中的应用，这些酶催化反应体系包括h r p 催化的还 原型罗丹明b 、酪氨酸、邻苯二胺( o p d ) 、3 - ( 4 羟苯基) 丙酸( p h p p a ) 等。利用酶催 化化学发光成像，对h r p 的定量分析既具有酶反应专一性好的优点，同时也具有 良好的线性范围和检出限，这为t c p o 化学发光体系用于免疫分析奠定了基础。第 三、四部分是以酶催化荧光反应为纽带，将酶联免疫吸附法( e l l s a ) 与t c p o 化学 发光成像分析相结合，建立了正常入血清样品中的泓干扰素( a - i f n ) 和癌胚抗原 ( c e a ) 定量分析的酶催化荧光化学发光免疫成像分析法。采用双抗体夹心法，在已 包被有抗体的9 6 ：f l 酶标板中加入抗原标准品或待测样本，使之与吸附在固相载体 鱼堕垦堑苎苎兰! ! ! ! 竺塑塑壅兰兰兰垒查 上的特异性抗体反应，孵育后洗涤除去未反应的样品；加入酶( h r p ) 标记的特异性 抗体与抗原反应；彻底洗涤后加入荧光底物和氧化剂过氧化氢，在3 7 c 水浴中孵 育一定时间后，取一定量的酶催化反应混合物质，利用t c p o - h 2 0 2 - 咪唑荧光物质 化学发光体系对其进行化学发光成像分析，通过检测化学发光信号实现对抗原和 待测样品的定量分析。此方法已经成功用于定量分析正常人血清中a 干扰素和癌胚 抗原含量，在最优化条件下，发光强度值与a - i f n 和c e a 分别在1 3 1 5 6 0 p g m l ( r 2 = o 9 9 9 1 ) 矛i 1 0 - 1 2 8 n g m l ( r 2 = 0 9 9 8 ) 范围内呈良好的线性关系，检出限分别 为0 8 p g m l 和0 5 n g m l ，对2 5 p g m l a i f n 和3 2 n g m l c e a 作9 次平行测定的相对标准偏 差分别为4 7 和4 2 。通过实验结果对照显示，酶催化荧光化学发光成像分析结 果与标准的比色法诊断结果基本一致。实验结果表明：化学发光免疫成像分析法 具有高通量、多元化检测、灵敏度高的特点，因此，用化学发光免疫成像分析法 对某些疾病的超痕量i 临床诊断是可行的。 关键词：化学发光免疫；化学发光免疫成像；过氧化草酸酯；酶催化反应； 荧光底物； c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a yi m a g i n g l i n g y a nh o u a b s t r a c tt h i st h e s i sc o n s i s t so f t w op a r t s i nt h ef i r s tp a r t ，ar e v i e wa b o u tc h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ( c l i a ) ，t h eb a s i c p r i n c i p l e s a n dn e wt e c h n o l o g i e so fc l i a ，t h et y p e sa n da p p l i c a t i o no f c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a yi m a g i n gw e r es u m m a r i z e d c l i ai st h a tu s i n g c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) s p e c i e so ra l le i ! l z y m ea sal a b e lt os t u d yt h er e a c t i o no f a n t i g e n a n da n t i b o d y ，a n dw ec a l ld e t e r m i n et h ec li n t e n s i t yb ya f f i l i a t i n gt h eo x i d a n to r e n z y m et ot h ec h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o na f t e ri m m u n o a s s a yr e a c t i o n i nt h i sw a y ，t h e c o n c e n t r a t i o n so fs a m p l e sc a nb eg a i n e da c c o r d i n gt ot h ec li n t e n s i t y d u et ot h em a i n a d v a n t a g e so fs i m p l e ，h i g hs e n s i t i v i t y ，w i d ed y n a m i cr a n g e ，l o n ga c t i v i t yo f t h el a b e l ， n o n - r a d i a t i o na n da u t o m a t i cc o n t r 0 1 c l i ah a sr a i s e dw o r l d w i d ei n t e r e s t c o m b i n e dt o m a n ya n a l y t i c a lm e t h o d ss u c ha sf l o wi n j e e t i o n , h p l c ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a n d c c d ( c h a r g e - c o u p l e dd e v i c e ) c a m e r ai m a g i n g , t h ea p p l i c a t i o no fc l i ac o u l do b t a i n d e v e l o p m e n tg r e a t l y t h ec u r r e n td e v e l o p m e n t so f c l i aa r et h a tt h e ys h o u l ds y n t h e s i z e n e wl a b e l si ni m m u n o a s s a ya n a l y s i s ，d e v e l o pn e wc h e m i l u m i n e s e e n ts y s t e m st h a th a v e m o r es e n s i t i v ea n dh i g h e rq u a n t u my i e l d c o m b i n e dc c di m a g i n gt e c h n o l o g yt oc l i a ，c h e m i l u m i n e s c e n ti m m u n o a s s a y i m a g i n g h a s t h ed i s a d v a n t a g e so f c l i 九a n da l s oh a st h ea d v a n t a g e so f h i g ht h r o u g h p u t a n ds i m u l t a n e i t yd e t e c t i o no fi m a g i n gd e v i c e i th a sb e e np a i dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n w o r l d w i d e 1 1 ”r e s e a r c hp a r ti n c l u d e sf o u rs e c t i o n s i n t h ef i r s ts e c t i o n , as e n s i t i v e s i m p l ea n d h i g ht h r o u g h p u tm e t h o dh a sb e e nu s e df o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fs e v e r a la v a i l a b l e f l u o r e s c e n tp r o b e s ( b u t y lr h o d a m i n e , r h e d a m i n eb ，r h o d a m i n e6 qt e t r a m e t h y l r h o d a m i n ei s o t h i o c y a n a t e ，f l u o r e s e e i na n df l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t ea n ds oo n ) ，a n da n e wc h e m i l u m i n e s c e n ts y s t e m ，b i s ( 2 ，4 ，6 - t r i c h l o r o p h e n y l ) o x a l a t e ( t c p o ) 一h y d r o g e n p e r o x i d e ( h 2 0 2 ) - g i y o x a l i n e f l u o r e s c e n ts u b s t a n c e h a sb e e nu s e di n t h i sr e s e a r c h t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt c p 0c h e m i l u m i n e s c e n c ei m a g i n ga n a l y s i sh a st h ea d v a n t a g eo f s e n s i t i v i t yo fc h e m i l u m i n e s c e n c ea n dh i g i lt h r o u g h p u to fi m a g i n g i th a dg o o dl i n e a r a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s10 “t o o l ! i nt h es e c o n ds e c t i o n ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) - c a t a l y z e d f l u o r e s c e n tr e a c t i o nh a sb e e nc o m b i n e dt o t c p o h 2 0 2 g l y o x a l i n e - f l u o r e s e e n t s u b s t a n c ec h e m i l u m i n e s c e n c e i m a g i n ga n a l y s i s ，a n d t h e s e i i i 陕西师范大学2 0 0 7 级硕士研究生毕业论文 e n z y m e d - c a t a l y z e dr e a c t i o n sc o n t a i n h r pc a t a l y z e t y r a m i n e , o - p h e n y l e n e d i a m i n e ( o p d ) ，3 - ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) - a c e t i ca c i d ( p h p p a ) a n dt h er e d u c e df o r m so fr h o d a m i n e b b a s e do nt h ea d v a n t a g e so fe n z y m e d - e a t a l y z e dr e a c t i o na n dc h e m i l u m i n e s c e n c e i m a g i n ga n a l y s i s ，t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fh r p c o u l db ea c h i e v e db yd e t e r m i n a t i o n o fc h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t y , a n di th a dg o o dl i n e a ra n dt h ed e t e r m i n a t i o nl i m i tw a s 1 0 1 g n 1 1 t h ei n v e s t i g a t i o np r o v i d e sap o s s i b i l i t yo fu s i n gt c p oc h e m i l u m i n e s c e n c e s y s t e mf o ri m m u n o a s s a y b a s e do ne n z y m e d - l i n k e di m m u n o s o r b e n t ( e l i s a ) ，a n d h r p - e a t a l y z e df l u o r e s c e n tr e a c t i o n , t c p oc h e m i l u m i n e s c e n c ei m a g i n ga n a l y s i sh a s b e e n u s e df o rd e t e r m i n a t i o no fi n t e r f e r o na l p h a ( a - i f n ) a n dc a r c i n o c m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) i n 丘e s hh u m a ns e r u ms a m p l e si nt h et h i r da n df o n l ls e c t i o n at y p i c a l s a n d w i c h t y p e ”i m m u n o a s s a yw a su s e d t h ea n t i g e ns t a n d a r do rs a m p l e sw e r ea d d e di n t ot h e 9 6 - w e l lp l a t e sc o a t e d 嘶t l la n t i b o d y a f t e ri n c u b a t i o ni n3 7 ，w a s h i n gs t e p sf o l l o w e d ， a n dt h eh r p - e o n j u g a t e da n t i - a - 1 f nm o n o e l o n a la n t i b o d yw a sa d d e dt or e a c tw i t h a n t i g e n a f t e ri n c u b a t i o na n dw a s h i n gs t e p s , t h ef l u o r o g e n i cs u b s t r a t ea n do x i d a n tw e r e a d d e di n t ot h em i c r o t i t r e ，t h e na ni n c u b a t i o ns t e p sf o l l o w e d a f t e ra d d i t i o no fm i x t u r e , t c p oc h e m i l u m i n e s c e n c es u b s t r a t e sw e r ea d d e dt od e t e r m i n ec li n t e n s i t y t c p o c h e m i l u m i n e s c e n c ei m a g i n gm e a s u r e m e n t s h a v eb e a ns u c c e s s f u l l yu s e df o ra n a l y s i so f t h ec o n t e n to f a - i f na n dc e ai nh u m a ns e r u ms a m p l e s u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ， t h ec li n t e n s i t yw a sp r o p o r t i o n a lw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f a - i f na n dc e ai nt h er a n g e o f1 3t 0 1 5 6 o p g m l ( r z = o 9 9 9 1 ) a n d1 0t o1 2 8 o n g m l ( r 2 = o 9 9 8 ) ，r e s p e c t i v e l y 1 n h e d e t e c t i o nl i m i t sw e r eo 8 p g m la n do 5 n g m l ( 3 0 ) ，r e s p e c t i v e l y t h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n ( r s d ) f o rn i n ep a r a l l e lm e a s u r e m e n t so f2 5 p g m l a - i f na n dc e a3 2 n g m l w e r e4 7 a n d4 2 ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r e d 谢t he l i s a ，t h em a i na d v a n t a g e so ft h i s n o v e lm e t h o di ss e n s i t i v e ，s i m p l e ，r a p i d ，h i g ht h r o u g h p u ta n ds i m u l t a n e o u sd e t e c t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ep r o p o s e dc l i am e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs o m e s u b s t a n c ei sf e a s i b l ei nc l i n i c a ld i a g n o s e s k e y w o r d s ：c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ；c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o - a s s a yi m a g i n g ；o x a l a t e ；e n z y m e d - e a t a l y z e dr e a c t i o n ；f l u o r o g e n i cs u b s t r a t e 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其它个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：堡：耋墨日期：塑坌石兰 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 予版和纸质版：有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名 像度岛 同期 d o o ，6 。j 陕西师范大学2 0 0 7 级硕士研究生毕业论文 1 综述化学发光免疫成像分析法的研究进展 1 1 化学发光免疫分析 1 1 1 化学发光免疫分析的主要类型 1 9 7 7 年，h a t m a n l l l 等将化学发光应用于免疫分析创建了化学发光免疫分析方 法( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，c l i a ) ，化学发光免疫分析是将具有高灵敏度 的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，藉以检测抗原或抗体的分 析技术。将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，通过化学发光反应 来测定发光标记物或酶标记物的化学发光信号，从而确定待测抗原或抗体的浓度， 它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性，其主要的优点在于： ( 1 ) 高灵敏度：由于不需要外来光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而具 有比荧光法更高的信噪比，其灵敏度比r i a 或e i a 高1 至2 个数量级；( 2 ) 发光标记物 稳定，有效期长，大多数发光标记物可保存数月甚至数年；( 3 ) 检测范围宽；( 4 ) 自 动化程度高，不仅可以大大提高检测工作效率，而且避免了手工操作可能带来的 误差，提高了分析方法的精密度【2 0 1 。 化学发光免疫分析是用化学发光剂( 包括发光物质或者发光反应催化剂等) 直 接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法，根据其标记物的不同可分为三大类：标 记酶的化学发光免疫分析，其中应用最多的是三种酶，依据h r p l u m i n 0 1 h 2 0 2 一对 碘苯酚( p i p ) 增强型化学发光反应体系进行检测的辣根过氧化物酶( h r p ) ，能催化 a m p p d 的分解反应从而产生化学发光进行抗原抗体定量分析的碱性磷酸酶 ( a l p ) ，另一种是虫荧光素酶，能催化氧化虫荧先素产生发光而实现对a t p 、各种 激素、药物以及抗原抗体的定量分析；标记化学发光物质的化学发光免疫分析， 最典型的是标记氨基异鲁米诺( a b e l ) 和吖啶酯类的化学发光免疫分析；另一种是 标记荧光物质，通过过氧化草酸酯化学发光体系进行检测的化学发光免疫分析。 i i 1 1 标记酶的化学发光免疫分析 化学发光酶免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ee n z y m ei m m u n o a s s a y ，c l e i a ) 是以 发光剂作为酶免疫测定的底物，底物通过酶的转化，生成化学发光的产物，然后 进行化学发光反应，根据化学发光强度来间接测定酶的含量。操作步骤分为免疫 部分和化学发光部分，与传统的显色e l i s a 法相比，存在着检测步骤的差异，前者 是通过显色，检测吸光度的变化，后者通过检测酶与化学发光底物作用后产生的 化学发光信号进行定量或者半定量分析。目前，常用的酶标记物有辣根过氧化物 酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h p o ) 、碱性磷酸酯酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a l p ) 和虫 荧光素酶，它们有各自对应的化学发光底物。 陕西师范大学2 0 0 7 级硕士研究生毕业论文 1 , 1 111 标记辣根过氧化物酶( i i r p ) 的化学发光酶免疫分析 h r p 是一种对氢受体有特异性，对氢供体缺乏特异性的酶，它常见的氢供体 有三大类：苯胺类衍生物、苯酚类衍生物和染料隐性体。h i 冲常用的发光底物是 鲁米诺或其衍生物。其催化原理是h r p 与h 2 0 2 反应被氧化生成h r _ pi ，h r pi 再 与鲁米诺负离子反应生成半还原的h r pi i 和鲁米诺自由基( l 啪i n o l 0 1 ，h r p i i 再和 另一分子的鲁米诺负离子( l u m i n 0 1 ) 反应转变为原来的酶h r p ，循环反应如图1 所 不o h 2 0 2 (、 h r p _ ) + h r p d + h 2 0 l u m i n o l 图lh r p 标记的c l e i a 反应帮l 理 f i g lm e c h a n i s mo f h r pl a b e l e dc l e i ar e a c t i o n 在化学发光酶免疫分析中，标记抗原抗体的酶h r p 能够催化化学发光底物的 反应产生化学发光。标记有过氧化物酶的抗原抗体经过免疫反应后，利用鲁米诺 作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂( n a o h 和h 2 0 2 ) 作用下，鲁米诺发光， 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。k o d a ka m e r l i t e t m 半自动分析系统的工 作原理就是如上所述。但是传统的化学发光体系( h r p ，l r t 2 0 2 l u m i n 0 1 ) 为几秒内瞬时 闪光、发光强度低、不易测量等缺点i l “，因此在发光系统中加入增强发光剂，如 萤火虫荧光素，含有取代基的酚类化合物( 如：4 , 4 噻唑酚i 。2 1 ，萘酚，6 羟基噻唑 酚化合物【1 3 】，取代的溴酸化合物【1 4 1 ，乙酰苯胺类化合物u 5 4 - ( 3 一噻吩基) 酚类化合物 【i6 】等) ，对碘苯酚等，发光信号能够大大增强，并可以在较长的时间内保持稳定， 便于重复测量，提高了分析灵敏度和准确性。用荧光素、噻唑等作为增强剂的 a m e r l i t e n d 发光增强酶免分析系统，其发光时间可持续2 0 m i n ；以对碘苯酚1 1 7 1 作为 化学发光增强剂的l u m i n 0 1 h 2 0 2 p i p h r p 化学发光体系，对铁蛋白甲胎蛋白的定 量分析可以比酶联免疫吸附测定法高l 2 个数量级。 1 1 1 1 2 标记碱性磷酸酯酶( a l p ) 的化学发光免疫分析 碱性磷酸酯酶的分子量为8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 ，是一种广泛存在于动物组织和微生 物中的含z n 的金属酶，它需要在碱性条件下催化各种底物的水解，反应适宜的p h 2 鱼堕里堑垄查兰! ! ! ! 塾翌主堡塞皇望些垒查 为8 1 0 。目前，因为a l p 稳定性好、活性高、易分离提纯的优点，它已广泛用于酶 联免疫分析和核酸杂交分析的标记物。1 9 9 5 年，b r o n s t e i n 等i l 驯提出了a l p - a m p p d 化学发光体系。a m p p d 是一种新型专利物质发光试剂，其化学名字是3 - ( 2 螺旋金 刚烷) 4 甲氧基- 4 ( 3 - 磷酰基氧化) 酚1 ，2 氧环化物( 3 - 2 - s p i r o a d a m a n t a n e ) - 4 - m e t h o x y - 4 - ) 3 ”- p h o a p h o r y t o x y ) p h e n y - i ，2 - d i o x e t a n e ) ，简称a m p p d 。a m p p d 能有 效的被碱性磷酸酯酶所分解，脱去一个磷酸酯，生成a m p p d 的中间产物，该中间 产物通过分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的问氧苯 甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态至基态时，产生 高量子效率的光辐射( 发光过程如图2 所示) ，试剂本身几乎没有发光背景值。 0 1 0 哟 + 、一 p q o o 旆。 图2a l p 标记的c l e i a 反应机理 f i 9 2m e c h a n i s mo f a l pl a b l e dc l e i a r e a c t i o n a m p p d 为磷酸酯酶的直接发光底物，可用来检测碱性磷酸酶或抗体、核酸探 针及其它配基的结合物。a l p a m p p d 发光体系具有非常高的灵敏度，无论是固相 还是液相检测，对标记物a l p 的检测限可达1 0 - 2 1 m o l l 1 9 1 ，是最灵敏的免疫测定方 法之一。在化学发光酶免疫分析中，a l p - a m p p d 体系已应用于肿瘤标志物如a 铁 蛋白，c e a ，c a 1 9 9 和c a 1 2 5 1 2 0 2 ”，b h c g ，l h ，f s h 2 2 1 以及t s h p a 等分析物 的免疫测定。在a m p p d 基础上加以改进并具有更好反应动力学和更高灵敏度的新 一代产物c s p d 、c d p s t a r 也已出现。这些体系已广泛用于各种基因、病原体d n a 的鉴定。如检测乙肝核心抗原d n a ( h b v c ) 【1 9 1 、单纯疱疹病毒d n a ( h s ) 【2 4 】，测定 的灵敏度比使用显色反应的底物b c i p n b t 高两个数量级。 1 1 1 1 3 标记荧光素酶的化学发光免疫分析 生物发光是存在于有生命的物质体内的一种特殊的化学发光形式，用于免疫 分析的生物发光酶联免疫分析法( b l e l a ) 常采用荧光素酶标记抗原或抗体。荧光素 酶常采用戊二醛法与抗体结合，它主要存在两个发光体系：荧光素酶黄素单核苷 酸( f m n ) 细菌化学发光体系和荧光素酶荧光素化学发光体系，应用最广泛的是后 陕西师范大学2 0 0 7 级硕士研究生毕业论文 者，其发光原理是：当反应系统中存在a t p - m 矿和0 2 时( 如图3 ) ，虫荧光素( l h 2 ) 和荧光素酶( e ) 可以产生焦磷酸( p p i ) 和腺苷酸( a m p ) ，接着0 2 和e - l h p a m p 弓 导荧 光素脱羧，形成激发态产物氧化荧光素，它在返回基态时产生绿光( x m a x = 5 6 2 n m ) ，其发射光强度直接和a t p 浓度成正比，在通常条件下反应效率可以达到 9 0 ( p h = in 。 m p 1 l h 2 + a t p + e - = 二= 宝+ e l h 2 一a m p + p p i 2 b l h 2 a 御+ 0 2 b p + c 0 2 + a m p 3 e - p + e p + h r 图3 荧光素酶标记的c l e i a 反应机理 f i 9 3m e c h a n i s mo f l u c i f e r a s el a b e l e dc l e i ar e a c t i o n 在临床分析中，标记荧光素酶的化学发光免疫分折已经广泛用于三硝基甲苯 ( t n t ) 抗原1 2 5 2 6 、2 ，4 二硝基苯酚( d n p ) 1 2 - i 1 、人血清中的i g g 量1 2 田、孕酮、人绒毛 膜促性腺激素、盯p 等物质的定量分析。对三硝基甲苯( t n t ) 抗原的定量分析，检 出限可达5 0 f m o l z * l ，人血清中i g g 量含量的测定灵敏度比e l i s a 显色光度法高2 5 倍 2 3 l 。 1 1 1 2 标记发光物质的化学发光免疫分析法 标记发光物质的化学发光免疫分析法是以发光剂作为抗原或抗体的标记物， 直接通过发光反应检测样本中的抗原或抗体的含量。用于标记的化学发光剂应符 合以下几个条件：能参与化学发光反应；与抗原或抗体偶联后能形成稳定的 结合物试剂；偶联后仍保持高的量子效应和反应动力；应不改变或很少改变 被标记物的理化特性，特别是要求不改变免疫学活性。鲁米诺类、吖啶酯类以及 钌联吡啶体系电化学发光试剂是最常用的标记发光剂。 1 1 121 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类标记的化学发光免疫分析 鲁米诺( l u m i n 0 1 ) ，异鲁米诺( i s o l u m i n 0 1 ) 及其衍生物是最早在c l i a q b 使用的一 种常用的化学发光物质，它们的结构如图4 ：这类物质的发光为氧化反应发光，在 质子环境中( 如水、水溶剂或低浓度的乙醇等) ，各种氧的存在形式如分子态氧、过 氧化物、超氧化物阴离子等都能够氧化鲁米诺以及衍生物，但是需要金属离子或 者酶作为催化剂才可以得到比较明显的发光现象阴在碱性水溶液中，以过氧化 氢为氧化剂时，可以观察到明显的发光现象，在催化荆存在时反应更剧烈。化学 发光光谱、荧光光谱实验表明鲁米诺化学发光的激发态产物是氨基邻苯二甲酸盐 离子，其发光机理图如图5 ： 4 陕西师范大学2 0 0 7 级硕士研究生毕业论文 1 ) ( 2 )3 ) 图4 鲁米诺( 1 ) 异鲁米诺( 2 ) 和氨基丁基乙基萘酰肼( 3 ) 的结构 f i 9 4s t r u c t u r eo f l u m i n 0 1 i s o - l u m i n o la n da m i n o b u t y l - e t h y l i s o l u m i n o l 时r 殴一瞬一m 图5 鲁米诺化学发光反应机理 f i 9 5s c h e m eo f l u m i n o lc h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o n 鲁米诺的发光光子产率约为0 0 1 ，最大发射光波长为4 2 5 n m ，它利用氨基与其它化 合物连接，实现对抗原或者抗体的标记。鲁米诺化学发光试剂的发光反应，必须 要有催化剂的催化( 如过氧化物酶) ，并且与蛋白质或多肽结合后，由于空间位阻的 表1 异鲁米诺作为标记物的免疫分析应用 t a b l e la p p l i c a t i o no f i s 0 - l u m i n o la sal a b e li ni m m u n o a s s a y a n a l y s i s 原因，发光活性明显减弱，光子产率降低为原来的1 0 ，因此鲁米诺虽在化学发光 免疫中是较好的底物，但是它需要酶的催化，因此鲁米诺主要用于酶标记的化学 发光免疫分析。氨基丁基乙基异鲁米诺( a b e j ) ，氨基己基乙基异鲁米诺( a h e i ) 等 。噼 鱼堕望堑苎叁兰! ! ! ! 丝堡主墅垄圭兰些垒查 鲁米诺的衍生物质，利用伸出的烷基链末端上的氨基与抗原或抗体偶联，大大减 少了标记后被标记分子对酰肼环的空闻位阻作用，其光量子产率也远比标记鲁米 诺高。表l 给出了异鲁米诺作为标记物在化学发光免疫分析中的应用。 在这些分析中，带有氨基的异鲁米诺的衍生物用n 羟基琥珀酰胺作为偶联试 剂。在上表的几种分析物中，除了乙肝表面抗原是用双位方法对抗体进行标记外， 所有分析都由分析物进行标记和竞争性结合过程。均相分析是基于与抗体的结合 增强了化学发光效率。除了甲状腺素，非均相分析是使用涂有抗体的试管，水解 后，在没有加入产生化学发光的试剂前，将标记物溶在溶液中，再对结合的标记 物的数量进行分析。 1 1 122 吖町酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯类化合物只要在h 2 0 2 和o h 存在下就能迅速产生化学发光，且具有很 高的化学发光量子产率，其中吖啶芳香酯的量子产率可达0 0 5 4 0 ，该类物质的化学 发光机制如图6 所示。 图6 吖啶酯类化合物的化学发光机制 f i 9 6m e c h a n i s mo f a c r i d i n ge s t e rc h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o n 在碱性环境中，吖啶酯与过氧化氢发生氧化反应，生成一个有张力的不稳定 的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为c 0 2 和电子激发态的n 甲基吖啶酮，此生成物所处 过渡态不稳定，迅速回到基态时发出最大发射波长为4 3 0 r i m 的光予。此外，通过不 发光的反应途径吖啶酯也能分解生成最终产物n 甲基吖啶酮。 一些能够促进过氧化氢分解的催化剂，如过渡金属离子、酶等都可以增强吖 啶酯的化学发光强度，在化学反应发生后，光是由吖啶酯分子直接释放的，这就 与环境的变化有关，研究表明，消去基团的特征、氧化剂浓度和溶液p h 值等都会 6 鱼堕里堑垄垄兰! ! ! ! ! 堕堑壅兰兰兰堕查 影响分解反应1 4 l j 。一般地，吖啶酯类化学发光底物具有高的量子产率，因为不需 要催化剂而具有很低的背景值，提高了信噪比，干扰作用小等优点，常常结合到 蛋白上用以激活酯类物质或者胺类物质【4 2 , 4 3 1 。离去基团共轭酸的p k a t j , 于h 2 0 2 的 p k a 时，有较高的发光量子产率m 。 对于吖啶酯类化合物，如果吖啶环上的c - 9 碳原子链上含有取代基且该取代基 能与吖啶环上的c - 9 原子和h 2 0 2 形成有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解 为c 0 2 和电子激发态自蚋一甲基吖啶酮，当回到基态时发出光子，则这类含有取代基 的吖啶化合物可以作为化学发光标记物。目前，应用较多的标记物有吖啶酯和吖 啶一9 ( n 一磺酰基) 碳酰胺。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在 有h z 0 2 的稀碱溶液中即能发生化学发光，具有许多优越性，特别是无需催化过程， 也无增强剂，从而降低了背景发光，提高了信噪比，干扰作用少。此外，该类化 合物作为化学发光免疫分析的发光标记物，还具有光释放快速集中、发光效率高、 发光强度大、易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少、标记物稳定等优点， 因此吖啶酯或吖啶磺酰胺是一类非常有效的化学发光标记物。 n 、f 啶醢或吖啶磺酰胺类化合物发光为闪光型。大多数物质在加入发光启动试 剂后0 4 s 左右发射光强度达到最大，半衰期约为0 9 s 左右。近年来，使用吖啶酯作 为标记物发展了各种不同分析物的竞争式和非竞争式免疫分析方法。如：人生长 激素【4 5 1 、白细胞介素、干扰素及其有关化合物 4 6 4 9 1 、胰岛素原、副甲状腺激素有 关的肽类l 划、朴脂蛋白b 【5 1 1 以及半抗原1 5 2 - 5 4 。有文献报道，高效液相色谱( h p l c ) 与化学发光免疫分析联用方法对t 4 进行了测赳5 5 】，同时，吖啶酯作为标记物对纽 胞中p r o e a l a i t i o n 的定量分析得到了发展【叫。 吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于c l n 通常采用的体系是a c r i d i n i u m e s t e r - i - t 2 0 2 体系或a c f i d i m u m 一( n s u l p h o n y l ) - c a r b o x a m i d e s - h 2 0 2 体系，即用吖啶酯或吖啶 磺酰胺标记抗体或抗原，用h n 0 3 + h 2 0 2 和n a o h 作发光启动试剂。有些在发光启动 试剂中加入t r i t o nx - 1 0 0 ，c t a c ，t w e e n - 2 0 等表面活性剂以增强发光。例如c i b a c o m i n g 公司的m a g i cl i t e 化学发光免疫分析系列商品试剂盒就是采用这种系统。 m a g i cl i t e 化学发光免疫分析系列商品试剂盒能做